Caracterización hemodinámica invasiva del síndrome de hipertensión Portal en cirróticos ratas

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Summary

Aquí describimos un protocolo detallado para las mediciones invasivas de parámetros hemodinámicos como la presión portal, el flujo sanguíneo esplácnico y hemodinámica sistémica para caracterizar el síndrome de hipertensión portal en ratas.

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Königshofer, P., Brusilovskaya, K., Schwabl, P., Podesser, B. K., Trauner, M., Reiberger, T. Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats. J. Vis. Exp. (138), e57261, doi:10.3791/57261 (2018).

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Abstract

Se trata de un protocolo detallado que describe mediciones hemodinámicas invasivas en cirróticas ratas para la caracterización del síndrome de hipertensión portal. Hipertensión portal (PHT) debido a la cirrosis es responsable de las complicaciones más severas en pacientes con enfermedad hepática. El cuadro completo del síndrome de hipertensión portal se caracteriza por aumento de la presión portal (PP) debido a la resistencia vascular intrahepática aumentada (IHVR), circulación hiperdinámica y el flujo sanguíneo esplácnico mayor. La vasodilatación arterial esplácnica progresiva y aumento gasto cardiaco con elevada frecuencia cardiaca (FC), presión arterial baja pero caracteriza el síndrome de hipertensión portal.

Nuevas terapias se están desarrollando ese objetivo disminuir PP por o dirigida a IHVR o aumento del flujo sanguíneo esplácnico, pero pueden ocurrir efectos secundarios en la hemodinámica sistémica. Por lo tanto, una caracterización detallada del portal venoso, esplácnico y parámetros hemodinámicos sistémicos, incluyendo medición de PP, flujo de la sangre venosa portal (PVBF), flujo de sangre arterial mesentérica, presión arterial mala (mapa) y HR es necesario para la preclínica evaluación de la eficacia de nuevos tratamientos de PHT. Nuestro artículo video provee al lector con un protocolo estructurado para la realización de mediciones hemodinámicas invasivas en cirróticas ratas. En particular, describimos la cateterización de la arteria femoral y la vena porta a través de una vena ileocólica y la medida del portal venosa y arterial esplácnica flujo mediante sondas de flujo perivascular Doppler-ultrasonido. Se muestran resultados representativos de los modelos de ratón diferentes de PHT.

Introduction

PHT se define como presión arterial patológicamente creciente en el sistema venoso portal que puede causar complicaciones graves en pacientes con cirrosis como sangrado variceal y ascitis1. Mientras que la hepática (p. ej., trombosis de la vena porta) y post hepática (p. ej., síndrome de Budd-Chiari) PHT son raros, PHT intrahepática debido a la cirrosis hepática representa la causa más común de ALT2.

En la cirrosis hepática, PP se aumenta sobre todo como consecuencia de la elevada IHVR3. En etapas avanzadas, PHT se agrava por el mayor PVBF debido a mayor gasto cardiaco y disminución de la resistencia vascular sistémica y esplácnica, definiendo el síndrome de hipertensión portal4. Ley de Ohm (ΔP = Q * R) implica que el IHVR y el flujo sanguíneo es proporcional a PP5. En pacientes, la medición directa de los PP es arriesgado y no rutinariamente realizadas; por el contrario, el gradiente de presión venosa hepática (HVPG) se utiliza como una medida indirecta de PP6,7. La HVPG se calcula restando la presión venosa hepática libre (FHVP) de la presión venosa hepática cuña (WHVP), que se miden utilizando un catéter con balón colocado en la vena hepática8. La HVPG fisiológico oscila entre 1 – 5 mmHg, mientras que un HVPG ≥10 mmHg define hipertensión portal clínicamente significativa (CSPH) e indica mayor riesgo de complicaciones relacionadas con el Alt, como sangrado por várices, ascitis y encefalopatía hepática9 . Aunque el PP (es decir, HVPG) es el parámetro más relevante para severidad PHT, información sobre otros componentes de PHT, incluyendo la gravedad de la circulación hiperdinámica (HR, mapa), flujo de sangre arterial esplácnica/mesentérica y IHVR, son fundamentales para obtener una comprensión global de lo distinto mecanismo subyacente de PHT.

Así, en contraste con mediciones indirectas de PP en los seres humanos, la metodología introducida para las ratas ofrece la ventaja de una medida directa de PP y permite la grabación de parámetros hemodinámicas adicionales caracterizan el síndrome de hipertensión portal. Además, la medida directa del PP es una excelente lectura integradora de la cantidad de fibrosis hepática (un determinante de IHVR) y supera algunas limitaciones de cuantificación de la fibrosis relacionada con errores de muestreo de tejido del hígado.

Los modelos de roedores más comúnmente utilizados de PHT cirrótico incluyen ligadura quirúrgica del conducto biliar (BDL), toxina-inducida por la lesión del higado (es decir, por tetracloruro de carbono, tioacetamida o administración de Dimetilnitrosamina) y hígado metabólica inducida por la dieta modelos de la enfermedad. Prehepatic Alt (no cirróticos) puede ser inducida por parcial de la vena porta ligadura (PPVL)10.

Pequeños roedores están bien adaptados para el método presentado, incluyendo ratones, hámsters, ratas o conejos y se asocian con relativamente bajos costos de mantenimiento. A pesar de todas las evaluaciones hemodinámicas son factibles de realizar en ratones, la mejor exactitud y reproducibilidad de los resultados se ven con las ratas o los roedores más grandes debido a la evidente ventaja del tamaño del animal. Además, micro-instrumentos específicos y dispositivos son necesarios para obtener los parámetros hemodinámicos similares en ratones. Por último, las ratas son más robustas con mortalidad y baja morbilidad asociada y por lo tanto, la deserción es probable que baje en ratas que en los ratones.

La metodología presentada es adecuada para la evaluación de tratamientos específicos de enfermedad hepática (es decir, drogas anti-fibróticas o antiinflamatorias) o farmacológica novela acerca de influencia el tono vascular y endotelial biología; y así, probable efecto parámetros hemodinámicos en alt.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad médica de Viena y el Ministerio austríaco de ciencia, investigación y economía (BMWFW). Procedimientos deben ser realizado en condiciones asépticas en una sala de operación o similar limpiar área de trabajo ya que las mediciones hemodinámicas representan las intervenciones quirúrgicas. Por lo general, se recomienda trabajar en condiciones estériles. Cuando se utiliza una anestesia inhalatoria, considerar una ventilación adecuada del quirófano para seguridad en el trabajo. Un período de tiempo de 40 – 50 min/animal tiene que ser considerado en el caso de lecturas hemodinámicas todas presentadas en este protocolo.

1. pre-quirúrgicos preparados

  1. Encender y calibrar el grabador multicanal electrónico incluyendo los transductores de presión según las instrucciones del fabricante.
  2. Conectar las sondas de flujo ultrasónico (1 mm y 2 mm) del amplificador de puente.
  3. Preparar una reserva de solución salina fisiológica, a temperatura del cuerpo, 37 ° C, para humedecer los tejidos o las compresas de Gasa.
  4. Registrar el peso del cuerpo animal para proporcionar anestesia ajustadas por el peso y la normalización de parámetros hemodinámicos según el peso del cuerpo.
  5. Preparar todo el material para una anestesia de inhalación.
    Nota: Si la inhalación o el equipo necesario es no en sitio o factible, luego anestesia inyectable con ketamina y xilacina puede utilizarse (80 – 100 mg/kg ketamina con xilacina de 5 – 10 mg/kg en solución salina fisiológica, intraperitoneal (i.p.)). Un volver a una dosis de ketamina (dosis reducida de 20 – 30 mg/kg, intramuscular (i.m.)) después de 30-45 min es necesaria para inducir la anestesia quirúrgica plano continua.
  6. Poner el animal bajo anestesia de isoflurano a corto plazo utilizando una caja de inducción de anestesia inhalatoria (5 min, isoflurano 5% v/v, 3 a 4 L O2-caudal). Cuidadosamente incline la caja y Compruebe la profundidad de la anestesia por el estado de inmovilidad del animal.
  7. Intubación la rata con un conveniente tubo endotraqueal hecho a sí mismo.
    Nota: Para el personal que son nuevo en la técnica de intubación, la analgesia/anestesia (paso 1.10) puede administrarse después de anestesia inhalatoria de corto plazo para permitir tiempo adicional para la intubación. Otra opción es una máscara de animal específico para anestesia inhalatoria.
    1. Utilice un tubo endotraqueal hecho a sí mismo de un catéter venoso periférico modificado (14 G). Cortar las alas de la manipulación y pegar un lazo de cinta adhesiva para la fijación posterior a la mejilla de la rata para evitar la dislocación del tubo endotraqueal (figura 1A).
    2. Utilice un dispositivo de alambre guía hecho a sí mismo de una cánula arterial modificado como un sostenedor del alambre guía y un alambre de punta adecuado (figura 1B).
    3. Use un escritorio adecuada de intubación para la colocación apropiada del animal. Coloque el animal en la posición supina con la cabeza en posición inclinada.
      Nota: Si no hay escritorio de intubación está disponible, es posible colocar el animal en posición supina con el cuello estirado con cuidado sobre el borde de la tabla. Sin embargo, este procedimiento no se recomienda debido al mayor riesgo de lesiones.
    4. Fije una sutura detrás de los incisivos en un lado de la rata y estírela suavemente el cuello del animal atando la sutura hacia abajo en el otro lado (figura 1).
    5. Iluminar la zona del cuello ventral pre traqueal por un haz de luz concentrado. Especialmente en animales albinos, asegúrese de que las cuerdas vocales están iluminadas a través de la piel para permitir la mejor visualización y rápida intubación.
      Nota: Utilice un animal específico laringoscopio para la intubación de animales pigmentados.
    6. Coge la lengüeta y tire suavemente usando dos dedos.
    7. Utilice un bastoncillo de algodón tratado con lidocaína (aerosol de la bomba) para anestesiar con cuidado la zona laríngea.
    8. Intubar al animal mediante la inserción del tubo endotraqueal entre las cuerdas vocales y la tráquea, con el apoyo del dispositivo de alambre guía (figura 1).
    9. Retire el dispositivo de cable de guía.
    10. Conecte el tubo al ventilador.
    11. Inicio del ventilador mediante los ajustes apropiados para el animal (1 L/min O2-flujo, Auto flujo = 90/min; presión inspiratoria: 18 mmHg; PEEP: 3 mmHg, I / E = 1:2) y Compruebe la correcta intubación.
      Nota: Si se observa la inflación del estomago, retire el tubo y vuelva a intentarlo. Además, comparar la actividad respiratoria a ritmo de ventilador o coloque dos dedos en la pared del abdomen justo sobre el estómago para evaluar potencial inflación del estómago.
  8. Inicio anestesia isoflurano en 0.5 – 1.0% v/v y 1 L/min O2-flujo inmediatamente después de la intubación exitosa (figura 2A).
  9. Fijar el tubo endotraqueal transbucal sutura a través de la mejilla y el lazo colocado cinta adhesiva del tubo.
  10. Administrar más anestesia y analgesia por dos jeringas de 1 mL, por ejemplo, i.p. de ketamina (100 mg/kg) (cánula, 23 G) [o i.m. distribuyendo el volumen inyectado (dosis) en inyecciones bilaterales en el músculo del muslo caudal (cánula de 30 G)] y piritramida (2 mg/kg) por la inyección subcutánea (s.c.) (cánula, 23 G). Tenga en cuenta el volumen máximo de inyecciones i.m. por sitio de inyección (figura 2B).
  11. Aplicar el ungüento oftálmico. Recorte el pelo del cuerpo en la región abdominal y los muslos internos. Desinfectar la piel.
    Nota: Tanto interior de los muslos debe ser afeitada para permitir el uso de la arteria femoral contralateral para mediciones de HR y mapa en el caso de la cateterización de la arteria femoral no se pudo en un lado. Afeitado en un momento posterior puede causar el pelo contaminar el campo quirúrgico.
  12. Fije el animal en posición supina sobre una almohadilla caliente (38 ° C) con cinta adhesiva (figura 2).
  13. Monitorear la temperatura del cuerpo del animal, por ejemplo, mediante el uso de una sonda de temperatura rectal (Figura 2D).
  14. Evaluar la profundidad de la anestesia por el cierre de tapa refleja y del dedo del pie-pizca-test antes de cualquier intervención o cirugía.

2. medición de recursos humanos y mapa

  1. Haga una incisión en la piel en la parte interna del muslo (seleccionar un lado) sobre la presunta localización de la arteria femoral por elevación de la piel por tejido pinzas y quitar un área de piel de unos 2 cm de longitud por Mayo tijera (Figura 3A).
  2. Exponer y sin rodeos disecar el arteria-vena-nervio complejo que incluye la arteria femoral del tejido fino conectivo (adventicia) al repetidamente abrir una pinza hemostática por el complejo.
  3. Disecar el arteria-vena-nervio complejo del tejido circundante a lo largo de ~1–1.5 cm (figura 3B).
  4. Si es necesario, quitar la grasa subcutánea/perivascular para una mejor visualización y disección.
    Nota: Tenga cuidado al quitar la grasa subcutánea/perivascular por tijeras de cutícula, ya que lesionado los vasos sanguíneos puede causar bleedings. Si se observa sangrado, aplique presión sobre la zona sangrante con una gasa pequeña o detener el sangrado por una pinza hemostática.
  5. Separar la arteria femoral la vena femoral y nervio con dos pinzas para alta precisión 45° ángulo amplio punto (tener en cuenta que la vena femoral es la estructura más medial y la arteria femoral se encuentra más lateral) (figura 3-F).
  6. Colocar una ligadura en la arteria femoral como distal como sea posible y utilizar una pinza curvada sobre la sutura para aplicar tracción longitudinal suave a la arteria femoral.
  7. Coloque una segunda sutura previamente anudada (pero no cerrado nudo) en la arteria femoral tan próximo como sea posible (figura 3).
  8. Preparar un catéter adecuado (PE-50 para la arteria femoral de rata) con una punta de corte inclinado (~ 45°) con solución salina fisiológica estéril heparinizada (5 mL jeringa 23 G embotado cánula). No sean burbujas de aire dentro del catéter, que dificultan la presión arterial y la lectura de hora (figura 3 H).
  9. Comprimir la arteria femoral en el extremo proximal de la sección expuesta con una pinza de micro para detener temporalmente el flujo de sangre arterial (figura 3I).
  10. Perforar la pared arterial en una localización distal de la sección disecada utilizando una cánula doblada (23 G) colocando una Soporte micro espátula de metal por debajo de la arteria femoral (figura 3J).
  11. Cuidadosamente cateterizar la arteria femoral a través de la perforación con la punta inclinada del catéter hacia arriba. Avanzar el catéter hasta que la abrazadera micro es aproximado (figura 3 K).
    Nota: En caso de éxito cateterismo de la arteria femoral en el primer intento, un segundo intento más proximal puede realizarse (comienza en paso 2.8). Si se produce la ruptura de la arteria o la sangría severa, ligar o apretar la arteria tan próxima como sea posible para evitar más pérdida de sangre. Si la pérdida de sangre es mínima, trate de catheterizing la arteria femoral contralateral (comienza en el paso 2.1).
  12. Abra la abrazadera micro y control de flujo de la sangre arterial pulsátil en el catéter (figura 3 L).
  13. Evitar que más afluencia de sangre en el catéter bloqueando la salida del catéter.
  14. Fijar el catéter en su localización intramural por el cierre de la ligadura proximal dispuesta alrededor de la arteria femoral y el catéter introducido (figura 3 M).
  15. Repetidamente enjuague y aspirar el catéter en la arteria femoral para evaluar correcta colocación intravascular. Pulsaciones arteriales en la columna de sangre aspirada deben ser fácilmente visibles.
  16. Fijar la posición del catéter a lo largo de la nave usando los extremos de la ligadura distal para prevenir la dislocación y asegura una posición longitudinal del catéter (figura 3N).
  17. Además, con cinta adhesiva el catéter cerca del animal sobre la mesa quirúrgica para fijarla y evitar luxación accidental.
  18. Conectar el catéter llenado con solución salina fisiológica para el transductor de presión evitando la formación de burbujas de aire.
  19. Iniciar la grabación de la HR y el mapa utilizando la interfaz digital (figura 3O).
  20. Cubrir el área expuesta en la parte interna del muslo con una compresa de gasa humedecido pequeñas (figura 3 P).
  21. Calcular el índice de hyperdynamic (HD): HD = mapa/HR.
    Nota: En Alt avanzada, el índice de HD es elevado en comparación con animales no portal hipertensiva. Sin embargo, un aumento en Índice de HD durante la cirugía también podría indicar hemorragia, hipovolemia o el dolor. Si valores mapa registrados son muy bajos pero la señal es buena y flujo pulsátil se detecta en el catéter, revise el nivel de anestesia y potencialmente reducir el nivel de anestesia. No parar completamente la anestesia isoflurano, ya que esto puede llevar a la profundidad de la anestesia insuficiente según el bienestar animal y buenas prácticas científicas.

3. flujo de sangre de la arteria mesentérica superior (SMABF)

  1. Realizar una laparotomía mediana (Figura 4A-C)
    1. Levantar la capa de piel con tejido pinzas 5-6 cm por debajo del xifoides y quitar una tira fina de la piel utilizando un Mayo tijera encima de la linea alba hasta el xifoides es alcanzado.
    2. En el centro de la incisión en la piel, levante la capa muscular por tejido pinzas a lo largo de la linea alba para crear distancia entre la pared abdominal y órganos esplácnicos.
    3. Abrir la cavidad peritoneal mediante la incisión de la pared abdominal con un bisturí en el linea alba. Ampliar la apertura al levantar la pared abdominal por fórceps de tejido con una tijera de Metzenbaum a lo largo de la linea alba en la misma distancia que la capa de la piel.
  2. Excavar el intestino usando bastoncillos de algodón húmedo comenzando con el coecum y colóquela sobre una gasa grande la compresa empapada en solución salina fisiológica al lado de la incisión (figura 4-F).
  3. Envuelva el intestino en la compresa de Gasa y asegúrese de que está humedecido con solución salina fisiológica (figura 4).
  4. Busque y exponga la arteria mesentérica superior.
  5. Disecar la arteria mesentérica superior con dos 'Schwabl' de Roma hecho a sí mismo-ganchos: Levante la arteria con el primer gancho y tratar de colocar el segundo de ellos a través del mismo túnel de tejido. Exponga la arteria mesentérica superior a lo largo de una distancia de 5 mm para que el sensor de flujo (1 mm) puede ubicarse alrededor de él (figura 4 H-K).
    Nota: Si lo prefiere, puede utilizarse una pinza de precisión 45° ángulo amplio punto para levantar así la arteria. 'Schwabl'-ganchos preparados de cánulas de 30 G con consejos sin rodeos rotos doblados en forma de gancho. Si son extensas, las arterias colaterales 'Schwabl'-ganchos pueden ser más seguros como bleedings de colaterales mientras que puede evitarse la disección de la arteria mesentérica superior. Si se presenta sangrado mientras se prepara la arteria mesentérica superior, coloque una compresa de Gasa pequeña en el sitio de la sangría durante 1 – 2 min con una presión suave. Pequeño sangrado generalmente se detendrá rápidamente; mantener siempre en mente humedecer periódicamente del tejido (paso 1.12). Si la arteria mesentérica superior sí mismo se perjudica, deben terminar las evaluaciones hemodinámicas.
  6. Aplique el gel de ultrasonido a sensor de la sonda ultrasónica y adjuntarlo a la arteria mesentérica esplácnica. Alinear a la ruta natural de la arteria mesentérica superior (figura 4B-M).
  7. Cierre la sonda de flujo (1 mm) y si es necesario suavemente aplique gel de ultrasonido adicional en el sensor Doppler para mejorar la calidad de la señal. Hacerlo mediante el uso de una jeringa (20 mL) llenada con gel de ultrasonido y una cánula de punta Roma (18 G) (figura 4N-O).
    Nota: Si la sonda de flujo no está bien alineada a lo largo de la evolución natural de la nave, la tensión puede causar constricción vascular y por lo tanto, flujo turbulento, que reduce la exactitud de las mediciones de flujo. Intenta volver a alinear la dirección de la sonda de flujo a lo largo de la ruta natural de la vasija y luego solucionar suficientemente la sonda de flujo en una posición adecuada.
  8. La SMABF de medir y evaluar la conformidad de la señal de flujo pulsátil para los picos sistólicos de la grabación de la arteria femoral.
    Nota: Si valores de mapa registrados son muy bajos pero la señal es buena y flujo pulsátil se detecta en el catéter, compruebe el nivel de anestesia y potencialmente reducir el nivel de anestesia. No parar completamente la anestesia isoflurano, ya que puede resultar insuficiente profundidad de la anestesia según el bienestar animal y buenas prácticas científicas.
  9. Encontrar una posición estable de la sonda de flujo (1 mm) y fijar el cable de la sonda de flujo. Iniciar la grabación de la SMABF sin más manipulación de la sonda de flujo (1 mm) (figura 4 P).

4. PVBF

  1. Localizar y exponer la vena porta en la cara dorsal del mesenterio que es cerca del hilio hepático (figura 5A).
  2. Suavemente disecar la vena porta de los tejidos circundantes usando un fórceps de amplio punto de ángulo de 45° de alta precisión: aislar la vena porta empujando suavemente y varias veces la pinza debajo de la vena porta para crear un túnel de tejido (figura 5B).
    Nota: Si una se presenta sangrado del tejido periportal preparando la vena porta, aplique presión suave en el sitio de la sangría durante 1-2 minutos utilizando un bastoncillo de algodón; Esto a menudo detiene el sangrado.
  3. Agrandar el túnel con la apertura de las pinzas de alta precisión 45° ángulo amplio punto lentamente y exponer la vena porta a lo largo de una distancia de 5-6 mm para permitir la colocación de la sonda de flujo perivascular (2 mm) (figura 5, D).
  4. Aplique el gel de ultrasonido a sensor de la sonda ultrasónica y adjuntarlo a la vena portal alineada con su vía natural (figura 5E).
  5. Cerca de la punta de prueba de flujo (2 mm) y aplique el gel de ultrasonidos adicionales si es necesario, como se describió anteriormente (paso 3.7) (figura 5F).
  6. Asegúrese de que la sonda de flujo se coloca de una manera no constrictivo alrededor de la vena porta (figura 5).
    Nota: Si la sonda de flujo no está bien alineada a lo largo de la evolución natural de la nave, la tensión puede causar constricción vascular y por lo tanto, flujo turbulento, que reduce la exactitud de las mediciones de flujo. Intenta volver a alinear la dirección de la sonda de flujo a lo largo de la ruta natural de la vasija y luego solucionar suficientemente la sonda de flujo en una posición adecuada.
  7. Encontrar una posición estable de la sonda de flujo (2 mm) y fijar el cable de la sonda de flujo. A continuación, iniciar la grabación de la PVBF (figura 5 H).
    Nota: Si valores de mapa registrados son muy bajos pero la señal es buena y flujo pulsátil se detecta en el catéter, compruebe el nivel de anestesia y potencialmente reducir el nivel de anestesia. No parar completamente la anestesia isoflurano, ya que puede resultar insuficiente profundidad de la anestesia según el bienestar animal y buenas prácticas científicas.

5. PP

  1. Preparar un catéter (PE-50 para las venas mesentéricas de rata) con un inclinado (unos 45°) punta de corte que se lava con solución salina fisiológica (jeringa de 5 mL y cánula Roma de 23 G). Preste atención que sin burbujas de aire dentro del catéter que impida la lectura PP (figura 6A).
  2. Manejar el intestino con guantes húmedos y dispersos en los dedos (Figura 6B).
  3. Optimizar la vista de la cama vascular mesentérica cerca del intestino (figura 6).
  4. Identificar los recipientes mesentéricos venosos principales hacia la vena porta (vena ileocolica - superior del mesenterica de vena - vena portae).
  5. Buscar a un cruce adecuado de la vena de ileocolonic que es accesible para la cateterización.
  6. Primero pegar el catéter en el tejido mesentérico por perforación del peritoneo visceral del mesentery cerca del cruce vascular para cateterización.
  7. Cuidadosamente haga avanzar la punta inclinada del catéter más cerca a una ensambladura de la vena ileocólica hasta que se vea una ligera impresión de la ensambladura del recipiente (figura 6).
  8. Por último, cateterizar el sistema venoso en línea con la ruta del buque Unión por perforación de la pared vascular en el ángulo de cruce de los vasos. (Figura 6E).
    Nota: Si se presenta sangrado en la cateterización de la vena ileocólica, utilizando una prensa de pulgar con una compresa de Gasa pequeña en el área de sangrado. Esta presión debe mantenerse durante 1 – 2 minutos detener el sangrado. Luego, tratar de insertar el catéter en una rama más proximal de la vena ileocólica.
  9. Haga avanzar el catéter más cuidadosamente a lo largo de la ruta principal vaso venoso a la vena porta sin perforación de la vena (figura 6F).
    Nota: Mantenga el catéter a una distancia suficiente a la sonda de flujo colocada alrededor de la rama principal de la vena porta para evitar artefactos en la señal de flujo y para evitar la perforación de la vena porta.
  10. Conectar el catéter llenado con solución salina fisiológica para el transductor de presión evitando la formación de burbujas de aire.
  11. Iniciar la grabación del PP.
  12. Registrar todos los parámetros hemodinámicos simultáneamente bajo condiciones estables durante varios minutos (figura 6h). Opcionalmente, el catéter venoso portal puede ser fijo en su lugar con pegamento de tejido y los intestinos pueden ser reubicados en la cavidad abdominal.
    Nota: Si valores de mapa registrados son muy bajos pero la señal es buena y flujo pulsátil se detecta en el catéter, compruebe el nivel de anestesia y potencialmente reducir el nivel de anestesia. No parar completamente la anestesia isoflurano, ya que puede resultar insuficiente profundidad de la anestesia según el bienestar animal y buenas prácticas científicas.

6. IHVR

  1. Después de sacrificar el animal, medir el peso del hígado. Calcular la IHVR: IHVR = PVBF/PP. normalizar este valor PVBF para el peso del hígado.

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Representative Results

Dependiendo del modelo animal y la gravedad de la enfermedad del hígado, el grado de PHT y la gravedad del síndrome de hipertensión portal es diferente (figura 7).

El modelo BDL causa cirrosis biliar debido a la colestasis. En consecuencia, PP aumenta con el tiempo y un hiperdinámico circulación desarrolla, como se ha visto un aumento de la HR y disminución del mapa. En los animales cirróticos, SMABF, PVBF y IHVR también aumentan la unanimidad a las alteraciones hemodinámicas y hepáticas (Figura 7AF).

Por el contrario, PPVL causa Alt prehepatic, no cirróticos, que se caracteriza por un aumento inmediato en el PP y los cambios correspondientes en la hemodinámica sistémica (figura 7-I). Sin embargo, durante los collaterals portosystemic curso del tiempo se convierten que pueden bajar el PP.

Los valores hemodinámicos de animales operado simulado permanecen en niveles fisiológicos y no cambian significativamente con el tiempo. La presión portal en animales sanos SO es máximo 5 a 6 mmHg (figura 7J-L).

Figure 1
Figura 1: dispositivos de intubación hecho a sí mismo: Tubo endotraqueal (A). (B) Guía cable escritorio de intubación de dispositivo (C). (D) tubo conectado al dispositivo de alambre guía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: preparación pre quirúrgica: (A) la intubación del animal. (B) Intramuscular y subcutánea para la anestesia. (C) fijación del animal en la estera de la calefacción. (D) colocación y fijación de sonda de temperatura rectal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: frecuencia cardiaca (FC) y Presión Arterial mala (mapa): (A) incisión de la piel. (B) preparación de la femoral vascular y estructuras nerviosas. (CF) Disección de la arteria femoral. (G) sutura Distal y fijación - proximal anudar la sutura proximal. (H) preparación del catéter femoral. () Colocación de la pinza micro vascular. (J) la perforación de la arteria femoral con una aguja curva. (K) la cateterización de la arteria femoral. (L) apertura de la pinza micro para la evaluación del pulso. (M) la fijación Proximal del catéter. (N) fijación Distal del catéter. Medición de mapa (O) y h (P) que cubren el campo quirúrgico con una gasa pequeña empapada de la compresa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: flujo de sangre Arterial Mesentérica Superior (SMABF): (AC) Laparotomía mediana. (D) excavación de coecum. (EF) Excavación del intestino. (G) envoltura de los intestinos en compresas de gasa empapadas. (HK) Ganchos de la preparación de la arteria mesentérica esplácnica con cánula Roma. (L, M) Fijación de la sonda de flujo. (N) aplicación de ultrasonido gel en el sensor de sonda de flujo. Correcta colocación no constrictiva (O) de la de la sonda de flujo. Medición (P) de SMABF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: flujo de la sangre venosa Portal (PVBF): (A) optimizado dorsal ver en vena porta (B) la disección de la vena porta del tejido graso mesentérico. (C) creación de un túnel de tejido para la sonda de flujo de la vena porta. (D, E) Fijación de la sonda de flujo de la vena porta. (F) aplicación de ultrasonido gel en el sensor de sonda de flujo. (G) correcta colocación no constrictiva de la sonda de flujo. (H) medida de PVBF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: presión Portal (PP): (A) preparación del catéter. (B) preparación de los intestinos. (C) optimizado ve en la vasculatura venosa mesentérica principal. (D) perforación del peritoneo visceral y adelanto de la rama vascular más adecuado del catéter. (E) la cateterización de la vena ileocólica en ángulo de unión entre la rama principal y una rama lateral. (F) adelanto de la punta del catéter en la vena portal mas cerca al hilio hepático. (G, H) Medición de PP. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: resultados del representante: Curso del tiempo de (A) PP, mapa (B) y (C) HR en ratas BDL. En consecuencia, se observan cambios en la SMABF (D) y PVBF (E) (F) IHVR. En PPVL, cambios hemodinámicos de PP (G), mapa (H) y () recursos humanos son más pronunciados en los primeros días después de la cirugía. En sana sham-funcionado (tan) animales, PP (J), (K) mapa y ubicación de recursos humanos (L) permanecen dentro de valores fisiológicos y no cambian con el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

PP es el parámetro de resultado principal para la evaluación del síndrome de hipertensión portal y refleja la severidad de la cirrosis subyacente. Deposición de la matriz (es decir, fibrosis) y la vasoconstricción sinusoidal (debido al aumento de expresión hepática de vasoconstrictores y disminución de respuesta a los vasodilatadores) causan mayor IHVR. La importancia de la PP y su impacto en la enfermedad hepática crónica se ha demostrado en múltiples preclínicos11,12,13,14 y estudios clínicos15,16, 17 , 18. por lo tanto, en pacientes cirróticos, el PP es un parámetro de resultado duro, y su reducción es recomendada por las pautas de tratamiento19,20 y un objetivo de investigación de Hepatología actual. Integral de modelos animales son necesarios para caracterizar y16,21 nuevos tratamientos de la PHT22. Este protocolo presenta la metodología necesaria para una caracterización hemodinámica detallada, incluyendo la evaluación de la presión portal y la circulación hiperdinámica, vasodilatación esplácnica de la resistencia intrahepática. Para conseguir un representante y hemodinámico completo conjunto de datos de modelos de roedores, experiencia y formación del operador de ejecución es de suma importancia.

Prevención y control de bleedings severos son especialmente destrezas. Preparación precisa y contundente de las secciones vasculares de interés es fundamental para evitar fallas en la canulación y bleedings severos. La pérdida de sangre significativa tiene un impacto en la hemodinámica y excluye las medidas exactas de los PP o puede resultado incluso en la muerte de los animales de laboratorio. Bleedings del documento que han ocurrido durante las mediciones en los protocolos y caracterizar la severidad y la localización del sangrado.

De nota, usando sondas de flujo perivascular ultrasonido evaluar flujo sanguíneo genera sólo una aproximación y puede ser objeto de errores, debido a los vasos diferentes tamaños y la alineación incorrecta de la sonda de lectura. Otra técnica para medir el flujo sanguíneo y especialmente distribución del flujo de sangre (incluyendo cálculo de portosistémica) es la microesfera color técnica23. Sin embargo, órganos enteros deben cosechar, disuelto, analizados, y esto omite la posibilidad de realizar histológica o análisis de la expresión. Por lo tanto, la técnica de ultrasonido compatible con los principios de las 'tres r' en la investigación animal (reducir, refinar y reemplazar) por Russell y Burch24. Además, sondas de flujo son adecuadas monitorear el flujo de sangre esplácnico en tiempo real y paralelo a otros parámetros hemodinámicos, mientras que la técnica de coloreado microesfera requiere integrar órgano (mesentérica) sanguíneo con el tiempo. Por otra parte, microesferas, que generalmente tienen un diámetro de 15 μm, requieren de una distribución normal de micro vasos con un diámetro < 15 μm en los órganos respectivos para evitar ser atrapado e inmóvil, de color que podría no ser el caso en hígados cirróticos.

La principal limitación de este método es la necesidad de un estado de inconsciencia y de la anestesia durante la caracterización hemodinámica del síndrome PHT en animales. La inyección más común y ampliamente utilizado anestesia ketamina/xilacina a menudo requiere redosing después de 30-45 min para obtener una profundidad necesaria de anestesia25,26; esto añade presión del tiempo sobre todo si se necesita la solución de problemas. Anestesia de inhalación supone muchas ventajas, pero se requiere equipo especial y anestésicos volátiles relacionados con las normas de seguridad deben seguirse. La profundidad de la anestesia puede ser adaptada rápidamente sin interferir con los procedimientos de cirugía mediante el ajuste de la concentración de anestesia. El tubo endotraqueal asegura vías aéreas especialmente después de la activación de la salvación por la ketamina y la ventilación asegura suficiente oxigenación y ventilación del animal para disminuir el riesgo de muerte inducida por la anestesia27. Ketamina/xilacina es todavía ampliamente anestesia usada, dosis bajas de isoflurano no causa cambios significativos de los parámetros hemodinámicos o Cardiovasculars en ratas28,29.

Experiencia local prever stateoftheart recomendaciones y mejores prácticas de la anestesia y los investigadores deben reconsiderar continuamente el tipo de anestesia que se utiliza para realizar estas evaluaciones hemodinámicas30. Futuros experimentos podrían usar telemetría con transductores de presión inalámbrico implantados que superar la actual anestesia general relacionados con limitaciones y permitirá la caracterización hemodinámica de animales conscientes.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a los veterinarios, enfermeras y cuidadores de animales en el centro de investigación biomédica por su continuo apoyo en nuestros proyectos de investigación. Los autores reconocen la importante entrada de todos los revisores del presente Protocolo. Algunas de las investigaciones fue financiado por el premio"joven Ciencia" de la Sociedad austríaca de Gastroenterología y Hepatología (ÖGGH) PS y el "Skoda Award" de la Sociedad austríaca de medicina interna TR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
LabChart 7 Pro software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Software
ML870 PowerLab 8/30 ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Electronic multichannel recorder
MLT0380/D ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure)
ML112 Quad Bridge Amplifier ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Bridge amplifier
TS420 Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA  - Flowmeter module
Biological Research Apparatus 7025 UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy  - Ventilator
Vapor 2000 Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany  - Isofluran Vaporizer
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA1PRB Ultrasonic flow probe (1mm)
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA2PSB Ultrasonic flow probe (2mm)
1st for intubation & 2nd for clean skin incisions  -  - Mayo scissor [x2]
Metzenbaum scissor  -  -  -
Cuticle scissor  -  -  -
e.g. Adson Brown tissue forceps  -  - Tissue Forceps
High precision 45° angle broad point forceps [x2]  -  -  -
Hemostat [x4]  -  -  -
e.g. Mikulicz peritoneal clamp  -  - Curved clamp
e.g. Dieffenbach clamp  -  - Micro clamp
e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm,  -  - Micro metal spatula
for transbuccal suture at intubation  -  - Needle holder
Scalpel grip  -  -  -
selfmade  -  - Intubation desk
blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow  -  - Blunt steel wire
modified arterial line 20G with Flowstich Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK #682245 Arterial line
Heating pad  -  -  -
Rectal temerature probe  -  -  -
Saline heater  -  -  -
Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat)  -  -  -
Inductionbox for inhalation anesthesia  -  -  -
Scale (able to measure mg)  -  -  -
Hair clipper  -  -  -
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden #393230 Peripheral venous catheter (14G)
Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, Smiths Medical International Ltd., Kent, UK #800/100/200 Catheter tube (PE-50)
e.g. Omnifix-F Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #9161406V Syringe 1mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606051V Syringe 5mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606205V Syringe 20mL
e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304622 Cannula (18G)
e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #300800 Cannula (23G)
e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304000 Cannula (30G)
e.g. Leukoplast S BSN medical GmbH, Hamburg,  Germany #47619-00 Adhesive tape
e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10972 Gauze compress (small)
e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10961 Gauze compress (big)
Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 SMI AG, St. Vith, Belgium #2021-04 Suture (Silk 4/0, EP 1.5)
e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany #EH7552 Transbuccal suture
e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany #967936 Cotton buds
e.g. Vue Ultrasoundgel Optimum Medical Limited, UK #1157 Ultrasound gel
e.g. Glubran 2 Gem srl, Viareggio, Italy #G-NB2-50 Tissue glue
e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel Swann-Morton, England, B.S. #202 Scalpel Knife
Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria  - Heparin
Florane Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK  - Isoflurane
OeloVital (5g) Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria  - Eye gel
Ketasol aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany  - Ketamine
Rompun Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria  - Xylazine
Xylocain 10% Pumpspray AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria  - Lidocaine pump spray
Dipidolor Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria  - Piritramide
NaCl 0.9% Fresenius, 1L Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria #13LIP132 Physiological saline solution

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References

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