אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

היישום המעשי והביצועים של שיטות לדור של דגימות רקמה נציג של חזירי מודלים בבעלי חיים עבור קשת רחבה של ניתוחים במורד הזרם בפרויקטים biobank מודגמות, כולל volumetry, דגימה אקראית שיטתית, ועיבוד דיפרנציאלית של דגימות רקמה עבור סוגי ניתוחים כמותיים מורפולוגיות ומולקולרית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במחקר רפואי translational, מודלים חזירי בהתמדה הפך פופולרי יותר. בהתחשב בערך גבוה של חיות בודדות, במיוחד של חזיר מהונדס גנטית מודלים ומספר מוגבל לעיתים קרובות בעלי זמינות של מודלים אלה, הקמת (biobank) אוספים של דגימות רקמה שלמאחה מעובדים מתאים קשת רחבה של שיטות ניתוח עוקבות, כולל ניתוחים לא צוין בנקודת הזמן של הדגימה, מייצגים גישות משמעותי כדי לנצל את מלוא היתרונות של הערך translational של המודל. לגבי הייחוד של האנטומיה חזירי, הנחיות מקיף לאחרונה הוקמו לדור מתוקננת של נציג, באיכות גבוהה דגימות שונים חזירי איברים ורקמות. קווים מנחים אלה הם תנאים מוקדמים חיוניים עבור הפארמצבטית התוצאות, comparability שלהם בין מחקרים שונים החוקרים. ההקלטה של נתונים בסיסיים, כמו משקולות איברים כרכים, הקביעה של המיקומים דגימה, המספרים של דגימות רקמה שיווצר, כמו גם שלהם התמצאות, גודל, עיבוד וזמירה כיוונים, הם הגורמים הרלוונטיים קביעת את generalizability ואת השימושיות של הדגימה עבור מולקולרית, כמותיים המורפולוגיים. . הנה, המחשה, מעשית, צעד אחר צעד בהפגנה של הטכניקות החשובות בדור של נציג, רב תכליתי biobank דגימות רקמות חזירי מוצג. השיטות המתוארות כאן כוללים קביעת צפיפות, ואמצעי אחסון איברים/רקמות היישום של הליך משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של איברים parenchymal על ידי ספירת נקודת, הנחישות של היקף רקמת הצטמקות הקשורים הטבעה היסטולוגית של דגימות, דור של דגימות מונחה באופן אקראי עבור ניתוחים כמותיים stereological, כגון איזוטרופיות אחיד אקראי (iur השוק) סעיפים שנוצר על ידי שיטות "Orientator" ו- "Isector", המדים אנכי קטעים אקראיים (VUR).

Introduction

ב translational רפואה, חזירים הם נפוצים יותר ויותר לשימוש כמו חיה גדולה מודלים1,2,3,4,5, עקב מספר קווי דמיון יתרון בין חזירי, אנטומיה, פיזיולוגיה, וזמינות של הוקמה שיטות ביולוגי מולקולרי לאפשר לדור של המותאמים, מהונדסים גנטית חזיר דגמים למגוון רחב של מחלות תנאים1,4.

עם זאת, מספר החיות של מודל חזיר בהתאמה מסופקים עבור ניסויים בכל עת לעומת מודלים מכרסמים, מוגבל. זאת בשל המרווח דור חזירי של שנה אחת, ואת המאמצים פיננסיים וגוזלת זמן נדרש עבור הדור של חזירי מודלים טרנסגניים. לכן, חיות בודדות של מודל חזירי, כמו גם כדוגמאות ניתן להפיק של החזירים האלה הם חשובים מאוד, במיוחד אם מהונדסים גנטית מודלים חזירי ו/או בעיות ניסיוני לטווח ארוך (למשל, סיבוכים מאוחר של מחלות כרוניות) נבדקים ב אנשים בגילאי2,6,7.

במהלך כל המחקר, הביצועים של ניתוחים נוספים אשר לא נקבעו בעיצוב ניסיוני הראשונית של המחקר עשוי מאוחר יותר להפוך להיות רלוונטי, למשל, לכתובת שאלות שונות הנובעות קודם לכן גילה ממצאים בלתי צפויות. אם הדוגמאות מתאימים עבור ניסויים נוספים אלה אינם זמינים, עלות גבוהה באופן לא פרופורציונלי והוצאות אינטנסיבית יתכן שיהיה צורך ליצור חזירים נוספים ודוגמאות רקמה. כדי להיות מוכנים לכל מצב כזה, דור של biobank אוספים דגימות שנשמרת גיבוי של איברים שונים, רקמות או ביו-נוזלים, באופן כמותי ובאופיו מתאימים למגוון רחב של ניתוחים שלאחר מכן, נחשב חשוב הגישה2,6,7. הנובעות יתרונות מיטבית מודל בעלי חיים חזירי, הזמינות של דגימות biobank נאותה גם מציעה את האפשרות ייחודי כדי לבצע קשת רחבה של שיטות ניתוח שונות על מדגם זהה בחומרים על רמה איברים רב אותו חיות בודדות, למשל, על ידי חלוקת דוגמיות המדענים של קבוצות עבודה שונות מאורגן ב6,72,רשת המחקר. בנוסף, אסטרטגיית הדגימה "מבט לעתיד" biobanking תורם גם הפחתה של מספר החיות הצורך במחקר. היתרונות של מודל חזירי biobanking הוכחו לאחרונה באיבר רב, multiomics רקחמ, איברים הצלב לדבר במודל של חזירי מהונדס גנטית של סוכרת לטווח ארוך, באמצעות דגימות מן Biobank החזיר מינכן MIDY 2.

קיימות מספר דרישות חובה דגימות biobank חייב לעמוד בדרך כלל כדי לבסס את המהימנות ואת interpretability של תוצאות הבדיקות שבוצעו לאחר מכן. הדגימות להפיקם reproducibly, הם חייבים להיות נציג, כלומר, במידה מספקת שיקוף התכונות מעוניין מולקולרית מורפולוגיים של האיבר/הרקמות הדגימות נלקחו מ-7. למתאים למגוון רחב של סוגי ניתוח במורד הזרם, הדגימות חייב להיות בכמויות מספיקות אשר מעובדות בהתאם לדרישות (כולל זמן ותנאי טמפרטורה) שיטות אנליטיות השונות, כולל תיאורי ניתוחים histopathological, כגון cryohistology, פרפין, היסטולוגיה פלסטיק, אימונוהיסטוכימיה, בחיי עיר הכלאה, ultrastructural אלקטרון מיקרוסקופיות ניתוחים ניתוחים אבחון קליני מעבדתי, כמו גם כמו מולקולרית ניתוחים של ה-DNA, RNA, חלבונים ו מטבוליטים.

כדי לאפשר ההערכה של מגוון רחב של פרמטרים מורפולוגי כמותיים ברורים כגון מספרים, אמצעי אחסון, אורכי או פני שטחים של רקמות שונות מבנים על ידי ניתוחים כמותיים stereological, קטע אקראי מטוסים של דוגמאות היסטולוגית של הרקמות/האיברים המתאימים צריכים להיות מוכנים7,8,9,10,11. במחקרים כמותיים מורפולוגי, הקביעה מדויקת מהנפח הכולל של רקמה, איבר, או איבר תא, הדגימות שנלקחו ממנו (קרי, החלל הפניה) חשיבות מכרעת7,9 , 12 לחישוב הכמויות מוחלטת של הפרמטרים מעוניין בתוך האיברים המתאימים, רקמת, או אורגניזם. בסופו של דבר, ההשפעה של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות במהלך ההכנה של מקטעים היסטולוגית חייב להיות נחוש ונלקח לתוך חשבון13. לכן, ניתוחים כמותיים stereological, במיוחד של דגימות בארכיון (קבוע דגימות רקמה, רקמה מוטבע בלוקים, סעיפים היסטולוגית, וכו ') ממחקרים קודמים הם לפעמים מוגבלות מאוד או אפילו בלתי אפשרי12, במיוחד אם volumetry של האיברים המתאימים/הרקמות לא בוצע, אם אין עיצובים דגימה נאותה הוחלו על צו מדגמים מייצגים, אם המספרים ואת כמויות של דוגמאות בודדות זמין אינן מספיקות, או העיבוד דוגמאות אינו תואם שערוך של הפרמטרים מורפולוגי כמותית של עניין. בשל הגורמים כמשפיע האפשריים סעפת, התאמת חומרי ארכיון-sample ניתוחים של פרמטרים מורפולוגי כמותיים ברורים באופן חד משמעי אין אפשרות לענות, אבל תלוי הערכה זהירה של כל מקרה ומקרה.

לפיכך, מיקום, גודל, מספר, עיבוד, כיוון זמירה, וכיוון דוגמאות של פוטנציאל ישפיעו על התוצאות של הבדיקות עוקבות, גורמים אלה חשיבות גדולה, יש לקחת בחשבון בעיצוב ניסיוני בכל מחקר. בכל הנוגע היבטים אלה תכונות מיוחדות של האנטומיה חזירי, הנחיות דיגום מקיף, מפורט, בקנה מידה גדול מותאם חזירי חייתיים לאחרונה הוקמו, מתן התייחסות איתנה מתוקננת, לשחזור , ויצירת יעיל של דגימות יתיר, מעובד כראוי, באיכות גבוהה יותר מ-50 שונים חזירי איברים ורקמות6,7.

התיאורים מתודולוגי, את ערכת לימוד בנושא המוצג במאמר הנוכחי מספקים נתונים היסטוריים, המחשה, מובנת, צעד הוראות שלב אחר שלב מעשי בביצוע מגוון רחב של טכניקות volumetry, דגימה של רקמות חזירי, איברים, ועיבוד של דגימות רקמה עבור שיטות ניתוח שונות במורד הזרם. הטכניקות נבחרים כוללים שיטות לקביעת איברים/רקמות כרכים וצפיפות המבוססת על העקרונות של ארכימדס, קאבליירי9, לרבות קביעת מימדי תלת מימדי התכווצות של רקמות הקשורים הטבעה שונות ההטבעה מדיה14 במהלך עיבוד לבדיקה היסטולוגית, גישות יישום מעשית משוקלל נפח שיטתית אקראי הדיגום, עיבוד של דגימות רקמה שנדגמו עבור אחר העוקבים ניתוחים7,8,9,15, דור של כראוי ומכוונים מעובד דגימות פוטנציאלית ניתוח כמותי stereological7,8, 9,10,11. לצד היישום שלהם בפרויקטים biobank חזירי, השיטות והפגינו מתאימים בדרך כלל ללימודי כל בחינת מאפיינים כמותיים היסטו-מורפולוגי של איברים/רקמות. יתר על כן, דגימה אקראית שיטתית עיצובים הם מועיל במיוחד לדור של מדגמים מייצגים ניסויים בשיטות ניתוח מולקולרית כדי לזהות שינויים שפע של, למשל, RNAs, חלבונים או מטבוליטים ב איברים ורקמות שונות.

בפסקאות הבאות לספק הקדמה קצרה לשיטות אלו, בזמן הביצוע המעשי שלהם מתוארת בסעיף פרוטוקול.

הנחישות של איברים/רקמות כרכים
קביעה של איברים משקולות ואמצעי אחסון חשוב מספר הגדרות ניסיוני, כמו גורמים אלה עשוי להצביע על שינויים, שעשוי להיות קשור השפעול נבדק גורמי עניין. הנפח הכולל איברים/רקמה נדרש גם כדי לחשב פרמטרים כמותיים מוחלט, (למשל, המספר בתא סכום) של צפיפויות נפח מספריים מוערך stereologically (כלומר, מספר התאים ליחידת נפח של רקמה)7,12. מלבד באמצעות ציוד טכני מורכב, כגון טומוגרפיה המחשב, טכניקות יש בעצם שלוש שיטות מעשיות נפוץ כדי לקבוע את נפח מוחלט של איבר או רקמה. היקף איבר יכול להיקבע על ידי "הנפחי מדידה ישירה", לפי עקרון ארכימדס, קרי, מדידת הנפח של מים או תמיסת מלח שנעקרו על ידי המבנה כאשר לחלוטין. עם זאת, עבור איברים חזירי וזהובה גדולים, גישות אלה הם מעשי נוטה העוסקת, מכיוון שהם דורשים מבחנות גדולות מאוד נפח/מדידה. יותר נוח, ניתן לחשב את עוצמת הקול איברים/רקמה שלו משקל, צפיפות7,12,16, אשר יכול ביעילות להיקבע באמצעות את "שיטת ועלייתו"7,12 ,16 (פרוטוקול שלב 1.1.). איברים/רקמות כרכים יכול גם להיות מוערך שימוש בגישות volumetry מבוסס על "עקרון Cavalieri" (1598-1647). במילים פשוטות, העיקרון קאבליירי קובע, כי אם שני עצמים הם למחלקה במישורים מקבילים למישור הקרקע, הפרופילים של הסעיפים לחתוך דרך שני העצמים ב המתאים המרחקים בין מישור הקרקע יש את אותם אזורים, שני העצמים יש באותו אמצעי אחסון. לפיכך, הנפח של אובייקטים באופן שרירותי בצורת יכול להיות מוערך כמו התוצר של אזורים הפרופיל שלהם סעיף סעיף מקביל, באותה מידה מרוחק מטוסים, המרחק בין המטוסים סעיף. . זה מובנת עם האנלוגיה הבאה: שקול שתי ערימות המורכב מספר זהה של מטבעות זהים ממוקמים לצד מחסנית אחת עם המשרת מטבעות בערימה אחד מעל השני מניב בצורת גליל של הערימה מטבע, והאחר ערימה של מטבעות עם מחוץ למרכז בעמדה מטבעות (איור 3 א). למרות הצורות של שני אוספים מטבעות שונים, האחסון שלהם זהים, מאז האזורים של המטבעות ברמות המתאימות של שתי ערימות (קרי, האזורים של פרופילים של מקטעים מקבילים לחתוך שתי ערימות מטבע מרחקים שווים קרקע) זהים. הערכה של הכרכים של חזירי איברים ורקמות באמצעות ה קאבליירי עקרון7,12,15 מתואר בשלב 1.2.

קביעת היקף רקמת הצטמקות הקשורים הטבעה היסטולוגית
ניתוח של מספר פרמטרים כמותיים מורפולוגי נמדד בסעיפים רקמות היסטולוגית, כולל ההשפעה של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות המתרחשים במהלך עיבוד עבור היסטולוגיה רקמה להיות נחושים ולא נלקח בחשבון. היקף רקמת הטבעה הקשורות הצטמקות עשוי להיות משתנה, תלוי הן על הרקמה, העיבוד שלו את ההטבעה בינוני8,13,17,18,19. באופן כללי, שינויים הקשורים הטמעה של אמצעי האחסון של דגימת רקמה (קרי, בעיקר הצטמקות) מתרחשים כל שלושת הממדים של החלל, ולכן משפיע על כל הפרמטרים ממדי ההערכה על ידי ניתוחים כמותיים stereological8 . בעיקרון, היקף רקמת הקשורות הטבעה, הביע כגורם הצטמקות לינארית רקמת (fS), התכווצות יכול להיות מוערך כפי שמוצג צעד 1.3. משמשת עבור תיקון של פרמטרים מורפולוגי כמותית (הצטמקות רגיש)14.

משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של איברים/רקמות
על הקמתה של אוסף biobank של דגימות איברים חזירי/רקמה, גישות משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית כמו שמתואר בשלב 2 הוכיחו להיות טכניקות מעשיות, לחיסכון בזמן ויעיל עבור הדור של נציג, רב תכליתי רקמות דוגם7,8,9,15.

הדור של איזוטרופיות אחיד אקראי מקטעים ומקטעים אנכי אחיד אקראי עבור ניתוחים stereological כמותית
דגימות רקמה Biobank צריך להיות מתאים עבור מגוון רחב של שיטות ניתוח stereological כמותיים שונים עבור הערכה של הפרמטרים לא היתה אפשרות לקבוע בלי הדגימה מוכן כראוי, לכל היותר. כמעט כל הפרמטרים stereological כמותיים ניתן לקבוע, באמצעות "isotropic (עצמאית) אחיד אקראי (iur השוק) סעיפים"8,9. בסעיפים iur השוק, כיוון תלת מימדי של המטוס סעיף של דגימת הרקמות הוא אקראי. אפשר להשיג על ידי אקראיות של העמדה של דגימת הרקמות ביחס המיקום של המטוס הסעיף, כפי שהוא מיושם בשיטה "Isector"11 (פרוטוקול שלב 3.1), או על ידי אקראיות על הכיוון של המטוס סעיף שיחסית אליה דגימת הרקמות, כמו שיטת "Orientator"10 (פרוטוקול שלב 3.2). דגימות רקמה, כגון העור - או mucosa הדגימה הצגת נוכח באופן טבעי, או לזיהוי כראוי והמוגדרים ציר אנכי, הכנת "אחיד אקראי (VUR) מקטעים אנכיים" (פרוטוקול שלב 3.3.) אך ורק למחלקה בתוך מישור שלהם הציר האנכי הוא יתרון8,20. על שיח שלם של היסודות התיאורטיים של הדגימה iur השוק/VUR, דיון מקיף של פוטנציאל במורד הזרם ניתוחים stereological כמותיים, הקורא מעוניין מכונה הלימוד של stereology כמותיים בחיים מדעי8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן להשתמש דגימות רקמה נגזר חיות מתות, מלא לציית לתקנות החוק הגרמני לרווחת בעלי חיים.

1. Volumetry

  1. ועלייתו בטכניקה לקביעת צפיפות רקמה/איברים (איור 1 , איור 2) 7 , 12 , 16
    1. להכין חומרים: האזמל להבים מגבות נייר, מלקחיים בסדר, מאזני מעבדה סטנדרטיים, זכוכית או פלסטיק בקבוקונים, saline 0.9%, מחזיקי הדגימה נבנה עצמית (איור 2 א).
    2. בלו פיסת רקמה (הגודל המרבי: 2 x 2 x 2 ס"מ3) מתוך האיבר/הרקמה, במיוחד מ תא איברים של עניין. קטנים, כגון בלוטת יותרת המוח, או בלוטת האצטרובל, האיברים שנמדדה בוססו.
      התראה: ודא שגודל המדגם ובמיוחד קטן יותר הקוטר הפנימי של כשהספל (שלב 1.1.5 למתימטיקה), ואת רמתו מילוי כדי לאפשר מלאה ועלייתו של המדגם ללא פנייה אל הקירות הפנימיים של כשהספל בשלב 1.1.7.
    3. בזהירות שתנגב את הדגימה. עם מגבת נייר כדי להסיר את נוזל הדם עודף/רקמות.
    4. שוקל את הדגימה בקנה מידה דיוק והקלטה של המשקל של המדגם (mS). לקבוע את המשקל של דגימות רקמה קטנה מ ג הקרוב (איור 1 א').
    5. המקום גביע מלא בטמפרטורת החדר saline 0.9% על המשקל. לא לגמרי ולמלא את הספל, כדי לאפשר צלילה של דגימת הרקמות בשלב שלאחר מכן ללא על גדותיו.
      התראה: שימוש בגודל גביע מתאים לגודל ושל נטל sample(s) הרקמה כדי למדוד את טווח מדידה אפקטיבית של הסקאלה. עבור מדגמים גדולים יותר עד 2 x 2 x 2 ס"מ3, גודל הספל של 50 – 100 מ ל מתאים בשילוב עם סולם מדידה של 100 מ ג ל 500 גרם, ואילו עבור מדגמים קטנים, להשתמש בקבוקונים של 5 – 10 מ"ל נפח בשילוב עם דיוק סולמות עם מדידת נע בין כ 0.1 מ"ג ו 20 גרם.
    6. להטביע את בעל מדגם (קרי, לולאה מספיק נוקשה של חוט דק או משהו דומה, איור 2A) בתמיסת המלח למיקום המסומן (חיצים איור 1B, 2B איור, איור 2C). לאחר מכן, לאפס (טרה) התצוגה של הסקאלה לאפס.
    7. בזהירות לצרף דגימת הרקמות המחזיק לדוגמה, לגמרי להטביע את הדגימה בתמיסת המלח עד עמדה מסומן על המחזיק לדוגמה (חיצים איור 1B, 2B איור, איור 2C).
      התראה: המדגם המשוקע, בעל מדגם כנראה אין קשר עם הקירות הפנימיים או בתחתית כשהספל או המשטח של תמיסת המלח.
    8. בעוד אתה מחזיק בעל מדגם של המדגם המשוקע במצב הזה, רושמות את משקל מוצגים בסולם (mL), בהתייחסו המשקל של תמיסת מלח שנעקרו על ידי דגימת הרקמות (איור 1 C, איור 2B, ו איור 2C).
    9. חישוב הנפח של המדגם (VS) מ- mL, הצפיפות של תמיסת מלח בטמפרטורת החדר (20 ° C) (ρמלוחים = g 1.0048/cm³) כמו VS mL= / Ρמלוחים [g g cm³] (איור 1).
    10. חישוב הצפיפות של דגימת הרקמות (ρלדוגמה) לפי המשקל (כלומר, מסה) של המדגם (mS), הנפח שלה (VS): ρדגימה = mS /VS[g/cm³] (איור 1).
    11. עבור איברים נמדדת בוססו, חזור על המדידה שלוש פעמים, לחשב את צפיפות איבר ממוצע מתוך הערכים מדידה אחת. עבור איברים גדולים/רקמות, לבצע מדידות חוזרות ונשנות עם דוגמאות שונות של התא באותו איבר/רקמות/איברים, לחשב את הצפיפות הממוצעת של המדידות יחיד, בהתאם.
    12. לחשב את הנפח הכולל של תא איברים/רקמות/אורגן שלה משקל, צפיפות (איור 1).
  2. היישום של השיטה-Cavalieri לקביעת אמצעי אחסון איברים חזירי 7
    1. להכין חומרים: הסרגל, קליבר, סכין, מספריים, מלקחיים, עט עמיד למים, פלסטיק, שקפים, סורק, צילום המצלמה ורשתות קרוס מודפס על שקפים פלסטיק.
    2. הנח הרקמה/האיבר שלם על משטח רגיל (חיתוך בסיס), למדוד את האורך (l) של האיבר לאורך ציר האורך (3B איור, איור 5A).
    3. את מלאה האיברים/הרקמות לחתוך לפרוסות מקבילים קו מקביל אורתוגונלית לציר האורך איברים (3C איור, איור 5B). לבחור מרחק d בין שני מקטעים (קרי, את עובי המרווח/מקטע אופטים, בדרך כלל כ- 1 ס מ) קטן מספיק לקבל מספר מספיק של רקמות/איברים לוחות. באופן אקראי למקם את המקטע הראשון למרחק בין 0 להמרווח אופטים מן השוליים של האיבר. בעודו חותך, לשפוט באופן חזותי את המיקום והכיוון של כל מטוס סעיף, כדי להשיג כ איברים מקבילים/רקמות לוחות של עובי אחיד פחות או יותר.
      הערה: המספר הדרוש של לוחות רקמות/איבר תלוי הצורה והגודל של הרקמה/האיברים שנבדקו. אם איברים קטנים או דגימות חייב להיות למחלקה של לוחות דק של ≤5 מ מ, להטביע את הדגימות אגר לפני חלוקתה (ראה שלב 1.3.3.) ולהשתמש במכשיר טכני שמגיע המדגם אגר-מוטבע. מרווחי אופטים מדעית recommendable חזירי ביותר איברים ורקמות, כמו גם דוגמאות עבור התקנים עם פרוסות, הם הצביעו על החומר משלים של "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7.
    4. במקום כל איבר/רקמות לוחות על המשטח אותו כלפי מטה בבסיס חיתוך (כלומר, באופן עקבי על הימין או על המטוס שמאלי של כל לוח איברים, 3D איור, איור 5C) ולספור את הלוחות (n).
    5. לקבל סעיף פרופילים של הלוחות רקמות על-ידי אחת מהצורות הבאות:
      1. בזהירות המקום הלוחות רקמות על שקפים פלסטיק שכותרתו כראוי, תוך שמירה על הכיוון של משטחים המקטע העליון והתחתון שלהם. לאתר קווי המתאר של הלוחות רקמות השקפים פלסטיק באמצעות עט עמיד למים (3E איור1-2).
      2. קח תמונות מצולמות הלוחות רקמות, מחזיק את המצלמה בצורה אנכית מעל משטחים סעיף (איור 3F). לצורך כיול, הנח סרגל הגודל ליד הלוחות רקמות.
      3. סריקת הלוחות רקמות סורק משטח הסורק תוך שמירה על הכיוון של משטחים המקטע העליון והתחתון שלהם (איור 3G). לצורך כיול, הנח סרגל הגודל ליד הלוחות רקמות.
    6. למדוד את תחומי הפרופילים (עקיבה, המצולם או סרוקים) סעיף של כל לוחות רקמות על ידי אחת מהצורות הבאות:
      1. כיסוי או להרכיב את הפרופילים סלאב איברים לעקוב אחריו עם רשת בגודל מתאים, מכויל צלבים המרווחות באופן שווה מודפס על שקיפות פלסטיק עם ספירת כל חוצה להכות את האזור פרופיל (איור 3E3-4; השווה ל איור 5D). לחשב את השטח פרופיל סעיף של כל לוח אורגן על-ידי הכפלת מספר צלבים להכות את האזור פרופיל על-ידי האזור המקביל צלב אחד.
        הערה: כדי לקבל נפח מדויקים דיים הערכות, לבחור רשת מוצלב במרחק קטן מספיק בין צלבים סמוכים, כך ממוצע של פחות 100 חוצה יכה את המשטחים סעיף הלוחות של איבר אחד בכל מקרה ומקרה בחן המחקר . רשת קרוס מדעית recommendable גדלים עבור איברים ורקמות חזירי ביותר הם הצביעו על החומר משלים של "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7.
      2. למדוד את האזורים הלוחות רקמות של תמונות דיגיטלי של התמונות/הסריקות באמצעות המתאימים זמינים מסחרית או freeware morphometry רך - ויישומים חומרה (איור 3 H), כגון תמונות מסחרי ניתוח מערכת21, או ImageJ22.
        התראה: הערה זה לוח רקמות (הראשון או האחרון) ממוקם על-גבי הסורק נח על פני השטח הטבעי שלו, בהתאמה, פרצופים למצלמה עם פני השטח הטבעי שלו. לכן, סרוק התמונה, התמונה תמונה של לוח זה, לא יציג משטח סעיף. לכן, אין פרופיל אזור מקטע נמדד בדמות תמונה/תמונות סרוקות סלאב רקמה זו (איור 3עכשיו). גם הקרנה יתר הערה להציג תמונות סרוקות ותצלומים של איברים/רקמות לוחות, דהיינו, רק למדוד את האזורים של הפרופילים סעיף בפועל, אך לא של הרקמה בתמונה שמאחורי סעיף סלאב פני השטח (איור 12 G-H).
    7. לחשב את האחסון איברים מוערך כמו התוצר של הסכום בכל התחומים הפרופיל המתאים סעיף של כל לוחות רקמות בכל מקרה (כלומר, באופן עקבי של ימינה או שמאלה, בהתאמה, המשטח החלק העליון או התחתון של כל איבר ואיבר סלאב העובי הממוצע של לוחות (קרי, את המנה של נמדד אורך הציר האנכי איברים (l) ואת מספר לוחות)15.
  3. קביעת היקף רקמת הקשורות הטבעה תלת מימדי הצטמקות במהלך עיבוד של דגימות רקמה עבור כפפות
    1. להכין חומרים: מיקרוטום להבים, מלקחיים, אגר, תבניות ליציקות מתכת, סורק דיגיטלי וגודל הסרגל (למשל, גרף נייר).
    2. לחתוך משטח סעיף המטוס טריים, מתוך דגימת רקמה קבוע.
      הערה: אם באמצעות דגימות של בקלות deformable רקמות (רכות) (רקמת שומן, כמו ג'לי רקמות), להטביע דגימת הרקמות קבוע באגר לפני אופטים (איור 4A).
    3. להטמיע לדוגמה באגר:
      1. לערבב אבקת אגר רגיל משמש מיקרוביולוגיה בינוני תרבות עם אמצעי אחסון המתאים של מים (כ 0.5-1 גרם אגר/10 מ ל מים) בתוך זכוכית. מערבבים את התערובת וחום זה תנור מיקרוגל ב- 700 W עד רותחים במשך 3-5 ס לבחוש את התערובת ולהביא לרתיחה שוב עבור s 3-5.
      2. לחלופין, כדי להגדיל את החדות של אגר אל הרקמות, לצבוע את נוזלי אגר, למשל, עם דיו שחור (להוסיף 10 מ של אגר נוזל חם דיו 1 מ"ל ומערבבים נמרצות).
      3. יוצקים על אגר חם לתוך תבנית יציקה (למשל, תבנית מתכת המשמש פרפין הטבעה, איור 10A-D) ויציפו דגימת הרקמות קבוע ב אגר חמים. תן את אגר מגניב עד התמצקות להסיר את התבנית, חותכים את גוש אגר עם הרקמה מוטבע באמצעות מיקרוטום או גילוח.
        התראה: בעת טיפול אגר נוזל חם, ללבוש משקפי מגן וכפפות. דגימות רקמה תהליך קבוע בפתרון פורמלדהיד תחת פליטה הוד וללבוש משקפי מגן וכפפות מעבדה.
    4. למקם את הדגימה שפני השטח שלו סעיף כלפי מטה על סורק משטח הסורק, יחד עם סרגל הגודל, סריקת פני השטח סעיף (איור 4Aב').
    5. קובעים את האזור של המשטח החלק של דגימת הרקמות קבוע (f) במהלך הסריקה הדיגיטלית, באחת מהשיטות המתוארות שלב 1.2.6 (איור 4B).
    6. להטביע את הדגימה במדיום ההטבעה פלסטיק, כגון אפוקסי (למשל, Epon) או glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)23(25 24,23,פרוטוקולים סטנדרטיים הבאים איור 4C). ודא כי השטח סעיף של המדגם קבוע שנסרקו בשלב הקודם (1.3.4) נשמרת במדגם פלסטיק-מוטבע.
      הערה: כדי לשמור על הכיוון של המשטח החלק של המדגם במהלך העיבוד של המדגם, באופן עקבי למקם את הדגימה שפני השטח המיועד סעיף שלו פונה כלפי מטה לתוך בקלטת ההטבעה או עובש הליהוק של או סמן המקטע המיועד השטח (או בצדו הנגדי של המדגם) עם דיו.
    7. לחתוך מקטע היסטולוגית מהגוש פלסטיק המקביל למשטח הסעיף המקורי של דגימת הרקמות קבוע (שלב 1.3.2) באמצעות מיקרוטום (איור 4D), הר המקטע על משטח זכוכית (איור 4D), יחתים אותו באופן שגרתי ( למשל, Hematoxylin ו eosin כתם, H & E)24,25.
      התראה: כדי לקבל מקטע היסטולוגית בקירוב אותו מישור כמו השטח הסעיף המקורי של דגימת הרקמות קבוע, להתאים בקפידה העמדה של גוש פלסטיק הר האזמל הקטן לפני חלוקתה.
    8. מקום השקופית עם החלק המוכתם פונה כלפי מטה על סורק משטח אופקי עם סרגל הגודל, הקדמות (איור 4E).
    9. קובעים את האזור של המקטע דגימת הרקמות פלסטיק-מוטבע (Ae) במהלך הסריקה הדיגיטלית, באחת מהשיטות שתוארו בשלב 1.2.6 (איור 4F).
    10. לחשב הצטמקות רקמות הטבעה הקשורות הממוצע (כדי להפוך את הרקמה המתאימים בינוני ההטבעה) מאזורי מדודה של פרופילים בסעיף המתאים של דגימות רקמה לפני ואחרי הטבעה פלסטיק והטבעה בינוני. ה גורם ההתכווצות ליניארי fs מחושבת השורש הריבועי של המנה של האזורים של הפרופילים סעיף של דגימות רקמה n לאחר הטמעת פלסטיק והטבעה בינוני (e) ואזורי של פרופילים בסעיף המתאים של דגימות רקמות אותו לפני הטמעת פלסטיק והטבעה בינוני (f) (איור 4G)14.

2. נפח משוקלל דגימה אקראית שיטתית בנקודה ספירת ועיבוד של רקמת Subsamples במורד הזרם ניתוח-סוגים7

  1. להכין חומרים: הסרגל, קליבר, סכין, מספריים, מלקחיים, עט עמיד למים, נקודה/קרוס רשתות הדפסה על שקפים פלסטיק וטבלאות מספר אקראי.
    הערה: העתקת תבניות עבור לחצות רשתות (5-60 מ"מ) הינם מסופקים בכל החומר משלים של"רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7.
  2. הנח הרקמה/האיברים על משטח רגיל (חיתוך בסיס), למדוד את האורך (l) של האיבר לאורך ציר האורך (5A איור, איור 6A).
  3. את מלאה האיברים/הרקמות לחתוך לפרוסות מקבילים קו מקביל אורתוגונלית לציר האורך שלו (איור 5B). לבחור מרחק d בין שני מקטעים (קרי, עובי המרווח/מקטע אופטים, בדרך כלל כ- 1 ס מ) קטן מספיק כדי לקבל מספר מספיק של רקמות/איברים פרוסות. באופן אקראי למקם את המקטע הראשון למרחק בין 0 להמרווח אופטים מן השוליים של האיבר. בעודו חותך, לשפוט באופן חזותי את המיקום והכיוון של כל מטוס סעיף להשגת איברים כ מקביל/רקמות לוחות של עובי אחיד פחות או יותר.
    הערה: המספר הדרוש של לוחות רקמות/איבר תלוי בגודל של הרקמה/האיברים שנבדקו ואת המספר של רקמות שנדגמו מיקומים. אם איברים קטנים או דגימות חייב להיות למחלקה של לוחות דק של ≤5 מ מ, להטביע את הדגימות אגר לפני חלוקתה (ראה שלב 1.3.3.) ולהשתמש התקנים הטכניים שמגיע המדגם אגר-מוטבע. מרווחי אופטים מדעית recommendable חזירי ביותר איברים ורקמות, כמו גם דוגמאות שמגיע התקנים מסומנים בחומר משלים של "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7.
  4. מקם כל איבר/רקמות לוחות על המשטח אותו כלפי מטה על בסיס חיתוך (איור 6B).
  5. שכבת-על לוחות רקמות עם רשת הצלב בגודל מתאים מודפס על שקיפות פלסטיק על-ידי הצבת החיצוני נשאר העליון צלב של הרשת נקודה אקראית מתוך הרקמה (איור 5C-D, איור 6B).
    הערה: בחר רשת מוצלב במרחק קטן מספיק בין צלבים סמוכים, כך בכל מקרה בחן המחקר, צלבים לפחות כפליים יכה את סעיף surface(s) של תא רקמת מתחננות שיטעמו, ככל שמספר הדגימות שיש לקחת בתא הזה הרקמה. רשת קרוס מדעית recommendable גדלים עבור איברים ורקמות חזירי ביותר הם הצביעו על החומר משלים של "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7.
  6. מארק וכל ספירה חוצה להכות את הרקמה (בהתאמה, רקמות תת תא מתחננות שיטעמו). באופן עקבי להחיל מצב אחיד של ספירת ומספור על הצלבים להכות תא רקמות כדי ניתן לטעום כל לוחות רקמות, למשלעל-ידי מספור רציף על הצלבים המתאימים בכל שורה אחר שורה, מן השמאל אל הימין מלמעלה למטה, או, למשל, על-ידי מספור חוצה סלאב רקמות אחד אחרי השני בכיוון השעון, החל הקרוב ביותר למצב בשעה 12, כפי שהוכח exemplarily ב איור 5Eהצלב.
  7. חילוק המספר צלבים להכות תא רקמות/רקמות להיות שנדגמו (n) על ידי מספר דוגמאות שיווצר כדי להשיג את מרווח הדגימה השיטתית (i).
  8. לקבוע את מיקום הדגימה הראשונה על-ידי בחירת מספר אקראי x במרווח בין 1 לאני. בשביל זה, להשתמש בטבלת המספרים האקראיים. לסמן את מיקום הדגימה הראשונה (x) ועל כל הבא x + אני, x + 2אני, x + 3i, וכו ', לחצות להכות תא רקמות/רקמות מתחננות שיטעמו על השקיפות פלסטיק באמצעות עט עמיד למים (איור 5F).
    הערה: טבלאות מספר אקראי יכול בנוחות ובמהירות להיווצר באמצעות שימוש מקוון מחולל מספרים אקראיים.
  9. לתייג את הרקמה במקומות המתאימים המסומנים חוצה מעט העלאת השקיפות פלסטיק, הנחת פיסת נייר קונפטי נקי, ריק קטן על פני השטח של לוח רקמות בעזרת זוג מספריים (5G איור, איור 6E ).
  10. בלו דגימה של רקמת מהמיקומים שנדגמו (איור 5 H, 6F איור, איור 7 א), בהמשך לסעף אותם עבור סוגים שונים של ניתוחים עוקבות (6G איור, איור 7 א-B), כפי שצוין במקטע טבלה 1.
  11. לאחר דגימה, השקפים פלסטיק עם מים חמים וסבון, יבש, נקי, לעשות בהם שימוש חוזר.

3. הדור איזוטרופיות אחיד אקראי (iur השוק) סעיפים ו אנכי אחיד אקראי (VUR) מקטעים עבור ניתוחים Stereological כמותית

  1. טכניקת "Isector"
    1. להכין חומרים: סכיני גילוח או מיקרוטום אגר, עובש הליהוק כדורית (למשל, יציקה תבניות פרלינים, אשר ניתן להשיג מהספקים קונדיטור), foldback מלחציים, מלקחיים.
    2. הכנס של רקמה בגודל שלמאחה פיסת (1 x 1 x 1 ס מ3) קבועה, שנדגמו באקראי באופן שיטתי תבנית ליציקת כדורית, מחזיקים יחדיו על ידי מהדק foldback, למלא את התבנית עם אגר נוזל חם (איור 8A-E).
    3. הסר לספרה אגר (איור 8F) עובש הליהוק לאחר התמצקות של אגר.
    4. לגלגל את גלגל אגר עם דגימת הרקמות מוטבע על-פני השולחן, לעצור, סעיף זה במיקום אקראי.
      הערה: המטוס סעיף וכתוצאה מכך הוא מקטע iur השוק (איור 8F-G).
    5. המשך כדי להטביע את דגימת רקמה שרף פלסטיק כגון GMA/MMA, שמירה על הכיוון של המקטע iur השוק מטוס (ראה 1.3.5).
  2. טכניקת "orientator"
    1. הכנת החומרים: סכיני גילוח או מיקרוטום, אגר, מלקחיים, טבלאות מספר אקראי, הדפסים של מעגלים equiangular, ואת קוסינוס משוקלל.
      הערה: העתקת תבניות חוגים ניתנים פרסומים קודמים8,26.
    2. למקם את דגימת רקמה קבוע (או רקמת קבוע אגר-מוטבע) על טביעת אצבע של עיגול equiangular עם קצה אחד מקביל 0-180 ° בכיוון (איור 9 א, איור 10E).
    3. לקבוע זווית אקראית על ידי שימוש בטבלה מספר אקראי. למצוא את הסימנים המתאימים היקף המעגל equiangular, הנשענת על המדגם. בעזרת הסימנים האלו, לגזור מקטע באמצעות המדגם (או דרך על אגר המקיפים את דגימת רקמה מוטבע), עם המטוס סעיף להיות מונחה מקביל לכיוון הזווית אקראי המצוין על היקף המעגל equiangular, ואנכי נח השטח של המדגם (איור 9B-C, איור 10F).
    4. מניחים את גוש רקמה עם משטח סעיף שנוצר בשלב הקודם מול החיסרון על מעגל קוסינוס משוקלל עם הקצה של פני השטח מנוחתו להציב מקביל לכיוון 1-1 (9D איור, איור 10 H).
    5. חזור על שלב 3.2.3 וחותכים מקטע חדש באמצעות המדגם בזווית אקראי נחוש להשתמש בטבלה מספר אקראי (איור 9E-F, איור 10I-J).
      הערה: המטוס סעיף וכתוצאה מכך הוא מקטע iur השוק.
    6. אם זה מתאים, לקבוע את האזור של הפרופיל סעיף iur השוק של דגימת הרקמות קבוע לקביעת הצטמקות רקמות הקשורות הטבעה (איור 9G-J) כפי שמתואר בשלב 1.3, והמשך כדי להטביע את דגימת רקמה בפלסטיק שרף כגון GMA/MMA.
  3. דור סעיפים אנכי אחיד אקראי (VUR)
    1. להכין חומרים: סכיני גילוח או מיקרוטום, אגר, מלקחיים, טבלאות מספר אקראי, והדפסים של מעגלים equiangular.
      הערה: העתקת תבניות חוגים ניתנים פרסומים קודמים8,26.
    2. הגדר ציר אנכי בתוך דגימת הרקמות קבוע כי הוא תמיד לזיהוי בסעיפים/המדגם במהלך והשלבים הבאים.
      הערה: בדרך כלל, הציר האנכי השטח הטבעי של דגימת הרקמות נבחר בתור הציר האנכי.
    3. אם זה מתאים, להטביע את הדגימה אגר (איור 11B).
      הערה: אגר-הטבעת לפני VUR - או iur השוק-חלוקתה של המדגם קבועה היא בדרך כלל recommendable עבור דגימות קטן, דק, שביר או רכים. גם להשתמש אגר-הטבעה של דוגמאות כדי להקל על המיקום של המדגם משרטוטי VUR במהלך עוקבות הטבעה של המדגם במדיום שרף הפלסטיק.
    4. מניחים את הדגימה על טביעת אצבע של עיגול equiangular, עם הציר האנכי להיות מונחה orthogonally למטוס של הטבלה לטבלה/נייר (איור 11C).
    5. המדגם בזווית אקראי (שנקבע באמצעות טבלה מספר אקראי) עם המטוס סעיף אורתוגונלית לטבלה גזורה מקביל לציר האנכי כדי לקבל מטוס סעיף VUR (איור 11D).
    6. אם זה מתאים, לקבוע את האזור של הפרופיל סעיף iur השוק של דגימת הרקמות קבוע לקביעת הצטמקות רקמות הטבעה הקשורות כפי שמתואר בשלב 1.3 (השווה ל 9G איור-J) והמשך כדי להטביע את דגימת רקמה ב שרף הפלסטיק כגון GMA/MMA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הטכניקה ועלייתו של קביעת צפיפות רקמה/איברים

איור 12A -B מראה הקביעה נציג של צפיפות ונפח של כליה חזירי בטכניקה ועלייתו שמתואר בשלב 1.1 (איור 1, איור 2). נציג יותר תוצאות מדידות צפיפות של האיברים חזירי נוספים מוצגים בטבלה מס ' 2. רשימה מקיפה של צפיפות התייחסות מגוונות חזירי רקמות ואיברים מוצג "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7. תוקפה של ערכי מדידה של דחיסות רקמת שהושג באמצעות השיטה ועלייתו ייתכן מוערך על ידי מדידות חוזרות באותה דגימת זרע, של דגימות עצמאית. רקמות חזירי ביותר להציג ערכי דחיסות גבוהה מעט יותר מים (ρמים ≈ 1.0), ואילו רקמות שחייה בתוך תמיסת מלח (רקמת שומן, רקמת הריאה) להציג צפיפויות < 1.0.

קאבליירי שיטה לקביעת אמצעי אחסון איברים

איור 12C -F מציג קביעת נציג עוצמת כליות חזירי (האיבר אותו, כפי שמוצג באיור 12A-B). האזורים של משטחים סעיף של הלוחות איברים נקבעו על-ידי נקודה-ספירה, באמצעות רשת קרוס-גבי מודפס על שקיפות פלסטיק, וכן על ידי מדידה planimetric בסעיף התחומים של איברים לוחות תמונה סרוקה הלוחות (משלם תשומת לב הקרנה יתר של רקמת ממוקם מאחורי המשטחים במקטע לוחות, איור 12 G-H). הדיוק של איברים/רקמת אחסון נתונים שהושגו על-ידי ביצועים של הגישה קאבליירי (שלב 1.2, איור 3) יכול להיות מוערך על ידי השוואה לאמצעי האחסון המתאימים שמחושבים המשקל ואת צפיפות של האיברים/הרקמה. הכרכים של הכליה בחן באיור 12 נקבע על ידי שיטת ועלייתו, השיטות קאבליירי שונה על ידי פחות מ 1% אחד מהשני. כאמצעי של דיוק ההערכות נפח קאבליירי, שלה מקדם של שגיאה (CE) ניתן לחשב, כפי שתואר קודם15.

קביעה של רקמות הקשורות הטבעה תלת מימדי הצטמקות במהלך עיבוד של דגימות רקמה עבור כפפות

התוצאות נציג של היקף רקמת הצטמקות הקשורים ההטמעה של דגימות רקמה חזירי (רקמות הכליה בקליפת המוח), שרפים פלסטיק (GMA/MMA או אפוקסי) לבדיקה כמותית histomorphological יוצגו בטבלה 2 (בעבר נתונים שלא פורסמו). הגורמים ההתכווצות ליניארי המצוין בטבלה 2 היו נחושים כפי שמתואר בשלב 1.3 (איור 4). הם מתייחסים צמצום נפח תלת מימדי של 29% להטבעת GMA/MMA, 22% להטבעת אפוקסי של חזירי קורטיקלית רקמת הכליה. איור 13 מציג דוגמאות מייצגות של דגימות שלמאחה מומשו או מוכן של רקמת שומן אגר-מוטבע, פורמלין-קבוע למדידת דוגמת סעיף שטח הפנים לקראת הטמעת פלסטיק.

משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית על ידי ספירת נקודת ועיבוד של רקמת Subsamples עבור סוגים שונים של ניתוח במורד הזרם

הטכניקה "אופטים, ספירת נקודת" עבור משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של איברים parenchymal (שלב 2, איור 5, 6 איור, איור 7) מייצג שיטה ותיקה, חסון, בדור של נציג דוגמאות עבור מספר סוגי עוקבות של ניתוחים2,7. התוצאות נציג הדור של הדגימה biobank שנדגמו באקראי באופן שיטתי, מאוד מיותר של חזירי איברים ורקמות שונים, עם עוקבות דיפרנציאלית עיבוד הדגימות רקמת נכרת למרובים שונים במורד הנהר שיטות ניתוח באמצעות דגימה בטכניקה המתוארת בשלב 2 (איור 5, איור 7ו exemplarily הפגינו ב איור 6) בעבר כבר פורסם2. בדור של דוגמאות biobank של רקמת הכבד המחקר הקודם biobank חזירי2, לדוגמה, חזירי הכבדים היו לגמרי למחלקה לתוך כ 20 לוחות של 2-3 ס מ עובי, נקודות המגע המוצגים עם עם 3 ס חוצה רשת, כפי שמתואר בשלב 2 ו-16 רקמות מיקומים של 2 x 2 x 2 ס"מ3 היו באופן שיטתי באופן אקראי שנדגמו, טוחנות בכל מקרה ומקרה. מכל אחת הדגימות נכרת, חמש subsamples נוצרו לאחר מכן עבור ניתוחים מולקולריים (קפוא ב-80 מעלות צלזיוס) של מיקומים שנדגמו, subsample אחד עבור cryohistology, subsample אחד היה תקוע בתוך פתרון Methacarn, ואחד פורמלדהיד לפתרון פרפין עוקבות ההטבעה ו היסטולוגית- ובדיקה immunohistochemical. הדור של הדגימות שונים 74 בכל מקרה (עד לאפס או העברה של הדגימות לתוך פתרון קיבוע) הושג תוך כ 20 דקות, על ממוצע2. Practicability/ההצלחה של דגימה המתואר, תת-דגימה הגישה עשוי להיות מוערך על ידי הערכה של האיכות של הדגימות שנוצר (כלומר, איכות RNA - או חלבון מבודד, שימור histomorphological, מאפיינים ultrastructural של דגימות רקמה, להתאמתם עבור ניתוחים immunohistological, וכו ')2

דור של איזוטרופיות אחיד אקראי (iur השוק) מקטעים ומקטעים אנכי אחיד אקראי (VUR) עבור ניתוחים Stereological כמותית

הטכניקות הפגינו לדור מונחות לפנים של מקטעים isotropic (iur השוק) אחיד אקראי ומקטעים VUR מ דגימות רקמה חזירי (biobank) (פרוטוקול שלב 3, באיור 8, 9 איור, איור 10, דמות 11), המאפשר בחינה של רוב הפרמטרים stereological כמותיים, במהירות ניתן לבצע עם קצת תרגול, וללא קשיים סביר או מקורות השגיאה. לכן, הדור של iur השוק-דגימות שמוצג באיור 9 (שיטת isector) ו- איור 10 (שיטת orientator) הוא נציג באופן מלא עבור פעולות שירות אלה.

Figure 1
איור 1: איור סכמטי של "הטכניקה ועלייתו" לקביעת צפיפות רקמה/איברים. (א) מידת משקל מדגם (כלומר, מסה, mS). (B) בקנה מידה tared את המשקל של גביע מלא עם סליין 0.9% של 20 ° C, בעל מדגם שקוע בתמיסת המלח למיקום מוגדר, מסומן. (ג) ועלייתו מלאה של המדגם למיקום המסומן של בעל מדגם ללא מגע הקירות הפנימיים או בתחתית הספל. המשקל המוצג על האיזון הוא המשקל של אמצעי האחסון של תמיסת מלח שנעקרו על ידי המדגם). הצפיפות של המדגם מחושבת כמצוין (כאן: ρדגימה = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = g 1.141/cm³). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: "טכניקת ועלייתו" קביעת צפיפות רקמה/איברים. מחזיקי דגימה שונים (A) בנוי חוט דק. משמאל לימין: לולאה של חוט תיל דק דרך בצינורית הזרקת דק, סל הסליל של חוט תיל. כדי להחזיק דגימות קטן ושברירי, כצעיף פשוטה של חוט דק. חיצים ב A-C מציינים את המיקום שאליו בעלי מדגם טובע לתוך תמיסת מלח. (B, C) מיצוב של בעל מדגם במהלך ועלייתו של המדגם בתוך תמיסת מלח (השווה ל איור 1 C). (B) מלאה חזירי בלוטת יותרת המוח ממוקמת ב בעל מדגם בצורת סל. (ג) מדגם של שריר הלב חזירי. הערה על צלילה מלאה של הדגימות בתוך תמיסת מלח ללא פנייה אל הקירות או בתחתית הספל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: איור סכמטי של היישום של השיטה קאבליירי לקביעת אמצעי אחסון איברים חזירי. (א) מטבע לערום לדוגמה עבור ההבנה של העיקרון Cavalieri. לפרטים, ראה מבוא. (בה) הפגנה סכמטי של אמצעי הערכה של כליה זלוף-קבוע. (B) מידת האורך (l) של הכליה לאורך ציר האורך. (ג) לחתוך איבר שלם n עבה באותה מידה (d) מקביל פרוסות אורתוגונלית לציר האורך איברים. (ד) איברים לוחות להציב על המשטח אותו כלפי מטה. שים לב כי המתים רקמות (מימין) הראשונה מונחת על משטח טבעי, קרי, לא קיים משטח סעיף. (E-H) גישות שונות כדי לקבוע סעיף פני שטחים הלוחות רקמות. (E) מעקב את קווי המתאר של כל לוח איברים עם עט עמיד למים על כיסוי פלסטיק שקיפות של הפרופילים לוח המחולק לרמות איברים עם בגודל מתאים, מכויל צלב רשת מודפס על שקיפות פלסטיק, ספירת חוצה להכות פרופיל שטח. האזור פרופיל איברים סעיף סלאב מחושבת לפי מספר צלבים מפגיעה באזור פרופיל סעיף האזור המקביל צלב אחד. (F,G) קביעת סעיף תחומי האיבר לוחות צילום תמונות שצולמו אנכי אוריינטציה למשטחים סעיף (F), או תמונות סרוקות הלוחות רקמות (G), עם שליטים כיול. נחישות (H) בסעיף התחומים של הרקמה לוחות של תמונות דיגיטלי של התמונות/סריקות באמצעות יישומי תוכנה morphometry המתאים. (אני) חישוב נפח מוערך של האיבר כמו התוצר של המצטבר באזור של המשטחים בסעיף המתאים של כל לוחות איבר כפול העובי הממוצע של האיבר לוחות15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: איור סכמטי של נחישות של רקמות הקשורות הטבעה תלת מימדי הצטמקות במהלך עיבוד של דגימות רקמה עבור היסטולוגיה. (א) חיתוך של משטח סעיף טריים, מטוס של דגימת רקמה קבוע (מייצב את צורת בקלות deformable רקמות (רכות) כגון רקמות שומן או ריאה על-ידי הטבעת באגר לפני חלוקתה). סריקה של המשטח סעיף של המדגם יחד עם סרגל הגודל. (B) קביעת Planimetric של האזור של המשטח החלק של דגימת הרקמות קבוע (f). (ג) שגרה הטבעה של המדגם פלסטיק והטבעה בינוני. (ד) הכנת מקטע היסטולוגית של גוש פלסטיק עם שימור של המטוס סעיף של המדגם. הרכבה של המקטע שקופיות זכוכית, צביעת שגרתית של השקופית. סריקה (E) של השקופית יחד עם סרגל הגודל. קביעת Planimetric (F) של האזור של המקטע של המדגם פלסטיק-מוטבע (e). (G) חישוב היקף רקמת הטבעה הקשורות הצטמקות כמו המנה של האזורים נמדדו של פרופילים בסעיף המתאים של דגימות רקמה לפני ואחרי הטבעה פלסטיק והטבעה בינוני14. תמונות בצד ימין מראים על פני סעיף מדגם פורמלדהיד-קבוע של רקמת שומן נעוץ אגר מושחרים-דיו לפני הטמעת שרף פלסטי (למעלה), המקביל סעיף הפרופיל (הוא מכתים) מדגם GMA/MMA-מוטבע (למטה). גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: איור סכמטי של משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית. הדוגמה הציג מראה דגימה אקראית שיטתית של שישה מיקומים רקמות בתוך קליפת כליות כליה זלוף-קבוע. (א) מידת האורך (l) של הכליה לאורך ציר האורך. (B) מלאה חלוקתה של האיבר כולו באותה מידה עבה (d) במקביל פרוסות אורתוגונלית לציר האורך איברים. (ג) איברים/רקמות לוחות להציב על אותו (קרי, הימין או השמאל) השטח פונה כלפי מטה. שכבת-על (D) הלוחות רקמות עם רשת הצלב בגודל מתאים מודפסים על שקיפות פלסטיק. החיצוני שמאל עליון צלב של הרשת ממוקמת מעל נקודה אקראית מחוץ הרקמה (שצוין על-ידי נקודה כחולה, ). ספירת (E) ולאחר המספור של כל חוצה להכות קליפת הכליה. בדוגמה הנוכחית, חוצה מפגיעה בקליפת הכליה ממוספרים ברציפות סלאב כליה אחת אחרי השניה (משמאל לימין), כל הליך סלאב בכיוון השעון, החל הצלב קרוב למיקום בשעה 12. . הנה, צלבים 36 פגע קליפת הכליה. שש עמדות דגימה הם מתחננות שיטעמו. לכן, כל תנוחה השישי בו צלב פוגע הרקמה נדגמים (36/6 = 6). (F) בדוגמה הנוכחית, לחצות המיקום של הרביעי (N ° 4) להכות קליפת הכליה נבחר באקראי מיקום הדגימה הראשונה. כל הפעולות הבאות השישי לחצות להכות את קליפת הכליה מסומן על השקיפות פלסטיק באמצעות עט עמיד למים. בדוגמה הנוכחית, אלה העמדות 4, 10, 16, 22, 28 ו- 34. Tagging (G) של המיקומים הרקמה המתאימה על ידי חתיכות קטנות של נייר קונפטי נקי, ריק על פני השטח של הרקמה. (H) כריתה של רקמה דגימות מן המיקומים שנדגמו באקראי בשיטתיות העיבוד הבאים עבור ניתוחים נוספים. איור זה השתנה מ Albl et al. (2016), דמויות S236 ו- S237, עמוד 186 (תוספי מזון)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית של קליפת כליות כליה חזירי (ראה איור 5) וכל הכללים עבור ספירת נקודת. כליות חזיר טרי (A). כליות (B) למחלקה לפרוסות לא פחות עבה מקבילים אורתוגונלית לציר האורך איברים, בשכבות עם צלב רשת מודפס על שקיפות פלסטיק. העיגול האדום מציין את המיקום של הנקודה אקראי נהגה אקראי המיקום של הרשת קרוס. (C) איור של כללים ספירת נקודות: cross/point נחשבת להכות תא רקמת להיות שנדגמו (הפניית תא), אם הפנימי הימני העליון של האנכי והאופקי בר של הצלב (חץ) מכסה את הרקמה. (ד) סימון צלבים להכות את קליפת הכליה ואת דגימה אקראית שיטתית של רקמות מיקומים (כאן, צלבים 119 פגע בקליפת הכליה, מיקומים 17 הם שנדגמו באופן שיטתי באופן אקראי באמצעות של הדגימה מרווח אני = 7). (E) שנדגמו באקראי בשיטתיות מיקומים של קליפת הכליה שתייגת על ידי נייר קונפטי. (F) טוחנות דגימות. (G) עוד חלוקה של דגימות נכרת לצורך עיבוד עוקבות של subsamples לסוגים שונים ניתוח במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: חלוקה של דגימות רקמה טוחנות מ באופן שיטתי רקמות שנדגמו באקראי מיקומים ועיבוד של subsamples עבור סוגי ניתוח במורד הזרם שונה. (א) איור סכמטי של דור של רקמת subsamples ממיקום אחד שנדגמו באקראי באופן שיטתי של קליפת הכליה (יליד רקמות) עבור ניתוחים שונים (למשל, FF-PE: פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, ולדגום MTC-PE: דוגמת Methacarn-קבוע, פרפין-מוטבע עבור היסטולוגיה מיקרוסקופיים אור; הקפאה: דוגמת עבור באזור הקפואים היסטולוגיה; -80 ° c:-קרח יבש קפוא דגימות רקמה לבדיקה מולקולרית). (B) כריתה של מיקומים שנדגמו באקראי באופן שיטתי של קליפת כליות כליה זלוף-קבוע, נוסף חלוקה של הדגימות רקמת נכרת, ועיבוד subsamples עבור כמותיים המורפולוגיים. לוחות של זלוף-קבוע חזירי בכליות (1), קרוס-רשת (2), אקראי מספר שולחן (3), equiangular ויוערך על-ידי קוסינוס במעגלים (4) לדור של מקטעים iur השוק (ראה איור 9, איור 10), פתרונות קיבוע שונות (5, 6, 7), לדוגמה מיכל לדגימות אלקטרון מיקרוסקופיות (8). דמות זו שונתה מ. Albl et al. (2016), איור S239, עמוד 186 (תוספי מזון)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: "Isector" סעיף הכנה מרקמות חזירי פורמלין-קבוע- (א) דוגמאות זלוף-קבוע את חזירי קליפת הכליה. עובש הליהוק כדורית (B). אגר נוזלי (C). (D-E) אגר-הטבעה של דגימות ב עובש הליהוק כדורית. אגר (F) בכפיפה עם דגימת רקמה מוטבעים. אגר (G) בכפיפה עם רקמת מוטבע למחלקה במיקום אקראי (מישור סעיף iur השוק). דמות זו שונתה מ. Albl et al. (2016), איור S6, עמוד 14 (תוספי מזון)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: איור סכמטי של הטכניקה "Orientator" להכנה סעיפים iur השוק. (א) Sample(s) של רקמת קבוע המוטלות על עיגול equiangular (ci1) עם קצה מקביל 0-180 ° בכיוון (מסומן על ידי קו אדום). Sectioning (B) של המדגם בזווית אקראי (הקו הירוק). (ב, ג) לאחרונה נוצר סעיף השטח של דגימת הרקמות (מסומן בצבע ירוק). (D) מדגם להנחה על מעגל שקל קוסינוס (ci2) עם משטח סקציות שנוצר בשלב הקודם מול החיסרון של קצה אחד של פני השטח מנוחתו מקביל לכיוון 1-1 (מסומן על ידי קו אדום). חיתוך (E) של המקטע השני דרך הדגימה בזווית אקראי. (F) Resulting באופן אקראי איזוטרופיות בסעיף מטוס המדגם (מסומן בצבע כחול). נחישות (G) של האזור של המקטע iur השוק של דגימת הרקמות קבוע עבור הערכה של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות כפי שמתואר בשלב 1.3. Embedding (H) של דגימת הרקמות שרף הפלסטיק. (אני) הוא Sectioning של גוש פלסטיק המחולקת למקטעים (במקביל למישור iur השוק) על מיקרוטום. (J) הרכבה של iur השוק הפלסטיק-הסעיפים בשקופיות זכוכית. דמות זו שונתה מ. Albl et al. (2016), איור S8, עמוד 15 (תוספי מזון)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: "Orientator" טכניקה להכנה iur השוק קטעים של דגימות רקמה אגר-מוטבע. (י-ם) באופן אופציונלי, אחד אגר-להטבעה דגימה שנדגמו באקראי באופן שיטתי של רקמות קבועה (אגר-הטבעה שימושית עבור דגימות רקמה קטנה, כך הראשון או שניתן למקם אותם בשני המקטעים אקראי בתוך אגר ללא חיתוך לרקמת). (E) מיקום הרחוב אגר על עיגול equiangular (ci1) עם קצה מקביל לכיוון 1-1 (מסומן על ידי קו אדום). (F, G) חלוקתה של גוש בזווית אקראי (כאן: 15-15, הקו הירוק) באמצעות טבלה מספר אקראי (חץ rnt, ירוק). (H) עוקבים מיצוב של גוש אגר על פני סעיף לחתוך בפה על משוקלל קוסינוס עיגול (ci2) עם הקצה של פני השטח מנוחתו להציב מקביל לכיוון 1-1 (מסומן על ידי קו אדום). (אני) והמקטע השני לחתוך הדגימה בזווית אקראי (כאן: 20-20, המצוין על-ידי קו כחול), נקבע על-ידי שימוש בטבלה מספר אקראי (חץ rnt, כחול). Iur השוק שנוצר (J) בסעיף מטוס של הרקמות. דמות זו שונתה מ. Albl et al. (2016), איור S9, עמוד 16 (תוספי מזון)7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11: איור סכמטי של VUR סעיף הכנה- (א) דגימת הרקמות קבוע עם מוגדרים (זיהוי) ציר אנכי (למשל, אנכי אל פני השטח הטבעי שלו). קבוע (B) לדגימות מוטבע אגר. (ג) מיקום דגימת רקמה the(agar-embedded) המודפסת של עיגול equiangular (ci1). ויא: הציר האנכי. (ד) Sectioning של המדגם בזווית אקראי (טבלה מספר אקראי; כאן: 30-30 לכיוון, המצוין על-ידי קו כחול) עם המטוס סעיף להיות מונחה orthogonally טבלה, במקביל לציר האנכי של המדגם. מטוס סעיף של VUR וכתוצאה מכך של דגימת הרקמות (מסומן בצבע כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12: נציג volumetry של כליה חזירי. (A-B) טכניקה צלילה. (א) קביעת המשקל כליות (מ'הילד). (B) קביעת המשקל של אמצעי האחסון של תמיסת מלח שנעקרו על ידי הכליה (מ'displ.saline). הכליה תלויים על חוט, מלא שקוע בתוך תמיסת מלח בלי לגעת התחתון או קירות הספל. הנפח מחושב של הכליה היא 92.6 cm³. (C-D) טכניקה קאבליירי, planimetry על ידי ספירת-נקודה. (ג) מידת האורך (l) של הכליה לאורך ציר האורך. (ד) קביעת פרופיל בסעיף התחומים של הכליה לוחות בנקודה לספור אחרי כיסוי של רשת של צלבים המרווחות באופן שווה מודפס על שקיפות פלסטיק. כאן, עוצמת הכליות המשוער הוא 93.3 cm³. (E-F) טכניקה קאבליירי, planimetry של תמונות סרוקות של סעיף אזורים פרופיל של הלוחות כליות (F). כאן, עוצמת הכליות המשוער הוא 92.8 cm³. C-E, הטבעי לעגל. השטח של הראשון או המתים האחרון של הכליה להציב על-גבי הסורק או בשכבות על-ידי שקיפות רשת מוצלב אינו משטח סעיף והוא לכן, שטח הפנים אין סעיף נמדד סלאב רקמה זו. (G-H) הפגנה של overprojection תמונות סרוקות של איברים/רקמות לוחות (G), לוחות איברים/רקמות בשכבות עם שקיפות רשת קרוס (H). Overprojecting חלקי הרקמה הלוחות איברים מסומנים על-ידי קווים מנוקדים שחור ולבן. רק באזורים של הפרופילים סעיף בפועל (כלומר, הרקמה מוקף על ידי הקו המקווקו לבן המצוין חלקית) נקבעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 13
איור 13: איור נציג של נאותה (א) ו שיוצרת (ב) הכנה של דגימות רקמה אגר-מוטבע נחישות של רקמות הצטמקות הקשורים הטבעה של דגימות בפלסטיק היסטולוגית הטמעת מדיה. (א) תמונות שנסרקו של המשטח החלק של מדגם קבוע של רקמת השומן התת עורית חזירי לפני הטמעת שרף הפלסטיק. המדגם שמוטבע מושחרים-דיו אגר לייצוב של הצורה של המדגם ונקה זיהוי של קווי המתאר פני מקטע. (B) לא ברור חלוקה לרמות של בועת אוויר משטח כלואה סעיף (חץ) בתוך אגר. גודל ברים = 5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ניתוח מדגם עיבוד
סוג פעולות שירות
ניתוחים מולקולריים תעתיק רנ א, חלבון, מטבוליט וכן יצירת פרופיל שומנים בדם,
גליקומיקס ניתוח, ניתוח הדנ א
חתיכות קטנות * רקמת טריים (מקורי) להקפיא קרח יבש או חנקן נוזלי. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
המורפולוגיים איכותי היסטולוגיה
[מיקרוסקופ אור, כולל אימונוהיסטוכימיה (IHC) & היברידיזציה]
טרי (מקורי) — או בחיי עיר - קבוע * דגימות רקמה כתות ומייצבים שונים (למשל, 4% פורמלדהיד פתרון) ולהשתמש הטמעת מדיה (שעוות פרפין, GMA/MMA, אפוקסי), בהתאמה.
Cryohistology
(סעיפים קפוא, כולל IHC)
דגימות רקמה (מקורי) טריים להטביע הדגימה חסימה בינוני, להקפיא במצב איזופנטאן מקורר חנקן נוזלי.
ניתוח ultrastructural
[מיקרוסקופ אלקטרונים, כולל שידור-(TEM) ואלקטרון סריקה]
חתיכות קטנות של טרי (מקורי) — או בחיי עיר- קבוע * דגימות רקמה לתקן את הדגימה בפתרון גלוטראלדהיד 2.5-6.25%, להטביע אפוקסי שרף הפלסטיק.
המורפולוגיים כמותיים מיקרוסקופ אור טרי (מקורי) - או בחיי עיר - קבוע * דגימות רקמה להכין iur השוק קיסרי (orientator-, isector-סעיפים) ו/או VUR-קטעים של דגימות רקמה מוטבע פלסטיק.
TEM חתיכות קטנות של טרי (מקורי) — או של בחיי עיר - קבוע * רקמה להכין iur השוק (orientator-, isector-סעיפים) קטעים של דגימות רקמה אפוקסי-מוטבע.

טבלה 1: עיבוד של רקמת subsamples טוחנות ממיקומים שנדגמו באקראי באופן שיטתי עבור סוגי ניתוחים שונים במורד הזרם. בהתאם לעיצוב הניסיונית של מחקר ואת הרקמה/האיברים תחת חקירה, מספר שונה של subsamples צריך להיות טוחנות ממיקום אחד רקמות שנדגמו באקראי באופן שיטתי, מעובד עבור סוגים שונים של ניתוחים במורד הזרם. פרוטוקולים מפורט עבור איברים חזירי ביותר/רקמות וסוגי המחקר ניתנים את "רקמת דגימה מדריכים עבור חזירי ביו מודלים"7. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate. Iur השוק: Isotropic המדים אקראי. VUR: המדים אנכיים אקראיים. * מקסימום. 2 x 2 x מ מ 23. למשל, רקמות זלוף קבוע או רקמות בריאות של הריאות החדירו עם קיבוע פתרון.

שיטה התוצאות נציג
הטכניקה ועלייתו של קביעת צפיפות רקמה/איברים (שלב 1.1, איור 1, איור 2) איברים חזירי/רקמות Ρ (g/cm³)
הכבד 1.071 ± 0.007
הלבלב 1.062 ± 0.016
החדר שריר הלב 1.036 ± 0.014
כליה 1.044 ± 0.006
רקמת שומן מהבטן בטן * 0.921 ± 0.032
בלוטת התריס 1.061 ± 0.007
המוח 1.051 ± 0.007
בלוטת יותרת הכליה 1.063 ± 0.025
שריר השלד * * 1.074 ± 0.003
הנתונים הם אמצעי ± משקולות איברים/רקמות ספציפיות SD. נקבעו ב- n = חזירים 18 (14 חזירים זכרים נקבות ו-4; גיל 60 ימים עד שנתיים שנים; 30 – 250 ק ג משקל גוף). * רקמת שומן של מצע המעי jejunal. * * מתכוון ערכים עבור הרחיב longissimus את מ', מ השוקתי cranialis, הזרוע התלת ראשי מ מ gluteobiceps.
קביעה של רקמות הקשורות הטבעה תלת מימדי הצטמקות במהלך עיבוד של דגימות רקמה עבור היסטולוגיה (שלב 1.3, איור 4) איברים/רקמות הטבעה בינוני       fS
קליפת הכליה (חזיר) GMA/MMA 0.89 ± 0.02
אפוקסי 0.92 ± 0.02
הנתונים הם אמצעי ± SD של מדידות של 24 דגימות של חזירים 12. fS: פקטור התיקון ההתכווצות ליניארי.

טבלה 2: התוצאות נציג של צפיפויות של הנבחרת חזירי איברים ורקמות7, וגורמים ההתכווצות ליניארי תיקון עבור הטבעה הקשורות רקמות הצטמקות של רקמת כליה קורטיקלית חזירי פלסטיק שונים הטמעת מדיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדור של אספנים מדגם biobank חזירי חייתיים דורש חזקים טכניקות ופרוטוקולים מצפני איברים/רקמות כרכים, הדור לשחזור של נציג, דגימות רקמה עודפת מתאים למגוון רחב של שיטות ניתוח שונות, ועבור אקראיות על הכיוון של מדגם מקטעים עבור ניתוחים כמותיים stereological. בשיטות המתוארות במאמר הנוכחי הם מותאמים הגדלים של חזירי איברים ורקמות, פותחו להכיר ביעילות דרישות אלה,2,7. הם מבוססים על עקרונות מתודולוגיים מוכרת היטב, הוכיחו בעבר שלהם practicability מחקרים שונים שהתפרסמו2,7,12,21. השיטות נבחרים חשובים עבור סוגים שונים של מחקרים בחינת דגימות רקמה/איברים, כיוון שהם מספקים בסיס לדור של מדגמים מייצגים, ולשם רכישת מגוון רחב של פרמטרים אשר אחרת לא היתה אפשרות לקבוע. שיטות אלה ניתן לבצע במהירות עם מעט מאמץ, עולים בקנה אחד עם כמעט כל מיני ניתוחים במורד הזרם. לכן, הם נחשבים מתאימים לא רק במודל חיה חזירי biobank פרויקטים, אלא גם שימושיים במחקרים הכוללים ניתוחים כמותיים histomorphological של דגימות רקמה של מינים אחרים במודל חיה גדולה (למשל, כבשים), כמו גם מחקרים וטרינרי. התחשבות ההיבטים הטכניים של השיטות השונות, כמה שלבים קריטיים והמגבלות צריך להיחשב במהלך הביצוע של הפרוטוקולים של הטכניקות המתאימות.

הטכניקה ועלייתו של קביעת צפיפות רקמה/איברים

במהלך נחישות של רקמות צפיפויות באמצעות השיטה ועלייתו (שלב 1.1, איור 1, איור 2), טיפול חייב להילקח לא לגעת בקירות פנימיים או בתחתית. הספל עם דגימת הרקמות או בעל הדגימה תוך הרקמה הוא מדגם שקוע בתוך תמיסת מלח. אחרת, קנה המידה יציג את המשקל של המדגם ולא את המשקל של אמצעי האחסון של תמיסת מלח שנעקרו על ידי המדגם. עבור דגימות רקמה מאוד קטן/אור (כמה מ ג), שיטת צלילה לקביעת צפיפות הרקמה היא מוגבלת, בשל surface tension את תמיסת המלח ואת המנה גבוהה לרעה של מדגם נפח האחסון של צלילה נוזל במיכל, אשר הפגיעה דיוק המדידה. . הנה, המשקל של המדגם עשויה לשמש לחישובים נוספים במקום האחסון מחושבת צפיפות. קביעת צפיפות הרקמה על ידי צלילה הוא גם לא יעיל עבור רקמת הריאה (מבולבל) טריים, עקב התוכן לא עקבי של האוויר בתוך הרקמה, ובחלק מן המקרים, שבו האיברים השפעול perfused/החדירו עם כתות ומייצבים.

קאבליירי שיטה לקביעת אמצעי אחסון איברים

השיטה של קאבליירי volumetry של חזירי איברים ורקמות מסורבל יותר בהשוואה להגדרה של אמצעי האחסון איברים איברים משקל, צפיפות. עם זאת, מתאים איברים אינה יכולה להישקל כראוי עקב עיבוד ניסיוני שלהם (למשל, איברים זלוף-קבועה או הריאות החדירו עם קיבוע פתרון). כאן, ניתן לשלב את שיטת volumetry קאבליירי אידיאלי עם טכניקה משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית המתוארים שלב 2 (איור 5, 6 איור, איור 12). במהלך הערכה של אמצעי אחסון איברים/רקמות מאזורי של סעיף פרופילים של פרוסות מקבילים, קו מקביל של האיברים/הרקמה (Cavalieri הגישה, שלב 1.2, איור 3), תחזוקה על הכיוון של הרקמה לוחות (המקטע העליון והתחתון המטוס ), כמו גם הקביעה מדויקת של האזור של כל פרופילי במקטע בעלות חשיבות גדולה. במיוחד, אם תמונות דיגיטליות או סריקות של איברים לוחות הם ניתחו planimetrically, overprojections של רקמות (מחוץ למטוס רקמות משרטוטי) של לוח רקמות (איור 12G-H) בזהירות הריכוזיות לספק אמצעי אחסון אמין הערכות.

קביעה של רקמות הקשורות הטבעה תלת מימדי הצטמקות במהלך עיבוד של דגימות רקמה עבור כפפות

היקף רקמת הטבעה הקשורות הצטמקות תלוי המדיום ההטבעה וסוג הרקמות, והם עשויים להשתנות גם בין דגימות מעובדים באופן שונה של הרקמה זהה.

ואילו חלקים קפואים נחשבים להצגת כמעט אין התכווצות במישור X-Y, פלסטיק והטבעה גורם בדרך כלל ההתכווצות קטן של הרקמה, רקמה הטבעה הקשורות הצטמקות הוא נרחב במיוחד בדגימות רקמה פרפין-מוטבע , והוא בדרך כלל באופן משמעותי יפגום כמותיים המורפולוגיים של פרמטרים ממדי בסעיפים היסטולוגית הדוגמאות הללו. בנוסף היקף גדול הצטמקות הכוללת תלת מימדי, הטבעה-פרפין גם גורם של התכווצות לא אחידה, דיפרנציאלי, אניסוטרופי ו משתנה של המדגם, של מבנים אנטומיים שונים, סוגי רקמות, סוגי תאים בתוך רקמת מדגם8,13. יתר על כן, בעיקר בסעיפים עבה היסטולוגית של דגימות רקמה פרפין-מוטבע, היקף רקמת הצטמקות ייתכן משמעותי גם נבדלים X-Y ו- Z-הכיוון של המקטע. הדבר יכול לנבוע הצטמקות דיפרנציאלית של סעיף באזור (X-Y-כיוון), ואת הגובה סעיף (קרי, העובי סעיף אנכי) בזמן מתיחות של המקטע באמבט מים הנפקה רקמות חם לאחר המקטע נחתכת הרקמה לחסום, במהלך ההליכים הבאים עיבוד מכתים, coverslipping של המקטע רכוב על זכוכית שקופית (קרי, התמוטטות הומוגנית של ציר z של הסעיפים)8. בנוסף, בסעיפים עבה, אולי יש דחיסה וזהובה חזקה יותר של אזורים סעיף-מטוס-ליד רקמות בתוך המקטע בזמן המקטע נחתך מהגוש רקמות (המוביל עיוות דיפרנציאלית של ציר z של הסעיפים)19 . תופעות אלה עשויים ואז גם לעוות את ההערכות של מספר מבנים רקמות בתוך המקטע על ידי שיטות ניתוח stereological כמותיים ברורים, כמו disector אופטי. לכן, חיזוי, ניטור, ותיקון של רקמות הטבעה הקשורות הצטמקות אינו ריאלי עבור דגימות רקמה פרפין-מוטבע8.

לעומת זאת, מידת נפח הצטמקות של דגימות רקמה נעוץ שרפים פלסטיק, כגון GMA/MMA או אפוקסי, הוא באופן משמעותי נמוך יותר, חשוב, אחיד יותר. לכן, הטבעה של שרף פלסטי עם בדוי הומוגני, הצטמקות איזוטרופיות, הכללית של הרקמה יש יתרון עבור מספר שיטות ניתוח פרמטרים מורפולוגי כמותיים שונים17,18. במהלך הערכה של רקמות הצטמקות הקשורים הטבעה שרף הפלסטיק, הצורה של הרקמה קבוע כדאי לא בנוסף להתעוות במהלך ההליך ההטבעה, כדי לאפשר השוואה של אזורים פרופיל בסעיף המתאים של קבוע ושל מוטבע דוגמאות. זה יכול להיות קשה דגימות רקמה רכה או דחוסה בקלות כגון רקמות שומן או ריאה או דגימות רקמה עם תוכן נוזלים גבוהה. כאן, הטבעה של המדגם קבוע באגר לפני חלוקתה של הרקמה הוא מועיל לייצב את הצורה של דגימת הרקמות במהלך הפלסטיק עוקבות הטמעת הליך (פרוטוקול שלב 1.3., איור 4). כדי להשיג מידע אמין, מדידות חוזרות של הצטמקות רקמות הטבעה הקשורות צריכה להתבצע, באמצעות דגימות השונות של הרקמה זהה. היקף רקמת הטבעה הקשורות הצטמקות מבוטאת של פקטור הצטמקות לינארית רקמת fs (פרוטוקול שלב 1.3.9., איור 4G). דוגמאות עבור משוואות באמצעות fs לתיקון הצטמקות של השונות אורך, שטח, נפח פרמטרים של רקמות שונות מבנים ניתנים מספר מחקרים כמותיים stereological14, 21,27.

משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית בנקודה ספירת ועיבוד של רקמת subsamples לסוגים שונים ניתוח במורד הזרם

הטכניקה הציג משוקלל נפח דגימה בשביל האיברים חזירי קובע דגימה אקראית מיקומים בתוך הרקמה פעם אחת, לאחר מכן מפיק הדוגמאות הכרחי עבור ניתוחים שונים נוספים על-ידי תת-דגימה של דגימות רקמה טוחנות מ אלה מקומות7. תחת משטרים משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית, כל מיקום הדגימה אפשרי בתוך הנפח הכולל של הרקמה/האיברים תחת בדיקה יש בדיוק אותו אקראי הזדמנות לטעום, generalizability מובטחת על ידי האוסף של מספר מספיק של דגימות. באמצעות עיצובים משוקלל נפח דגימה אקראית שיטתית לדור של דגימות parenchymal איברים, ולכן יעיל מונע תוצאות ניתוח יכול להיות מוטה על ידי (שעשויות להיות לא צפוי ולא בלתי מזוהה) אי-שוויון הפצות שונות רקמה תפקודית או מורפולוגי מאפיינים בתוך מיקומים שונים של איבר, אשר הוכחו, למשל, אמצעי האחסון מרושע, צפיפות האחסון מספריים hepatocytes חזירי באזורים שונים של parenchyma הכבד28 . האסטרטגיה נבחרים "slabbing-רקמות, תת-דגימה" בשביל האיברים חזירי מובנת בקלות, תואם דרישות טכניות מהשיטות ניתוחים במורד הזרם, יכול להיות מהר ביצעו ואני הותאם לדרישות מחקר ספציפי, ובכך למנוע הטיות דגימה שיטתית, הפחתת השתנות ניסיוני והגדלת הדיוק של הניסוי הכולל, בעת היותו יעיל יותר דגימה אסטרטגיות שבו כל מיקום הדגימה יחיד ייקבע באופן אקראי9 ,15. מספר דגימות חייב להיווצר, כמובן תלוי על הפרמטר שנבדקו ולשינויים שלה בתוך דגימות ממקומות שונים של הרקמה/האיבר שנדגם. בדור של אוספים מדגם biobank נועדו לאפשר בחינה של מספר מרבי של פרמטרים שונים (לא צוין בזמנו של דגימה) על ידי מגוון של שיטות אנליטיות, אסטרטגיה דגימה שפניה כזו בדרך כלל מתזמנת דור של מספרים גבוהים יחסית של דגימות מיותר לכל איבר/רקמות.

דור של איזוטרופיות אחיד אקראי (iur השוק) מקטעים ומקטעים אנכי אחיד אקראי (VUR) עבור ניתוחים stereological כמותית

כמה מן הטכניקות בשימוש בדור של מקטעים iur השוק, VUR, עבור כמותיים ניתוחים stereological קצת סיבכו בסיסים תיאורטיים, הסברים ולכן הם לעיתים קרובות (מיותרת) נמנעו על ידי מדענים רבים, למרות מעשי שלהם יישום קל למדי. VUR סעיפים קלים במיוחד ליצור, והם ממוטבים עבור הערכות צפיפות/שטח בשילוב עם בדיקת cycloid מערכות8,9,20. לעתים קרובות הם מועדף בשל הכיוון מוכר של המטוס סעיף. עם זאת, בניגוד iur השוק מקטעים, VUR מקטעים אינם מתאימים עבור הערכה של אורך-פרמטרים8,9.

במהלך ההכנה של מקטעים iur השוק, VUR, השלב הקריטי הוא, בעצם, כדי לשמור על פני השטח סעיף iur השוק או VUR המדגם קבוע במהלך הטבעה שרף הפלסטיק, וכדי להבטיח כי תמיד ניתן לזהות הציר האנכי של VUR מקטעים (שלב 3, איור 9, איור 10, איור 11).

בעתיד, היישום רחבה יותר של השיטות המתוארות לעיל שאוכל לתרום באופן משמעותי להקים תקנים באופן עקבי באיכות גבוהה עבור דור של biobank דומות, רב תכליתי דגימות חזירי ואחרים מודלים בעלי חיים גדולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה ליסה Pichl לסיוע טכני מעולה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709 (2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics