Invasiva hemodynamiska karakterisering av Portal-hypertensiv syndrom hos cirrotiska råttor

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för invasiva mätningar av hemodynamiska parametrar inklusive portal tryck, splanchnic blodflödet och systemiska hemodynamiken för att karakterisera den portal hypertensiv syndromet hos råttor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Königshofer, P., Brusilovskaya, K., Schwabl, P., Podesser, B. K., Trauner, M., Reiberger, T. Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats. J. Vis. Exp. (138), e57261, doi:10.3791/57261 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detta är en detaljerad protokoll som beskriver invasiva hemodynamiska mätningar hos cirrotiska råttor för karakterisering av portal hypertensiv syndrom. Portal hypertension (PHT) på grund av cirros är ansvarig för de mest allvarliga komplikationerna hos patienter med leversjukdom. En fullständig bild av portal hypertensiv syndrom kännetecknas av ökat portal tryck (PP) på grund av den ökade intrahepatisk kärlmotstånd (IHVR) och hyperdynamic omsättning ökade splanchnic blodflödet. Progressiv splanchnic arteriell vasodilatation och ökad hjärtminutvolym med förhöjd puls (HR) men låga artärtryck karakteriserar den portal hypertensiv syndromet.

Nya terapier för närvarande utvecklas som syftar till att minska PP av antingen inriktning IHVR eller ökat splanchnic blodflöde — men biverkningar på systemiska hemodynamiken. Således en detaljerad karakterisering av portalen venös, splanchnic och systemiska hemodynamiska parametrar, inklusive mätning av PP, portalen venösa blodflödet (PVBF), mesenteriska arteriella blodflödet, genomsnittliga arteriella trycket (karta) och HR behövs för prekliniska utvärdering av effekten av nya behandlingar för PHT. Vår video artikel ger läsaren med ett strukturerat protokoll för att utföra invasiva hemodynamiska mätningar hos cirrotiska råttor. I synnerhet vi beskriver kateterisering av femoralartären och portalen ven via ett ileocolic ven och mätning av portalen venös och splanchnic blodflödet via perivaskulär Doppler-ultraljud flöde sonder. Representativa resultat av olika råtta modeller av PHT visas.

Introduction

PHT definieras som patologiskt förhöjt blodtryck i portalen venösa systemet som kan orsaka allvarliga komplikationer hos patienter med cirros såsom variceal blödning och ascites1. Även före leverfunktion (t.ex., vena portae) och efter leverfunktion (t.ex., Budd-Chiari syndrom) PHT är sällsynta, intrahepatisk PHT på grund av skrumplever utgör den vanligaste orsaken till PHT2.

I skrumplever ökar PP primärt till följd av förhöjda IHVR3. I avancerade stadier, PHT förvärras av den ökande PVBF på grund av ökad hjärtminutvolym och minskade systemisk och splanchnic kärlmotstånd — definiera de portal hypertensiv syndrom4. Ohms lag (ΔP = Q * R) innebär att IHVR och blod flödet är proportionell till PP5. Hos patienter är direkt mätning av PP riskabelt och inte rutinmässigt utförs; i stället används den nedsatt venösa tryckgradienten (HVPG) som ett indirekt mått på PP6,7. HVPG beräknas genom att subtrahera gratis nedsatt venös trycket (FHVP) från inklämd nedsatt venös trycket (WHVP), som mäts med hjälp av en ballongkateter som placeras i en nedsatt ven8. Den fysiologiska HVPG varierar mellan 1 – 5 mmHg, medan en HVPG ≥10 mmHg definierar kliniskt signifikant portal hypertoni (CSPH) och indikerar ökad risk för PHT-relaterade komplikationer, såsom variceal blödning, ascites och leverencefalopati9 . Även om PP (dvsHVPG) är den mest relevanta parametern för PHT svårighetsgrad, information om andra komponenter i PHT, inklusive svårighetsgraden av hyperdynamic omsättning (HR, karta), är splanchnic/mesenterica arteriella blodflödet och IHVR, kritiska till Skaffa en omfattande förståelse av olika underliggande mekanismen av PHT.

Således, i motsats till indirekta mätningar av PP i människor, introducerade metoden för råttor erbjuder fördelen av en direkt mätning av PP och tillåter inspelning av ytterligare hemodynamiska parametrar som kännetecknar den portal hypertensiv syndromet. Dessutom direkt mätning av PP är en utmärkt integrativ avläsning av leverfibros (avgörande betydelse för IHVR) och övervinner vissa begränsningar av fibros kvantifiering relaterade till levervävnad urvalsfel.

De vanligaste gnagare modellerna av cirrotiska PHT inkluderar kirurgiska gallgången ligatur (BDL), toxin inducerad leverskada (dvs.av koltetraklorid, thioacetamide eller dimethylnitrosamine administration) och kost-inducerad metabolisk lever sjukdomsmodeller. Prehepatic (icke-cirrotiska) PHT kan induceras av partiell portvenen ligatur (PPVL)10.

Små gnagare lämpar sig väl för denna metod, inklusive möss, hamstrar, råttor eller kaniner, och associeras med relativt låga underhållskostnader. Trots detta ses alla de hemodynamiska bedömningarna är möjlig att utföra i möss, bättre noggrannhet och reproducerbarheten av resultaten med råttor eller större gnagare på grund av den uppenbara fördelen med djurens storlek. Dessutom behövs särskilda mikro-instrument och enheter att få liknande hemodynamiska parametrar hos möss. Slutligen, råttor är mer robust med lägre associerade sjuklighet och dödlighet och således de i förtid sannolikt lägre hos råttor än hos möss.

Den presenterade metoden är väl lämpad för att utvärdera specifika behandlingar leversjukdom (dvs, anti fibrotiska eller antiinflammatoriska läkemedel) eller roman farmakologiska närmar sig det inflytande kärltonus och/eller endotelceller biologi; och således sannolikt effekt hemodynamiska parametrar i PHT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den etiska kommittén vid medicinska universitetet i Wien och det österrikiska ministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi (BMWFW). Procedurer måste utföras under aseptiska förhållanden i en drift rum eller liknande ren arbetsplats eftersom de hemodynamiska mätningarna representerar kirurgiska ingrepp. Generellt rekommenderas arbetar i sterila förhållanden. När du använder en inandning anestesi, överväga tillräcklig ventilation av kirurgi rummet för arbetarskydd. En tidsperiod på 40 – 50 min/djur måste övervägas i fall alla hemodynamiska utläsningar presenteras i detta protokoll.

1. före kirurgiska preparat

  1. Slå på och kalibrera elektroniska flerkanaliga diktafonen inklusive tryckgivare enligt tillverkarens anvisning.
  2. Anslut de ultraljud flöde sonderna (1 mm och 2 mm) till bron förstärkaren.
  3. Förbereda en reservoar av steril fysiologisk koksaltlösning lösning, värms till kroppstemperatur, 37 ° C, för att fukta vävnader eller gasväv kompresser.
  4. Rekord i djurens kroppsvikt ge vikt justerade anestesi och normalisering av hemodynamiska parametrar enligt kroppsvikt.
  5. Förbered all utrustning för en inandning anestesi.
    Obs: Om inandning anestesi eller nödvändig utrustning är inte på plats eller genomförbart, då injektion anestesi med ketamin och xylazin kan användas (80 – 100 mg/kg ketamin med 5 – 10 mg/kg xylazin i fysiologisk koksaltlösning lösning, intraperitoneal (IP)). Ett nytt dosering av ketamin (reducerad dos på 20 – 30 mg/kg, intramuskulär (i.m.)) efter 30 – 45 min är nödvändigt att inducera kontinuerlig kirurgiska-plane anestesi.
  6. Lägga djuret under kortsiktiga isofluran anestesi med en induktion box för inandning anestesi (5 min, 5% v/v isofluran, 3 – 4 L O2-flöde). Försiktigt luta rutan och kontrollera djup anestesi av orörlighet status för djuret.
  7. Intubation råtta med en lämplig self-made endotrakealtub.
    Obs: För personal som är nya för intubation tekniken, den smärtlindring/anestesi (steg 1.10) kan ges direkt efter kortvarig inandning anestesi att ge extra tid för intubation. Ett annat alternativ är en djur-specifika ansiktsmask för inandning anestesi.
    1. Använd en self-made endotrakealtub från en modifierad perifer venkateter (14 G). Skär av vingarna hantering och anbringa en tejp loop för bakre fixering till råttans mage att förhindra dislokation av endotrakealtub (figur 1A).
    2. Använda en self-made guide tråd enhet från en modifierad arteriell kanyl som en guide tråd hållare och en lämplig trubbig spets tråd (figur 1B).
    3. Använd lämplig intubation skrivbord för korrekt placering av djuret. Placera djuret i ryggläge med huvudet i vinklad position.
      Obs: Om ingen intubation skrivbord är tillgängliga, är det möjligt att placera djuret i ryggläge med nacken försiktigt sträckte sig över bordskanten. Detta förfarande rekommenderas dock inte på grund av ökad risk för skador.
    4. Fixa en sutur bakom på framtänderna på ena sidan av råtta, och försiktigt sträcka djurets hals genom att knyta suturen på andra sidan (figur 1 c).
    5. Belysa området före luftrör ventrala krage av en fokuserad ljusstråle. Särskilt i albino djur, säkerställa att stämbanden belyses genom huden för att förbättrad visualisering och snabba intubation.
      Obs: Använd en djur-specifika laryngoskop för intubation av pigmenterade djur.
    6. Ta tungan och dra försiktigt ut det med hjälp av två fingrar.
    7. Använd en bomullstopp som behandlas av lidokain (pumpspray) att noggrant söva området larynx.
    8. Intubation djuret genom att infoga endotrakealtub mellan stämbanden och i luftstrupen, med stöd av guide tråd enheten (figur 1 d).
    9. Ta bort guide tråd enheten.
    10. Anslut röret till ventilatorn.
    11. Starta ventilatorn med lämpliga inställningar för djuret (1 L/min O2-flöde, Auto flöde = 90/min; inandningstryck: 18 mmHg; PEEP: 3 mmHg, jag / E = 1:2) och kontrollera om korrekt intubation.
      Obs: Om inflationen i magen noteras, ta bort röret och försök igen. Dessutom jämför respiratoriska aktiviteten till ventilatorn rytm eller placera två fingrar på den buk-väggen rätt över magen för att bedöma potentiella inflationen i magen.
  8. Starta isofluran anestesi på 0,5 – 1,0% v/v och 1 L/min O2-flöde omedelbart efter lyckad intubation (figur 2A).
  9. Fixa endotrakealtub av en transbuccal sutur genom kinden och fäst tejp loop av röret.
  10. Administrera ytterligare anestesi och analgesi av två 1 mL sprutor, t exketamin (100 mg/kg) i.p. (23 G kanyl) [eller i.m. genom att distribuera den injicerade volymen (dos) bilaterala injektioner i bakre lårmuskeln (30 G kanyl)] och piritramide (2 mg/kg) av subkutana (s.c.) injektion (23 G kanyl). Notera den högsta volymen i.m. injektioner per injektionsställe (figur 2B).
  11. Tillämpa ögonsalva. Klipp kroppshår på buken regionen och båda inre lår. Desinficera huden.
    Obs: Båda lårens bör vara rakad för att tillåta användning den kontralaterala femoralisartären för HR och karta mätningar i fall kateterisering av femoralartären misslyckades på ena sidan. Rakning en senare tidpunkt kan orsaka hår att förorena operationsområdet.
  12. Fixa djuret i ryggläge på en värmedyna (38 ° C) med självhäftande tejp (figur 2 c).
  13. Övervaka kroppstemperaturen hos djuret kontinuerligt, t.ex., med hjälp av en rektal temperatursond (figur 2D).
  14. Bedöma anestesi djupet av luckstängning reflex och tå-nypa-test före intervention eller kirurgi.

2. mätning av HR och karta

  1. Incisionsfilm huden på de inre lår (Välj en sida) ovanför förmodade platsen av femoralartären genom att lyfta huden av vävnad tång och ta bort huden på ca 2 cm längd av Mayo hobbyverktyg (figur 3A).
  2. Exponera och rakt på sak dissekera komplexet artär-ven-nerv som innehåller femoralartären från bindväv (adventitia) genom att upprepade gånger öppna en hemostat längs komplexet.
  3. Dissekera artär-ven-nerv anläggningen från den omgivande vävnaden längs ~1–1.5 cm (figur 3B).
  4. Om det behövs ta bort subkutan/perivaskulär fett för en bättre överblick och dissektion.
    Var försiktig när du tar bort subkutan/perivaskulär fett av nagelband sax, eftersom skadade blodkärl kan orsaka blödningar. Om blödning noteras, utöva påtryckningar på det blödande området med hjälp av en liten kompress eller stoppa blödningen genom en hemostat.
  5. Separat femoralartären från femoral ven och nerv med två hög precision 45° vinkel bred punkt pincett (anser att femoral ven är mest mediala struktur och femoralartären ligger mer laterala) (figur 3 c-F).
  6. Placera en ligatur på femoralartären som distala som möjligt och använda en böjd klämma på suturen gälla femoralartären skonsam längsgående dragkraft.
  7. Placera en andra pre knuten (men inte slutna knot) sutur på femoralartären som proximala som möjligt (figur 3 g).
  8. Förbereda en lämplig kateter (PE-50 för råtta lårbensartären) med sneda (~ 45°) cut-off spets spolas med hepariniserad steril fysiologisk koksaltlösning lösning (5 mL spruta och 23 G trubbig kanyl). Se till att inga luftbubblor är inuti katetern som de hindrar den artärtryck och HR avläsning (figur 3 H).
  9. Komprimera femoralisartären på den proximala änden av exponerade avsnittet använda en mikro klämma att tillfälligt stoppa arteriella blodflödet (figur 3I).
  10. Perforate kärlväggen på en distala plats i avsnittet dissekerade med hjälp av en böjd kanyl (23 G) medan placera en stödjande micro metall spatel under femoralartären (figur 3J).
  11. Noggrant catheterize femoralartären igenom perforeringen med snedskuren spets av katetern uppåt. Förväg katetern tills micro klämman är approximeras (figur 3 K).
    Obs: Vid misslyckade kateterisering av femoralartären vid första försöket, en mer proximal andra försöket kan utföras (börja på steg 2,8). Om den artär spricker eller allvarlig blödning uppstår, ligera eller klämma artären som proximala som möjligt för att förhindra ytterligare blodförlust. Om blodförlusten är minimal, försök catheterizing den kontralaterala femoralisartären (börja på steg 2.1).
  12. Öppna micro klämman och kontrollera för pulserande arteriella blodflödet i katetern (figur 3 L).
  13. Förhindra ytterligare tillströmning av blod i katetern genom att blockera utflödet av katetern.
  14. Fixa katetern i dess intraluminal plats genom att stänga beredda proximala ligatur runt femoralartären och introducerade katetern (figur 3 M).
  15. Upprepade gånger skölj och aspirera katetern i femoralartären att bedöma lämplig intravaskulär placering. Arteriell pulsering i kolumnen aspirerade blod bör vara lätt märkbar.
  16. Fixa katetern position längs fartyget med ändarna av distala ligatur att förhindra dislokation och säkerställa en längsgående position av katetern (figur 3N).
  17. Dessutom, tejpa katetern nära djuret på kirurgiska bordet för att säkra den och förhindra oavsiktlig förskjutning.
  18. Anslut katetern fylld med fysiologisk koksaltlösning lösning för att tryckgivaren samtidigt undvika bildandet av luftbubblor.
  19. Starta inspelning HR och karta i digitala gränssnittet (figur 3O).
  20. Täcka det utsatta området på på insidan av låret med en liten fuktad kompress kompress (figur 3 P).
  21. Beräkna hyperdynamic (HD) index: HD = karta/HR.
    Obs: I avancerade PHT, HD index är förhöjd jämfört med icke-portal hypertensiv djur. En ökning av HD index under operation kan dock också tyda på blödning, hypovolemi eller smärta. Om inspelade karta värden är mycket låg men signalen är bra och pulserande flöde upptäcks i katetern, kontrollera nivån av anestesi och potentiellt minska nivån av anestesi. Inte helt sluta isofluran anestesi, eftersom detta kan leda till otillräcklig anestesi djup enligt djurskydd och god vetenskaplig praxis.

3. överlägsen mesenterica artär blodflöde (SMABF)

  1. Utföra en median laparotomi (figur 4A-C)
    1. Lyft hudlagret med vävnad pincett 5 – 6 cm nedanför xiphoid och ta bort en tunn remsa av huden med hjälp av en Mayo hobbyverktyg ovan linea alba tills xiphoid nås.
    2. På mitten hud snittet, lyft den muskulösa lagret av vävnad tången längs linea alba att skapa avstånd mellan bukväggen och splanchnic organ.
    3. Öppna bukhålan genom öppning av den buk-väggen med en skalpell på linea alba. Förlänga öppningen samtidigt lyfta bukväggen av vävnad pincett med en Metzenbaum sax längs linea alba över samma avstånd som hudlagret.
  2. Försiktigt gräva tarmen använder våt bomull knoppar genom att starta med coecum och placera den på en stor gasväv kompress indränkt i steril fysiologisk koksaltlösning lösning bredvid snitt (figur 4 d-F).
  3. Svepa tarmen in i gasbinda komprimera och kontrollera att den är fuktad med steril fysiologisk koksaltlösning lösning (figur 4 g).
  4. Leta upp och exponera den överlägsna mesenterica artären.
  5. Dissekera den överlägsna mesenterica artären med två self-made trubbiga 'Schwabl'-krokar: lyft artären med första kroken och försök att placera den andra en genom samma vävnad tunneln. Utsätta den överlägsna mesenterica artären längs ett 5 mm avstånd att säkerställa flöde sonden (1 mm) kan placeras runt det (figur 4 H-K).
    Obs: Om så önskas, en precision 45° vinkel bred punkt tången kan användas att lyfta artären samt. 'Schwabl'-krokar är beredda från 30 G kanyler med rent ut trasiga tips böjd till en krok form. Om säkerheter artärerna är omfattande, den 'Schwabl'-krokar kan vara säkrare som blödningar från säkerheter medan dissekera den överlägsna mesenterica artären kan undvikas. Om blödning uppstår medan du förbereder den överlägsna mesenterica artären, placera en liten gasbinda komprimera på blödningsstället för 1 – 2 min med lätt tryck. Liten blödning upphör oftast snabbt; ha alltid i åtanke att fukta vävnaden regelbundet (steg 1.12). Om den överlägsna mesenterica artären själv skadas, måste de hemodynamiska bedömningarna avslutas.
  6. Tillämpa ultraljud gel till ultraljud flöde sondens sensor och koppla den till den splanchnic mesenterica artären. Justera det naturliga sträckningen av den överlägsna mesenterica artären (figur 4L-M).
  7. Stäng flöde sonden (1 mm) och vid behov försiktigt applicera ytterligare ultraljud gel på Doppler sensorn att förbättra signalkvaliteten. Göra det med hjälp av en spruta (20 mL) fylld med ultraljud gel och en trubbig spets kanyl (18 G) (figur 4N-O).
    Obs: Om sonden flödet inte stämmer väl längs det naturliga förloppet av fartyget, spänning kan orsaka vaskulär sammandragning och således turbulent flöde, vilket minskar noggrannheten av Flödesmätningarna. Försök att åter justera riktningen av flödet sonden längs naturliga sträckningen av fartyget och sedan fixa tillräckligt flöde sonden i en lämplig position.
  8. Mäta SMABF och bedöma enlighet av pulserande flöde signalen till systoliskt topparna av femoralartären inspelningen.
    Obs: Om inspelade karta värden är mycket låg men signalen är bra och pulserande flöde upptäcks i katetern, kontrollera nivån av anestesi och minska potentiellt nivån av anestesi. Inte helt sluta isofluran anestesi, eftersom detta kan leda till otillräckligt djup anestesi enligt djurskydd och god vetenskaplig praxis.
  9. Hitta en stabil position av flöde sonden (1 mm) och åtgärda kabel i flödet sonden. Starta inspelningen av SMABF utan ytterligare manipulering av flöde sonden (1 mm) (figur 4 P).

4. PVBF

  1. Leta upp och exponera portalen ven på den dorsala ansiktet tarmkäxet som ligger nära levern hilum (figur 5A).
  2. Försiktigt dissekera portalen ven från den omgivande vävnaden med hjälp av en hög precision 45° vinkel bred punkt pincett: isolera portalen ven genom försiktigt och upprepade gånger trycka tången under portalen ven skapa en vävnad tunnel (figur 5B).
    Obs: Om en blödning uppstår från periportal vävnaden samtidigt förbereda portalen ven, applicera lätt tryck på blödningsstället för 1-2 min med hjälp av en bomullstuss; Detta slutar ofta blödningen.
  3. Förstora tunneln genom att öppna hög precision 45° vinkel bred punkt tången långsamt och exponera portalen ven längs en sträcka på 5-6 mm så att placeringen av perivaskulär flöde sonden (2 mm) (figur 5 c, D).
  4. Tillämpa ultraljud gel till ultraljud flöde sondens sensor och bifoga det till portalen ven i linje med dess naturliga rutt (figur 5E).
  5. Stänga flödet sonden (2 mm) och tillämpa ytterligare ultraljud gel om det behövs, som tidigare beskrivits (steg 3,7) (figur 5F).
  6. Kontrollera flödet sonden placeras i en icke-konstriktiv väg runt portalen ven (figur 5 g).
    Obs: Om sonden flödet inte stämmer väl längs det naturliga förloppet av fartyget, spänning kan orsaka vaskulär sammandragning och således turbulent flöde, vilket minskar noggrannheten av Flödesmätningarna. Försök att åter justera riktningen av flödet sonden längs naturliga sträckningen av fartyget och sedan fixa tillräckligt flöde sonden i en lämplig position.
  7. Hitta en stabil position av flöde sonden (2 mm) och åtgärda kabel i flödet sonden. Sedan, starta inspelningen av PVBF (figur 5 H).
    Obs: Om inspelade karta värden är mycket låg men signalen är bra och pulserande flöde upptäcks i katetern, kontrollera nivån av anestesi och minska potentiellt nivån av anestesi. Inte helt sluta isofluran anestesi, eftersom detta kan leda till otillräckligt djup anestesi enligt djurskydd och god vetenskaplig praxis.

5. PP

  1. Förbereda en kateter (PE-50 för råtta mesenteriska vener) med en lutande (cirka 45°) cut-off spets som spolas med steril fysiologisk koksaltlösning lösning (5 mL spruta och trubbiga 23 G kanyl). Uppmärksamma att inga luftbubblor är inuti katetern som de hindrar den PP avläsningen (figur 6A).
  2. Hantera tarmen med blöta handskar och plats det spridda över fingrarna (figur 6B).
  3. Optimera vyn av mesenterica vaskulär sängen nära tunntarmen (figur 6 c).
  4. Identifiera de viktigaste venös mesenteriala fartyg leder till portalen ven (vena ileocolica - vena mesenterica medföra eventuell smittrisk superior - vena portae).
  5. Hitta en lämplig korsning av ileocolonic ven som är tillgänglig för kateterisering.
  6. Först hålla katetern i mesenteriala vävnaden vid perforerande viscerala peritoneum i tarmkäxet nära vaskulär korsningen valt för kateterisering.
  7. Noggrant avancera katetern närmare snedskuren spets till en korsning av ileocolic ven tills ett lätt intryck av fartyget korsningen ses (figur 6 d).
  8. Slutligen catheterize det venösa systemet i linje med anslutande fartyget rutten av perforering kärlväggen i passage vinkel av fartygen. (Figur 6E).
    Obs: Om blödning uppstår på kateterisering av ileocolic ven, med en tumme press med en liten gasbinda komprimera på det blödande området. Detta tryck ska bibehållas för 1 – 2 min att stoppa blödningen. Efteråt försök infoga katetern på en mer proximal gren av ileocolic venen.
  9. Fram katetern försiktigt vidare längs sträckan venös huvudkärlet till portalen ven utan perforering i venen (figur 6F).
    Obs: Håll katetern på ett tillräckligt avstånd till flöde sonden placeras runt den viktigaste grenen av portalen ven att undvika artefakter i flödet signalen och förhindra perforering av portalen ven.
  10. Anslut katetern fylld med fysiologisk koksaltlösning lösning för att tryckgivaren samtidigt undvika bildandet av luftbubblor.
  11. Starta inspelningen PP.
  12. Spela in alla hemodynamiska parametrar samtidigt under stabila förhållanden under flera minuter (figur 6 g, H). Du kan också portalen venös katetern kan sättas fast på plats med hjälp av vävnad lim och tarmarna kan åter placeras i bukhålan.
    Obs: Om inspelade karta värden är mycket låg men signalen är bra och pulserande flöde upptäcks i katetern, kontrollera nivån av anestesi och minska potentiellt nivån av anestesi. Inte helt sluta isofluran anestesi, eftersom detta kan leda till otillräckligt djup anestesi enligt djurskydd och god vetenskaplig praxis.

6. IHVR

  1. Efter att offra djur, mäta leverns vikt. Beräkna IHVR: IHVR = PVBF/PP. normalisera detta PVBF värde till vikten av levern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beroende på djurmodell och svårighetsgraden av leversjukdom är graden av PHT och svårighetsgraden av portal hypertensiv syndrom olika (figur 7).

BDL modellen orsakar biliär cirros på grund av gallstas. Följaktligen, PP ökar över tid och en hyperdynamic omsättning framkallar, som ses av en ökning av HR och minskning av karta. I cirrotiska djur öka SMABF, PVBF och IHVR också konkurrenslagen till nedsatt och hemodynamiska förändringar (figur 7AF).

Däremot PPVL orsakar prehepatic, icke-cirrotiska PHT, som kännetecknas av en omedelbar ökning av PP och motsvarande förändringar i systemiska hemodynamiken (figur 7 g-jag). Men, under den tid-rätters portosystemic utveckla säkerheter som kan sänka PP.

De hemodynamiska värdena av simulerade manövrerade djur kvar vid fysiologiska nivåer och signifikant förändring inte över tid. Portalen trycket i friska SO djur är på maximalt 5 till 6 mmHg (figur. 7J-L).

Figure 1
Figur 1: self-made intubation enheter: (A) endotrakealtub. (B) Guide tråd enhet (C) Intubation skrivbord. (D) Tube bifogas guide tråd enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: före kirurgiska preparat: (A) Intubation av djur. (B) intramuskulär och subkutan injektion för anestesi. (C) fixering av djur på värme matta. (D) placering och fastställande av rektal temperatursond. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: puls (HR) och genomsnittliga arteriella trycket (karta): (A) huden snitt. (B) beredning av den femorala vaskulära och nerv strukturer. (CF) Dissektion av femoralartären. (G) distala suturen och fixering - proximala Knut före proximala suturen. (H) beredning av femorala katetern. (jag) placering av vaskulär micro klämman. (J) Perforation av femoralartären med en böj nål. (K) kateterisering av femoralartären. (L) öppnandet av micro klämman för bedömning av puls. (M) proximala fixering av katetern. (N) Distal fixering av katetern. (O) mätning av karta och HR. (P) som täcker operationsområdet med blöt liten gasbinda komprimera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: överlägsen mesenterica arteriella blodflödet (SMABF): (AC) Median laparotomi. (D) utgrävning av coecum. (EF) Utgrävning av tarmen. (G) omslag i tarmarna i blöt gasbinda komprimera. (HK) Beredning av splanchnic mesenterica artär med trubbig kanyl krokar. (L, M) Fastsättning av sonden flöde. (N) tillämpning av ultraljud gel på sonden flödessensorn. (O) korrekt 'icke-konstriktiv' placering av den flöde sondens. (P) mätning av SMABF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: portalen venösa blodflödet (PVBF): (A) optimerad dorsala Visa på portalen ven (B) dissekering av portalen ven från mesenterica fettvävnad. (C) skapande av en vävnad tunnel för portalen ven flöde sonden. (D, E) Fastsättning av sonden flöde till portalen ven. (F) tillämpning av ultraljud gel på sonden flödessensorn. (G) rätt 'icke-konstriktiv' placering av sonden flöde. (H) mätning av PVBF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Portal tryck (PP): (A) beredning av katetern. (B) beredning av tarmar. (C) optimerad Visa på de viktigaste mesenterica venösa kärlsystemet. (D) Perforation av den viscerala peritoneum och befordran av grenen katetern närmre lämplig vaskulär. (E) kateterisering av ileocolic ven i korsningen vinkel mellan de viktigaste grenen och en side-gren. (F) befordran av kateterspetsen i portalen ven närmare till levern hilum. (G, H) Mätning av PP. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa resultat: Tidsförloppet för (A) PP, (B) karta och (C) HR BDL råttor. Således kan förändringar i (D) SMABF, (E) PVBF och (F), IHVR observeras. I PPVL, är hemodynamiska förändringar (G) PP, (H) karta och (jag) HR mest uttalad i de första dagarna efter operationen. I manövrerade friska sham (så) djur, (J) PP, (K) karta och (L) HR kvar inom fysiologiska värden och inte förändras över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PP är den viktigaste resultat parametern för utvärdering av portal hypertensiv syndrom och återspeglar svårighetsgraden av underliggande cirrhos. Både matrix nedfall (dvs, fibros) och sinusformade vasokonstriktion (beror på ökat nedsatt uttryck av kärlsammandragande medel och minskat lyhördhet för vasodilaterare) orsakar ökad IHVR. Vikten av PP och dess inverkan på kronisk leversjukdom har visats i flera prekliniska11,12,13,14 och kliniska studier15,16, 17 , 18. därför hos cirrotiska patienter, PP är en hård resultatet parameter, och dess förminskning rekommenderas av behandling riktlinjer19,20 och ett huvudsakliga forskning mål av nuvarande hepatologi. Omfattande djurmodeller behövs för att karakterisera och översätta16,21 nya behandlingsalternativ PHT22. Detta protokoll presenterar den metodik som behövs för en detaljerad hemodynamiska karakterisering, inklusive bedömning av portalen trycket, hyperdynamic cirkulation, splanchnic vasodilatation och intrahepatisk motstånd. För att uppnå en representant och full hemodynamiska data från djurmodeller, är erfarenhet och utbildning av operatorn utför av yttersta vikt.

Förebyggande och bekämpning av allvarliga blödningar är särskilt viktiga färdigheter. Trubbiga och precisa preparat av vaskulär delar av intresse är avgörande för att undvika kanylering misslyckanden och allvarliga blödningar. Betydande blodförlust påverkar hemodynamiken och utgör hinder för noggranna mätningar av PP eller kan även resultatet i laboratoriet djuret. Dokument blödningar som har inträffat under mätningarna i protokollen och karakterisera den svårighetsgrad och lokalisering av blödning.

Notera, med perivaskulär ultraljud flöde sonder för att bedöma blodflöde genererar bara en approximation och kan utsättas för läsning fel, på grund av olika fartyg storlekar och felaktiga sonden justering. En annan teknik att mäta blodflödet, och särskilt blodflödet distribution (inklusive beräkning av portosystemic rangering) är den färgade microsphere teknik23. Dock hela organ måste skördas, upplöst och analyseras, och detta utesluter den möjligheten att utföra histologiska eller uttryck analys. Därför ultraljud tekniken stöder principerna om de 'tre Rs' i djurförsök (minska, förfina och ersätta) av Russell och Burch24. Flöde sonder är dessutom lämpligt att övervaka splanchnic blodflödet i realtid och parallellt med andra hemodynamiska parametrar, medan färgade microsphere tekniken kräver att integrera orgel (mesenterica blodflödet) över tid. Dessutom färgade mikrosfärer, som vanligtvis har en diameter på 15 µm, kräver en normalfördelning av mikro-fartyg med en diameter < 15 µm i respektive organ att undvika att bli fångad och orörliga, som kanske inte är fallet i cirrotiska lever.

Den största begränsningen med denna metod är behovet av ett tillstånd av medvetslöshet och anestesi under hemodynamiska karakterisering av PHT syndrom hos djur. Den vanligaste och mest använda injektion anestesi ketamin/xylazin kräver ofta ny dosering efter 30 – 45 min att få nödvändiga djup anestesi25,26; Detta lägger till tidspress särskilt om felsökning behövs. Med inandning anestesi innebär många fördelar, men speciell utrustning krävs, och säkerhet förordningar relaterade till flyktiga anestetika måste följas. Djupet av anestesi kan anpassas snabbt utan att störa ingrepp genom justering av koncentrationen för anestesi. Endotrakealtub säkrar luftvägarna särskilt efter aktivering av frälsning av ketamin och ventilationen säkerställer tillräcklig syresättning och ventilation av djuret att risken för anestesi-inducerad död27. Medan ketamin/xylazin är fortfarande i stor utsträckning orsakar används, låg dos isofluran anestesi inga signifikanta förändringar av hemodynamiska eller kardiovaskulära parametrar i råttor28,29.

Lokal erfarenhet och förordningar ger sig rekommendationer och bästa praxis för anestesi, och forskarna måste kontinuerligt ompröva typ av bedövning som används för att utföra dessa hemodynamiska bedömningar30. Framtida experiment kan använda telemetri med inopererade trådlös tryckgivare som kommer att övervinna den nuvarande begränsningar relaterade till allmän anestesi och tillåta hemodynamiska karakterisering av medvetna djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar de veterinärer, sjuksköterskor och djurhållare vid Center för biomedicinsk forskning för deras fortsatta stöd under våra projekt. Författarna erkänner viktig input av alla recensioner av detta protokoll. Några av forskningen finansierades av ”Young Science Award” av det österrikiska samhället för gastroenterologi och hepatologi (ÖGGH) till PS och ”Skoda Award” av den österrikiska Society of Internal Medicine i TR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
LabChart 7 Pro software ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Software
ML870 PowerLab 8/30 ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Electronic multichannel recorder
MLT0380/D ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Pressure transducer (x2: for Portal Pressure and Arterial Pressure)
ML112 Quad Bridge Amplifier ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA  - Bridge amplifier
TS420 Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA  - Flowmeter module
Biological Research Apparatus 7025 UGO BASILE S.R.L., Comerio, Italy  - Ventilator
Vapor 2000 Dräger Medical AG & Co. KG, Lübeck, Germany  - Isofluran Vaporizer
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Superior Mesenteric Artery) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA1PRB Ultrasonic flow probe (1mm)
Perivascular probes (rat) for Transonic systems (Portal Vein) Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA #MA2PSB Ultrasonic flow probe (2mm)
1st for intubation & 2nd for clean skin incisions  -  - Mayo scissor [x2]
Metzenbaum scissor  -  -  -
Cuticle scissor  -  -  -
e.g. Adson Brown tissue forceps  -  - Tissue Forceps
High precision 45° angle broad point forceps [x2]  -  -  -
Hemostat [x4]  -  -  -
e.g. Mikulicz peritoneal clamp  -  - Curved clamp
e.g. Dieffenbach clamp  -  - Micro clamp
e.g. micro spatula with flat ends, width 4 mm,  -  - Micro metal spatula
for transbuccal suture at intubation  -  - Needle holder
Scalpel grip  -  -  -
selfmade  -  - Intubation desk
blut, flexible and with a suitable diameter for arterial cannula and venflow  -  - Blunt steel wire
modified arterial line 20G with Flowstich Becton Dickinson, Farady Road, Swindon, UK #682245 Arterial line
Heating pad  -  -  -
Rectal temerature probe  -  -  -
Saline heater  -  -  -
Laryngoscope (specific for animal size, e.g. rat)  -  -  -
Inductionbox for inhalation anesthesia  -  -  -
Scale (able to measure mg)  -  -  -
Hair clipper  -  -  -
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
e.g. modified BD Venflon Pro Safety 14GA Becton Dickinson Infusion Therapy, AB, SE251 06 Helsingborg, Sweden #393230 Peripheral venous catheter (14G)
Fine-Bore Polyethylene Tubing, ID 0.58mm, OD 0.96mm, Portex, Smiths Medical International Ltd., Kent, UK #800/100/200 Catheter tube (PE-50)
e.g. Omnifix-F Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #9161406V Syringe 1mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606051V Syringe 5mL
e.g. Injekt Solo B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany #4606205V Syringe 20mL
e.g. BD Microlance 3, 18G - 1 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304622 Cannula (18G)
e.g. BD Microlance 3, 23G - 1" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #300800 Cannula (23G)
e.g. BD Microlance 3, 30G - 1/2" Becton Dickinson S.A., Fraga, Spain #304000 Cannula (30G)
e.g. Leukoplast S BSN medical GmbH, Hamburg,  Germany #47619-00 Adhesive tape
e.g. Gazin RK Mullkompressen (18x8cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10972 Gauze compress (small)
e.g. Gazin RK Mullkompressen (5x5cm) Lohmann & Rauscher, Vienna, Austria #10961 Gauze compress (big)
Silk Braided black, USP 4/0, EP 1.5 SMI AG, St. Vith, Belgium #2021-04 Suture (Silk 4/0, EP 1.5)
e.g. Mersilk, 2-0 (3 Ph. Eur.), PS-1 Prime Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Germany #EH7552 Transbuccal suture
e.g. Cottonbuds (2.2mm, 15cm) Paul Hartmann AG, Heidenheim, Germany #967936 Cotton buds
e.g. Vue Ultrasoundgel Optimum Medical Limited, UK #1157 Ultrasound gel
e.g. Glubran 2 Gem srl, Viareggio, Italy #G-NB2-50 Tissue glue
e.g. Surgical scalpell knife Nr. 10 - carbon steel Swann-Morton, England, B.S. #202 Scalpel Knife
Heparin, 5000 i.E./mL (Natriumheparin) Medicamentum Pharma GmbH, Allerheiligen im Mürztal, Austria  - Heparin
Florane Aesica Queenborough Ltd., Queenborough, UK  - Isoflurane
OeloVital (5g) Fresenius Kabi Austira Gmbh, Graz, Austria  - Eye gel
Ketasol aniMedica GmbH, Senden-Bösensell, Germany  - Ketamine
Rompun Bayer Austria Ges.m.b.H., Vienna, Austria  - Xylazine
Xylocain 10% Pumpspray AstraZeneca Österreich GmbH, Vienna, Austria  - Lidocaine pump spray
Dipidolor Jansen-Cilag Pharma GmbH, Vienna, Austria  - Piritramide
NaCl 0.9% Fresenius, 1L Fresenius Kabi Austira GmbH, Graz, Austria #13LIP132 Physiological saline solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ripoll, C., et al. Hepatic venous pressure gradient predicts clinical decompensation in patients with compensated cirrhosis. Gastroenterology. 133, (2), 481-488 (2007).
  2. Bosch, J., Groszmann, R. J., Shah, V. H. Evolution in the understanding of the pathophysiological basis of portal hypertension: How changes in paradigm are leading to successful new treatments. J Hepatol. 62, S121-S130 (2015).
  3. Blachier, M., Leleu, H., Peck-Radosavljevic, M., Valla, D. C., Roudot-Thoraval, F. The burden of liver disease in Europe: a review of available epidemiological data. J Hepatol. 58, (3), 593-608 (2013).
  4. Colle, I., Geerts, A. M., Van Steenkiste, C., Van Vlierberghe, H. Hemodynamic Changes in Splanchnic Blood Vessels in Portal Hypertension. Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291, (6), 699-713 (2008).
  5. Laleman, W., Van Landeghem, L., Wilmer, A., Fevery, J., Nevens, F. Portal hypertension: from pathophysiology to clinical practice. Liver International. 25, (6), 1079-1090 (2005).
  6. Franchis, R. d Updating Consensus in Portal Hypertension: Report of the Baveno III Consensus Workshop on definitions, methodology and therapeutic strategies in portal hypertension. Journal of Hepatology. 33, (5), 846-852 (2000).
  7. Zardi, E. M., Di Matteo, F. M., Pacella, C. M., Sanyal, A. J. Invasive and non-invasive techniques for detecting portal hypertension and predicting variceral bleeding in cirrhosis: a review. Annals of medicine. 46, (1), 8-17 (2014).
  8. Kumar, A., Sharma, P., Sarin, S. K. Hepatic venous pressure gradient measurement: time to learn. Indian J Gastroenterol. 27, (2), 74-80 (2008).
  9. Tsochatzis, E. A., Bosch, J., Burroughs, A. K. Liver cirrhosis. Lancet. 383, (9930), 1749-1761 (2014).
  10. Abraldes, J. G., Pasarín, M., García-Pagán, J. C. Animal models of portal hypertension. World Journal of Gastroenterology : WJG. 12, (41), 6577-6584 (2006).
  11. Reiberger, T., et al. Sorafenib attenuates the portal hypertensive syndrome in partial portal vein ligated rats. Journal of Hepatology. 51, (5), 865-873 (2009).
  12. Schwabl, P., et al. Pioglitazone decreases portosystemic shunting by modulating inflammation and angiogenesis in cirrhotic and non-cirrhotic portal hypertensive rats. Journal of Hepatology. 60, (6), 1135-1142 (2014).
  13. Reiberger, T., et al. Nebivolol treatment increases splanchnic blood flow and portal pressure in cirrhotic rats via modulation of nitric oxide signalling. Liver International. 33, (4), 561-568 (2013).
  14. Schwabl, P., et al. The FXR agonist PX20606 ameliorates portal hypertension by targeting vascular remodelling and sinusoidal dysfunction. Journal of Hepatology. 66, (4), 724-733 (2017).
  15. Mandorfer, M., et al. Sustained virologic response to interferon-free therapies ameliorates HCV-induced portal hypertension. J Hepatol. 65, (4), 692-699 (2016).
  16. Schwabl, P., et al. Interferon-free regimens improve portal hypertension and histological necroinflammation in HIV/HCV patients with advanced liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 45, (1), 139-149 (2017).
  17. Reiberger, T., Mandorfer, M. Beta adrenergic blockade and decompensated cirrhosis. Journal of Hepatology. 66, (4), 849-859 (2017).
  18. Reiberger, T., et al. Carvedilol for primary prophylaxis of variceal bleeding in cirrhotic patients with haemodynamic non-response to propranolol. Gut. 62, (11), 1634-1641 (2013).
  19. Reiberger, T., et al. Austrian consensus guidelines on the management and treatment of portal hypertension (Billroth III). Wiener klinische Wochenschrift. 129, (3), 135-158 (2017).
  20. de Franchis, R. Expanding consensus in portal hypertension. Journal of Hepatology. 63, (3), 743-752 (2015).
  21. Pinter, M., et al. The effects of sorafenib on the portal hypertensive syndrome in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma - a pilot study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 35, (1), 83-91 (2012).
  22. Schwabl, P., Laleman, W. Novel treatment options for portal hypertension. Gastroenterol Rep (Oxf). 5, (2), 90-103 (2017).
  23. Klein, S., Schierwagen, R., Uschner, F., Trebicka, J. Mouse and Rat Models of Induction of Hepatic Fibrosis and Assessment of Portal Hypertension. (2017).
  24. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. (1959).
  25. Langhans, W., Myrtha, A., Riediger, T., Lutz, T. A. Routine animal use procedures. Institute of Veterinary Physiology, University of Zurich, Physiology and Behavior Laboratory, Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich. (2016).
  26. Animal Care and Use Program. Rat and Mouse anesthesia and analgesia: Formulary and General Drug Information. The University of British Columbia. (2016).
  27. Davis, J. A. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  28. Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Veterinary Research. 10, (1), 198 (2014).
  29. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48, (1), 6-14 (2014).
  30. Becker, K., et al. Statement on anesthesia methodologies: Recommondations on anaesthesia methodologies for animal experimentation in rodents and rabbits. GV-SOLAS - German veterinary association for animal welfare. (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics