Paraffin indlejring og tynde skæring af mikrobielle koloni biofilm til mikroskopisk analyse

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver fiksering, paraffin indlejring og tynde skære teknikker for kimtal biofilm. I rede prøver, kan biofilm underkonstruktion og reporter udtryk mønstre visualiseres ved mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Skæring via paraffin indlejring er en bredt etablerede teknik i eukaryote systemer. Her giver vi en metode til fiksering, indlejring, og skæring af intakt mikrobielle koloni biofilm ved hjælp af perfunderet paraffinvoks. For at tilpasse denne metode til brug på koloni biofilm, vi udviklet teknikker til vedligeholdelse af hver prøve på substratet vækst og laminering det med en agar overlayer, og tilføjet lysin til Fikseringsvæske løsningen. Disse optimeringer forbedre prøve opbevaring og bevarelse af micromorphological funktioner. Prøver forberedt på denne måde er indstillet til tynde skæring og imaging af lys, fluorescens og transmissions Elektron Mikroskopi. Vi har anvendt denne teknik til kolonien biofilm af Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisog Vibrio cholerae. Det høje niveau af detailrigdommen i prøver genereret ved denne metode, kombineret med reporter stamme engineering eller brug af specifikke farvestoffer, kan give spændende indsigt i fysiologi og udvikling af mikrobielle samfund.

Introduction

De fleste mikrober har kapacitet til form biofilm, holdt Fællesskaber af celler sammen af egen-producerede matricer. Biofilm kan dyrkes i mange typer af fysiske opsætninger, med forskellige regimer af næringsstof og substrat bestemmelse. Specifikke assays til Biofilmdannelse tendens til at give reproducerbare flercellede strukturer, og udbredte arkitekturer er observeret for Fylogenetisk forskelligartede arter på fællesskabsplan eller makroskopisk plan. Når mikrober er vokset som kolonier på solid medium under en atmosfære, makroskopisk morfologi formidler oplysninger om kapacitet til produktion af matrix og ofte korrelerer med andre træk 1,2,3. Den interne arkitektur af mikrobielle kolonier kan også give et fingerpeg om biofilm-specifikke kemi og fysiologi, men har været svært at karakterisere. Seneste programmer af cryoembedding og cryosectioning teknikker til bakteriel kolonier har aktiveret imaging og visualisering af specifikke funktioner i hidtil uset opløsning 4,5,6. Undersøgelser med animalsk væv har dog vist at paraffin indlejring giver overlegen bevarelse af morfologi i forhold til cryoembedding 7 og har været brugt til at visualisere bakterier i væv 8,9. Vi har derfor udviklet en protokol for fiksering, paraffin indlejring og tynde skæring af mikrobielle koloni biofilm. Her vil vi beskrive forberedelse af Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biofilm tyndslib 10,11, men vi har også med succes anvendt denne teknik til biofilm dannes af bakterier Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, og Vibrio cholerae12.

Processen med integrering af paraffin og tynd-skæring biofilm følger en simpel logik. Først, biofilm er indkapslet i et lag af agar at bevare morfologi under behandlingen. For det andet indkapslet biofilm er neddykket i fiksativ til bitmapgenkendelse makromolekyler og bevare micromorphology. Disse er derefter dehydreret med alkohol, ryddet med en mere ikke-polære opløsningsmidler og derefter infiltreret med flydende paraffin voks. Når infiltreret, er prøverne indlejret i voks blokke for skæring. Sektioner er skåret, monteret på dias og derefter rehydreret for at returnere dem til en mere naturlig tilstand. Fra dette punkt, kan de farves eller omfattet af montering medium til mikroskopisk analyse.

Denne protokol producerer tynde sektioner af mikrobielle biofilm egnet til histologisk analyse. Koloni biofilm delstrukturer er synlige, når tyndslib udarbejdet ved hjælp af denne metode er afbildet ved lysmikroskopi. Biofilm kan også dyrkes på medier indeholdende fluorescerende pletter specifikke for individuelle funktioner eller plettet på trinnet rehydrering umiddelbart inden montering (trin 9,5-9,6). Endelig, mikrober kan blive manipuleret til at producere fluorescerende proteiner i en konstitutiv eller regulerede mode tillader i situ rapportering af celle distribution eller gen udtryk inden for disse samfund. Vi har brugt disse metoder til at bestemme koloni biofilm dybde, celle distribution, matrix distribution, vækstmønstre og spatiotemporelle genekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vækst af Pseudomonas aeruginosa koloni biofilm

  1. Forberedelse af Medium-tolagede plader
    1. Forberede en 10 g/L trypton, 10 g/L agar (Se Tabel af materialer) løsning i ionbyttet vand.
    2. Autoklave i 20 min. afkøles til 50-60 ° C i et vandbad.
    3. Hældes 45 mL af opløsningen, agar-trypton i et 100 mm x 100 mm firkantet fad (Se Tabel af materialer) ved hjælp af en 50 mL konisk slange. Tillad agar størkne (~ 20-30 min). Hæld en anden, 15 mL lag ud over første lag. Lad størkne natten, fjerner kondens fra låg eventuelt ved aftørring med en fnugfri serviet.
  2. Spotting koloni biofilm
    1. Streak stammer af interesse fra fryseren bestande på LB agar plader13 og Inkuber i mørke i 12-16 timer ved 37 ° C og 80-100% relativ luftfugtighed.
    2. For hver stamme eller kopiere, skal du bruge en enkelt koloni til podes 2 mL af LB og Inkuber i mørke i 12-16 timer ved 37 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
    3. Sub kultur ved fortynding 1: 100 til frisk LB og inkubere i mørke i 2,5-3 timer ved 37 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
    4. Måling af ekstinktionen bruger et spektrofotometer og justere med steril LB til at opnå en cellesuspension med en OD500 nm af ~ 0,5.
    5. Afhængigt af den ønskede koloni størrelse, afpipetteres 2,5-10 µL af cellesuspension på en medium-tolagede tallerken (udarbejdet i trin 1.1) og give stedet for at tørre til ~ 20 min. forlader petri låget klem i nærheden af åben ild kan lette tørring.
    6. Inkuber spot kolonier ved 25 ° C og 80-100% relativ luftfugtighed, i mørke i op til 4 dage.

2. forberedelse af Fikseringsvæske løsningen

  1. Forberede den Fikseringsvæske løsning på dagen for eksempel høst. Fortynd 37% formaldehyd (FA) i 1 x PBS til en endelig koncentration på 4% FA.
    Forsigtig: FA er flygtige og giftige. Bære værnemidler og arbejde i et velventileret stinkskab.
  2. Umiddelbart før anvendelsen, opløse L-lysin hydroklorid i 4% FA (udarbejdet i trin 2.1) ved stuetemperatur til en slutkoncentration på 50 mM L-lysine HCl.

3. direkte anvendelse af fiksativ på koloni Biofilm [ekstraudstyr]

Bemærk: Vi har fundet, at biofilm morfologi bevares bedst når agar overlay er tilføjet før fiksering. Dette trin udgør imidlertid også en ændring i miljøforhold, der kan påvirke genekspression. Fluorescerende reporter udtryk mønstre skal derfor bekræftes ved hjælp af en særskilt protokol, hvor trinnet fiksering er udført før tilsætning af agar overlay, som beskrevet her.

  1. På dagen for fiksering, og arbejder i et velventileret stinkskab, pipetteres fiksativ forberedt i trin 2 direkte på agar overfladen omkring koloniens kant, gør det muligt at nå frem til koloniens periferien uden nedsænkning det. Gælde kun som meget fiksativ som er nødvendig for at fuldt surround kolonien, ca. 500 µL. tillade fiksativ til diffus i kolonien og de omkringliggende agar.
  2. Når fiksativ er blevet fuldt absorberet i kolonien og omkringliggende medier, omkring 20-30 min, og resterende FA er ikke længere synlig på pladen, Gentag trin 3.1. Tillad denne fiksativ til diffus i kolonien og de omkringliggende agar.
  3. Når fiksativ er blevet fuldt absorberet i kolonien og omkringliggende Gentag media trin 3.1, denne gang anvende fiksativ på overfladen af kolonien direkte. Tillad denne fiksativ til diffus i kolonien og de omkringliggende agar, fortsætter til trin 4 kun jo Fikseringsvæske er blevet absorberet og er ikke længere synlig på pladen.

4. overliggende kolonier med Agar

  1. På dagen for fiksering, forberede en 10 g/L agar løsning i deioniseret vand og autoklave i 10-20 minutter for at opløse. Afkøles i vandbad til 50 ˚C.
  2. Forsigtigt hældes 15 mL af opløsningen, agar over vækstmediet og koloni. Tillad agar til at danne en gel ved stuetemperatur i 5 min (figur 1B).
  3. Brug et skarpt barberblad til at skære en firkantet, 3-lags chuck med kolonien lamineret mellem de øverste to lag. Hvis flere prøver, sikre, at hver chuck reduceres til en tilsvarende størrelse.
  4. Forsigtigt fjerne overskydende agar fra koloni-holdige chuck.
  5. For at ophæve de to øverste lag af agar (indeholdende kolonien) fra det nederste lag af chuck (figur 1 c), våd den fladt hoved af en spatel i 1 x PBS eller vand og forsigtigt indsætte mellem de øverste og nederste lag. Lamineret kolonien bør adskille fra det nederste lag. Vær omhyggelig med ikke at fordreje eller bøje den laminerede koloni, når man løfter det fra sin base.

5. fiksation

  1. Arbejder i et velventileret stinkskab, straks overføre lamineret kolonien (dvs., 2-lags chuck) til en indlejring kassette (Se Tabel af materialer), mærket med et kemikalie-resistent mærkning pen. Placere den indlejring kassette i et glas dias mailer (se tabel over materialer) indeholdende fiksativ forberedt i trin 2.1-2.2. Sørg for der er ingen luftbobler fanget inde indlejring kassetten.
  2. Inkuber prøven i fiksativ overnatning i mørke ved stuetemperatur.

6. prøve behandling: Buffer vask, dehydrering, Clearing og Infiltration

  1. Efter natten fiksering, vask prøven to gange i 1 x PBS for 1 h. For de bedste resultater, automatisere reagens homogenisering ved hjælp af spin funktion af en automatisk væv processor (se tabel af materialer) indstillet til en lav indstilling. Hvis ingen processor er tilgængelige, kan behandling køres manuelt.
  2. Følg buffer vask af dehydrering gennem en gradueret serie af ethanol (EtOH) fortyndinger i 1 x PBS (25%, 50%, 70% og 95%) i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Dehydrere i tre vasker 100% EtOH i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Ryd dehydreret prøven i tre vasker af 100% orange olie-baserede clearing agent (se tabel over materialer) i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Infiltrere den ryddede prøve to gange med smeltet paraffin voks (Se Tabel af materialer), opvarmes til 55˚C i 2 timer.

7. prøve indlejring

  1. Fyld en voks formen med smeltet paraffin voks er opvarmet til 55 ˚C. Bruge en opvarmet, flad spatel til hurtigt for at overføre det infiltreret chuck fra indlejring kassetten i voks formen, at sikre, at chuck hviler parallelt med bunden af formen. Undgå at anvende overdreven pres på chuck. Voks forme muligvis brugerdefinerede 3-D udskrives, eller er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer).
  2. Tillad voks at størkne natten over ved 4 ˚C. Prøver støbt i massivt voks kan gemmes på ubestemt tid på 4 ˚C.
  3. Når voks er størknet, punktafgifter prøve fra formen og trim overskydende voks fra omkring prøven med et barberblad. Lad overskydende voks strækker sig fra den ene ende af prøven, parallelt med den i skæring, der kan bruges til at klemme den ind i mikrotomen (Se Tabel af materialer). Også efterlade en kappe af voks, ca 1 mm tyk, omkring prøven og glat sin ansigter.

8. skæring

  1. Varme vandbad til 42 ˚C. Klemme prøven i mikrotom med overfladen af kolonien orienteret vinkelret på kanten af bladet (Se Tabel af materialer).
  2. Trim prøven i 50 µm mellemrum, indtil den ønskede fly af kolonien er nået, hvorfra dele vil blive indsamlet.
  3. Skære et bånd af det ønskede antal 10 µm tykt sektioner ved hjælp af en mikrotom indstillet til en skæring hastighed på 75-80 rpm og en frivinkel af 6-10˚. Bruge en bøde-tippes pensel til at løsne båndet fra bladet.
  4. Brug en dråbe vand på spidsen af en Pasteur pipette (foretrukket) eller pincet, forsigtigt overførsel båndet til vandbadet. Vær omhyggelig med at undgå fældefangst luftbobler under afsnittet.
  5. Straks indsætte et dias i vandbadet og Placer den under båndet i en 45˚ vinkel.
  6. Tryk den smalle kant af båndet til dias, lige under etiketten matteret. Båndet skal overholde.
  7. Træk diaset ud af vandbadet, justering af vinklen bliver vinkelret på overfladen af vandet, og tillader bånd at lægge fladt mod dias langs dens længde. Undgå overskydende vand under båndet diffusering i RIP.
  8. Forsigtigt stå diasset på en absorberende fnugfri væv, fugtspredende overskydende vand fra afsnittet.
  9. Lå diasset på et stykke køkkenrulle, og lad det tørre ved rumtemperatur natten i mørke. Dias kan gemmes på ubestemt tid på 4 ˚C i mørke.

9. varme-fixing, rehydrering og montering

  1. Opvarme en fladede varmeplade til 45 ˚C. Varme glideslidsen for 30-60 min. Voks vil blive semi-smeltet og tromle mod diaset.
  2. Forsigtigt løfte dias fra varmepladen og lægge det fladt på en glat, udjævnes, stuetemperatur overflade, ved hjælp af omsorg for, at den smeltede voks ikke trække på hver side af diaset, indtil voks størkner (~ 1 min).
  3. Bruger et glas dias mailer, de voks dias i fire vasker af clearing agent for 5 min hver, ved hjælp af en Büchner indsugningsventil fjerne løsning mellem vasker.
  4. Vask dias tre gange i 100% EtOH for 1 min.
  5. Rehydrere dias i en gradueret serie af ethanol i omvendt rækkefølge for behandling (95%, 70%, 50% og 25%) for 1 min hver efterfulgt af to 1-min vasker i 1 x PBS.
  6. Straks montere sektioner i en Tris-buffered montering medium (Se Tabel af materialer) og dækglas, undgå indførelsen af luftbobler. Tillad montering medium at polymerisere natten over ved stuetemperatur.
  7. Når polymeriserede, forsegle coverslip til dias ved hjælp af klare neglelak. Forseglet dias kan opbevares på ubestemt tid i mørke ved 4 ˚C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode genererer biofilm tynde sektioner hvori forskellige morfologiske funktioner og zoner af genekspression kan være afbildet af DIC, Fluorescens mikroskopi og TEM. Mens DIC imaging ved hjælp af en 40 X oliebestandighedsobjektet kan være tilstrækkeligt til at vise nogle morfologiske træk (figur 2E), har vi fundet at Fluorescens mikroskopi af stammer, der er udviklet til constitutively express fluorescerende protein giver forbedret visualisering af celle fordeling i stikprøven (figur 2D). Billeder af enkelte sektioner kan være syet sammen til at generere et tværsnit af hele kolonien (figur 2B) og at give sammenhæng til lokalisering af strukturelle træk inden for den generelle morfologi på makroskopisk plan (Sammenlign Figur 2A, B, og C). Morfologiske træk og fluorescerende signaler kan måles ved hjælp af billedbehandling software14. Strukturer inden for biofilm eller overgange mellem zoner af genekspression kan derefter være korreleret med fordelinger af metabolitter eller kemiske gradienter11 .

Denne protokol kan ændres og tilpasses på flere måder. Brug af en stamme, manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner under kontrol af en bestemt promotor giver mulighed for visualisering af fordelingen af genekspression (figur 3A). Kolonier kan dyrkes på medium indeholdende farvestoffer, eller farvestoffer kan tilføjes efter skæring, for at plette specifikt polysakkarider (tal 3B og C). Endelig kan prøver forberedt i en modificeret udgave af denne protokol blive undersøgt af TEM (figur 3D) at give mulighed for visualisering ved højere opløsning end det aktiveres med DIC eller Fluorescens mikroskopi.

Figure 1
Figur 1: Skematisk skildrer setup for kolonien vækst før fiksering.
(A) kolonier dyrkes på toppen af to lag af agar-størknede vækstmediet (top og bund) og (B) er derefter belagt med et ekstra lag (overlay), som bevarer koloni morfologi. C kolonien klemt inde mellem overlay og øverste lag er derefter adskilt fra det nederste lag til videreforarbejdning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Micromorphological funktioner og YFP fluorescens i tværsnit af paraffin-embedded kolonier.
Repræsentative data for en Pseudomonas aeruginosa PA14 ΔLitoria koloni15 constitutively udtrykker YFP og dyrket i 3 dage på 1% trypton, 1% agar indeholdende Congo rød og Coomassie blå. (A) top-view, fluorescens billede viser halvdelen af en koloni før fiksering. B tværsnit af hele kolonien efter integrering af paraffin. Den boxed område var afbildet med en 10 X mål linse (C). Den boxed område i (C) blev derefter afbildet med en 40 X olie fordybelse mål linse bruger fluorescens (D) og DIC (E). Skala barer repræsenterer 2 mm (A), 500 µm (B) og 100 µm (C-E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Reporter udtryk, før og efter farvning af biofilm funktioner og TEM billeddannelse af paraffin-embedded koloni biofilm prøver.
(A) MexGPr-NGL reporter fluorescens i en P. aeruginosa PA14 kolonien vokset til 3 dage på 1% trypton, 1% agar. B fluorescens af bundne Congo rød i en P. synxantha kolonien vokset til 5 dage på et medium, der indeholder farvestoffet. C fluorescens af Wisteria lactuella lektin pletten for Pel polysaccharid i en P. aeruginosa PA14 ΔLitoria koloni (dyrkes i 2 dage på 1% trypton, 1% agar indeholdende Congo rød og Coomassie blue), anvendes efter skæring. (D) TEM billede af en P. aeruginosa PA14 ΔLitoria koloni (vokset i 3 dage på 1% trypton, 1% agar indeholdende Congo rød og Coomassie blå), og forarbejdet til skæring via paraffin indlejring *. Skalalinjen repræsenterer 40 µm (A-B), 20 µm (C) og 5 µm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

* Denne prøve blev behandlet for skæring via paraffin-embedding gennem trin 4 i ovennævnte protokol, udelade trin 4.1-4.3, og derefter behandlet separat for TEM analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Integrering af paraffin og tynd-skæring vævsprøver er en klassisk histologisk teknik, der gør det muligt for billeddannelse af mikro-morfologiske strukturer og er almindeligt anvendt på eukaryote væv, og er blevet anvendt med en vis succes på mikrobiel prøver8 ,9. Mens cryoembedding giver mulighed for stærk fastholdelse af endogene og immunfluorescent signal, er paraffin indlejring generelt at foretrække, da det giver bedre bevarelse af morfologi16. Tilpasse denne metode for anvendelse på mikrobielle biofilm, fokuseret vi på egenskaber, der er unikke for vores system. Celler og matrix af væv er ofte holdt sammen relativt håndfast, mens biofilm tendens til at være mere sarte; Vi optimeret derfor rutinemæssig fiksering og voks indlejring protokoller for at maksimere prøve fastholdelse. Opretholde prøven på substratet vækst og overliggende kolonien med agar umiddelbart før fiksering sikrer, at prøven ikke er tabt fra toppen eller bunden. Men overliggende kolonier med agar, der er for varmt kan skade kolonierne, således ekstra pleje bør tages under dette trin.

Fiksering er et afgørende skridt for at bevare strukturen gennem det barske dehydrering, clearing, og infiltration trin kræves for integrering af paraffin. Vi fandt, at lysin-formaldehyd fiksering bedst bevarer integriteten af prøven. Opløselige lysin, en diamin, kan reagere med aldehyder at danne krydsbundet polymerer og blevet foreslået at styrke exopolymeric stof (EPS) mod mekanisk nedbrydning17,18.

Vi har observeret, at baggrunden fluorescens aftager med successive vasker i orange olie-baserede clearing agent eller gennem langvarig eksponering, under prøven rehydrering (trin 9.3). Over behandling med clearing agent kan imidlertid resultere i sprødt prøver, der er vanskelige at afsnit19. Det kan være nødvendigt at justere lydstyrken eller antal opvaske afspejler mængden af voks til stede under hver rehydrering. Øget baggrund fluorescens kan ligeledes opstå som følge af kontaminering af væv forarbejdning reagenser, hvor voks, som er lidt autofluorescent, er enten fuldt ud eller delvist blandbar i clearing opløsningsmiddel eller ethanol anvendes i disse trin (trin 6.1-6.4). Derudover har vi fundet at ethanol mindsker reporter signal, og det er afgørende at re udgør fluorophore i to skylninger af PBS før montering (trin 9,5-9,6).

Denne metode giver også mulighed for lokalisering af konstituerende og promotor-drevet fluorescens på løsningen af celler. Men vi tilråde forsigtighed, når du bruger denne metode til at fortolke genekspression. Trinnet overlay indført i denne protokol (trin 4.2), anvendelse, fiksering på 50 ˚C, præsenterer en betydelig miljømæssig ændring i forhold til de oprindelige vækstbetingelser, der kan påvirke gen expression mønstre. Det kan være nyttigt at kontrollere udtrykket mønstre ved at anvende fiksativ til kolonien direkte, umiddelbart før hælde overlay, men til en pris på morfologi (Valgfrit trin 3.1-3.3).

En anden faktor påvirker fortolkningen af Fluorescens er afsnittet selv topografi. Forskellige områder af biofilm kan udstille varierende grader af strukturelle integritet og være mere eller mindre modtagelig til bevarelse via fiksering, afhængigt af hvilke, hvis nogen, funktionelle grupper disse komponenter er stand til at bidrage til Fikseringsvæske cross-linking 20. som følge heraf sektioner kan miste biomasse uforholdsmæssigt fra afsnit overfladen når skifter fra én morfologiske eller metaboliske zone til en anden langs koloniens z-aksen. Dette kan løses af imaging en intakt fokale udsnit af afsnittet med en Konfokal mikroskop.

Ud over at anvende denne teknik til stammer manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner, har vi undersøgt micromorphological funktioner af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) og i biofilm prøver farves med specifikke fluorescerende farvestoffer (figur 3A ). Jennings et al. beskrev for nylig et farvestof specifikt for Pel, den store polysaccharid produceret af P. aeruginosa PA14 biofilm 21. Som beskrevet i de ovenstående protokol og repræsentative resultater, anvendelsen af dette farvestof til sektioner giver mulighed for visualisering af Pel distribution i PA14 koloni biofilm på høj opløsning (figur 3 c) 3. Omvendt, fluorescerende farvestoffer såsom Congo rød kan føjes til vækstmediet og afbildet efter skæring (figur 3B). Anvendelsen af en overlejring bevarer også kolonien biofilm morfologi og celle struktur i hele behandlingen for TEM (figur 3D).

Den optimerede metode beskrevet her muliggør udarbejdelsen af kolonien biofilm for skæring via indlejring af paraffin, hvori endogene signal og funktioner eller kompleksbundet farvestoffer kan være lokaliseret i vivo med overlegen opløsning og minimere prøve tab og bevarelse af indfødte koloni makro - og mikro-morfologier. Vi anerkender, at betydelige indsats, tid og reagens brug er nødvendig for denne metode. Vi mener dog disse ulemper modvirkes af graden af morfologiske bevarelse, opløsning af i situ fluorescens og imødekommenhed til før og efter farvning procedurer eller alternativ behandling strategier (som forberedelse til TEM) yder denne teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af NSF karriere AWARD 1553023 og NIH/NIAID award R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics