Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

Biology
 

Summary

Det här protokollet beskriver hur att visualisera den övergående DNA packningen i cyanobakterier. Synkron odling, övervakning av fluorescensmikroskopi, snabb nedfrysning och hög spänning cryo-elektron tomografi används. Ett protokoll för dessa metoder presenteras och diskuteras framtida tillämpningar och utvecklingen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Murata, K., Kaneko, Y. Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. Exp. (137), e57197, doi:10.3791/57197 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det här protokollet beskriver hur att visualisera den övergående DNA packningen i cyanobakterier. DNA packning är en dramatisk cytoplasmiska händelse nyligen funnit för att inträffa i vissa cyanobakterier innan celldelningen. På grund av den stora cellstorleken och övergående karaktär är det dock svårt att undersöka strukturen i detalj. För att övervinna svårigheterna, först produceras DNA packning reproducibly i Cyanobakterien Synechococcus elongatus PCC 7942 av synkron kultur med 12 h varje ljus/mörk cykel. Andra är DNA packning övervakas av fluorescensmikroskopi och fångas av snabb nedfrysning. Tredje, detaljerad struktur av DNA packas celler visualiseras i tre dimensioner (3D) av högspänning cryo-elektron tomografi. Denna uppsättning metoder är allmänt tillämplig att undersöka övergående strukturer i bakterier, e.g. celldelning, kromosomsegregering, phage infektion osv., som övervakas av fluorescensmikroskopi och visualiseras direkt av Cryo-elektron tomografi vid lämpliga tidpunkter.

Introduction

DNA packning är en dramatisk cytoplasmiska händelse som har identifierats i vissa cyanobakterier. När Synechococcus elongatus var odlade under 12 h varje ljus/mörk cykel, DNA syntes sammandrag i slutet av perioden ljus, som var klart avvikande från utseendet på den andra tiden pekar1. Det har föreslagits att denna process styrs av en dygnsrytm klocka baserat på Kai proteiner2. Seki et al. har rapporterat att DNA färgas med Hoechst 33342 var packas i S. elongatus celler mot slutet av perioden ljus och visade en vågig rod-form i fluorescens Mikroskop. Kompakterade DNA separeras sedan i två i mitten av stången som cellen delas, och slutligen återvände till en enhetlig normalfördelningen i varje dotter cell3. Men hämmade dess övergående natur och stor storlek för elektronmikroskopi strukturell analys. Murata et al. kombinerat flera metoder, inklusive synkron kultur, fluorescensmikroskopi, snabb nedfrysning och hög spänning electron cryo-tomografi (cryo-HVET), och lyckades identifiera strukturen av övergående DNA kompaktering, inklusive kineticsen av polyfosfat organ (PPBs)4. Manuskriptet innehåller visuell förklaring av sådant svårt material i detalj genom att kombinera de experimentella rutiner.

S. elongatus har en kapsel form, en längd på 2 till 5 µm, en bredd på om 0,5 µm och perfekt DNA kompaktering visas i levande celler endast för en mycket kort tid. Därför, de strukturella förändringar som sker i den Cyanobakterie DNA-packningen var okända i detalj. För att undersöka dessa strukturer genom elektronmikroskopi, är det nödvändigt att övervinna två tekniska problem. En är observationen av sådana ett tjockt exemplar av hela bakterien på nära infödda villkor, och den andra är snabb fixering av en dynamisk struktur. När det gäller det första problemet beror oelastisk genomsnittlig gratis sökvägen (iMFP) av elektroner på den accelererande spänningen av elektronmikroskop5. I ett transmissionselektronmikroskop (TEM) på 300 kV, det är mindre än 350 nm. Till exempel när en is-embedded Cyanobakterie (preparatet tjocklek ≈ 600 nm) observeras i 200kV TEM (iMFP ≈ 250 nm), strukturerna inuti cellen är svåra att observera. Däremot 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) kan ge och bild av cytoplasmisk strukturen i hela cellen (figur 1). I detta protokoll, som en del av lösningen, en hög spänning elektronmikroskop (HVEM) vid en accelererande spänning på 1 MV var anställd. Faciliteter som implementerar HVEM är dock begränsade i världen. Möjliga alternativa lösningar diskuteras också i avsnittet diskussion. Det andra problemet löstes av cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Detta är ett kraftfullt verktyg för att visualisera dynamiska strukturer på nära inhemska förhållanden, där preparatet är snabbt nedfruset i flytande etan använder en snabb frysning enhet, och det frusna ögonblicket observeras direkt med ett minimum av ändringar6. Kombinera med datortomografi, kan en ögonblicksbild av tredimensionella (3D) strukturer rekonstrueras från tilt serie7. I detta experiment, DNA packning reproducerades i S. elongatus använder synkron kultur under 12 h varje ljus/mörk cykel, och tidpunkten för frysning av provet bestämdes av övervakning i fluorescens Mikroskop.

De metoder som beskrivs här är allmänt tillämpliga på studiet av dynamiska strukturer i bakterieceller, e.g. celldelning, kromosomsegregering och phage infektion, och har en potential att öppna nya vägar i mikrobiologisk forskning.

Protocol

1. synkron kultur av cyanobakterier

  1. Kultur S. elongatus PCC 7942 på steriliserade BG 11 tallrik (i en 9 cm steril plast petriskål) innehållande 1,5% (w/v) agar och 0,3% (w/v) natriumtiosulfat8.
  2. Lägg plattorna i en tillväxt kammare vid 23 ° C med låg intensitet av 50 µE/m2/s och föremål för 12 h ljus/12 h mörka cykler.
  3. Överföra cellerna på färska BG11 agarplattor en gång i veckan.
    Obs: Kulturerna på ägarn visas som gröna band av aktivt prolifererande celler efter en vecka under detta kultur-villkor.
  4. Ta gröna klumpar av celler med en flamma steriliserad Trådögla och strimma cellerna på färska BG11 agar plåt. Gör detta på en ren bänk.

2. övervakning av fluorescensmikroskopi

  1. Använda celler odlade på agarplattan för 6 dagar för att iaktta DNA packning. Samla celler från plattan i slutet av perioden ljus genom att hälla 1 mL 0,2 M sackaroslösning över cellerna. Upprepa hälla lösningen på cellerna så att de flesta av cellerna samlas. Över upphängd-cell lösningen till en micro tube för DNA färgning.
  2. Lägg till DNA färgning färgämne (t.ex. Hoechst 33342) lösning 500 µL av den svävande cell lösningen i en mikro röret till en slutlig koncentration på 1 µg/mL. Sedan, hålla röret i mörkret i 10 min.
  3. Centrifugera i 1 minut vid 2000 x g till sediment cellerna. Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 µL av 0,2 M sackaroslösning att få en tät cellsuspension.
  4. Överför 1 µL av lösningen innehållande färgade celler till en bild glas, sätta ett täckglas och observera med fluorescens Mikroskop utrustat med ett UV-filter med ett objektiv med en förstoring på 100 X och nedsänkning olja.
  5. Bekräfta att den DNA-packningen iakttas på denna punkt i de flesta celler och förbereda provet för nästa frysning steg.

3. prov frysning för Cryo-HVET

  1. Konfigurera en avsvalkningspool-frysning enhet. Fyll behållaren med flytande kväve och börja kyla cryo-kammaren efter anslutning tanken och kammare med en Teflon-slang.
  2. Fyll flytande etan i en liten koppar gryta inne i kammaren efter nedkylning kammaren till flytande kväve temperatur. Bära glasögon under drift, eftersom flytande etan är explosiv.
  3. Glow ansvarsfrihet kol-sidan av en holey kol-belagd EM rutnät (holey rutnät) för 30 s vid 50 mA använder en plasma ion bombarder.
  4. Applicera 1 µL BSA gold tracer (15 nm) till holey rutnätet som relaterat markör.
  5. Gälla en 2,5 µL alikvot av celler i DNA packning scenen holey rutnätet. Torka bort överflödig lösning med ett filterpapper. Störta rutnätet i flytande etan med en kolv i steget frysning enheten omedelbart.
  6. Förvaras fryst rutnäten i flytande kväve lagring tills de undersöks.

4. Cryo-HVET

  1. Ställ in HVEM vid en hög spänning på 1 MV.
  2. Montera rutnätet fryst i en cryo-preparathållare för HVEM förhandskyld till-150 ° C med flytande kväve inuti cryo-arbetsstationen och ladda in den i HVEM. Var noga med att undvika kontaminering av is.
  3. Välj imaging område vid lägre förstoring 1, 000 X. Justera höjden eucentric z-axeln.
  4. Tilt preparatet scenen till-60 ° och ta bort motreaktion vippande rotation.
  5. Justera fokus nära målplatsen vid förstoring 10, 000 X. Ange en under fokus 6 till 10 µm av avvikelse från fokuserad bild. För imaging, ställa in dosen till 2 e-2 eller mindre på preparatet i förväg.
  6. Mäta elektron dosen av strömtätheten på skärmen bilden i HVEM. Ta en bild på en elektron film eller digital kamera på samma förstoring som fokuserar processen.
  7. Samla in tilt bilder manuellt genom samma förfarande som i (4.5) från-60 ° till + 60 ° på en tilt vinkel ökning av 2 ° till 4 °.
    Obs: I många moderna elektronmikroskop, är förvärvet av tilt serien automatiserad av kombinationen av en digital kamera. I så fall, följ bruksanvisningen. För negativa filmer, utveckla filmerna för 12 min vid 20° C i en utvecklare tank med en full styrka developer och fixa i en fixare för 10 min. digitalisera filmerna med en upplösning på 4 000 dpi (0,635 nm/pixel på bilden) använder en flatbäddsskanner. När det gäller en digitalkamera, omfattas av de insamlade bilderna direkt till nästa bild bearbetningssteg. Om nödvändigt, minska bildens storlek med en median filter med hjälp av två till fyra binning (storlek minska faktor) och lämplig programvara (t.ex. ImageJ).

5. tomografiska återuppbyggnad

  1. Göra en stack fil från individen luta bilder med hjälp av kommandot ”tif2mrc” eller ”newstack” i IMOD programvara9.
  2. Starta eTomo GUI programvara i IMOD och ställa in bildparametrar för: pixelstorlek, relaterat diameter, Rotera bild, etc. Sedan skapa skript.
  3. Utföra individuella program enligt programvaran i tabeller av material, där serierna tilt är linje med relaterat märkpennor (med en genomsnittlig kvarstående fel mindre än 0,5). Slutligen, rekonstruera en 3D tomogram med SIRT algoritm i IMOD.
  4. Extrahera en region av intresse (ROI) från tomogram och denoise med denoise filter: en Anisotrop diffusion filter i IMOD, bilaterala filter i EMAN10eller en matematisk morfologi filtrera11, etc., med lämpliga parametrar att öka kontrasten.

6. segmentering av funktionen av intresse

Obs: Det förfarande som beskrivs nedan är specifik för den programvara som används (se Material tabell) men andra programvarupaket kan användas i stället. Se deras användarhandboken.

  1. I 3D Viewer-fönstret, öppna filen tomogram på Amira programvara och skapa en OrthoSlice.
  2. Skapa en segmentering-fil genom att välja ett nytt ”Etikettfält” i fönstret Redigeraren för segmentering.
  3. Manuellt spåra gränsa av funktionen av intresse (FOI). Följ FOI genom alla tomogram skivor. För det andra FOI, skapa ett nytt ”material” och upprepa samma operation.
  4. Generera en surface rendering genom att välja menyn ”SurfaceGen”. För att visualisera den segmenterade volymen, Välj menyn ”SurfaceView”. För att flytta, rotera och zooma in 3D-volymen, använda verktygen i 3D Viewer-fönstret.
  5. För automatisk segmentering, använda Magic Wand Tool. Klicka på ett objekt, och justera skjutreglagen i displayen och maskering för att täcka intervallet av värden så att det markeras fullt av dess funktioner.

Representative Results

En exakt synkron kultur under 12 h varje ljus/mörk cykel, visar DNA märkt med Hoechst en enhetlig normalfördelningen i mörka skick (figur 2a). Dock den successivt komprimerar inom cellen under perioden ljus och visas som en vågig rod-liknande struktur (figur 2b) i slutet av perioden ljus. Slutligen, staven delar på center (pilar i figur 2 c) och dess två delar distribueras i dottercellerna (figur 2d). Kompakterade DNA försvinner omedelbart efter celldelning och DNA återgår till en normal enhetlig fördelning.

När en alikvot av celler som innehåller celler i slutskedet av DNA packning överfördes omedelbart till ett holey rutnät och snabb fryst i flytande etan och frysta rutnätet observerades av 1 MV cryo-HVEM, det inre strukturerar av cyanobakterier inklusive DNA, tylakoida membran lager, cellväggar och PPBs, dök upp som en ögonblicksbild vid tidpunkten för frysning (figur 3a). Många celler visade distinkta DNA packning i cellerna (vita pilar i figur 3a), och kan lätt skiljas från normala celler (vit pilspetsar i figur 3b). Några uppvisade en förträngning i mitten av cellerna som förväntat innan celldelningen (gula pilen i figur 3a).

I 3D tomograms, kunde stora organeller i cellen segmenteras; cellvägg, tylakoida membran lager, DNA och PPBs kunde vara distingerat (figur 4). Särskilt var packat DNA åtskilda av en distinkt lucka i cytoplasman där DNA var omgiven av låg densitet material och tylakoida membran lagren var förvrängd längs vågiga staven av kompakterade DNA. Dynamiska beteende PPBs observerades nyligen: i DNA packas celler, många små PPBs sågs att följa DNA, medan de är stora och färre i normala celler. Dessutom de flesta av PPBs verkade som par, och några DNA verkade vara i en process av separation från PPBs. Detta föreslog att PPBs själva är indelade i två av DNA dubbelarbete och funktion som leverantörer av fosfat för DNA-syntesen.

Figure 1
Figur 1. Cryo-EM bilder av is-embedded normala cyanobakterier, S. elongatus PCC 7942 på olika accelererande spänningar. (a) 200kV och (b) 1000kV. Skalstapeln = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensmikroskopi av Cyanobakterien S. elongatus celler. Efter synkron kultur under 12 timme varje ljus/mörk cykler, var celler fläckad med Hoechst 33342. (a) celler efter 2 h för uppkomsten av mörka staten som visar enhetliga DNA märkning. DNA i många celler gradvis kondenseras under perioden ljus. Slutligen bildade en tjock vågiga staven (b) typiska DNA packningsgrad. Efter detta skede kompakterade DNA strukturer snabbt dividerat på deras centrerar (pilspetsar) under celldelning (c), och två fragmenten separeras i dottercellerna (d). Dottercellerna återvände till enhetliga DNA märkning igen under den mörka perioden. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Cryo-HVEM bilden av cyanobakterier inbäddad i amorf ice. (a) visar en raw-bild på 0 ° tilt. Bilder togs i slutet av perioden ljus. Vissa celler Visa vågiga stavformade DNA kroppar liknar eukaryota kondenserade kromosomer (vita pilar). I normala celler uppvisar cyanobakterier en urskiljbar DNA-strukturen inom cytoplasman (vit pilspetsar). Några uppvisar en förträngning i mitten av cellerna som förväntat innan celldelningen (gul pil). (b) xy, xz, yz-skivor av en 3D tomogram. Gula streckade linjerna visar korsningar av skivor. Skalstapeln = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: ultrastruktur av celler som innehåller komprimerad DNA. De viktigaste komponenterna är segmenterade: cellvägg (ljust gul), tylakoida membran (röd) och DNA (blå). (a) visar en z-skiva en 3D tomogram. (b) alla segment. Constrictionen som anger cellseparation visas i mitten av cellen (pil). PPBs modelleras som gult eller orange sfärer; varje orange cirkel representerar motsvarigheten till det närmaste gula området. Skalstapeln = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi har lagt fram en sekvens av protokoll för att visualisera övergående DNA packning i cyanobakterier. Det grundläggande konceptet är liknande till det av korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)12. Dessutom i denna metod, var levande cyanobakterier övervakas av fluorescensmikroskopi, snabbt frusen på EM rutnät och direkt visualiseras med högspänning cryo-elektron tomografi. Som en första ansökan, detaljerad struktur av DNA packas bakterieceller var framgångsrikt visualiseras i 3D. För närvarande detta förfarande är specifika för detta ämne, men den kommer att tillämpas mer omfattande, med modifierad metodik i vissa fall. Här diskuteras fördelarna, begränsningarna och de framtida möjligheterna av denna metod.

En av fördelarna med denna metod är 3D-visualisering av hela cellen. 1 MV HVEM framgångsrikt visualiseras dynamiskt struktur av subcellulär organeller i DNA packas celler. I fina struktur inuti normala celler kan dock inte särskiljas på grund av låg bildens kontrast. Ökande oelastisk och flera spridning i tjocka exemplar suddigare bild13. Noll- och de flesta-trolig-förlust bild filtrering av ett energi-filter kan förbättra bildkontrasten genom att minska inelastiska scattering14,15, men det fungerar inte för exemplar som är tjockare än iMFP. Noll- och de flesta-trolig-förlust topparna minskar drastiskt med preparatet tjocklek. Det är särskilt svårt att få en tillräcklig signal-brus-förhållande för elektron känsliga is-embedded exemplar. Murata et al. har visat att 1MV skanning överföring mikroskopi (STEM) ger högre bildens kontrast än en ljusa fältet bild i plast inbäddade jästceller med 5 µm tjocklek, där avbildakontrasten ges primärt av amplitud kontrast13 . Det förväntas dock att effekten av indirekt skada på högre accelererade elektroner skapar en annan begränsning till bestrålning dos för skada känsliga cryo-exemplar16. Tillämpningen av Volta och Zernike fas plattor17,18 för HVEM kan kunna minska knock-on skador genom att minska den totala dosen i framtiden. En annan begränsning att använda HVEM för tjocka exemplar kommer från det faktum att användaren som ger HVEM är knappa över hela världen.

Använda en alternativ metod för att iaktta tjocka exemplar, cryo-stammen tomografi 300 har kV visat hög kontrast bilder på fryst-hydrerad exemplar med tjocklek överstiger flera hundra nanometer19. För att hämta faskontrast cryo-Stem, har pthychographic elektronmikroskopi också införts, där fas plattan i kondensorn linsen införlivar en fas-modulerat diffraktion till en pixelated 2D detektorn20. Bilderna hämtas genom beräkning från flera diffractions. För direkt och snabb 3D cryo-imaging stora Native frysta prover, cryo-FIB-SEM kan också använda21, där seriell sektionering med en fokuserad ion beam och blockera ansikte imaging tillämpas för imaging fullt hydrerad frysta prover. Även om dessa tekniker utöka visning av biologiska prover, det är svårt att hitta platsen för bakterier, t.ex. märkt bakterier, eftersom målet är helt under isen och inte kan identifieras innan trimning.

DNA-komprimering ger en tydlig struktur i cyanobakterier. DNA packas celler är lätt skiljer sig även utan att vara missfärgade på grund av en stor täthet partiskhet i celler som inte är närvarande i normala celler. Att visualisera fler lokala evenemang i cellen, är det dock nödvändigt att överföra fluorescently märkt ROI i elektronmikroskopet. För korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM), är ljusmikroskop och elektronmikroskop bilder generellt korrelerade med fluorescerande latex pärlor eller kvantprickar på EM finder rutnät12. Märkning partiklarna måste vara av hög elektrontätheten förutom fluorescens. De kan exakt och tillförlitligt korrelerar ståndpunkterna mellan de två bilderna. Dessutom kan bekräftar märkta området med kryo-Ljus microscopy, fullständig överlappning av ROI uppnås mellan två Mikroskopen. När kännetecknar mer detaljerade strukturella händelser i DNA kompaktering, blir dessa partiklar och cryo-ljus mikroskopet ett oumbärligt verktyg för en mer robust och exakt korrelation i framtiden.

Denna artikel visar hur att karakterisera DNA packning i cyanobakterier övergående struktur genom en kombination av synkron kultur, fluorescensmikroskopi och högspänning cryo-elektron tomografi. Detta protokoll fokuserar på observation av kompakterade DNA. Genom att kombinera denna metod med annan ny teknik som nämns ovan, det kommer vara möjligt att undersöka processen av DNA compaction mer i detalj och passande modifierade metoder är allmänt tillämpliga på andra dynamiska strukturella händelser i bakterier.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgements

Tammo Reisewitz tack för kritisk läsning av manuskript, och både Mako Hayashi och Sayuri Hagiwara för noggrann odling och observation av cyanobakterier, Yoshitaka Kimori för bildbehandling, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki och Miyoko att författarna Nagayoshi för att hjälpa med segmentering av strukturerna. Detta arbete stöds av programmet Collaborative studie av det nationella institutet för fysiologiska vetenskaper (NVP) till Y.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 solution Dojindo 346-07951 1mg/mL in H2O
Agar Powder (for plant culture) Wako 016-11875
Boric acid Wako 027-02192 99.5%
Manganese chloride tetrahydrate Wako 139-00722 99%
Zinc sulfate heptahydrate Wako 264-00405 99.5%
Sodium molybdate Wako 196-02472 99%
Copper sulfate pentahydrate Wako 039-04412 99.5%
Cobalt nitrate hexahydrate Wako 031-03752 99.5%
Sodium nitrate Wako 191-02542 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Wako 131-00405 99.5%
Calcium chloride dehydrate Wako 031-00435 99.5%
Citric acid Wako 036-05522 98%
EDTA-2Na Dojindo 343-01861 99.5%
Sodium carbonate Wako 197-01581 99.8%
Potassium phosphate dibasic Wako 164-04295 99%
TES (Good’s buffer) Dojindo 344-02653 99%
Ferric ammonium citrate Wako 092-00802 1st Grade
Sodium thiosulfate pentahydrate Wako 197-03585 99%
BSA gold tracer 15nm Aurion 215.133
Quantifoil EM grid Quantifoil MicroTools R3.5/1 Copper grid
Electron films Kodak SO-163
Developer Kodak D19
Fixer Kodak Rapid fixer Solution
Filter paper Whatman Grade 1
Growth chamber NKsystem LH-100SP
Fluorescent microscope Nikon ECLIPSE 50i
High voltage TEM HItachi H1250M
Cryo-specimen holder for HVEM Gatan
plunge-freezing device Leica EM CPC
Plasma Ion bombarder Vacuum device PIB-10
Liquid nitrogen storage Taylor-Wharton 25LDB
Developing tank Dosaka EM TB-3-75
flatbed scanner Nikon Coolscan 9000ED
Segmentation software FEI Amira https://www.fei.com/software/amira
Tomographic Reconstruction software eTOMO http://bio3d.colorado.edu/imod

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103, (22), 8564-8569 (2006).
  2. Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
  3. Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16, (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
  4. Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934 (2016).
  5. Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120, (3), 276-308 (1997).
  6. Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202, (3), 407-419 (2013).
  7. Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176 (2017).
  8. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
  9. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
  10. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
  11. Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
  12. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).
  13. Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
  14. Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
  15. Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148, (3), 297-306 (2004).
  16. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35, (6), 399-409 (2004).
  17. Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111, (44), 15635-15640 (2014).
  18. Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18, (8), 903-912 (2010).
  19. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11, (4), 423-428 (2014).
  20. Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics