Parafin innebygging og tynn snitting av mikrobielle kolonien biofilm for mikroskopisk analyse

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver fiksering, parafin innebygging og tynne snitt teknikker for mikrobiell kolonien biofilm. I forberedt prøver, kan biofilm underlaget og reporter uttrykk mønstre visualiseres mikroskopi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cornell, W. C., Morgan, C. J., Koyama, L., Sakhtah, H., Mansfield, J. H., Dietrich, L. E. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. J. Vis. Exp. (133), e57196, doi:10.3791/57196 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Snitting via parafin innebygging er en bredt etablerte teknikk i eukaryote systemer. Her gir vi en metode for fiksering, innebygging, og skjæring av intakt mikrobiell kolonien biofilm bruker perfused parafinvoks. For å tilpasse denne metoden for bruk på kolonien biofilm, vi utviklet teknikker for å opprettholde hvert utvalg på sin vekst substrat og laminering det med en agar overlayer, og lagt lysin etappe, den stabiliserende løsningen. Disse optimaliseringer bedre eksempel oppbevaring og bevaring av micromorphological funksjoner. Prøver forberedt på denne måten er mottagelig å tynne snitting og tenkelig av lys, fluorescens og overføring elektronmikroskop. Vi har brukt denne teknikken kolonien biofilm Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisog Vibrio cholerae. Det høyt detaljnivået som er synlig i prøver generert av denne metoden, kombinert med reporter belastning engineering eller bruk av bestemte fargestoffer, gir spennende innblikk i fysiologi og utvikling av mikrobielle samfunn.

Introduction

De fleste mikrober har kapasitet til skjemaet biofilm, holdt samfunn av celler sammen av egenproduserte matriser. Biofilm kan dyrkes i mange typer fysiske oppsett, med ulike regimer av nærings og underlaget bestemmelsen. Konkrete analyser for biofilm formasjon pleier å gi reproduserbar flercellet strukturer og felles arkitekturer observeres for phylogenetically ulike arter på fellesskapet eller makroskopisk nivå. Når mikrober dyrkes som kolonier på solid medium under en atmosfære, makroskopisk morfologi formidler informasjon om kapasiteten for matrise produksjon og ofte korrelerer med andre trekk 1,2,3. Den interne arkitekturen i mikrobiell kolonier gir også hint om biofilm-spesifikke kjemi og fysiologi, men har vært vanskelig å karakterisere. Siste programmer cryoembedding og og kryosnitt teknikker bakteriell koloniene har aktivert bildebehandling og visualisering av spesielle funksjoner på enestående oppløsning 4,5,6. Men har studier med dyr tissue vist at parafininnstøper gir overlegen bevaring av morfologi sammenlignet med cryoembedding 7 og har blitt brukt til å visualisere bakterier i vev 8,9. Derfor har vi utviklet en protokoll for fiksering, parafin innebygging og tynn snitting av mikrobielle kolonien biofilm. Her vil vi beskrive utarbeidelse av Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biofilm tynne snitt 10,11, men vi har også lykkes brukt denne teknikken biofilm dannet av bakterier Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, og Vibrio cholerae12.

Prosessen med innebygging av parafin og tynn-snitting biofilm følger en enkel logikk. Først er biofilm omsluttet av et lag av agar å bevare morfologi under behandling. Andre, innkapslet-biofilm senkes i et bindemiddel til krysskobling makromolekyler og bevare micromorphology. Dette er så dehydrert med alkohol, fjernet med en mer ikke-polar løsemiddel og så infiltrert med flytende parafin voks. Når tok er prøvene innebygd i voks blokkerer snitting. Inndelinger er kuttet, montert på lysbilder og deretter utvannet for å returnere dem til en mer naturlig tilstand. Fra dette punktet, kan de være beiset eller dekket i montering medium for mikroskopisk analyse.

Denne protokollen gir tynne snitt av mikrobielle biofilm egnet for histologiske analyse. Kolonien biofilm underlag er synlige når tynne snitt tilberedt med denne metoden er fotografert av * lys. Biofilm kan også dyrket på medier som inneholder fluorescerende flekker spesifikke for enkeltfunksjoner eller farget ved rehydrering trinn, umiddelbart før montering (trinn 9.5-9.6). Til slutt, mikrober kan være konstruert for å produsere fluorescerende proteiner i et grunnleggende eller regulert mote tillater i situ rapportering av cellen distribusjon eller genet uttrykk innenfor disse samfunnene. Vi har brukt disse metodene til å bestemme kolonien biofilm dybde, celle distribusjon, matrix distribusjon, vekst mønstrene og spatiotemporal genuttrykk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vekst av Pseudomonas aeruginosa kolonien biofilm

  1. Utarbeidelse av Medium-Bilayer plater
    1. Forberede en 10 g/L tryptone, 10 finans agar (se Tabell for materiale) løsning i deionisert vann.
    2. Autoclave i 20 min. kult å 50-60 ° C i et vannbad.
    3. Hell 45 mL av agar-tryptone løsningen i en 100 x 100 mm firkantet rett (se Tabell for materiale) med en 50 mL konisk rør. Tillate agar å stivne (~ 20-30 minutter). Hell andre, 15 mL lag på toppen første laget. La stivne over natten, fjerne kondens fra lokkene om nødvendig ved å tørke med en lofri vev.
  2. Småblødninger kolonien biofilm
    1. Strek toner av interesse fra fryseren aksjer på LB agar plater13 og ruge i mørket 12-16 h på 37 ° C og 80-100% relativ fuktighet.
    2. For hver stamme eller kopiere, kan du bruke en enkelt koloni å vaksinere 2 mL LB og ruge i mørket 12-16 h på 37 ° C med skjelvende på 250 rpm.
    3. Sub kultur fortynne 1: 100 til frisk LB og rugende i mørket 2,5-3 h på 37 ° C med skjelvende på 250 rpm.
    4. Måle optisk densitet bruker et spektrofotometer og justere med sterilt LB å oppnå en celle hjuloppheng med et OD500 nm på ~ 0,5.
    5. Avhengig av ønsket kolonien størrelse, Pipetter 2,5-10 µL av cellen suspensjon på en medium-bilayer plate (forberedt i trinn 1.1) og la stedet tørke for ~ 20 min. forlate petri lokket gløtt nær åpen flamme kan gjøre tørking.
    6. Inkuber spot kolonier ved 25 ° C og 80-100% relativ fuktighet, i mørket i opptil 4 dager.

2. tilberedning av etappe, den stabiliserende

  1. Forberede etappe, den stabiliserende løsningen ved eksempel høsting. Fortynne 37% formaldehyd (FA) i 1 x PBS til en siste konsentrasjon på 4% FA.
    FORSIKTIG: FA er flyktig og giftige. Bruk verneutstyr og arbeid i et godt ventilert avtrekksvifte.
  2. Umiddelbart før bruk oppløse L-lysine hydrochloride i 4% FA (forberedt i trinn 2.1) ved romtemperatur å en final konsentrasjon av 50 mM L-lysine HCl.

3. direkte bruk av bindemiddel til koloni Biofilm [valgfrie]

Merk: Vi har funnet at biofilm morfologi opprettholdes best når agar overlegget legges før fiksering. Men utgjør dette trinnet også en endring i miljøforhold som kan påvirke genuttrykk. Fluorescerende reporter uttrykk mønstre bør derfor kontrolleres ved hjelp av en egen protokoll som fiksering trinnet utføres før en agar overlegg, som beskrevet her.

  1. Pipetter bindemiddel i trinn 2 direkte agar overflaten rundt koloniens kant, slik at det å nå koloniens periferi uten submerging det ved fiksering, og arbeider i et godt ventilert avtrekksvifte. Gjelde bare så mye bindemiddel som kreves for å fullt ut Omgi kolonien, ca 500 µL. Tillat bindemiddel å spre inn i kolonien og den omkringliggende agar.
  2. Når bindemiddel er fullstendig absorbert inn i kolonien og omkringliggende media, ca 20-30 min, og gjenværende FA er ikke lenger synlig på tallerkenen, gjentar du trinn 3.1. Tillate denne bindemiddel å spre inn i kolonien og den omkringliggende agar.
  3. Når bindemiddel er fullstendig absorbert inn i kolonien og omkringliggende gjenta media trinn 3.1, denne gangen bruker bindemiddel på overflaten av kolonien direkte. Tillate denne bindemiddel å spre inn i kolonien og den omkringliggende agar, fortsetter til trinn 4 bare etter alle etappe, den stabiliserende er absorbert og er ikke lenger synlig på tallerkenen.

4. overliggende kolonier med Agar

  1. På dagen for fiksering, Forbered en 10 g/L agar løsning i deionisert vann og autoklav i 10-20 minutter å oppløse. Kule i et vannbad til 50 grader.
  2. Forsiktig helle 15 mL av agar løsningen vekst middels og koloni. Tillate agar å danne en gel i romtemperatur i 5 min (figur 1B).
  3. Bruk en skarp barberblad til å kutte en firkant, 3-lags chuck med kolonien laminert mellom de øverste to lagene. Hvis forbereder flere eksempler, kontrollerer du at hver chuck kuttes til en tilsvarende størrelse.
  4. Fjern overflødig agar fra kolonien inneholder chuck.
  5. For å løfte to fukting av agar (inneholder kolonien) fra det nederste laget av chuck (figur 1 c), våt flate leder av en slikkepott i 1 x PBS eller vann og forsiktig inn mellom øverste og nederste lagene. Laminert kolonien bør skille fra det nederste laget. Vær forsiktig med å forvrenge eller bøye laminert kolonien når løfte den fra sin base.

5. fiksering

  1. Arbeider i et godt ventilert avtrekksvifte, øyeblikkelig overføre laminert kolonien (dvs. 2-lags chuck) i en innebygging kassett (se Tabell for materiale), merket med en kjemisk bestandige merking. Plasser innebygging kassetten i et glass lysbilde mailer (se tabell av materialer) som inneholder bindemiddel i trinn 2.1-2.2. Kontroller at det er ingen luftbobler fanget inne innebygging kassetten.
  2. Inkuber eksemplet i bindemiddel overnatter i mørket ved romtemperatur.

6. prøve behandling: Buffer vask, dehydrering, Clearing og infiltrasjon

  1. Overnatting fiksering, vaskes prøven to ganger i 1 x PBS 1t hver. For best resultat, automatisere reagens homogenisering bruker spinn funksjon av en automatisk basert vevsprosessor (se tabell av materialer) satt til en lav innstilling. Hvis ingen prosessoren er tilgjengelig, kan behandlingen kjøres manuelt.
  2. Følg buffer vask av dehydrering gjennom en gradert rekke etanol (EtOH) fortynninger i 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) for 1 h hver ved romtemperatur.
  3. Tørke i tre vasker 100% EtOH 1 h hver ved romtemperatur.
  4. Fjern dehydrert eksemplet i tre vasker 100% orange oljebasert clearing agent (se tabell av materialer) 1 h hver ved romtemperatur.
  5. Infiltrere ryddet prøven to ganger med flytende parafin voks (se Tabell for materiale), oppvarmet til 55˚C, 2 h hver.

7. innstøping

  1. Fyll en voks mold med flytende parafin voks oppvarmet til 55 grader. Bruk en oppvarmet, flat slikkepott til å raskt overføre infiltrere chuck fra innebygging kassetten i voks mold, sikre at chuck hviler parallell til bunnen av mold. Unngå å bruke overdreven trykk på chuck. Voks former kan være tilpasset 3D trykt, eller kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale).
  2. Tillate voks å størkne natten på 4 grader. Prøver støpt i solid voks lagres på ubestemt tid på 4 grader.
  3. Når voksen har styrket, avgiftsdirektoratet prøven fra formen og trim overflødig voks fra rundt prøven med et barberblad. La overflødig voks strekker seg fra den ene enden av prøven, parallelt med flyet snitting som kan brukes å klemme den til mikrotomen (se Tabell for materiale). Også la en kappe av voks, ca 1 mm tykk, rundt prøven og glatt dens ansikter.

8. snitting

  1. Varme et vannbad til 42 grader. Fast prøven inn mikrotomen med overflaten av kolonien orientert vinkelrett til kanten av bladet (se Tabell for materiale).
  2. Trim prøven i 50-µm intervaller inntil ønsket flyet av kolonien er nådd, som deler hentes.
  3. Skjær et bånd av ønsket antall 10 µm tykke snitt med en mikrotom en snitting hastighet på 75-80 rpm og en klaringsvinkel av 6-10˚. Bruk en tynn pensel koble båndet fra bladet.
  4. Bruke en dråpe vann på spissen av en Pasteur Pipetter (foretrukket) eller tang, forsiktig overføre båndet til vannbad. Være forsiktig for å unngå overtrykk luftbobler under delen.
  5. Umiddelbart setter inn et lysbilde i vannbad og plasser den under båndet i 45˚ vinkel.
  6. Trykk den smale kanten på transferfolien i lysbildet, bare under frostet etiketten. Båndet skal følge.
  7. Dra lysbildet av vannbad, justere vinkelen til bli vinkelrett på overflaten av vannet, og slik at båndet skal ligge flatt mot lysbildet langs. Unngå overlapping overflødig vann under båndet.
  8. Forsiktig stå lysbildet på en absorberende bomullsklut vev, wicking overflødig vann fra delen.
  9. Lå lysbildet på et papirhåndkle og la dem tørke i romtemperatur over natten i mørket. Lysbilder kan lagres på ubestemt tid på 4 grader i mørket.

9. varme-festing, rehydrering og montering

  1. Varm en flatet kokeplate til 45 grader. Varme lysbildet i 30-60 minutter. Voksen blir delvis smeltet og flat mot lysbildet.
  2. Forsiktig løfte lysbildet fra kokeplate og legger den flatt på en jevn og jevnet, romtemperatur overflate, benytter seg å sikre at smeltet voks ikke trekke på hver side av lysbildet til voksen stivner (~ 1 min).
  3. Bruker et glass lysbilde mailer, de voks lysbilder i fire vasker av oppryddingen agent i 5 minutter hver, med en Büchner aspirator fjerne løsningen mellom vasker.
  4. Vask lysbildene tre ganger i 100% EtOH for 1 min.
  5. Rehydrate lysbildene i en gradert rekke etanol i omvendt rekkefølge av behandling (95%, 70%, 50% og 25%) for 1 min hver etterfulgt av to 1-min vasker i 1 x PBS.
  6. Umiddelbart montere delene i et Tris-bufret montering medium (se Tabell for materiale) og bruke en dekkglassvæske, unngå innføring av luftbobler. Tillat montering middels til danner over natten i romtemperatur.
  7. Når polymerized, sel dekkglassvæske på lysbildet med klart neglelakk. Forseglet lysbilder lagres på ubestemt tid i mørket på 4 grader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden genererer biofilm tynn-deler der distinkte morfologiske egenskaper og soner av genuttrykk kan avbildes DIC, fluorescens mikroskopi og TEM. Mens DIC bildevisning på en 40 X oljeobjektiv nedsenking kan være tilstrekkelig til å vise noen morfologiske funksjoner (figur 2E), vi har funnet at fluorescens mikroskopi av stammer utviklet constitutively uttrykke fluorescerende protein gir forbedret visualisering av cellen distribusjon i prøven (figur 2D). Bilder av enkelte deler kan være sydd sammen å generere et tverrsnitt av hele kolonien (figur 2B) og gi kontekst lokalisering av strukturelle funksjoner innen generell morfologi på makroskopisk nivå (sammenlign Figur 2A, B og C). Morfologiske funksjoner og fluorescerende signaler kan måles ved hjelp av tenkelig programvare14. Strukturer i biofilm eller overganger mellom soner av genuttrykk kan deretter være korrelert med distribusjoner av metabolitter eller kjemiske graderinger11 .

Denne protokollen kan endres og tilpasses på flere måter. Bruk belastning konstruert uttrykke fluorescerende protein under kontroll av en bestemt promoter gjør visualisering av fordelingen av genuttrykk (figur 3A). Kolonier kan dyrkes på medium som inneholder fargestoffer, eller fargestoffer kan legges til etter skjæring, til stain bestemt polysakkarider (tall 3B og C). Endelig, prøver forberedt en modifisert versjon av denne protokollen kan undersøkes av TEM (figur 3D) å tillate visualisering med høyere oppløsning enn aktiveres av DIC eller fluorescens mikroskopi.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk viser oppsettet for kolonien vekst før fiksering.
(A) kolonier dyrkes på to lag med agar-befestet oppblomstringen medium (topp og bunn) og (B) er så kledde med et ekstra lag (overlegg), som bevarer kolonien morfologi. (C) kolonien klemt mellom overlegg og øverste laget er så skilt fra det nederste laget for videre behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Micromorphological funksjoner og YFP fluorescens i tverrsnitt av parafin-embedded kolonier.
Representant dataene for en Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz koloni15 constitutively uttrykke YFP og vokst for 3 dager på 1% tryptone, 1% agar inneholder Kongo rød og Coomassie blå. (A) topp-Vis, fluorescens bildet viser halvparten av en koloni før fiksering. (B) tverrsnitt av hele kolonien etter parafin-innebygging. Eske området ble avbildet med en 10 X linsen (C). Innrammet område c ble deretter fotografert med en 40 X olje nedsenking linsen fluorescens (D) og DIC (E). Skala barer representerer 2 mm (A), 500 µm (B) og 100 µm (C-E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Reporter uttrykk, før og etter farging av biofilm funksjoner og TEM bildebehandling av parafin-embedded kolonien biofilm prøver.
(A) mexGPr-GFP reporter fluorescens i en P. aeruginosa PA14 koloni dyrket i 3 dager på 1% tryptone, 1% agar. (B) fluorescens bundet Kongo Red i en P. synxantha koloni dyrket i 5 dager på et medium som inneholder fargestoff. (C) fluorescens Wisteria floribunda Lektiner flekken for Pel polysakkarid i en P. aeruginosa PA14 Δphz koloni (vokst for 2 dager på 1% tryptone, 1% agar inneholder Kongo rød og Coomassie blå), brukt etter snitting. (D) TEM bildet av en P. aeruginosa PA14 Δphz koloni (vokst for 3 dager på 1% tryptone, 1% agar inneholder Kongo rød og Coomassie blå), og behandles ved snitting via parafininnstøper *. Skala linjen representerer 40 µm (AB), 20 µm (C) og 5 µm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

* Dette eksemplet ble behandlet for snitting via parafininnstøper gjennom trinn 4 ovenfor protokollen, utelater trinnene 4.1-4.3, og deretter behandles separat for TEM analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Innebygging av parafin og tynn-snitting vevsprøver er en klassisk histologiske teknikk som lar avbilding av mikro-morfologisk strukturer er vanlig på eukaryote vev og brukes med en viss suksess på mikrobiell prøver8 ,9. Mens cryoembedding gir sterk oppbevaring av endogene og immunofluorescent signal, anbefales parafin innebygging generelt som det gir bedre bevaring morfologi16. Tilpasse denne metoden skal mikrobiell biofilm, fokuserte vi på egenskaper som er unike for systemet. Cellene og matrise av vev er ofte holdt sammen relativt robust mens biofilm tendens til å være mer delikat; vi derfor optimalisert rutinemessig fiksering og voks innebygging for å maksimere eksempel oppbevaring. Opprettholde prøven på sin vekst substrat og overliggende kolonien med agar umiddelbart før fiksering sikrer at prøven ikke er tapt fra toppen eller bunnen. Imidlertid kan overliggende kolonier med agar som er for varmt skade koloniene, så ekstra forsiktighet bør utvises i dette trinnet.

Fixation er et kritisk punkt for beholder strukturen gjennom harde dehydrering, fjerne, og infiltrasjon trinn kreves for parafininnstøper. Vi fant at lysin-formaldehyd fiksering beste beholder integriteten til prøven. Løselig lysin, en diamine, kan reagere med aldehyder å danne krysskoblet polymerer og har blitt foreslått å forsterke exopolymeric substans (EPS) mot mekanisk fornedrelse17,18.

Vi har observert at bakgrunnen fluorescens avtar med påfølgende vasker i oransje oljebasert clearing agent, eller gjennom langvarig eksponering, under eksempel rehydrering (trinn 9.3). Over behandling av clearing-agenten kan imidlertid føre sprø prøver som er vanskelige å paragraf19. Det kan være nødvendig å justere volum eller antall vasker å gjenspeile voks under hver utvanning. Økt bakgrunn fluorescens kan likeledes oppstå fra forurensning av vev behandling reagenser, der voks, som er litt autofluorescent, er enten helt eller delvis blandes i clearing løsemiddel eller etanol brukes i fremgangsmåten (trinn 6.1-6,4). dessuten vi har funnet at etanol reduserer reporter signal, og det er avgjørende å re utgjør fluorophore i to vasker av PBS før montering (trinn 9.5-9.6).

Denne metoden tillater også lokalisering av grunnleggende og Promotøren-drevet fluorescens oppløsning celler. Men anbefaler vi forsiktighet når du bruker denne metoden til å tolke genuttrykk. Overlegg trinnet i denne protokollen (trinn 4.2) brukt før fiksering på 50 grader, presenterer en betydelig miljøendringer i forhold til de opprinnelige veksten forholdene som kan påvirke genet uttrykk mønstre. Det kan være nyttig å kontrollere uttrykket mønstre ved å bruke bindemiddel kolonien direkte, umiddelbart før strømme overlegg, men til en pris på morfologi (valgfritt trinn 3.1 3,3).

En annen faktor som påvirker tolkningen av fluorescens er topografien på selve inndelingen. Forskjellige regioner i biofilm kan vise varierende grad av strukturell integritet og være mer eller mindre mottakelig for bevaring via fiksering, avhengig som eventuelt funksjonelle grupper disse komponentene kan bidra til etappe, den stabiliserende cross-linking 20., inndelinger kan miste biomasse uforholdsmessig fra delen overflaten når overgang fra én morfologiske eller metabolske sone til en annen langs koloniens z-aksen. Dette kan tas av imaging en intakt fokal stykke delen med AC confocal mikroskop.

I tillegg bruker denne teknikken stammer konstruert uttrykke fluorescerende proteiner, har vi undersøkt micromorphological funksjoner ved overføring elektronmikroskop (TEM) og i biofilm prøver med bestemte fluorescerende fargestoffer (figur 3A ). Jennings et al. nylig beskrevet en bestemt fargestoff Pel, det store polysakkaridet produsert av P. aeruginosa PA14 biofilm 21. Som beskrevet i de protokollen og representant resultatene, lar programmet denne fargestoff til deler for visualisering av Pel distribusjon i PA14 koloni biofilm høy oppløsning (Figur 3 c) 3. Derimot fluorescerende fargestoffer som Kongo røde legges til vekstmediet og fotografert etter snitting (figur 3B). Anvendelsen av et overlegg bevarer også kolonien biofilm morfologi og celle struktur gjennom behandling for TEM (figur 3D).

Optimalisert metoden beskrevet her gjør utarbeidelse av kolonien biofilm for snitting via parafininnstøper, der endogene signal og funksjoner eller kompleksbundet fargestoffer kan være lokalisert i vivo med førsteklasses oppløsning samtidig prøve tap og bevare opprinnelige kolonien makro - og mikro-morphologies. Vi erkjenner at det kreves omfattende innsats, tid og reagens bruk for denne metoden. Men føler vi disse ulempene er motvirkes av graden av morfologiske bevaring, oppløsning i situ fluorescens og amenability før og etter farging prosedyrer eller alternativ behandling strategier (som forberedelse til TEM) by av denne teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NSF karriere AWARD 1553023 og NIH/NIAID award R01AI103369.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 3/4" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A Purchased from univeristy biostores 
Agar  Teknova  A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask  Pyrex 5340 Purchased from univeristy biostores 
Chemically-resistant Marking Pen VWR 103051-182 Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish  ******** ******** Store bought
Congo Red Indicator Grade VWR AAAB24310-14 Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue  VWR EM-3340 Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)  Fisher Scientific 50 247 04 Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold  ******** ******** 3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)  Electron Microscopy Sciences 70182
Ethanol 200P Decon Labs, Inc.  2701 Purchased from univeristy biostores 
Fine-tipped Brush ******** ******** Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm Fisher Scientific 12-519-21C
Glass Rehydration Mailer  Ted Pella 21043 20 slide mailer 
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent  Fisher Scientific 50 899 90150 Manufacturer: National Diagnostics 
Histosette, Embedding Casette Fisher Scientific 15 182 701A
L-lysine hydrochloride  Fisher Scientific BP386 100
Low Profile Microtome Blades Fisher Scientific 22 210 048 Manufacturer: Sturkey 
Micropipette  VWR 89080-004 Promo-pack
Micropipette Tips  See comments section See comments section p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome  Fisher Scientific 905200U/00016050 Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) Ricca Chemical RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax) VWR 15159-486 Manufacturer: McCormick Scientific 
Petri Dishes Square 100x100x15mm Laboratory Disposable Products  D210-16
Potassium chloride  EMD Chemicals  PX1405-1 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Potassium phosphate  Fisher Scientific P380-500 Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Razor Blades  VWR 55411-050 Purchased from univeristy biostores 
Slide Warmer  Fisher Scientific NC0865259 NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride  VWR 0241-1KG Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Sodium phosphate  VWR BDH9296.500 ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house 
Suprafrost Histology Slides  Fisher Scientific 12-544-2
Tissue Flotation Water Bath  Fisher Scientific NC0815797 Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor  Fisher Scientific 813160U/Q#00009061 Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone  Teknova  T9012
Yeast extract Teknova  Y9010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51, (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4, (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195, (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81, (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. 171538 (2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186, (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321, (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68, (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33, (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290, (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, (36), 11353-11358 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics