मानव टाप एंटीबॉडी के लिए Electrochemiluminescence परख

Immunology and Infection
 

Summary

यहां, हम electrochemiluminescence (ECL) परख का उपयोग मानव टाप एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए तरीके प्रस्तुत किया । प्रोटोकॉल, प्रकार की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया 1 मधुमेह, अन्य स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए स्वतः एंटीबॉडी का पता लगाने पर विस्तारित किया जा सकता.

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Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).

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Abstract

टाइप-1 से जुड़े टाप-एंटीबॉडी को तुच्छ करना मधुमेह (T1D) परियोजना के लिए रास्ता है और आम जनता में इस बीमारी रोकते जाता है । एक उपंयास ECL परख उच्च संवेदनशीलता और वर्तमान ' सोने ' मानक रेडियो-बाध्यकारी परख (RBA) से विशिष्टता के साथ टाप एंटीबॉडी के लिए एक रेडियोधर्मी द्रव चरण परख है । ECL परख और अधिक ठीक उच्च जोखिम, कम जोखिम से उच्च-अपनत्व एंटीबॉडी भेद द्वारा रोगसूचक T1D की शुरुआत को परिभाषित कर सकते हैं, कम संबंध RBAs में उत्पंन एंटीबॉडी, और पारंपरिक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा ). इस ECL परख में इस्तेमाल किया प्रतिजन प्रोटीन Sulfo के साथ लेबल-टैग और बायोटिन, क्रमशः है । प्रत्येक ECL autoantibody परख है कि एक विशेष प्रतिजन प्रोटीन का उपयोग करता है एक अनुकूलन कदम से पहले यह प्रयोगशाला आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है । यह कदम विशेष रूप से सीरम एसिड उपचार, सांद्रता, और Sulfo-टैग और बायोटिन के साथ लेबल दो अलग प्रतिजनों के अनुपात के लिए आवश्यकताओं का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है । परख करने के लिए, सीरम नमूने Sulfo-टैग-संयुग्मित और biotinylated कैप्चर antigen में फास्फेट बफ़र्ड समाधान (पंजाब), 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त प्रोटीन के साथ मिश्रित कर रहे हैं । बाद में, नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन हैं । एक ही दिन, एक streptavidin-लेपित प्लेट अवरोधक बफर के साथ तैयार किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी । दूसरे दिन, streptavidin प्लेट को धो लें और सीरम-प्रतिजन मिश्रण को प्लेट पर ट्रांसफर कर दें । प्लेट शेखर पर प्लेट रखें, यह कम गति पर सेट, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । बाद में, प्लेट फिर से धोया जाता है, और पाठक बफर जोड़ा जाता है । इसके बाद प्लेट रीडर मशीन पर गिनी जाती है । परिणाम एक सूचकांक है, जो आंतरिक मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सीरम नमूनों से उत्पंन होता है के माध्यम से अवगत करा रहे हैं ।

Introduction

एक हाल ही में मचान वर्गीकरण प्रणाली रोगियों में T1D के प्रारंभिक चरणों के निदान के साथ सहायता करने के लिए बनाया गया है । मानव टाप एंटीबॉडी का सटीक पता लगाने की पहचान करने और प्रतीकात्मक प्रकार 1 मधुमेह, के रूप में टाप एंटीबॉडी की उपस्थिति β-सेल प्रतिरक्षा की उपस्थिति को इंगित करता है में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । दर जिस पर मधुमेह β-कोशिका की उन्मुक्ति की प्रारंभिक घटना से रोगियों को प्रभावित रोगसूचक रोग, संख्या और टाप एंटीबॉडी के प्रकार के साथ जुड़े, चर है2,3.

autoantibody seroconversion की आयु, titer, और टाप एंटीबॉडी के अपनत्व की प्रगति की दर को प्रभावित कर सकते हैं रोगसूचक प्रकार 1 मधुमेह4,5,6,7,8 ,9,10. हाल ही में, विकसित ECL परख बड़े पैमाने पर मांय किया गया है, वृद्धि की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है, और अधिक रोग है विशिष्ट10,11,12,13। इन परख की भविष्यवाणी को बढ़ाने और टाप एंटीबॉडी के पहले का पता लगाने के माध्यम से मधुमेह जोखिम के मचान । वे और अधिक ठीक टाप उन्मुक्ति की दीक्षा चिह्नित और कम आत्मीयता और कम जोखिम मधुमेह के लिए प्रासंगिक नहीं संकेतों की अनदेखी.

एक ECL परख में, सीरम में एंटीबॉडी, अगर मौजूद है, Sulfo-टैग-संयुग्मित प्रतिजन द्रव चरण में biotinylated कब्जा प्रतिजन के लिए पुल । पाटने के बाद, बायोटिन लिंकर ठोस चरण में पकड़ा और streptavidin लेपित प्लेट पर Sulfo-टैग द्वारा ECL के माध्यम से पता चला (चित्रा 1) ।

इस समीक्षा में, एकल एंटीबॉडी ECL परख मानव टाप एंटीबॉडी के साथ मुख्य रूप से उपयोग किया जाता है । संक्षेप में, मल्टीप्लेक्स एंटीबॉडी एकल ECL परख पर आधारित परख चर्चा की जाएगी । मल्टीप्लेक्स परख के लिए कई की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 10, एक के भीतर एंटीबॉडी एक अच्छी तरह से, सीरम के 15 µ एल का उपयोग कर । यह सरल उच्च प्रवाह परख स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक साथ, कई आम जनता में प्रासंगिक कई स्व प्रतिरक्षा रोगों के लिए एंटीबॉडी ।

Protocol

1. बफर तैयारी

  1. लेबलिंग बफर (2x पंजाब, पीएच 7.9): आसुत (डीडी) पानी की 400 मिलीलीटर में, 10x पंजाबियों के 100 मिलीलीटर जोड़ने, NaOH के साथ 7.9 करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  2. बायोटिन की 3 मिमी: भंग 1 में बायोटिन की मिलीग्राम 588 µ एल लेबलिंग बफर के ।
  3. 3 मिमी के Sulfo-टैग: भंग 150 nmol के Sulfo-टैग में 50 µ l के लेबलिंग बफर.
  4. Antigen बफ़र (5% BSA): 1x पंजाब के 500 मिलीलीटर में, गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के 25 ग्राम जोड़ें ।
  5. 0.5 मीटर एसिटिक एसिड सॉल्यूशन तैयार करें ।
  6. 1.0 m of Tris-hcl बफर ph 9.0:1 m Tris-hcl बफर तैयार करें, और एचसीएल के साथ पीएच को 9.0 में समायोजित करें ।
  7. कोटिंग बफर (3% अवरोधक एक): 1x पंजाब के 500 मिलीलीटर में, ब्लॉकर ए के 15 जी जोड़ें ।
  8. वाशिंग बफर (0.05% 20 के बीच, PBST): 1x पंजाब के 5000 मिलीलीटर में 20 के बीच 2.5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. बफर पढ़ना (2x surfactant के साथ बफर टी पढ़ें): डीडी पानी के 500 मिलीलीटर में, surfactant (सामग्री की तालिका) के साथ 4x पढ़ें बफर टी की 500 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. स्टोर बायोटिन और Sulfo-एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में टैग ।
    नोट: दोनों बायोटिन और Sulfo-टैग समाधान हमेशा नए सिरे से सिर्फ लेबलिंग प्रक्रिया से पहले तैयार किया जाना चाहिए ।

2. लेबल बायोटिन और Sulfo के साथ मानव टाप प्रतिजन-टैग

नोट: एक उच्च एकाग्रता के प्रतिजन, ≥ 0.5 मिलीग्राम/एमएल, एक अधिक कुशल लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए सिफारिश की है ।

  1. बायोटिन और Sulfo-टैग के लिए मानव टाप दाढ़ का अनुपात निर्धारित करें ।
    1. antigen दाढ़ संख्या को आणविक भार द्वारा विभाजित करके प्राप्त करें ।
    2. 1:5 के छोटे आणविक वजन (≤ 10 केडी) के साथ प्रतिजन के लिए दाढ़ अनुपात का उपयोग करें, और 1:20 के दाढ़ अनुपात के साथ प्रतिजन के लिए बड़ा आणविक भार (> 50 केडी).
    3. अपनी एकाग्रता द्वारा दाढ़ संख्या बांटकर बायोटिन या Sulfo-टैग के लिए मात्रा की गणना करें ।
  2. 1:5 के दाढ़ अनुपात के साथ बायोटिन या Sulfo-टैग के साथ मानव टाप एक साथ मिलाएं ।
    नोट: या तो tris या glycine बफर सिस्टम में प्रोटीन पीएच 7.9 आकार स्पिन कॉलम का उपयोग कर के साथ 2x पंजाबियों बफर करने के लिए विमर्श किया जाना चाहिए ।
  3. के बाद से बायोटिन और Sulfo-टैग प्रकाश संवेदनशील हैं, एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों को कवर । 1 एच के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  4. गर्मी के दौरान, प्रधानमंत्री तीन बार कॉलम में 2x पंजाबियों बफर वितरण द्वारा स्पिन कॉलम । 2 मिनट के लिए हर बार 1000 x g पर समाधान केंद्रापसारक ।
    नोट: वर्तमान में लेबलिंग प्रतिक्रिया, ब्रिजिंग के माध्यम से, अभी भी हो रही है और रोकने की जरूरत है ।
  5. लेबल वाले मानव टाप को शुद्ध करके लैबल लगाने की प्रतिक्रिया को रोकें । शुद्ध करने के लिए, स्पिन कॉलम के माध्यम से antigen पास और 2 मिनट के लिए 1000 x g पर कॉलम केंद्रापसारक ।
  6. antigen प्रोटीन और अंतिम वॉल्यूम की मात्रा का उपयोग करते हुए लेबल्ड antigen एकाग्रता (µ g/µ l) का निर्धारण करें ।
    नोट: मोटे तौर पर, वहां 90-95% हर स्पिन कॉलम पास के बाद लेबल प्रतिजन की अवधारण होगा ।
  7. Aliquot antigen और संग्रहीत लेबल antigen-80 ° c ।

3. सबसे अच्छा सांद्रता और दो लेबल एंटीजन के लिए परख (परीक्षक बोर्ड परख) के लिए अनुपात को परिभाषित

  1. प्रत्येक के लिए 200 µ एल की कुल मात्रा के साथ दो सीरम नमूने, एक उच्च सकारात्मक और एक नकारात्मक, तैयार करें ।
  2. सीरम के Aliquot 4 µ एल और अंतिम मात्रा एक 96-well पीसीआर प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति 20 µ एल है जब तक 1x पंजाबियों जोड़ें । चित्र 2aमें दिखाए गए अनुसार, उच्च धनात्मक नमूने के लिए आधे प्लेट का उपयोग करें और ऋणात्मक नमूने के लिए अंय छमाही ।
  3. 10 µ l बायोटिन की और 10 µ l की Sulfo-टैग लेबल antigen और दो अलग लेबल प्रतिजनों के लिए सीरियल कमजोरियां आचरण, जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है । एक लेबल प्रतिजन के लिए एक क्षैतिज धारावाहिक कमजोर पड़ने और अंय लेबल प्रतिजन के लिए एक ऊर्ध्वाधर धारावाहिक कमजोर पड़ने भागो ।
  4. 5.3 से 9.1 में वर्णित परख कदम के बाकी जारी रखें ।
  5. चित्र bमें दिखाए गए नकारात्मक नमूने से संबंधित संकेतों में से प्रत्येक के विरुद्ध उच्च धनात्मक नमूने से संकेतों के अनुपात की गणना करें ।
  6. बायोटिन और Sulfo टैग के लिए सबसे अच्छा सांद्रता की पहचान करें प्रतिजनों लेबल के लिए नकारात्मक के लिए सकारात्मक के उच्चतम या पास उच्चतम अनुपात के साथ एक बिंदु का चयन करके । अनुपात की पहचान करने के लिए नकारात्मक नमूना से कम पृष्ठभूमि संकेत पर विचार करें.
    नोट: परख दिन 1 चरण 6 से चरण 4 शामिल हैं ।

4. antigen बफ़र की सही एकाग्रता का उपयोग कर तैयार करें बायोटिन/Sulfo-टैग लेबल Antigen

  1. चेकर बोर्ड की परख पर आधारित प्रत्येक प्रतिजन के तर्कसंगत एकाग्रता का चयन करें ।
  2. 3 मिलीलीटर समाधान की थाली के प्रति प्लेट तैयार, बायोटिन की तर्कसंगत एकाग्रता का उपयोग/Sulfo-टैग लेबल प्रतिजन के लिए antigen बफ़र ।

5. लेबल प्रतिजन के साथ मशीन सीरम नमूने

नोट: इस खंड में दो प्रोटोकॉल हैं, सीरम एसिड उपचार के बिना एक और सीरम एसिड उपचार के साथ एक । आईएए परख को छोड़कर सभी टाप autoantibody की परख कदम 5.1 से 5.5 के लिए सीरम एसिड उपचार के बिना नियमित रूप से प्रोटोकॉल का उपयोग करें, जबकि आईएए परख इन कदमों को छोड़ देता है और कदम से 5.6 5.9 के लिए सीरम एसिड उपचार के साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करता है ।

  1. सीरम के Aliquot 4 µ एल और अंतिम मात्रा एक 96-well पीसीआर प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति 20 µ एल है जब तक 1x पंजाबियों जोड़ें ।
  2. लेबल्ड antigen समाधान प्रति well के 20 µ l जोड़ें ।
  3. लाइट से बचने के लिए सीलिंग चमकी के साथ पीसीआर प्लेट को ढक कर जाएं ।
  4. 2 एच के लिए आर टी पर एक शेखर (कम गति) पर प्लेट रखो ।
  5. 4 ° c रेफ्रिजरेटर में थाली रखो और रात भर गर्मी (18-24 ज) ।
    नोट: 5.6 से 5.9 तक के चरणों का निंन प्रोटोकॉल केवल आईएए परख और अंय autoantibody परख के लिए डिज़ाइन किया गया है इन चरणों को छोड़ दें ।
  6. प्रत्येक सीरम नमूने के लिए 0.5 M एसिटिक एसिड की 18 µ l के साथ सीरम के 15 µ l को मिलाएं । आर टी पर 45 मिनट के लिए इस मिश्रण की मशीन ।
  7. प्रतिजन समाधान तैयार बायोटिन और Sulfo-टैग की तर्कसंगत एकाग्रता के साथ प्रतिजन लेबल, परीक्षक बोर्ड परख पर आधारित, antigen बफर का उपयोग कर । प्रत्येक में अच्छी तरह से, aliquot 35 µ एल के प्रतिजन बफर, युक्त बायोटिन और Sulfo-टैग लेबल antigen, एक नई पीसीआर प्लेट में ।
  8. 45 मिनट की मशीन (चरण 5.6) चरण समाप्त होने से पहले, 8.3 µ l का 1 M Tris pH 9.0 बफ़र प्रत्येक अच्छी तरह antigen प्लेट (चरण 5.6) पर के पक्ष में जोड़ें । यह Tris बफ़र और antigen के बीच मिश्रण को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है । तुरंत सीरम, जो एसिड के साथ इलाज किया जाता है के 25 µ एल स्थानांतरण, 5.6 चरण में, एक अच्छी तरह से और समाधान आंदोलन । लाइट से बचने के लिए सीलिंग चमकी के साथ पीसीआर प्लेट को ढक कर जाएं ।
  9. 2 घंटे के लिए आर टी पर एक शेखर (कम गति) पर प्लेट रखो 4 ° c रेफ्रिजरेटर में थाली रखो और थाली रात भर मशीन (18-24 ज) की अनुमति देते हैं ।

6. Streptavidin प्लेट तैयार करें

  1. 4 ° c रेफ्रिजरेटर से एक streptavidin प्लेट ले लो और थाली आरटी करने के लिए आने के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. streptavidin प्लेट आरटी पर है एक बार, एक अच्छी तरह से करने के लिए 3% अवरोधक के 150 µ एल जोड़ें ।
  3. सील पंनी के साथ पीसीआर प्लेट को कवर किया ।
  4. रात में 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में थाली मशीन ।
    नोट: परख दिन 2 चरण 9 से कदम 7 शामिल हैं ।

7. स्थानांतरण सीरम/प्रतिजन Streptavidin प्लेट को मशीन

  1. अगले दिन, बाहर फ्रिज से streptavidin थाली ले और प्लेट से बफर छोड़ दें । बाहर तालिका पर कुछ सूखे कागज तौलिए सेट और प्लेट उल्टा जब तक वहां कुओं के अंदर कोई और बफर है नल ।
  2. PBST के 150 µ l के साथ खाली streptavidin प्लेट को अच्छी तरह से भरें और PBST को प्लेट से कुल तीन धुल के लिए त्यागें ।
  3. streptavidin प्लेट में प्रति अच्छी तरह से सीरम/प्रतिजन मशीन के 30 µ एल स्थानांतरण ।
  4. प्रकाश से बचने के लिए पंनी के साथ प्लेट को कवर । एक कम सेटिंग में, 1 एच के लिए आरटी पर थाली हिला ।

8. थाली धो और पढ़ें बफर जोड़ें

  1. थाली से मशीन त्यागें । PBST के 150 µ l को अच्छे से जोड़ें और PBST को प्लेट से निकाल कर कुल तीन बहाकर के लिए छोड़ दें ।
  2. धोने के बाद, बफर पढ़ने के प्रति अच्छी तरह से 150 µ एल जोड़ें ।
    नोट: यह समाधान में हवा के बुलबुले को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कैसे प्लेट रीडर मशीन पर थाली पढ़ा है को प्रभावित करेगा ।

9. थाली पढ़ें और डेटा का विश्लेषण

  1. प्लेट रीडर मशीन पर थाली गिनती । एंटीबॉडी मान प्रति सेकंड (सीपीएस) गणना के रूप में दिखाए जाते हैं ।
  2. एंटीबॉडी एक रिश्तेदार सूचकांक के रूप में प्लेट रीडर मशीन से प्राप्त स्तर व्यक्त करते हैं । निंन समीकरण से अनुक्रमणिका परिकलित करें:
    सूचकांक मूल्य = [सीपीएस (नमूना)-सीपीएस (नकारात्मक नियंत्रण)]/[सीपीएस (सकारात्मक नियंत्रण)-सीपीएस (नकारात्मक नियंत्रण)] ।
  3. धनात्मकता के लिए कट-ऑफ का उपयोग करते हुए सकारात्मक और नकारात्मक एंटीबॉडी परिणामों की पहचान करें, 100 स्वस्थ नियंत्रण विषयों के 99th शतमक के आधार पर परिभाषित किया गया है (बिना किसी ज्ञात स्व-प्रतिरक्षित रोगों से रहित मधुमेह वाले व्यक्ति और जिनके पास मधुमेह का कोई पारिवारिक इतिहास नहीं है).

Representative Results

चित्र 2 जांचकर्ता बोर्ड प्रदर्शित करता है । यह दिखाया गया है कि 250 के एनजी/Sulfo के एनजी/-टैग लेबल प्रतिजन के सबसे तर्कसंगत उच्च सकारात्मक नियंत्रण नमूना से संकेतों पर विचार परख में इस्तेमाल किया सांद्रता रहे हैं, है परख पृष्ठभूमि के रूप में नकारात्मक नियंत्रण नमूना है, और के अनुपात नकारात्मक संकेतों के लिए सकारात्मक इन दो लेबल प्रतिजनों के अनुकूलित सांद्रता के साथ, परख 100 नव T1D और 100 स्वस्थ नियंत्रण के साथ रोगियों का निदान से सीरम नमूने के साथ प्रदर्शन किया गया । ०.०२३ के सूचकांक मूल्य परख कट के रूप में परिभाषित किया गया था धनात्मकता के लिए बंद । यह रोगियों में 85% संवेदनशीलता का प्रतिनिधित्व करता है और स्वस्थ नियंत्रण में 99% विशिष्टता रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता का उपयोग (ROC) वक्र चित्रा 3ए में दिखाया गया है । अज्ञात नमूनों के लिए परख आंतरिक मानक उच्च सकारात्मक, कम सकारात्मक, और नकारात्मक नियंत्रण के नमूनों के साथ आयोजित किया गया था । सीपीएस की गिनती के परिणाम तालिका 2a में दिखाए जाते हैं. उच्च और कम सकारात्मक नियंत्रण का मतलब सीपीएस लाल, १७९०३ [(19940 + 15866)/2] और 814 [(857 + 820)/2] में हाइलाइट किए गए हैं, और नकारात्मक नियंत्रण हरे, 168 [(170 + 165)/2] में हाइलाइट किए गए हैं । अज्ञात नमूनों के लिए सूचकांक की गणना की जाती है "(सीपीएसनमूना-168)/(17903-168)." तालिका b सभी नमूनों के लिए परिकलित अनुक्रमणिका मान दिखाता है । ०.०२३ से अधिक वाले अनुक्रमणिका मान लाल रंग में लिखे गए हैं, जो तालिका 2aमें भी लाल रंग में लिखा गया सीपीएस मान से संबंधित हैं । ये मान उन धनात्मक परिणामों के रूप में परिभाषित किए जाएंगे जो स्वस्थ नियंत्रण जनसंख्या के 99वें शतमक से अधिक हैं । जब एक तर्कहीन प्रतिजन एकाग्रता का प्रयोग किया जाता है, परख एक उच्च पृष्ठभूमि है, के रूप में तालिका 2c में दिखाया जाएगा । सकारात्मक एंटीबॉडी के निम्न स्तर के मूल्यों की तरह याद किया जाएगा A2, A5, D1, और H4 में ग्रे में प्रकाश डाला तालिका 2d.

Figure 1
चित्र 1 : एक bivalent प्लेट पर कब्जा की एक एकल ECL-आईएए परख पर चित्रण । सीरम पुल में टाप autoantibody Sulfo-टैग संयुग्मित antigen को biotinylated कैप्चर antigen, जो streptavidin-लेपित प्लेट पर ठोस चरण में कैप्चर किया गया है । प्लेट पर कब्जा कर लिया Sulfo-टैग संयुग्मित प्रतिजन का पता लगाने ECL के माध्यम से पूरा किया है । यह आंकड़ा यू, एट अलसे संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : कट-ऑफ परख धनात्मकता का निर्धारण करने के लिए ROC वक्र । 85% संवेदनशीलता के अनुरूप विशिष्टता का 99वां शतमक चुना गया और इसे ०.०२३ के सूचकांक मूल्य के रूप में दर्शाया गया है । परख की यह ऊपरी सीमा 100 स्वस्थ नियंत्रण से लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : सामान्य मानव सीरम अवरुद्ध ECL-आईएए संकेतों का चित्रण. एक: एक इंसुलिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मोआब) के साथ ECL-आईएए परख से संकेत काफी सामान्य मानव सीरम के अलावा द्वारा अवरुद्ध थे. जब पंजाब में मोआब की तुलना, संकेत आंशिक रूप से जब मानव सीरम एसिड के साथ इलाज किया गया था बहाल किया गया । बी: 4 रोगी सीरा के साथ एक ECL-आईएए परख से संकेत काफी एसिड उपचार के साथ बढ़ाया गया । यह आंकड़ा यू, एट अलसे संशोधित किया गया है । 11. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : Mutiplex ECL परख के चित्रण । एंटीबॉडी-प्रतिजन परिसरों विशिष्ट लिंकर्स के साथ द्रव चरण में बनते हैं । विशिष्ट एंटीबॉडी-प्रतिजन-linker परिसर में एक ही अच्छी तरह से विशिष्ट linker-धब्बे में से प्रत्येक पर रोक रहे हैं । प्लेट रीडर मशीन धब्बों के विभिन्न स्रोतों से संकेतों भेद करने में सक्षम है और सीपीएस 10 विभिन्न चैनलों पर गिना जाता है, क्रमशः देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: परीक्षक बोर्ड परख सांद्रता और बायोटिन और Sulfo के अनुपात-टैग लेबल एंटीजन निर्धारित करता है । एक: कच्चे सीपीएस प्लेट और नकारात्मक सीरम के आधे पर उच्च सकारात्मक सीरम के साथ परीक्षक बोर्ड प्लेट के लिए दूसरे आधे पर मायने रखता है । biotinylated प्रतिजन की एकाग्रता क्षैतिज श्रृंखला में पतला था और Sulfo की एकाग्रता-टैग लेबल प्रतिजन श्रृंखला में खड़ी पतला था । B: सीपीएस के अनुपात मूल्यों नकारात्मक सीरम से उनकी इसी सीपीएस गिनती के प्रत्येक के खिलाफ उच्च सकारात्मक सीरम से गिना जाता है । पीले प्रकाश डाला कुओं पैनल बी में नकारात्मक के लिए सकारात्मक का सबसे अच्छा अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस अनुपात के लिए मेल खाती है 250 एनजी/एमएल बायोटिन और 250 एनजी/एमएल Sulfo टैग लेबल प्रतिजन सांद्रता एक पैनल में नकारात्मक सीरम के लिए एक स्वीकार्य कम सीपीएस गिनती के साथ । इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Table 2
तालिका 2: परख परिणामों का विश्लेषण । एक: कच्चे सीपीएस मानक उच्च और कम सकारात्मक नियंत्रण के साथ परख थाली से गिनती लाल रंग में प्रकाश डाला और मानक नकारात्मक नियंत्रण हरे रंग में प्रकाश डाला । प्रत्येक नमूना परख में दोहराया गया था । B: अनुक्रमणिका मान की गणना की गई, जैसा कि परख प्रोटोकॉल में वर्णित है । किसी भी अनुक्रमणिका मान ०.०२३ से बड़ा था जो एक धनात्मक परिणाम के रूप में, लाल रंग में हाइलाइट किया गया निर्धारित था । सी: कच्चे सीपीएस नमूनों की एक ही सेट के साथ परख थाली से गिनती जब एक तर्कहीन प्रतिजन एकाग्रता इस्तेमाल किया गया था । यह एक उच्च पृष्ठभूमि में हुई और कुछ कम सामांय रूप से पता चला, के रूप में पैनल बी में दिखाया गया है, नकारात्मक में बदल रहे थे, पैनल में ग्रे में प्रकाश डाला डी. इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

टाप एंटीबॉडी वर्तमान में प्रकार की प्रतिरक्षा के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय मार्क्स हैं 1 मधुमेह. वे टाप विशिष्ट उन्मुक्ति की शुरुआत के निशान और प्रकट रोग जोखिम निर्धारित करते हैं । ECL परख, टाप एंटीबॉडी के लिए, बड़े पैमाने पर किया गया है कई राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय प्रकार में मान्य 1 मधुमेह नैदानिक परीक्षण. परख में वृद्धि की संवेदनशीलता और विशिष्टता के रूप में वर्तमान ' गोल्ड ' मानक RBAs की तुलना में दिखाया गया है । ECL परख उच्च रोग विशिष्टता और उच्च जोखिम कम जोखिम, कम से RBA द्वारा उत्पंन-अपनत्व के संकेतों से भेदभाव के द्वारा उच्च बीमारी विशेष के लिए अपने बेहतर लाभ दिखाया गया है । यह विशेष रूप से विषयों जो केवल एकल टाप autoantibody सकारात्मक है और टाइप करने के लिए कभी नहीं प्रगति की है में देखा है 1 मधुमेह । इन कम संबंध के अधिकांश एंटीबॉडी को अनुवर्ती साल के भीतर किया परीक्षण के दौरान खो पाए थे, ' एक क्षणिक सकारात्मक रूप में बर्ताव । के रूप में पहले से कल्पना की, इन कम ' समानता ' एकल एंटीबॉडी की संभावना एक पार से प्रतिक्रियाशील अणु के साथ प्रतिरक्षण से हुई । जबकि उच्चतर संबध, उच्चतर जोखिम टाप करने वाले स्वयं के साथ प्रतिरक्षण से हुआ इसके अलावा, ECL-परख पूर्व मधुमेह के साथ बच्चों में वर्षों से वर्तमान मानक रेडियो-बाध्यकारी परख (RBA) से ' seroconversion ' के समय antedate करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, जो जंम से नैदानिक मधुमेह के लिए पीछा किया गया । एक चल रहे अंतरराष्ट्रीय नैदानिक परीक्षण, युवा (टेडी) में मधुमेह के पर्यावरणीय निर्धारकों, सटीक पता लगाने के लिए समय और उपस्थिति इंगित करने के लिए सबसे पहले टाप autoantibody ' seroconversion ' को निशाना बनाना टाप की शुरुआत बहुत प्रतिरक्षा और पर्यावरण ट्रिगर की पहचान करने के लिए । ECL परख में वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए एक संभावित कारण यह है कि परख सभी immunoglobulin वर्गों कब्जा: आईजीजी, आईजीएम, IgA, या IgE, बल्कि पारंपरिक RBA या एलिसा जो केवल आईजीजी का पता लगाने पर निर्भर से ।

ECL परख में, आईएए जैसे कुछ विशेष एंटीबॉडी के लिए, प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी के बंधन को कुछ सामांय मानव सीरम में मौजूद घटक द्वारा बाधित लगता है । निकालने के लिए या इस निषेध जारी, सीरम नमूनों की एसिड उपचार के लिए पहले सीरम प्रतिजन के साथ किया गया था करने के लिए आवश्यक था । [चित्रा 5] में दिखाया गया है, ECL-आईएए परख, दोनों माउस इंसुलिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और ' रोगियों सीरम एंटीबॉडी के प्रतिजन के साथ बाध्यकारी गतिविधियों बहुत बढ़ाया गया था । सीरम नमूनों की अंलीकरण, एंटीबॉडी परख में इस्तेमाल किया, आमतौर पर असंबद्ध पूर्व मौजूदा जटिल परिसरों के लिए लागू है । कैसे आईएए संकेतों मानव सीरम के नमूनों में हिचक रहे है और सीरम के अंलीकरण द्वारा जारी के पीछे तंत्र ज्ञात नहीं है, लेकिन इस विधि अंय ECL में इस्तेमाल किया गया है परख14,15आधारित है ।

कुछ मामलों में, जब अणुओं लेबल, या तो बायोटिन या Sulfo-टैग, प्रतिजन प्रोटीन अणुओं के लेबलिंग positionsinside पर हैं, या बहुत एंटीबॉडी बाध्यकारी है, जो एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं की कुंजी epitopes के करीब । यह परख संवेदनशीलता कम हो जाएगा और पूरी तरह से नीचे परख आंसू कर सकते हैं । नियमित लेबलिंग प्रक्रिया के लिए, अधिकतम या संतृप्ति प्रत्येक प्रतिजन प्रोटीन अणु के लिए वांछित हर संभव लेबलिंग की स्थिति की लेबलिंग क्षमता को अधिकतम करने के द्वारा प्रति लेबल अणु के अनुसार अधिक से अधिक गतिविधि या संकेत उत्पंन करने के लिए है । unसंतृप्त लेबलिंग अणुओं का दाढ़ अनुपात को कम करने के द्वारा किया जाना चाहिए (बायोटिन और Sulfo-टैग) antigen प्रोटीन पर लेबलिंग एंटीबॉडी बाइंडिंग गतिविधि के व्यवधान के लिए एक संभावित कारण हो जाता है । प्रमुख epitopes बेहतर आरक्षित किया जा सकता है और एंटीबॉडी बाध्यकारी गतिविधि के व्यवधान ज्यादातर मामलों में unसंतृप्त लेबलिंग रणनीति का उपयोग कर जारी किया जा सकता है ।

प्रत्येक परख अज्ञात नमूनों की सूचकांक गणना के लिए एक आंतरिक मानक उच्च सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करना चाहिए । सामांय नियंत्रण की है परख ऊपरी सीमा के पास एक कम सकारात्मक नियंत्रण के लिए परख संवेदनशीलता की निगरानी के लिए शामिल महत्वपूर्ण है । प्रयोगशाला लंबी अवधि के उपयोग के लिए मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के पर्याप्त aliquots रखना चाहिए और सभी aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । परख गुणवत्ता आश्वासन के लिए, परख प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट में चलाया जाना चाहिए और हर सकारात्मक परिणाम एक अलग परख में नमूना दोहरा द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए । एक तिहाई परख आवश्यक है जब दूसरी पुष्टि परख पहले परख और दो परख है, जो सहमत के परिणाम के साथ सहमत नहीं है (उदा, +, + या-,-), एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम के अंतिम निर्धारण किया जाएगा ।

एकल ECL परख के लिए निर्धारित मंच के साथ, एक मल्टीप्लेक्स की परख इन पर विस्तार किया जा सकता है । यह एक साथ एक अच्छी तरह से सीरम की एक छोटी राशि के साथ एक में 10 अलग एंटीबॉडी को निर्धारित कर सकते हैं । वर्तमान में, चार आईएए, गड़, IA-2a, और ZnT8A सहित टाप एंटीबॉडी T1D और आम जनता के साथ रोगियों के दोनों रिश्तेदारों में T1D करने के लिए प्रगति की जोखिम भविष्यवाणी के लिए महत्व में बराबर हैं । इन 4 वर्तमान एकल autoantibody माप का उपयोग कर एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए उपयोग के तरीकों श्रमसाध्य और अक्षम हैं, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर जनसंख्या स्क्रीनिंग के लिए । महत्वपूर्ण बात, T1D के साथ रोगियों के 40% तक एक अतिरिक्त स्व-प्रतिरक्षित हालत16,17,18है । दुर्भाग्य से, इन स्थितियों के लिए स्क्रीन करने के लिए कोई आसान और सस्ती उपकरण है । मल्टीप्लेक्स ECL परख केवल एक में 4 वर्तमान प्रमुख टाप autoantibody परख के संयोजन में सक्षम नहीं है, लेकिन यह भी करने में सक्षम है और अंय प्रासंगिक स्व प्रतिरक्षित रोग से अधिक autoantibody परख गठबंधन । यह यह कुशलतापूर्वक बड़े पैमाने पर आबादी में एक साथ कई स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए संभव बनाता है । मल्टीप्लेक्स ECL परख में, के रूप में [चित्रा 6] में दिखाया गया है, प्रत्येक एंटीबॉडी-प्रतिजन द्रव-चरण में गठित परिसर में एक ही अच्छी तरह से एक विशिष्ट linker स्रोत स्थान पर रोका जाएगा । प्लेट रीडर मशीन पर सिग्नल रिसीवर स्पॉट के 10 विभिन्न स्रोतों से संकेतों को पहचान करने में सक्षम है । हालांकि, एक बहुत ही उच्च संकेत के साथ स्पॉट एक उच्च परख पृष्ठभूमि उत्पंन और परस्पर बात के माध्यम से पड़ोसी धब्बे को हस्तक्षेप के कारण कर सकते हैं । इस कारण से, प्रत्येक autoantibody परख के लिए ऊपरी सीमा संकेतों से कम 20,000 गिनती तक सीमित होना चाहिए । हमारे अनुभव में, कम पृष्ठभूमि के साथ एंटीबॉडी अपेक्षाकृत दूर रखा जाना चाहिए उन स्थानों से उच्च गिनती होने जब स्पॉट मानचित्र बनाया गया है । मल्टीप्लेक्स ECL की परख का उपयोग करते हुए दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए यह सिफारिश की गई है कि इसी linker का इस्तेमाल इसी autoantibody परख के लिए किया जाए ताकि परख सुसंगत रहें.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

यह काम NIH ग्रांट DK32083, JDRF ग्रांट 2-SRA-2015-51-क्यू-आर द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R

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References

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