Emodinamico invasivo caratterizzazione della sindrome Portal-ipertesi in ratti cirrotici

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Summary

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurazioni invasive dei parametri emodinamici, compreso pressione portale, flusso sanguigno intestinale ed emodinamica sistemica al fine di caratterizzare la sindrome iperteso in ratti.

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Königshofer, P., Brusilovskaya, K., Schwabl, P., Podesser, B. K., Trauner, M., Reiberger, T. Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats. J. Vis. Exp. (138), e57261, doi:10.3791/57261 (2018).

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Abstract

Si tratta di un protocollo dettagliato che descrive invasive misure emodinamiche in ratti cirrotici per la caratterizzazione della sindrome ipertensiva portale. Ipertensione portale (PHT) a causa di cirrosi è responsabile per le complicanze più gravi in pazienti con l'affezione epatica. Il quadro completo della sindrome ipertensiva portale è caratterizzato da aumento della pressione portale (PP) dovuto l'aumento della resistenza vascolare intraepatico (IHVR), circolazione hyperdynamic, flusso sanguigno intestinale aumentata. Vasodilatazione arteriosa splancnica progressiva e arterioso aumentato con elevata frequenza cardiaca (HR), ma bassa pressione arteriosa caratterizza la sindrome di iperteso.

Nuove terapie sono in fase di sviluppo che mirano a diminuire PP da entrambi IHVR targeting o aumentato flusso sanguigno intestinale — ma possono verificarsi effetti collaterali sull'emodinamica sistemica. Così, una dettagliata caratterizzazione del portale venosa, splancnica e parametri emodinamici sistemici, compreso la misura di PP, flusso sanguigno venoso portale (PVBF), flusso sanguigno arterioso mesenterico, pressione arteriosa media (MAP) e HR è necessaria per preclinici valutazione dell'efficacia di nuovi trattamenti per PHT. Il nostro video articolo fornisce al lettore con un protocollo strutturato per l'esecuzione di misurazioni emodinamiche invasive in ratti cirrotici. In particolare, descriviamo la cateterizzazione dell'arteria femorale e vena portale tramite una vena ileocolic e la misurazione del portale venosa e flusso sanguigno intestinale tramite sonde di flusso di Doppler-ultrasuono perivascolare. Sono mostrati risultati rappresentativi dei modelli differenti del ratto di PHT.

Introduction

PHT è definito come patologico aumento della pressione sanguigna nel sistema venoso portale che può causare le complicazioni severe in pazienti con cirrosi come spurgo variceal e ascite1. Pre-epatico (ad es., trombosi della vena portale) e post-epatica (ad es., sindrome di Budd-Chiari), mentre PHT sono rare, intraepatica PHT a causa di cirrosi epatica rappresenta la causa più comune di PHT2.

Nella cirrosi epatica, PP principalmente è aumentato in conseguenza di elevati IHVR3. Nelle fasi avanzate, PHT è aggravato dal PVBF aumentato a causa di una maggiore gittata cardiaca e diminuzione della resistenza vascolare sistemica e splancnica — definire la sindrome ipertensiva portale4. Legge di Ohm (ΔP = Q * R) implica che il flusso di sangue e IHVR sono proporzionali alla PP5. In pazienti, misura diretta della PP è rischioso e non ordinariamente svolte; invece, il gradiente di pressione venosa epatica (HVPG) viene utilizzato come una misura indiretta di PP6,7. L'HVPG è calcolata sottraendo la pressione venosa epatica libera (FHVP) dalla pressione venosa epatica incastrata (WHVP), che sono misurati utilizzando un catetere a palloncino inserito in una vena epatica8. L'HVPG fisiologico varia tra 1-5 mmHg, mentre un HVPG ≥ 10 mmHg definisce ipertensione portale clinicamente significativa (CSPH) e indica il maggior rischio di complicanze correlate a PHT, quali spurgo variceal, l'ascite e l'encefalopatia epatica9 . Anche se PP (cioè, HVPG) è il parametro più rilevante per la severità PHT, informazioni su altri componenti di PHT, compreso la gravità della circolazione di hyperdynamic (HR, MAP), il flusso sanguigno arterioso splancnico/mesenterica e IHVR, sono fondamentali per ottenere una comprensione globale del meccanismo sottostante distinto di PHT.

Così, in contrasto con le misure indirette di PP in esseri umani, la metodologia introdotta per ratti offre il vantaggio di una misura diretta di PP e permette la registrazione di ulteriori parametri emodinamici che caratterizzano la sindrome ipertensiva portale. Inoltre, la misura diretta di PP è un'eccellente lettura integrativa della quantità di fibrosi del fegato (un determinante importante del IHVR) e supera determinati limiti di quantificazione di fibrosi correlati a errori di campionamento del tessuto del fegato.

I più comunemente usati modelli del roditore di PHT cirrotici includono la legatura chirurgica dei dotti biliari (BDL), danno epatico indotto da tossina (cioè, di tetracloruro di carbonio, thioacetamide o amministrazione dimetilnitrosammina) e fegato metabolico indotta da dieta modelli di malattia. Prehepatic PHT (non cirrotici) può essere indotta da parziale della vena portale legatura (PPVL)10.

Piccoli roditori sono adatti per il metodo proposto, tra cui topi, criceti, ratti o conigli e sono associati con relativamente bassi costi di manutenzione. Nonostante che tutti le valutazioni emodinamiche sono possibile eseguire nei topi, migliore precisione e riproducibilità dei risultati sono visti con ratti o più grandi roditori dovuto l'ovvio vantaggio di dimensione animale. Inoltre, specifici micro-strumenti e dispositivi sono necessari per ottenere i parametri emodinamici simili nei topi. Infine, i ratti sono più robusti con mortalità e morbilità associata inferiore e così, i tassi di abbandono sono probabilmente più bassi nei ratti che nei topi.

La metodologia presentata è particolarmente adatta per la valutazione dei trattamenti specifici dell'affezione epatica (cioè, farmaci anti-infiammatori o anti-fibrotici) o romanzo farmacologico si avvicina quel tono vascolare influenza e/o biologia endoteliale; e così, i parametri emodinamici del probabile effetto in PHT.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di medicina di Vienna e il Ministero austriaco della scienza, ricerca ed economia (BMWFW). Le procedure devono essere eseguite in condizioni asettiche in una sala operatoria o simili pulire l'area di lavoro poiché le misure emodinamiche rappresentano gli interventi chirurgici. Generalmente, lavorando in condizioni di sterilità è raccomandato. Quando si utilizza un'anestesia per inalazione, considerare un'adeguata ventilazione della sala operatoria per sicurezza sul lavoro. Un periodo di tempo di 40 – 50 min/animale deve essere considerato nel caso tutte le letture emodinamiche presentate nel presente protocollo.

1. pre-operatoria preparazioni

  1. Accendere e calibrare il registratore multicanale elettronico, compresi i trasduttori di pressione secondo le istruzioni del fabbricante.
  2. Collegare le sonde di portata a ultrasuoni (1 mm e 2 mm) per l'amplificatore a ponte.
  3. Preparare un serbatoio di soluzione fisiologica sterile, riscaldata a temperatura corporea, 37 ° C, per inumidire i tessuti o compresse di garza.
  4. Registrare il peso corporeo dell'animale per fornire anestesia di peso-regolato e normalizzazione dei parametri emodinamici secondo il peso corporeo.
  5. Preparare tutte le attrezzature per un'anestesia per inalazione.
    Nota: Se l'anestesia per inalazione e/o attrezzature necessarie è non sul sito o fattibile, quindi anestesia iniezione utilizzando ketamina e xilazina può essere utilizzato (80 – 100 mg/kg ketamina con 5-10 mg/kg xylazina in soluzione fisiologica, intraperitoneale (i.p.)). Un ri-somministrazione di ketamina (dose ridotta di 20 – 30 mg/kg, intramuscolare (i.m.)) dopo 30 – 45 min è necessaria per indurre l'anestesia chirurgica-aereo continua.
  6. Mettere l'animale in breve termine isoflurano anestesia utilizzando un motore di induzione per l'anestesia per inalazione (5 min, isoflurano 5% v/v, 3 – 4 L O2-flusso). Attentamente inclinare la scatola e controllare la profondità dell'anestesia lo stato di immobilità dell'animale.
  7. Intubare il ratto con un idoneo tubo endotracheale self-made.
    Nota: Per il personale che sono nuovo per la tecnica di intubazione, l'analgesia/anestesia (passo 1.10) può essere data subito dopo anestesia inalazione a breve termine concedere tempo supplementare per l'intubazione. Un'altra opzione è un animale specifico maschera facciale per anestesia per inalazione.
    1. Utilizzare un tubo endotracheale di self-made da un catetere venoso periferico modificato (14 G). Tagliamo le ali di movimentazione e appone un loop di nastro adesivo per il fissaggio posteriore alla guancia del ratto per prevenire la dislocazione del tubo endotracheale (Figura 1A).
    2. Utilizzare un dispositivo di filo guida self-made da una cannula arteriosa modificata come un supporto del filo guida e il filo con la punta blunt adatto (Figura 1B).
    3. Utilizzare una scrivania di intubazione per un corretto posizionamento dell'animale. Metti l'animale in posizione supina con la testa in posizione angolata.
      Nota: Se nessun banco di intubazione è disponibile, è possibile posizionare l'animale in posizione supina con il collo allungato con attenzione sopra il bordo della tabella. Tuttavia, questa procedura non è consigliata a causa di aumento del rischio di lesioni.
    4. Difficoltà una sutura dietro gli incisivi su un lato del ratto e stendere delicatamente il collo dell'animale legando la sutura da altro lato (Figura 1).
    5. Illuminare la zona di pre-tracheale collare ventrale di un fascio di luce concentrato. Soprattutto in animali albini, assicurarsi che le corde vocali sono illuminate attraverso la pelle per consentire una migliore visualizzazione e intubazione rapida.
      Nota: Utilizzare un animale specifico laringoscopio per intubazione di animali pigmentati.
    6. Afferrare la linguetta e tirarlo delicatamente utilizzando due dita.
    7. Utilizzare un batuffolo di cotone trattato da lidocaina (pompa spray) per anestetizzare attentamente l'area laringea.
    8. Intubare l'animale inserendo il tubo endotracheale tra le corde vocali e nella trachea, utilizzando il supporto del dispositivo filo guida (Figura 1).
    9. Rimuovere il dispositivo del filo guida.
    10. Collegare il tubo al ventilatore.
    11. Avviare il ventilatore utilizzando le impostazioni appropriate per l'animale (1 L/min O2-flusso, il flusso di Auto = 90/min; pressione inspiratoria: 18 mmHg; PEEP: 3 mmHg, ho / E = 1:2) e controllare la corretta intubazione.
      Nota: Se l'inflazione dello stomaco è notato, rimuovere il tubo e riprovare. Inoltre, confrontare l'attività respiratoria al ritmo ventilatore o posizionare due dita sulla parete dell'addome destro sopra lo stomaco per valutare potenziale inflazione dello stomaco.
  8. Avviare isoflurano anestesia a 0,5 – 1,0% v/v e 1 L/min O2-avviati subito dopo intubazione riuscita (Figura 2A).
  9. Fissare il tubo endotracheale da una transbuccal della sutura attraverso la guancia e il loop di nastro adesivo apposto del tubo.
  10. Somministrare ulteriore anestesia e analgesia di due siringhe da 1 mL, per esempio, ketamina (100 mg/kg) i.p. (cannula 23G) [o i.m. distribuendo il volume iniettato (dose) in iniezioni bilaterali nel muscolo della coscia caudale (cannula per 30 G)] e piritramide (2 mg/kg) per via sottocutanea (s.c.) (cannula 23G). Nota il volume massimo di iniezioni i.m. al sito di iniezione (Figura 2B).
  11. Applicare l'unguento dell'occhio. Tagliare i peli del corpo presso la regione addominale ed entrambe le coscie interne. Disinfettare la pelle.
    Nota: Entrambe le coscie interne dovrebbero essere rasate per consentire l'utilizzo di arteria femorale controlaterale per HR e mappa misure nel caso in cui il cateterismo dell'arteria femorale non riuscita su un lato. Rasatura in un secondo tempo può causare i capelli a contaminare il campo chirurgico.
  12. Difficoltà l'animale in posizione supina su una piastra elettrica (38 ° C) con nastro adesivo (Figura 2).
  13. Monitorare la temperatura corporea dell'animale continuamente, ad esempio, utilizzando una sonda di temperatura rettale (Figura 2D).
  14. Valutare la profondità di anestesia di chiusura coperchio reflex e toe-pizzico-test prima di qualsiasi intervento o intervento chirurgico.

2. misura di HR e mappa

  1. Incidere la pelle sulla parte interna della coscia (selezionare un lato) sopra la presunta posizione dell'arteria femorale alzando la pelle di tessuto forcipe e rimozione di una zona di pelle di circa 2 cm di lunghezza di Mayo forbici (Figura 3A).
  2. Esporre e sezionare senza mezzi termini il complesso dell'arteria-vena del nervo che include l'arteria femorale da tessuto connettivo (adventitia) aprendo più volte un emostato lungo il complesso.
  3. Sezionare il complesso dell'arteria-vena del nervo dal tessuto circostante lungo ~1–1.5 cm (Figura 3B).
  4. Se necessario, rimuovere il grasso sottocutaneo/perivascolare per una vista migliore e la dissezione.
    Nota: Fare attenzione quando si rimuove il grasso sottocutaneo/perivascolare di forbici della cuticola, poiché vasi sanguigni feriti può causare emorragie. Se il sanguinamento è notato, applicare una pressione sulla zona sanguinante utilizzando una piccola garza o fermare l'emorragia di una pinza emostatica.
  5. Separare l'arteria femorale dalla vena femorale e del nervo con il forcipe alta precisione 45° angolo ampio punto di due (considera che la vena femorale è la struttura più mediale e l'arteria femorale si trova più laterale) (Figura 3-F).
  6. Appoggiate una legatura dell'arteria femorale distale come possibile e utilizzare un morsetto curvo sulla sutura per applicare lieve trazione longitudinale all'arteria femorale.
  7. Posizionare una seconda sutura pre-annodata (ma non chiuso nodo) sull'arteria femorale prossimale come come possibile (Figura 3).
  8. Preparare un catetere adatto (PE-50 per arteria femorale del ratto) con una punta di taglio inclinato (~ 45°) lavata con soluzione fisiologica sterile eparinizzata (cannula 5 mL siringa e 23 G smussa). Garantire che bolle d'aria non sono all'interno del catetere come essi ostacolano la pressione arteriosa e della lettura HR (Figura 3 H).
  9. Comprimere l'arteria femorale all'estremità prossimale della sezione esposta utilizzando una micro pinza per interrompere temporaneamente il flusso di sangue arterioso (Figura 3I).
  10. Perforare la parete arteriosa in posizione distale della sezione dissecata utilizzando una cannula piegata (23 G) pur ponendo una spatola di metallo micro supporto sotto l'arteria femorale (Figura 3J).
  11. Attentamente cateterismo dell'arteria femorale attraverso la perforazione con la punta inclinata del catetere rivolta verso l'alto. Avanzare il catetere fino a quando la micro pinza è approssimata (Figura 3 K).
    Nota: In caso di esito negativo cateterizzazione dell'arteria femorale al primo tentativo, un secondo tentativo più prossimale può essere eseguito (iniziare al punto 2.8). Se si verifica la rottura dell'arteria o spurgo severo, legare o il morsetto dell'arteria prossimale come possibile prevenire l'ulteriore perdita di sangue. Se la perdita di sangue è minima, tentare il cateterismo dell'arteria femorale controlaterale (iniziare al punto 2.1).
  12. Aprire la micro pinza e verificare per il flusso di sangue arterioso pulsatile nel catetere (Figura 3 L).
  13. Impedire ulteriore afflusso di sangue nel catetere bloccando la fuoriuscita del catetere.
  14. Fissare il catetere nella sua posizione di intraluminal chiudendo la legatura prossimale disposta intorno all'arteria femorale e il catetere introdotto (Figura 3 M).
  15. Ripetutamente sciacquare ed aspirare il catetere nell'arteria femorale per valutare il corretto posizionamento intravascolare. Pulsazione arteriosa nella colonna del sangue aspirato dovrebbe essere facilmente percepibili.
  16. Fissare la posizione del catetere lungo la nave usando le estremità della legatura distale per impedire la dislocazione e garantire una posizione longitudinale del catetere (Figura 3N).
  17. Inoltre, nastro il catetere in prossimità dell'animale sul tavolo operatorio per fissarlo e prevenire la dislocazione accidentale.
  18. Collegare il catetere riempito con soluzione fisiologica al trasduttore di pressione, evitando la formazione di bolle d'aria.
  19. Avviare la registrazione la HR e mappa utilizzando l'interfaccia digitale (Figura 3O).
  20. Coprire l'area esposta sulla parte interna della coscia con una compressa di garza inumidita piccolo (Figura 3 P).
  21. Calcolare l'indice di hyperdynamic (HD): HD = mappa/HR.
    Nota: Nel PHT avanzata, l'indice di HD è elevata rispetto agli animali non-portale ipertesi. Tuttavia, un aumento nell'indice di HD durante la chirurgia potrebbe anche indicare emorragia, ipovolemia o dolore. Se valori registrati mappa sono molto bassi, ma il segnale è buono e il flusso pulsatile è rilevato nel catetere, controllare il livello dell'anestesia e potenzialmente ridurre il livello di anestesia. Non interrompere completamente isoflurano anestesia, poiché questo può condurre a profondità di anestesia insufficiente secondo il benessere degli animali e buona prassi scientifica.

3. superiore dell'arteria mesenterica del flusso sanguigno (SMABF)

  1. Eseguire una laparotomia mediana (fig. 4A-C)
    1. Sollevate lo strato di pelle con pinze 5 – 6 cm sotto il xifoideo e rimuovere una sottile striscia di pelle utilizzando un Mayo a forbice sopra la linea alba fino al xifoideo è raggiunto.
    2. A metà l'incisione cutanea, sollevate lo strato muscolare dal forcipe del tessuto lungo la linea alba per creare una distanza tra la parete addominale e organi intestinali.
    3. Aprire la cavità peritoneale di incisione della parete addominale con un bisturi presso la linea alba. Estendere l'apertura mentre si solleva la parete addominale dal forcipe del tessuto con una forbice di Metzenbaum lungo la linea alba sulla stessa distanza come lo strato della pelle.
  2. Delicatamente scavare l'intestino utilizzando bastoncini di cotone bagnato iniziando con il coecum e posizionarlo su un impacco di grande garza imbevuto di soluzione fisiologica sterile accanto a incisione (Figura 4-F).
  3. Avvolgere l'intestino nell'impacco di garza e assicurarsi che è inumidito con soluzione fisiologica sterile (Figura 4).
  4. Individuare ed esporre l'arteria mesenterica superiore.
  5. Sezionare l'arteria mesenterica superiore con due self-made smussato 'Schwabl'-ganci: sollevare l'arteria con il primo gancio e provare a posizionare il secondo uno attraverso il tunnel del tessuto stesso. Esporre l'arteria mesenterica superiore lungo una distanza di 5 mm per garantire che la sonda di flusso (1 mm) può essere collocata intorno ad esso (Figura 4 H-K).
    Nota: Se si preferisce, una pinza di precisione 45° angolo ampio punto consente di sollevare l'arteria pure. 'Schwabl'-ganci sono preparati da aghi da 30g con punte senza mezzi termini rotti piegato a forma di gancio. Se le arterie collaterali sono estese, il 'Schwabl'-ganci possono essere più sicuri come bleedings dai collaterals mentre dissezione dell'arteria mesenterica superiore può essere evitato. Se il sanguinamento si verifica mentre si prepara l'arteria mesenterica superiore, inserire un impacco di piccola garza sul sito emorragico per 1 – 2 min con una leggera pressione. Piccolo sanguinamento di solito si ferma rapidamente; Tenete sempre a mente per inumidire il tessuto periodicamente (passo 1.12). Se l'arteria mesenterica superiore si è danneggiato, devono terminare la valutazione emodinamiche.
  6. Applicare il gel per ultrasuoni al sensore della sonda di portata ad ultrasuoni e allegarlo all'arteria mesenterica splancnica. Allinearlo all'itinerario naturale dell'arteria mesenterica superiore (Figura 4L-M).
  7. Chiudere la sonda di flusso (1 mm) e se necessario delicatamente applicare gel per ultrasuoni supplementari sul sensore Doppler per migliorare la qualità del segnale. Farlo utilizzando una siringa (20 mL) riempita con gel per ultrasuoni e una cannula con punta blunt (18 G) (Figura 4N-O).
    Nota: Se la sonda di flusso non è ben allineata lungo il corso naturale della nave, tensione potrebbe causare costrizione vascolare e, quindi, flusso turbolento, che riduce la precisione delle misurazioni del flusso. Prova a ri-allineare la direzione della sonda flusso lungo il percorso naturale della nave e quindi sufficientemente fissare la sonda di flusso in modo adeguato.
  8. Il SMABF di misurare e valutare la conformità dell'ingresso del flusso pulsatile alle vette sistolica della registrazione dell'arteria femorale.
    Nota: Se i valori registrati mappa sono molto bassi ma il segnale è buono e il flusso pulsatile è rilevato nel catetere, controllare il livello dell'anestesia e potenzialmente ridurre il livello di anestesia. Non interrompere completamente l'anestesia isoflurano, poiché questo può portare a insufficiente profondità dell'anestesia secondo il benessere degli animali e buona prassi scientifica.
  9. Trovare una posizione stabile della sonda di flusso (1 mm) e fissare il cavo della sonda di flusso. Iniziare a registrare il SMABF senza ulteriori manipolazioni della sonda di flusso (1 mm) (Figura 4 P).

4. PVBF

  1. Individuare ed esporre la vena portale alla faccia dorsale del mesentery che è vicino al hilum del fegato (Figura 5A).
  2. Delicatamente sezionare la vena portale dal tessuto circostante utilizzando una pinza di alta precisione 45° angolo ampio punto: isolare la vena portale spingendo delicatamente e ripetutamente il forcipe sotto la vena portale per creare un tunnel nel tessuto (figura 5B).
    Nota: Se si verifica un sanguinamento dal tessuto periportale mentre si prepara la vena portale, applicare una leggera pressione sul sito emorragico per 1-2 min utilizzando un batuffolo di cotone; Questo spesso si ferma l'emorragia.
  3. Ingrandire il tunnel aprendo lentamente il forcipe di ampio punto di alta precisione 45° angolo ed esporre la vena portale lungo una distanza di 5-6 mm per consentire il posizionamento della sonda di flusso perivascolare (2 mm) (Figura 5, D).
  4. Applicare il gel per ultrasuoni al sensore della sonda di portata ad ultrasuoni e allegarlo alla vena portale allineata con il suo percorso naturale (Figura 5E).
  5. Chiudere la sonda di flusso (2 mm) e applicare il gel per ultrasuoni supplementari se necessario, come descritto in precedenza (punto 3.7) (Figura 5F).
  6. Assicurarsi che la sonda di flusso sia posizionata in modo non costrittiva intorno alla vena portale (Figura 5).
    Nota: Se la sonda di flusso non è ben allineata lungo il corso naturale della nave, tensione potrebbe causare costrizione vascolare e, quindi, flusso turbolento, che riduce la precisione delle misurazioni del flusso. Prova a ri-allineare la direzione della sonda flusso lungo il percorso naturale della nave e quindi sufficientemente fissare la sonda di flusso in modo adeguato.
  7. Trovare una posizione stabile della sonda di flusso (2 mm) e fissare il cavo della sonda di flusso. Quindi, avviare la registrazione PVBF (Figura 5 H).
    Nota: Se i valori registrati mappa sono molto bassi ma il segnale è buono e il flusso pulsatile è rilevato nel catetere, controllare il livello dell'anestesia e potenzialmente ridurre il livello di anestesia. Non interrompere completamente l'anestesia isoflurano, poiché questo può portare a insufficiente profondità dell'anestesia secondo il benessere degli animali e buona prassi scientifica.

5. PP

  1. Preparare un catetere (PE-50 per vene mesenteriche del ratto) con un inclinato (circa 45°) punta di cut-off che si è lavata con soluzione fisiologica sterile (siringa da 5 mL e cannula smussa 23 G). Prestare attenzione che non sono bolle d'aria all'interno del catetere che ostacolino la lettura PP (Figura 6A).
  2. Gestire l'intestino con i guanti bagnati e luogo che sparse per le dita (Figura 6B).
  3. Ottimizzare la visualizzazione del letto vascolare mesenterica vicino al piccolo intestino (Figura 6).
  4. Identificare i vasi mesenterici venosi principali che conduce alla vena portale (Portae del vena ileocolica - mesenterica di vena - vena).
  5. Troverete un bivio adatto della vena ileocolonic che è accessibile per cateterizzazione.
  6. Prima il bastone il catetere in tessuto mesenterico di perforazione del peritoneo viscerale del mesentery vicino a svincolo vascolare scelto per cateterizzazione.
  7. Far avanzare con cautela la punta inclinata del catetere più vicino ad una giunzione della vena ileocolic fino a quando si vede una leggera impressione della giunzione nave (Figura 6).
  8. Infine, cateterismo sistema venoso in linea con la giunzione rotta nave da perforazione della parete vascolare presso l'angolo di incrocio dei vasi. (Figura 6E).
    Nota: Se si verifica sanguinamento il cateterismo della vena ileocolic, utilizzando una pressa di pollice con una compressa di garza piccola nella zona di sanguinamento. Questa pressione deve essere mantenuta per 1 – 2 min fermare l'emorragia. In seguito, provare a inserire il catetere in una filiale più prossimale della vena ileocolic.
  9. Far avanzare il catetere con attenzione ulteriore lungo il percorso principale vaso venoso alla vena portale senza perforazione della vena (Figura 6F).
    Nota: Tenere il catetere a una distanza sufficiente alla sonda di flusso posizionato intorno al ramo principale della vena portale per evitare artefatti nel segnale di flusso e per impedire la perforazione della vena portale.
  10. Collegare il catetere riempito con soluzione fisiologica al trasduttore di pressione, evitando la formazione di bolle d'aria.
  11. Avviare la registrazione la PP.
  12. Registrare tutti i parametri emodinamici simultaneamente in condizioni stabili per diversi minuti (Figura 6, H). Facoltativamente, il catetere venoso portale può essere fissato in posizione mediante colla tessuto e l'intestino può essere ri-trova nella cavità addominale.
    Nota: Se i valori registrati mappa sono molto bassi ma il segnale è buono e il flusso pulsatile è rilevato nel catetere, controllare il livello dell'anestesia e potenzialmente ridurre il livello di anestesia. Non interrompere completamente l'anestesia isoflurano, poiché questo può portare a insufficiente profondità dell'anestesia secondo il benessere degli animali e buona prassi scientifica.

6. IHVR

  1. Dopo sacrificare l'animale, misurare il peso del fegato. Calcolare il IHVR: IHVR = PVBF/PP normalizzare questo valore PVBF per il peso del fegato.

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Representative Results

A seconda del modello animale e la severità dell'affezione epatica, il grado di PHT e la severità della sindrome ipertensiva portale è diverso (Figura 7).

Il modello BDL provoca cirrosi biliare dovuto colestasi. Di conseguenza, PP aumenta nel tempo e un hyperdynamic circolazione si sviluppa, come visto da un aumento di HR e diminuzione della mappa. Negli animali cirrotici, SMABF, PVBF e IHVR anche aumentare concordemente le alterazioni epatiche ed emodinamiche (figura 7AF).

Al contrario, PPVL cause prehepatic, non cirrotici PHT, che è caratterizzata da un aumento immediato in PP e le modifiche corrispondenti in emodinamica sistemica (Figura 7-io). Tuttavia, durante i collaterals portosystemic tempo corso sviluppare che può abbassare PP.

I valori emodinamici di animali falsità-azionati rimangono a livelli fisiologici e non sono cambiato significativamente nel corso del tempo. La pressione portale in animali sani SO è al massimo 5-6 mmHg (figura 7J-L).

Figure 1
Figura 1: dispositivi self-made intubazione: (A) tubo endotracheale. (B) guida filo reception di intubazione del dispositivo (C). (D) il tubo collegato al dispositivo di guida filo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: preparazione pre-operatoria: (A) l'intubazione dell'animale. (B) intramuscolare e sottocutanea per l'anestesia. (C) fissazione di animale sulla stuoia del riscaldamento. (D) posizionamento e fissaggio sonda temperatura rettale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: frequenza cardiaca (HR) e pressione arteriosa media (MAP): (A) incisione cutanea. (B) preparazione della femorale vascolare e strutture nervose. (CF) Dissezione dell'arteria femorale. Sutura distale (G) e fissazione - prossimale pre-nodo sutura prossimale. (H) preparazione del catetere femorale. (io) posizionamento del morsetto micro vascolare. (J) perforazione dell'arteria femorale con un ago di curvatura. (K) cateterizzazione dell'arteria femorale. (L) apertura di micro pinza per la valutazione dell'impulso. (M) fissazione prossimale del catetere. (N) di fissaggio distale del catetere. (O) misurazione della mappa e HR (P) che copre il campo chirurgico con garza piccola imbevuto comprimere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: flusso di sangue arterioso mesenterico superiore (SMABF): (AC) Laparotomia mediana. (D) lo scavo di coecum. (EF) Scavo dell'intestino. (G) avvolgimento degli intestini in compressa di garza imbevuta. (HK) Preparazione dell'arteria mesenterica splancnica con cannula smussa ganci. (L, M) Collegamento della sonda di flusso. (N) applicazione degli ultrasuoni gel sul sensore sonda di flusso. Corretto posizionamento non costrittiva (O) della della sonda di flusso. (P) misura di SMABF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: flusso sanguigno venoso portale (PVBF): (A) ottimizzato dorsale Mostra su vena portale (B) la dissezione della vena portale dal tessuto adiposo mesenterico. (C) creazione di un tunnel nel tessuto per la sonda di flusso della vena portale. (D, E) Collegamento della sonda flusso alla vena portale. (F) applicazione degli ultrasuoni gel sul sensore sonda di flusso. (G) corretto non costrittiva posizionamento della sonda di flusso. (H) misura di PVBF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: pressione portale (PP): (A) preparazione del catetere. (B) preparazione dell'intestino. (C) ottimizzata Mostra sul sistema vascolare venoso mesenterico principale. (D) perforazione del peritoneo viscerale e avanzamento del ramo vascolare più vicino a adatto del catetere. (E) cateterizzazione della vena ileocolic al angolo di giunzione tra il ramo principale e un ramo laterale. Avanzamento (F) della punta del catetere nella vena portale più vicino all'ILO del fegato. (G, H) Misurazione di PP Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: rappresentante risultati: Corso di tempo di (A) PP, mappa (B) e (C) HR nei ratti di BDL. Di conseguenza, si osservano cambiamenti nella SMABF (D), PVBF (E) e (F) IHVR. In PPVL, i cambiamenti emodinamici di PP (G) e (H) mappa (io) HR sono più evidenti nei primi giorni dopo l'intervento chirurgico. Nel sano falsità-azionati (così) animali, PP (J), (K) (L) HR e mappa rimangono entro valori fisiologici e non cambiano nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

PP è il parametro principale di risultato per la valutazione della sindrome iperteso e riflette la gravità della cirrosi sottostante. Sia la deposizione di matrice (cioè, fibrosi) e vasocostrizione sinusoidale (causa di aumentata espressione epatica di vasocostrittori e risposta ai vasodilatatori in diminuzione) causare aumento IHVR. L'importanza di PP e il suo impatto sull'affezione epatica cronica è stato dimostrato in più preclinici11,12,13,14 e studi clinici15,16, 17 , 18. quindi, nei pazienti cirrotici, PP è un parametro di risultato difficile, e sua riduzione è raccomandata da trattamento linee guida19,20 e un obiettivo di ricerca principale dell'attuale Epatologia. Modelli animali complete sono necessarie per caratterizzare e tradurre16,21 opzioni di trattamento novello di PHT22. Questo protocollo presenta la metodologia necessaria per una dettagliata caratterizzazione emodinamica, compresa la valutazione della pressione portale, circolazione hyperdynamic, vasodilatazione splancnica e resistenza intraepatico. Per realizzare un rappresentante ed emodinamico completo set di dati da modelli del roditore, esperienza ed addestramento dell'operatore performante è della massima importanza.

Prevenzione e controllo dei sanguinamenti gravi sono competenze soprattutto chiave. Preparazioni smussati e precise delle sezioni di interesse vascolare è fondamentale al fine di evitare errori di inserimento di una canula e gravi emorragie. Significativa perdita di sangue ha un impatto sull'emodinamica e preclude misurazioni accurate di PP o può anche derivare nella morte dell'animale di laboratorio. Bleedings di documento che si sono verificati durante le misurazioni nei protocolli e caratterizzano la gravità e la posizione di spurgo.

Della nota, utilizzando sonde perivascolari ecografiche flusso per valutare il flusso sanguigno genera solo un'approssimazione e potrebbe essere sottoposti a lettura errori, dovuti alla nave diverse dimensioni e allineamento errato sonda. Un'altra tecnica per misurare il flusso sanguigno e la particolare distribuzione del flusso sanguigno (incluso calcolo di smistamento portosystemic) è la tecnica di microsfere colorate23. Tuttavia, organi interi devono essere raccolte, dissolto e analizzati, e questo consente di omettere la possibilità di eseguire istologico o l'analisi di espressione. Quindi, la tecnica di ultrasuono sostiene i principi delle 'Tre r' nella ricerca animale (ridurre, perfezionare e sostituire) di Russell e Burch24. Inoltre, sonde di flusso sono adatti per monitorare il flusso sanguigno intestinale in tempo reale e parallela ad altri parametri emodinamici, mentre la tecnica di microsfere colorate richiede l'integrazione dell'organo (sangue mesenterico) flusso nel tempo. Inoltre, colorate microsfere, che solitamente hanno un diametro di 15 µm, richiedono una distribuzione normale dei micro-vasi con un diametro < 15 µm negli organi rispettivi per evitare di diventare intrappolati ed immobile, che potrebbe non essere il caso in fegati cirrotici.

La principale limitazione di questo metodo è la necessità di uno stato di incoscienza e anestesia durante la caratterizzazione emodinamica della sindrome PHT negli animali. L'iniezione più comune e ampiamente usato anestesia chetamina/xilazina richiede spesso redosing dopo 30 – 45 minuti per ottenere una profondità necessaria di anestesia25,26; Questo aggiunge pressione del tempo, soprattutto se è richiesta la risoluzione dei problemi. Usando l'inalazione anestesia comporta molti vantaggi, ma attrezzatura speciale è richiesto, e anestetici correlate ai volatili regolamenti di sicurezza devono essere seguiti. La profondità dell'anestesia può essere adattata rapidamente senza interferire con le procedure di chirurgia regolando la concentrazione di anestesia. Il tubo endotracheale assicura airways, soprattutto dopo l'attivazione della salvezza di ketamina e la ventilazione garantisce sufficiente ossigenazione e ventilazione dell'animale per ridurre il rischio di morte indotta da anestesia27. Mentre chetamina/xilazina è ancora ampiamente usato, della basso-dose isoflurano anestesia non provoca nessun cambiamento significativo dei parametri emodinamici o cardiovascolari in ratti28,29.

Regolamenti e l'esperienza locale forniscono proceduti consigli e best practice dell'anestesia e i ricercatori devono riconsiderare continuamente il tipo di anestesia utilizzato per eseguire queste valutazioni emodinamiche30. Gli esperimenti futuri potrebbero utilizzare telemetria con trasduttori di pressione wireless impiantato che consente di superare l'attuale anestesia correlate ai generali limitazioni e consentire emodinamico caratterizzazione di animali coscienti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo i veterinari, infermieri e detentori di animali presso il centro di ricerca biomedica per il continuo supporto durante i nostri progetti di ricerca. Gli autori riconoscono l'importante contributo di tutti gli ospiti del presente protocollo. Alcune delle ricerche è stato finanziato dal "Young Science Award" della società austriaca di gastroenterologia ed epatologia (ÖGGH) per PS e il premio"Skoda" della società austriaca di medicina interna a TR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
LabChart 7 Pro software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Software
ML870 PowerLab 8/30 ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Electronic multichannel recorder
MLT0380/D ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure)
ML112 Quad Bridge Amplifier ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Bridge amplifier
TS420 Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA  - Flowmeter module
Biological Research Apparatus 7025 UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy  - Ventilator
Vapor 2000 Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany  - Isofluran Vaporizer
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA1PRB Ultrasonic flow probe (1mm)
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA2PSB Ultrasonic flow probe (2mm)
1st for intubation & 2nd for clean skin incisions  -  - Mayo scissor [x2]
Metzenbaum scissor  -  -  -
Cuticle scissor  -  -  -
e.g. Adson Brown tissue forceps  -  - Tissue Forceps
High precision 45° angle broad point forceps [x2]  -  -  -
Hemostat [x4]  -  -  -
e.g. Mikulicz peritoneal clamp  -  - Curved clamp
e.g. Dieffenbach clamp  -  - Micro clamp
e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm,  -  - Micro metal spatula
for transbuccal suture at intubation  -  - Needle holder
Scalpel grip  -  -  -
selfmade  -  - Intubation desk
blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow  -  - Blunt steel wire
modified arterial line 20G with Flowstich Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK #682245 Arterial line
Heating pad  -  -  -
Rectal temerature probe  -  -  -
Saline heater  -  -  -
Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat)  -  -  -
Inductionbox for inhalation anesthesia  -  -  -
Scale (able to measure mg)  -  -  -
Hair clipper  -  -  -
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden #393230 Peripheral venous catheter (14G)
Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, Smiths Medical International Ltd., Kent, UK #800/100/200 Catheter tube (PE-50)
e.g. Omnifix-F Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #9161406V Syringe 1mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606051V Syringe 5mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606205V Syringe 20mL
e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304622 Cannula (18G)
e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #300800 Cannula (23G)
e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304000 Cannula (30G)
e.g. Leukoplast S BSN medical GmbH, Hamburg,  Germany #47619-00 Adhesive tape
e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10972 Gauze compress (small)
e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10961 Gauze compress (big)
Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 SMI AG, St. Vith, Belgium #2021-04 Suture (Silk 4/0, EP 1.5)
e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany #EH7552 Transbuccal suture
e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany #967936 Cotton buds
e.g. Vue Ultrasoundgel Optimum Medical Limited, UK #1157 Ultrasound gel
e.g. Glubran 2 Gem srl, Viareggio, Italy #G-NB2-50 Tissue glue
e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel Swann-Morton, England, B.S. #202 Scalpel Knife
Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria  - Heparin
Florane Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK  - Isoflurane
OeloVital (5g) Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria  - Eye gel
Ketasol aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany  - Ketamine
Rompun Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria  - Xylazine
Xylocain 10% Pumpspray AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria  - Lidocaine pump spray
Dipidolor Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria  - Piritramide
NaCl 0.9% Fresenius, 1L Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria #13LIP132 Physiological saline solution

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References

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