猪生物医学模型生物库组织样品的取样策略与处理

Medicine

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Summary

在生物库项目的下游分析中, 展示了猪动物模型代表性组织样本生成方法的实际应用和性能, 包括容量、系统随机抽样、组织样品的鉴别处理, 用于定性和定量的形态学和分子分析类型。

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

在翻译医学研究中, 猪模型逐渐变得越来越受欢迎。考虑到个别动物的高价值, 特别是基因改良猪模型, 以及这些模型的可用动物数量有限, 建立了适当加工的组织样本 (生物库), 适合于广泛的后续分析方法, 包括没有在取样时间点指定的分析, 代表了充分利用模型的平移值的有意义的方法。关于猪解剖学的特殊性, 最近建立了综合指导方针, 以标准化生成代表性的, 高质量的样品从不同的猪器官和组织。这些指导原则是结果重现性的必要条件, 也是不同研究和调查人员之间的可比。基本数据的记录, 例如器官重量和体积、取样位置的确定和要生成的组织样本数量, 以及它们的方向、大小、加工和修剪方向, 都是相关因素。确定标本的概化和可用性的分子, 定性, 定量形态学分析。本文介绍了猪组织中具有代表性的、多用途的生物库标本最重要的生产技术。这里描述的方法包括测定器官/组织体积和密度, 用点计数法对实质器官进行容积加权系统随机抽样程序的应用, 确定组织收缩程度与样本的组织学嵌入有关, 并生成随机定向样本进行定量视学分析, 如由 "定位装置" 和 "Isector" 方法产生的各向同性均匀随机 (产学研) 剖面, 以及垂直均匀随机 (VUR) 部分。

Introduction

在翻译医学中, 猪越来越普遍地使用作为大动物模型1,2,3,4,5, 由于猪的几个有利相似性和人体解剖和生理学, 以及现有的分子生物学方法, 允许为多种疾病条件生成量身定做的基因改良猪模型1,4

然而, 与啮齿动物模型相比, 可以随时为实验提供的不同猪模型的动物数量是有限的。这是由于猪的世代间隔大约一年, 并且为猪模型和畜牧业的世代需要的财政和时间密集的努力。因此, 猪模型的个体动物, 以及可以从这些猪身上生成的样本, 都非常有价值, 特别是如果转基因猪模型和/或长期实验性问题 (例如, 晚期并发症的慢性病) 在老年个体检查2,6,7

在任何研究过程中, 在研究的初步实验设计中尚未排定的额外分析的表现可能后来变成相关的,例如, 以解决由于先前发现的不同问题意想不到的发现。如果没有合适的样品进行这种额外的试验, 不成比例可能需要花费高昂的成本和耗费大量时间的开支来产生更多的猪和组织样本。为应对这种可能性, 生物库收集不同器官、组织或生物液体的保守备份样本, 在数量上和质量上都适合广泛的后续分析, 被认为是重要的方法2,6,7。从猪的动物模型中获得最佳的好处, 充分的生物库样本的可用性也提供了独特的可能性, 在同一样本材料上执行广泛的不同分析方法在一个多器官水平上, 在同一单个动物,例如, 通过在研究网络267中组织的不同工作组的科学家分发样本。此外, biobanking 的 "前瞻性" 抽样策略也有助于减少研究中需要的动物数量。猪模型 biobanking 的优势最近已在多器官, multiomics 研究, 检查器官交叉谈话的基因改良猪模型长期糖尿病, 使用标本从慕尼黑米迪猪生物库2

有一些强制性要求生物库样品必须普遍遵守, 以建立可靠性和解读的结果, 随后进行分析。必须重现性生成样本, 并且它们必须具有代表性, 即, 充分反映了从7中抽取样本的组织/器官感兴趣的形态学和分子特征. 为了适合广泛的下游分析类型, 样品必须采取足够的数量和处理, 根据要求 (包括时间和温度条件) 的不同分析方法, 包括描述性病理学分析, 如 cryohistology, 石蜡和整形组织学, 免疫组化,原位杂交, 超微结构的电子显微分析, 临床实验室诊断分析, 以及分子分析 DNA, RNA, 蛋白质和代谢物。

通过定量视学分析, 允许对多种不同的定量形态学参数 (如数字、体积、长度或不同组织结构的表面积) 进行评估, 随机断面平面各器官/组织的组织学样本需要准备7,8,9,10,11。在定量形态学研究中, 对组织、器官或器官室总容积的精确测定, 样本取自 (, 参考空间) 至关重要7,9,12计算相应器官、组织或有机体中相关参数的绝对数量。最终, 在组织学切片的制备过程中, 嵌入相关组织收缩的影响必须确定并考虑到13。因此, 以往研究中的定量视学分析, 特别是存档样本 (固定组织样本、嵌入组织块、组织学切片、等等) 有时会受到严重限制, 甚至是不可能的12,特别是如果没有执行有关的器官/组织的容量, 如果没有充分的抽样设计适用于保证代表性样品, 如果数量和数量的可利用的单独样品是不足的, 或者, 如果处理样本与感兴趣的定量形态学参数的估计不相容。由于各种可能的影响因素, 档案样本材料对不同数量形态参数分析的适用性不能明确地得到回答, 而是取决于对个别案件的仔细评估。

因此, 由于样品的位置、大小、数量、加工、修剪方向和方向等因素对后续分析的结果有潜在影响, 因此这些因子具有重要意义, 必须在任何研究的实验设计中加以考虑。关于这些方面和猪解剖学的特点, 最近建立了适合猪动物模型的全面、详细、大规模的抽样准则, 为标准化、可重现性提供了有力的参考。, 并高效生成冗余、经过充分处理的高质量样品, 来自50多个不同的猪器官和组织6,7

本文所示的方法学描述和视频教程提供了详细的、说明性的、可理解的、循序渐进的指导, 以实现各种容量技术的实际性能、猪组织取样和器官, 并处理组织样品的不同下游分析方法。精选的技术包括根据阿基米德和卡瓦列里的原理确定器官/组织体积和密度的方法9, 包括确定与所涉组织的三维收缩的尺寸嵌入到不同的嵌入媒体14在组织学检查过程中, 应用实际体积加权系统随机抽样方法, 对不同后续的取样组织标本进行处理。分析7,8,9,15, 并为潜在的定量视学分析生成适当的面向和处理的样本7,8, 9,10,11。除了在猪生物库项目中的应用, 所展示的方法一般适用于检查器官/组织的定量历史形态特性的所有研究。此外, 系统随机抽样设计特别有利于在实验中产生代表性样品, 方法是利用分子分析法检测在各种器官和组织。

下段简要介绍了这些方法, 而它们的实际性能则在 "协议" 部分中进行了说明。

器官/组织体积的测定
在几个实验环境中, 器官重量和体积的测定是很重要的, 因为这些因素可能表明变化, 可能与实验性研究的兴趣因素有关。一个器官/组织的总体积也通常需要计算绝对数量参数, (例如, 总细胞数), 从 stereologically 估计的数字体积密度 (, 每个体积单位的细胞数组织)7,12。除了使用复杂的技术设备 (如计算机断层扫描) 技术外, 基本上还有三种常用的方法来确定器官或组织的绝对体积。一个器官的容量可以由 "直接容积测量" 决定根据阿基米德的原则,, 测量水的容量或盐水由结构完全地淹没时偏移。然而, 对于比较大的猪器官, 这些方法是不切实际的, 容易不精确, 因为它们需要非常大的容积/测量烧瓶。更方便的是, 一个器官/组织的体积可以计算从它的重量和密度7,12,16, 可以有效地确定使用 "淹没方法"7,12 ,16 (协议步骤 1.1)。器官/组织体积也可以根据 "卡瓦列里原则" (1598–1647) 使用容量方法估计。简单地说, 卡瓦列里原则规定, 如果两个物体在平行于地面平面的平面上切片, 而在与地面平面相对应的距离上切割两个物体的剖面轮廓有相同的区域, 则两个物体有相同的音量。因此, 任意形状物体的体积可以被估计为其截面剖面区域的乘积, 平行, 同样遥远的剖面平面和截面平面之间的距离。这是可理解的与以下类比: 考虑两个栈组成相同数量的相同的硬币是并排放置, 一个栈与硬币有序堆放在一起产生圆柱形的硬币栈, 和其他用离中心位置的硬币堆叠的硬币 (图 3A)。虽然两个硬币栈的形状是不同的, 它们的体积是相同的, 因为硬币的面积在两个栈的相应级别 (, 平行截面轮廓的区域通过两个硬币栈在相同的距离切割地面) 是相同的。使用卡瓦列里原理估计猪器官和组织的体积7,12,15在步骤1.2 中描述。

组织学埋植相关组织收缩程度的测定
在对组织学组织切片测量的几种定量形态学参数进行分析时, 必须确定并考虑组织处理过程中嵌入相关组织收缩对组织学的影响。嵌入相关组织收缩的程度可能是可变的, 并且取决于组织、处理和嵌入介质8,13,17,18,19。通常, 组织样本体积的嵌入相关变化 (, 主要是收缩) 发生在所有三维空间中, 因此影响由定量视学分析估计的所有维度参数8.基本上, 嵌入相关组织收缩的程度, 表示为线性组织收缩因子 (fS), 可以估计如步骤1.3 所示。用于校正 (收缩敏感) 定量形态学参数14

器官/组织体积加权系统随机抽样
为建立生物库收集猪器官/组织样本, 体积加权系统随机抽样方法, 如步骤2所述, 证明是切实可行的, 节省时间, 和有效的技术, 以产生代表,多用途组织样本7,8,9,15

定量视学分析的各向同性均匀随机剖面和垂直均匀随机剖面的生成
生物库组织样本需要适用于多种不同的定量视学分析方法, 用于估计在没有充分制备标本的情况下无法确定的最大参数。几乎所有定量视学参数都可以用 "各向同性 (独立) 均匀随机 (产学研)" 部分 "8,9" 来确定。在产学研切片中, 组织样品断面平面的三维方向是随机的。这可以通过随机化组织样本的位置相对于截面平面的位置, 如应用于 "Isector" 方法11 (协议步骤 3.1), 或通过随机化截面平面相对于组织样本, 如 "定位装置" 方法 10 (协议步骤 3.2).在组织样本中, 如皮肤或黏膜标本显示自然存在, 或定义和正确地可识别的垂直轴, 准备 "垂直均匀随机 (VUR) 部分" (协议步骤 3.3.) 严格地切片在他们的飞机垂直轴有利8,20。为了全面论述产学研/VUR 抽样的理论基础, 并对潜在的下游定量视学分析进行了综合讨论, 读者可以参考生活中定量视学教科书。科学8,9

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Protocol

这里描述的所有方法都使用来自死动物的组织样本, 完全符合德国动物福利法律规定。

1. 容量

  1. 用于测定组织/器官密度的淹没技术 (图 1 图 2)7,12,16
    1. 准备材料: 手术刀刀片, 纸巾, 细钳, 标准实验室秤, 玻璃或塑料烧杯, 0.9% 盐水, 和自制标本持有人 (图 2A)。
    2. 将组织 (最大尺寸: 2 x 2 x 2 厘米3) 从器官/组织中, 特别是从感兴趣的器官隔间中切除。小器官, 如垂体, 或松果体, 被测量在托托
      注意: 确保样品的尺寸明显小于烧杯内径 (步骤 1.1.5 et), 其填充级别允许完全淹没样品而不接触烧杯内壁的步骤1.1.7。
    3. 用纸巾仔细擦拭样品, 去除多余的血液/组织液。
    4. 在精度刻度上对示例进行权衡, 并记录该示例的权重 (mS)。确定小组织样本的重量到最近的 mg (图 1A)。
    5. 在秤上放置一个装有室温0.9% 盐水的烧杯。不要完全填满烧杯, 允许在随后的步骤中淹没组织样本而不溢出。
      注意: 使用烧杯大小适当的大小和重量的组织样本要测量和有效的测量范围的规模。对于大于 2 x 2 x 2 cm3的较大样本, 50–100 mL 的烧杯大小与从大约100毫克到500克的刻度量相结合是适当的, 而对于小样本, 则使用 5–10 mL 体积的烧杯与精确刻度配合测量范围在大约0.1 毫克和 20 g 之间。
    6. 将采样保持器 () 浸没在生理盐水中一个有标记的位置 (图 1B图 2B图 2C) 中的一个足够刚性的细线或类似的东西,图 2A)。然后, 将刻度的显示重置为零。
    7. 仔细地将组织样本附着在样品架上, 并将样品完全浸入盐水中, 直到到达样品持有者的标记位置 (图 1B中的箭头、图 2B图 2C)。
      注意: 浸没样品和样品持有者不得与内壁或烧杯底部或盐水表面接触。
    8. 在将样本持有者和浸没样本保存在该位置时, 记录在刻度上显示的重量 (mL), 指的是由组织样本 (图 1C图 2B图 2C)。
    9. mL中计算示例的卷 (VS), 和盐的密度在室温下 (20 °c) (ρ盐水 = 1.0048 克/立方公分) 作为 V S = m L/ ρ生理盐水[g/克/立方公分](图 1)。
    10. 从示例 (ms) 和它的卷 (Vs) 的重量 (、质量) 和它的音量计算组织样本的密度 (ρ示例): ρ示例 = mS /VS[g/立方公分] (1)。
    11. 对于测量的器官在托托, 重复测量三次, 并计算平均器官密度从单一的测量值。对于大型器官/组织, 重复测量同一个器官/组织/器官隔间的不同样本, 并计算平均密度从单一的测量, 因此。
    12. 从重量和密度计算器官/组织/器官隔间的总容积 (图 1)。
  2. 卡瓦列里方法在猪器官容积测定中的应用7
    1. 准备材料: 尺, 卡尺, 刀, 剪刀, 镊子, 防水笔, 塑料透明胶片, 扫描仪, 照相相机, 以及印在塑料透明胶片上的十字网格。
    2. 将整个器官/组织放在平坦表面 (切割底座) 上, 并测量该器官沿其纵轴的长度 (l) (图 3B,图 5A)。
    3. 将完整的器官/组织切割成与纵向器官轴正交的等距平行切片 (图 3C,图 5B)。在两个节之间选择距离d (, 切片间隔/切片厚度, 通常约为1厘米), 足够小, 以获得足够数量的组织/器官板。随机地将第一部分放置在距离0和切片间隔之间, 从器官的边缘。切片时, 目视判断各断面平面的位置和方向, 获得近似均匀厚度的平行器官/组织板。
      注意: 组织/器官板的必要数量取决于被检查的器官/组织的形状和大小。如果小器官或样品必须在≤5毫米的薄板中切片, 则在切片之前将样品嵌入琼脂 (见步骤 1.3.3), 并使用一个技术装置切片的琼脂嵌入样品。在 "猪生物医学模型组织取样指南"7的补充材料中注明了大多数猪器官和组织的切片间隔, 以及切片装置的例子。
    4. 将所有器官/组织板置于同一曲面上 (, 在每个风琴板的右侧或左侧剖面上一致,图 3D,图 5C), 并计算板数 (n)。
    5. 通过下列方法之一获得组织板的截面剖面图:
      1. 小心地将组织板放在适当标记的塑料透明胶片上, 同时保持其上、下断面表面的方向。使用防水笔 (图 3E1-2) 跟踪塑料透明胶片上的组织板的轮廓。
      2. 拍摄组织板的照相图像, 将相机垂直放置在截面表面上方 (图 3F)。校准时, 在组织板旁边放置一个尺寸标尺。
      3. 扫描平板扫描仪上的组织板, 同时保持其上、下断面表面的方向 (图 3G)。校准时, 在组织板旁边放置一个尺寸标尺。
    6. 通过下列方法之一测量所有组织板的 (跟踪、拍照或扫描的) 剖面图的区域:
      1. 覆盖或叠加被跟踪的器官板形外形与适当地大小, 被校正的网格相等地间距的十字架打印在塑料透明度并且计数所有十字架击中概要区域 (图 3E3-4; 与比较图 5D)。计算每个风琴板的剖面剖面面积, 将十字线的交点数乘以对应于一个十字架的面积。
        注: 要获得足够精确的体积估计, 请选择相邻交叉处之间有足够小距离的十字网格, 以便平均至少100个十字架在研究的每个被审查的案件击中一个器官的板材的部分表面.在 "猪生物医学模型组织取样指南"7的补充材料中标明了大多数猪器官和组织的跨网格尺寸。
      2. 使用适当的商用或免费软件计量软件 (图 3H) (如商业图像分析系统21), 测量照片/扫描数字图像中的组织板区域。或 ImageJ22
        警告: 注意, 一个组织板 (第一个或最后一个) 放置在扫描仪的自然表面上, 分别以其自然表面面对相机。因此, 扫描的图像, 该板的照片图像, 将不会显示截面表面。因此, 在该组织板的扫描图像/照片图像 (图 3I) 中不测量截面面积剖面。另外注意在扫描图像和器官/组织板的照片中的过度投射,, 只测量实际剖面剖面的区域, 而不是位于板状截面表面后面的图像中的组织 (图 12 G H)。
    7. 将估计的器官体积计算为每个病例的所有组织板的所有对应剖面区域的总和的乘积 (, 分别是右侧或左侧, 每个风琴板的上或下断面表面和板的平均厚度 (, 垂直机构轴 (l) 的测量长度的商数和板数)15
  3. 组织学组织标本加工过程中三维嵌入相关组织收缩程度的测定
    1. 准备材料: 切片刀片, 镊子, 琼脂, 金属铸造模具, 数字扫描仪, 尺寸标尺 (例如, 图表纸)。
    2. 从固定的组织样本中切开一个新鲜的平面切片表面。
      注: 如果使用易变形 (软) 组织 (脂肪组织, 凝胶组织) 的样品, 在切片之前将固定组织样本嵌入琼脂 (图 4A)。
    3. 在琼脂中嵌入样品:
      1. 混合标准琼脂粉作为微生物学培养基中的适当容积的水 (大约 0.5–1 g agar/10 毫升水) 在玻璃烧杯。搅拌混合物, 加热到微波炉在 700 W, 直到沸腾 3–5 s. 搅拌混合物, 并再次煮沸 3–5 s。
      2. 或者, 要增加琼脂与组织样品的对比度, 请将液体琼脂 (例如) 染成黑色墨水 (加入1毫升墨水至10毫升的热液琼脂, 并大力搅拌)。
      3. 将热琼脂倒入浇铸模 (例如, 用于石蜡嵌入的金属模具,图 10AD), 并将固定组织样本浸入热琼脂中。让琼脂冷却, 直到凝固, 删除模具, 并削减琼脂块与嵌入组织使用切片或剃刀刀片。
        注意: 在处理热液琼脂时, 戴上防护护目镜和手套。在排气罩下固定在甲醛溶液中的加工组织样品, 佩戴防护护目镜和实验室手套。
    4. 将该样品与它的剖面面置于平板扫描仪上, 连同尺寸标尺并扫描截面曲面 (图 4A, B)。
    5. 使用步骤1.2.6 (图 4B) 中描述的技术之一, 确定数字扫描中固定组织样本 (Af) 的截面曲面区域。
    6. 将样品嵌入塑料嵌入介质中, 如环氧树脂 (例如、Epon) 或 glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)23, 遵循标准协议23,24,25 (图 4C)。确保在上一步 (1.3.4) 中扫描的固定样本的截面表面保持在塑料嵌入的样品中。
      注: 为了在样品加工过程中保持样品的断面表面的方向, 将试样与其预期的截面表面朝下向下进入嵌入盒或铸件模具, 或标记预期的截面。与墨水的表面 (或样品的反面)。
    7. 使用切片 (图 4D), 从与固定组织样本 (步骤 1.3.2) 的原始切片表面对应的塑料块中剪切一个组织学切片, 在玻璃幻灯片上装入该节 (图 4D) 并对其进行常规着色 (例如, 苏木精和伊红染色, H & e)24,25
      注意: 要在与固定组织样本的原始切片表面近似的情况下接受组织学切片, 在切片前仔细调整塑料块在切片的安装位置。
    8. 将滑块与带尺寸标尺的带染色的切片一起放置在平板扫描仪上, 并扫描该节 (图 4E)。
    9. 使用步骤 1.2.6 (图 4F) 中描述的技术之一, 确定数字扫描中塑料嵌入组织样本 (Ae) 部分的区域。
    10. 在植入塑料培养基前后, 从组织样品相应断面剖面的测量区域计算出其平均嵌入相关组织收缩率 (分别为组织和嵌入介质)。线性收缩系数fs 是在嵌入到塑料嵌入介质 (e) 和区域中的n组织样本剖面图区域的商数的平方根。在嵌入到塑料嵌入介质 (Af) (图 4G)14之前, 相同组织样本的相应剖面剖面。

2. 按点计数和处理不同下游分析的组织标本的量加权系统随机抽样-类型7

  1. 准备材料: 尺, 卡尺, 刀, 剪刀, 镊子, 防水笔, 点/十字网格印在塑料透明胶片, 和随机数表。
    注意: 在 "猪生物医学模型的组织取样指南" 的补充材料中提供了交叉网格 (5–60 mm) 的复制模板7
  2. 将器官/组织放在平坦的表面 (切割底座) 上, 并测量该器官沿其纵轴的长度 (l) (图 5A,图 6A)。
  3. 将完整的器官/组织切割成与其纵轴正交的等距平行切片 (图 5B)。在两个节之间选择距离d (, 切片间隔/切片厚度, 通常约为1厘米), 小到足以获得足够数量的组织/器官切片。随机地将第一部分放置在距离0和切片间隔之间, 从器官的边缘。切片时, 目视判断各断面平面的位置和方向, 以获得近似均匀厚度的平行器官/组织板。
    注: 必要数量的组织/器官板取决于被检查的器官/组织的大小和取样的组织位置的数量。如果小器官或样品必须在≤5毫米的薄板中切片, 则在切片之前将样品嵌入琼脂中 (见步骤 1.3.3), 并使用技术装置切片的琼脂嵌入样品。在 "猪生物医学模型组织取样指南"7的补充材料中注明了大多数猪器官和组织的切片间隔, 以及切片装置的例子。
  4. 将所有器官/组织板置于切割底座上的同一曲面上 (图 6B)。
  5. 通过将网格的最外层左上部交叉置于组织的随机点之外 (图 5C-d,图 6B), 将组织板覆盖在塑料透明度上的适当大小的十字网格上。
    注: 选择交叉网格, 在相邻交叉之间有足够小的距离, 因此在研究的每一个案例中, 至少两次, 因为许多十字架会击中组织舱的切片表面被取样, 作为样品的数量必须从那个纸巾盒里拿出来。在 "猪生物医学模型组织取样指南"7的补充材料中标明了大多数猪器官和组织的跨网格尺寸。
  6. 标记并计数所有撞击组织的十字架 (分别是要取样的组织子室)。始终如一地采用统一的计数和编号方式, 在所有组织板中取样的交叉撞击组织隔间,例如, 按每行中各自交叉的连续编号, 从左向右, 从从上到下, 或者例如, 通过按顺时针方向对一个组织板中的十字编号, 从最接近十二点位置的十字开始, 如图 5E中所示的 exemplarily。
  7. 通过要生成的样本数 (i) 除以要取样的组织/组织间隔的交叉数 (n)。
  8. 通过在1和i之间的间隔中选择随机数字x , 确定第一个取样位置。为此, 请使用随机数字表。标记第一个取样位置 (x) 和每个下一个x + ix + 2ix + 3i等,交叉击中组织/组织隔间被取样的塑料透明度使用防水笔 (图 5F)。
    注意: 随机数表可以方便快捷地使用在线随机数生成器生成。
  9. 用一对镊子 (图 5G,图 6E ), 通过略微提高塑料透明度, 并在组织板表面放置一小块干净的空白纸屑纸来标记与标记十字架对应的组织位置。).
  10. 从取样位置 (图 5H图 6F图 7A) 的组织的消费样本, 并进一步细分它们以进行不同类型的后续分析 (图 6G,图 7AB), 如中所述表 1
  11. 取样后, 用温水和肥皂清洗塑料透明胶片, 晾干, 再用。

3. 定量视学分析的各向同性均匀随机 (产学研) 剖面和垂直均匀随机 (VUR) 截面的生成

  1. "Isector" 技术
    1. 准备材料: 剃刀或切片刀片, 琼脂, 球形铸件模具 (例如, 果仁糖的铸造模具, 可从糖果供应商), 保护夹具, 和镊子。
    2. 将适当大小的一块 (1 x 1 x 1 cm3) 固定, 系统地随机取样组织在球形铸件模子, 由保护夹子一起举行, 并且用温暖的液体琼脂填满模子 (图 8A-E)。
    3. 将琼脂球 (图 8F) 从凝固后的铸型中取出。
    4. 将琼脂球体与嵌入的组织样本横放在桌子上, 停止, 并在随机位置部分。
      注意: 生成的截面平面是产学研部分 (图 8F-G)。
    5. 继续在塑料树脂中嵌入组织样本, 如 GMA/甲基丙烯酸酯, 保持产学研断面平面的方向 (见 1.3.5)。
  2. "定位装置" 技术
    1. 准备材料: 剃刀或切片刀片, 琼脂, 镊子, 随机数表, 等角的打印, 余弦加权圆。
      注意: 在以前的出版物826中提供了圆形的复制模板。
    2. 将固定组织 (或琼脂嵌入固定组织) 的样本放置在与0–180°方向平行的等角圆的打印上 (图 9A,图 10E)。
    3. 使用随机数字表确定随机角度。在等角圆的刻度上找到相应的标记, 样本停留在这个圆圈上。使用这些标记, 切割一个部分通过样本 (或通过琼脂周围的嵌入组织样本), 与剖面平面平行的方向上显示的随机角度指示的等角圆的规模, 并垂直于示例的静止曲面 (图 9B-c,图 10F)。
    4. 将组织块与上一步中生成的截面曲面置于余弦加权圆上, 其边缘位于与1-1 方向平行的静止曲面 (图 9D图 10H)。
    5. 重复步骤 3.2.3, 用随机数字表 (图 9E-f,图 10I-J) 确定的随机角度, 通过示例来剪切新节。
      注意: 产生的截面平面是产学研部分。
    6. 如有必要, 确定固定组织样本的产学研剖面的面积, 以确定与步骤1.3 中所述的嵌入相关的组织收缩 (图 9G-J), 并继续将组织样本嵌入塑料中。树脂, 如 GMA/甲基丙烯酸甲酯。
  3. 垂直均匀随机 (VUR) 剖面的生成
    1. 准备材料: 剃刀或切片刀片, 琼脂, 镊子, 随机数表, 和等角圆圈的打印。
      注意: 在以前的出版物826中提供了圆形的复制模板。
    2. 在固定组织样本中定义垂直轴, 在后续步骤中, 在示例/节中始终可识别。
      注意: 通常, 垂直于组织样本自然表面的轴被选择为垂直轴。
    3. 如果合适, 请将该示例嵌入琼脂 (图 11B)。
      注: 在固定样品的 VUR 或产学研切片前琼脂嵌入一般可推荐用于小、薄、脆或软样品。在塑料树脂培养基中, 采用琼脂嵌入样品, 方便了 VUR 切片样品的定位。
    4. 将示例放在等角圆的打印上, 垂直轴正交定向到表/纸张表的平面 (图 11C)。
    5. 以随机角度 (确定使用随机数字表) 剪切样本, 并将截面平面正交于表, 并平行于垂直轴以接收 VUR 截面平面 (图 11D)。
    6. 如有必要, 确定固定组织样本产学研剖面的面积, 以确定与步骤1.3 中描述的嵌入相关的组织收缩情况 (与图 9GJ比较), 并继续将组织样本嵌入塑料树脂, 如 GMA/甲基丙烯酸甲酯。

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Representative Results

浸没法测定组织/器官密度

图 12A-b显示使用步骤 1.1 (图 1,图 2) 中描述的淹没技术来确定猪肾脏密度和体积的代表性。其他猪器官和组织的密度测量的更有代表性的结果载于表 2。"猪生物医学模型的组织取样指南"7显示了一个更全面的不同猪组织和器官参考密度清单。用浸没法获得的组织密度测量值的有效性可以通过重复测量相同样本和独立标本来估计。大多数猪组织显示密度值略高于水 (ρ ≈ 1.0), 而在盐水中游泳的组织 (脂肪组织, 肺组织) 显示密度 < 1.0。

卡瓦列里测定器官体积的方法

图 12C-f显示了对猪肾脏体积的代表性测定 (与图 12AB中显示的相同器官)。器官板的部分表面的区域由点计数决定, 使用被印在塑料透明度的叠加的十字架网格, 并且通过平面测量器官板材的区段区域在被扫描的图象板材 (支付注意在石板截面表面后的组织过度投射,图 12 G H)。卡瓦列里方法 (步骤1.2、图 3) 的性能所获得的器官/组织容积数据的准确性可以通过与从器官/组织的重量和密度计算得出的相应体积进行比较来估计。在图 12中检查的肾脏体积由浸没方法确定, 而卡瓦列里方法的数量相差不到1%。作为卡瓦列里体积估计精度的量度, 可以计算其误差系数 (CE), 如前所述的15

组织学组织标本加工过程中三维嵌入相关组织收缩的测定

表 2中显示了与在塑料树脂中嵌入猪组织样本 (全球海洋环境状况评估/甲基丙烯酸甲酯或环氧树脂) 有关的组织收缩程度的代表性结果 (形态学) (以前未发布的数据)。表 2中显示的线性收缩系数是根据步骤 1.3 (图 4) 中所述确定的。它们指的是三维体积减少29% 的 GMA/MMA 嵌入, 22% 用于环氧树脂嵌入猪皮质肾组织。图 13显示了用于在塑料嵌入之前测量试样截面表面积的琼脂嵌入的福尔马林固定脂肪组织的充分和充分制备样品的典型例子。

不同下游分析类型的点计数和组织标本处理的体积加权系统随机抽样

实质器官体积加权系统随机抽样的 "切片和点计数" 技术 (步骤2、图 5图 6图 7) 代表了一种建立的、健壮的代表生成方法。多个后续类型分析的示例2,7。对各种猪器官和组织进行系统随机抽样、高度冗余生物库标本生成的典型结果, 随后对不同下游的切除组织样品进行了差异处理。使用步骤 2 (图 5图 7图 6中演示的 exemplarily) 中描述的取样技术的分析方法以前已发布2。在以前的猪生物库研究中, 生物库的肝脏组织样本的生成, 例如, 猪肝被完全分成约20块 2-3 厘米厚的板, 叠加有3厘米的十字网格, 如步骤中所述.2, 16 个组织位置大约 2 x 2 x 2 cm3被系统地随机地抽样和切除在每个案件。从每一个切除样品, 随后产生五标本的分子分析 (冻结在-80 °c) 取样地点, 一个亚组为 cryohistology, 一个亚组被固定在 Methacarn 溶液, 和甲醛溶液中的一个随后石蜡嵌入和组织学-免疫组化检查。每盒74种不同样品的生成 (直到将样品冷冻或转移到固定溶液中) 在大约20分钟内达到, 平均为2。所述取样和抽样方法的实用性/成功性可通过对所生成样品的质量的评估 (、RNA 或分离蛋白的质量、形态学的保存和组织样品的超微结构特性, 它们对免疫组织化学分析的适用性,等等) 2

定量视学分析的各向同性均匀随机 (产学研) 剖面和垂直均匀随机 (VUR) 截面的生成

从猪 (生物库) 组织样本 (协议步骤3、 8、9、10、图中) 向正向方向生成各向同性均匀随机 (产学研) 节和 VUR 切片的技术证明. 11), 允许对大多数定量视学参数进行检查, 可以在某些实践中快速完成, 并且没有合理的困难或错误来源。因此, 在图 9 (isector 技术) 和图 10 (定位装置技术) 中显示的产学研示例的生成对于这些方法是完全具有代表性的。

Figure 1
图 1: "淹没技术" 用于测定组织/器官密度的示意图.(A) 对采样粗细 (、质量、 mS) 的度量。(B) 缩放 tared, 其重量为0.9% 生理盐水20°c 的烧杯, 以及浸没在盐水中的样品持有者, 以确定的标记位置。(C) 将样品完全浸入样品持有者的标记位置, 而不与内壁或烧杯底部接触。平衡显示的重量是由样品所取代的盐水体积的重量)。样品的密度计算如被表明 (这里: ρ示例 = mS/Vs = ms/(mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1.141 克/立方公分)请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: "淹没技术" 用于测定组织/器官密度.(A) 由细线构造的不同样本持有者。从左到右: 一个细线线通过一个薄的注射套管, 一个螺旋篮子的电线, 以容纳小而脆弱的标本, 和简单的钢丝吊索。A-C中的箭头指示样本持有者浸入生理盐水的位置。(B, C)样品持有者在盐水浸泡过程中的定位 (与图 1 C比较)。(B) 将猪脑垂体完整放置在篮状标本夹中。(C) 猪心肌样。注意在盐水中完全浸没样品而不接触烧杯的墙壁或底部。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 卡瓦列里方法在猪器官体积测定中的应用示意图.(A) 硬币堆栈示例, 用于理解卡瓦列里原则。有关详细信息, 请参阅介绍。(B H)灌注固定肾容积估计的示意图。(B) 测量肾脏沿其纵轴的长度 (l)。(C) 将完整的器官切割成n同样厚 (d) 平行切片正交到纵向器官轴。(D) 放置在同一表面上的风琴板朝下。请注意, 第一个 (右) 组织板放置在其自然表面上,, 没有截面曲面。(E-H)不同的方法来确定的切片表面区域的组织板。(E) 用防水笔在轮廓的风琴板型材的塑料透明叠加上追踪每个风琴板的外形, 并在塑料透明度上印上适当尺寸的经标定的十字网格, 计数交叉撞击剖面区域。根据截面剖面面积和对应于一个十字的面积, 计算出风琴板断面剖面面积。(F,G)在垂直方向上对截面曲面 (F), 或在组织板 (G) 的扫描图像中, 使用标尺进行校准的照片图像中的器官板区的部分区域的确定。(H) 使用适当的形态测量软件应用程序, 确定照片/扫描的数字图像中组织板的截面区域。(I) 计算器官的估计体积, 作为所有风琴板的相应断面表面的累计面积的乘积, 乘以器官板的平均厚度15请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 用于组织学的组织样本处理过程中三维嵌入相关组织收缩的示意图.(A) 从固定组织样本中切割新鲜的平面切片表面 (通过在切片前嵌入琼脂来稳定易变形 (软) 组织的形状, 如脂肪或肺组织)。用尺寸标尺扫描样品的截面面。(B) 平面确定固定组织样本的截面曲面区域 (Af)。(C) 在塑料嵌入介质中常规嵌入样品。(D) 制备塑料块的组织学切片, 并保存试样的剖面平面。安装在玻璃滑梯上的部分和常规的幻灯片染色。(E) 将幻灯片与大小标尺一起扫描。(F) 平面确定塑料嵌入的示例 (Ae) 部分的区域。(G) 在嵌入塑料介质14之前和之后, 将嵌入相关组织收缩的程度计算为组织样本相应剖面剖面的对应区域的商数。右侧的图像显示了在塑料树脂 (顶部) 内嵌入在油墨发黑琼脂中的脂肪组织的甲醛固定样品的切片表面, 以及在全球海洋环境状况评估/甲基丙烯酸甲酯 (底部) 的相应断面剖面 (he 染色)。刻度条 = 2 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 体积加权系统随机抽样的示意图.本例显示系统随机抽样的六个组织位置在肾皮质的灌注固定肾。(A) 测量肾脏沿其纵轴的长度 (l)。(B) 将整个器官完整切片成同样厚的 (d) 平行切片, 与纵向器官轴垂直。(C) 放置在相同位置的器官/组织板 (, 右或左) 表面朝下。(D) 覆盖有适当大小的十字网格的组织板, 印在塑料透明上。网格的最外层左上十字被放置在组织外的一个随机点上 (由蓝色点·表示)。(E) 对所有撞击肾皮质的交叉点进行计数和编号。在本例中, 撞击肾皮质的十字架依次在一个肾板上连续编号 (从左向右), 每块板沿顺时针方向前进, 从最接近十二点位置的十字开始。在这里, 36 个十字架击中了肾皮质。六取样位置将被取样。因此, 每个第六位置的交叉击中组织被取样 (36/6 = 6)。(F) 在本例中, 第四十字 (N° 4) 击中肾皮质的位置随机选择为第一取样位置。每下第六个十字击中肾皮质用防水笔标记在塑料透明。在本示例中, 这些位置为4、10、16、22、28和34。(G) 将相应的组织位置标记为在组织表面放置的小块干净的空白纸屑纸。(H) 从随机系统取样的地点切除组织标本并随后进行处理以进一步分析。此图已从 Albl 等 (2016)、图 S236 和 S237、186页 (补编)7中修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 对猪肾脏的肾皮质进行体积加权系统随机抽样 (参见图 5) 和点计数规则.(A) 新鲜猪肾。(B) 将肾脏切片成同样厚的平行切片, 正交于纵向器官轴, 用塑料透明的交叉网格覆盖。红色圆圈表示随机点的位置, 用来随机化交叉网格的位置。(C) 点计数规则的插图: 一个十字/点被计算为命中要取样的组织隔间 (参照隔间), 如果十字 (箭头) 的垂直和水平条的右上内角覆盖组织。(D) 标记的交叉击中肾皮质和系统随机抽样的组织位置 (这里, 119 个十字架击中肾皮质和17个地点被系统地随机抽样使用抽样间隔i = 7)。(E) 随机系统地取样由纸屑纸标记的肾皮质部位。(F) 切除的样本。(G) 进一步细分切除后的样品, 用于后续处理不同下游分析类型的标本。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 对不同下游分析类型的系统随机取样的组织位置和标本处理的组织样本进行细分.(A) 从一个系统地随机抽样地对肾皮质 (本机组织) 进行不同分析 (例如、FF-pe: 福尔马林固定、石蜡嵌入样品和 MTC pe) 生成组织标本的示意图说明:Methacarn-固定, 石蜡嵌入样品的光显微组织学;冷冻: 冰冻切片组织学标本;-80 °c: 冻干冰组织样品为分子分析)。(B) 系统地切除灌注固定肾脏的肾皮质, 进一步细分切除的组织样本, 并处理标本的定性和定量形态学分析。灌注固定猪肾板 (1), 跨网格 (2)、随机数表 (3)、等角和余弦加权圆 (4) 用于生成产学研节 (请参见图 9图 10)、不同的固定解决方案 (5、6、7) 和示例电子显微样品容器 (8)。此数字已从 Albl et . 中进行了修改。(2016), 图 S239, 186 页 (补编)7请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: "Isector" 部分由福尔马林固定猪组织制备.(A) 样本的灌注固定猪肾皮质。(B) 球形铸件模具。(C) 液态琼脂。(D E)球形铸造模具中样品的琼脂嵌入。(F) 琼脂球形与嵌入的组织样品。(G) 琼脂球形, 嵌入组织切片在一个随机位置 (产学研剖面平面)。此数字已从 Albl et . 中进行了修改。(2016), 图 S6, 14 页 (补编)7请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: "定位装置" 技术的示意图说明, 用于产学研部分的制备。(A) 放置在等角圆 (ci1) 上的固定组织的样本, 其边缘与0–180°方向平行 (由红线指示)。(B) 以随机角度 (绿线) 切片样本。(B、C)新生成的切片表面的组织样本 (以绿色颜色表示)。(D) 将样本放置在余弦加权圆 (ci2) 上, 并在上一步中生成的截面曲面与1-1 方向平行的静止曲面的一条边 (由红线表示)。(E) 以随机角度切割第二节。(F) 产生的样本随机各向同性剖面平面 (以蓝色表示)。(G) 确定固定组织样本的产学研部分面积, 用于估计与步骤1.3 中所述的嵌入相关的组织收缩。(H) 在塑料树脂中嵌入组织样本。(I) 在切片上切片塑料块 (平行于产学研平面)。(J) 在玻璃滑梯上安装产学研塑料型材。此数字已从 Albl et . 中进行了修改。(2016), 图 S8, 15 页 (补编)7请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 10
图 10: "定位装置" 技术, 用于制备琼脂嵌入组织样品的产学研切片。(-d)可选的, 你可以琼脂嵌入一个系统随机抽样标本的固定组织 (琼脂嵌入是有用的小组织样本, 使第一个或两个随机部分可以放置在琼脂内不切割组织)。(E) 将琼脂块定位在等角圆 (ci1) 上, 其边缘与1-1 方向平行 (由红线指示)。(F, G)用随机数表 (rnt、绿色箭头) 确定的块在随机角度 (这里: 15-15, 绿线) 切片。(H) 随后在余弦加权圆 ( ci2) 上的部分曲面上的琼脂块的定位, 与静止曲面的边缘平行于1-1 方向 (由红线表示)。(I) 第二部分以随机角度 (此处为: 20-20, 由蓝线表示), 用随机数字表 (rnt、蓝色箭头) 确定。(J) 导致组织样本的产学研切片平面。此数字已从 Albl et . 中进行了修改。(2016), 图 S9, 16 页 (补编)7请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 11
图 11: VUR 部分准备的示意图说明.(A) 固定组织样本, 具有定义的 (可识别) 垂直轴 (例如, 垂直于其自然表面)。(B) 固定的组织样本嵌入琼脂中。(C) 在等角圆 (ci1) 的打印上定位 (琼脂嵌入的) 组织样本。VA: 垂直轴。(D) 以随机角度 (随机数表) 对样本进行切片 (在这里: 30-30 方向, 由一条蓝色线表示) 与剖面平面被正交朝向表并且平行于样品的垂直轴。产生的 VUR 切片的组织样本 (以蓝颜色表示)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 12
图 12: 猪肾脏的代表容量.(A-B)淹没技术。(A) 确定肾脏重量 (m儿童)。(B) 确定由肾脏置换的生理盐水容积 (mdispl. 生理盐水) 的重量。肾脏被挂在一根绳子上, 完全浸没在盐水中, 而不触及烧杯的底部或墙壁。肾脏的计算量为92.6 立方公分。(C-D)卡瓦列里技术, planimetry 点计数。(C) 测量肾脏沿其纵轴的长度 (l)。(D) 通过在塑料透明度上打印的均匀间隔交叉网格覆盖后的点计数确定肾脏板块剖面剖面区域。在这里, 肾脏的估计体积是93.3 立方公分。(E-F)卡瓦列里技术, planimetry 的扫描图像的剖面剖面区域的肾板 (F)。在这里, 肾脏的估计体积是92.8 立方公分。在C-E中, 放置在扫描仪上的肾脏的第一个或最后一个板的自然圆形表面, 或由交叉网格透明覆盖的区域不是截面表面, 因此, 在该组织板中没有测量截面表面积。(G-H)overprojection 在器官/组织板 (G) 的扫描图像中的显示, 以及用交叉网格透明 (H) 覆盖的器官/组织板中的显示。Overprojecting 器官板的组织部分由斑点白色和黑线指示。仅确定实际截面轮廓的区域 (, 由部分指示的白色虚线包围的组织)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 13
图 13: 充分 (A) 和次优 (B) 的代表性说明制备琼脂嵌入组织样本, 用于测定组织性塑料嵌入介质中样品的嵌入.(A) 扫描在嵌入塑料树脂之前, 猪皮下脂肪组织的固定样本切片表面的图像。该样品嵌入在油墨发黑的琼脂中, 以稳定试样的形状, 清晰地识别截面表面轮廓。(B) 在琼脂内的剖面表面和包裹的气泡 (箭头) 的模糊轮廓。刻度条 = 5 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.

分析 示例 处理
类型 方法 (s)
分子分析 RNA 转录, 蛋白质, 代谢物和脂质分析,
新陈代谢分析, DNA 分析
新鲜 (原生) 组织的小块 * 在干冰或液氮中结冰。存储在-80 摄氏度。
定性形态学分析 组织学
[光镜, 包括免疫组化 (IHC) & 原位杂交]
新鲜 (本机)-或原位固定 * 组织样本 根据需要使用不同的护 (例如、4% 甲醛溶液) 和嵌入介质 (石蜡、GMA/甲基丙烯酸甲酯、环氧树脂)。
Cryohistology
(冰冻切片, 包括 IHC)
新鲜 (本机) 组织样本 在液氮冷却异戊烷中嵌入样品, 冻结介质, 冷冻。
超微结构分析
[电子显微镜, 包括透射-透射电镜) 和扫描电子显微镜]
小块新鲜 (本机)-或原位固定 * 组织样本 在2.5–6.25% 戊二醛溶液中固定样品并嵌入环氧树脂塑料树脂中。
定量形态学分析 光镜 新鲜 (本机)-或原位固定 * 组织样本 准备产学研切片 (定位装置, isector 切片) 和/或 VUR 切片的塑料嵌入组织样品。
tem 新鲜小块 (本机)-或原位固定 * 组织 准备产学研 (定位装置, isector 节) 部分的环氧嵌入组织样品。

表 1: 对不同下游分析类型的系统随机取样位置切除组织标本的处理.根据研究的实验设计和所研究的器官/组织, 不同的标本数量应从系统随机抽样的组织位置切除, 并进行不同类型的下游分析。对大多数猪器官/组织和研究类型的详细协议提供了 "猪生物医学模型的组织取样指南"7。GMA/甲基丙烯酸甲酯: Glycolmethacrylate/methylmethacrylate。产学研: 各向同性均匀随机。VUR: 垂直均匀随机。最大.2 x 2 x 2 毫米3。**例如, 肺灌注固定组织或肺组织注入固定液。

方法 代表性结果
浸没法测定组织/器官密度 (步骤 1.1,图 1,图 2) 猪器官/组织 ρ(g/立方公分)
1.071 @ 0.007
胰腺 1.062 @ 0.016
心室心肌 1.036 @ 0.014
1.044 @ 0.006
腹部内脏脂肪组织 * 0.921 @ 0.032
甲状腺 1.061 @ 0.007
大脑 1.051 @ 0.007
肾上腺 1.063 @ 0.025
骨骼肌肉 ** 1.074 @ 0.003
数据就意味着. 特定器官/组织重量在 n = 18 只猪 (14 个女性和4只男性猪; 年龄60天到2年; 身体重量30–250公斤)。* 空肠肠系膜上的脂肪组织。** 的平均值为 m. longissimus 肌, m. 胫骨 cranialis, m. 三头肌肌和 m. gluteobiceps。
组织学组织样品处理过程中三维嵌入相关组织收缩的测定 (步骤 1.3,图 4) 器官/组织 嵌入介质       fS
肾皮质 (猪) GMA/甲基丙烯酸甲酯 0.89 @ 0.02
环氧树脂 0.92 @ 0.02
数据是指24例12只猪的测量结果。fS: 线性收缩修正因子。

表 2: 特定猪器官和组织密度的代表性结果7, 以及不同塑料嵌入介质中猪皮质肾组织嵌入相关组织收缩的线性收缩校正因子。

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Discussion

从猪动物模型中产生的生物库样本收集需要强健的技术和协议, 以确定器官/组织体积, 可再现的代表性, 多余的组织样本, 适合广泛的不同的分析方法, 并对抽样剖面的随机化进行定量视学分析。本条所述方法适用于猪器官和组织的大小, 并已开发出有效满足这些要求的2,7。它们基于公认的方法论原则, 并在不同的发布研究中证明了它们的实用性2,7,12,21。这些特点的方法对于检查组织/器官样本的各类研究都很重要, 因为它们为产生代表性样品提供了基础, 并获得了其他无法确定的各种参数。这些方法可以很快地执行, 很少的努力, 并与几乎所有的下游分析兼容。因此, 它们被认为不仅适用于猪动物模型生物库项目, 而且在涉及对其他大型动物模型物种 (例如, 绵羊) 的组织样本进行定量形态学分析的研究中也很有用, 因为以及兽医学的研究。考虑到不同方法的技术方面, 在执行各自技术的议定书时必须考虑到一些关键步骤和限制。

浸没法测定组织/器官密度

在用浸没法测定组织密度时 (步骤1.1、图 1图 2), 必须注意不要用组织样本或样品持有者触摸烧杯的内壁或底部, 而组织样本则是淹没在盐水中。否则, 该比例将显示样本的重量, 而不是由样本偏移的盐水体积的重量。对于非常小/轻的组织样品 (几毫克), 由于盐的表面张力和样品体积对烧杯中浸没液体体积的不利高商数, 淹没法测定组织密度是有限的, 这是阻碍测量的准确性。在这里, 样品的重量可能用于进一步的计算, 而不是密度计算的体积。由于组织中空气的含量不一致, 以及在某些情况下, 器官在实验性地灌注/灌输护的情况下, 通过浸没来测定组织密度对新鲜 (无固定) 肺组织也没有效果。

卡瓦列里测定器官体积的方法

与器官重量和密度的测定相比, 猪器官和组织卡瓦列里容量的方法比较繁琐。然而, 它适用于不能适当地衡量的器官由于他们的实验处理 (例如, 灌注固定的器官或肺用固定溶液灌输)。在这里, 卡瓦列里容量方法最好与步骤2中描述的卷加权系统随机抽样技术相结合 (图 5图 6图 12)。在估计器官/组织容量从平行, 相等的器官/组织的等距切片 (卡瓦列里方法, 步骤 1.2,图 3) 的区域, 维护组织板的方向 (上部和下断面平面), 以及准确地确定所有剖面剖面的面积是非常重要的。特别是, 如果对器官板的数字图像或扫描进行分析 planimetrically, 则必须仔细考虑组织板 (图 12G H) 的组织面板 (在切片组织平面外) 的 overprojections, 以提供可靠的体积估计.

组织学组织标本加工过程中三维嵌入相关组织收缩的测定

嵌入相关组织收缩的程度取决于嵌入介质和组织类型, 并且在相同组织的不同加工样品之间也可能有所不同。

虽然冰冻切片被认为在 X Y 平面上几乎没有收缩, 而塑料嵌入通常会导致组织的收缩, 嵌入相关组织收缩在石蜡嵌入组织样品中尤为广泛。, 通常会显著损害这些样本组织学切片中维数参数的定量形态学分析。除了在很大程度上的整体三维收缩, 石蜡嵌入也导致不均匀, 差异, 各向异性和可变收缩的样本和不同的解剖结构, 组织类型和细胞类型内组织示例8,13。此外, 特别是在较厚的组织切片的石蜡嵌体标本, 组织收缩程度也可能显著不同的 X Y 和 Z 方向的部分。这可能是由于截面区域 (在 X Y 方向) 和截面高度 (, 垂直截面厚度) 在部分从组织中剪切后, 在热组织浮选水浴中截面的收缩。块, 并在后续处理、染色和 coverslipping 过程中安装在玻璃幻灯片上的节 (, 节的 Z 轴的均匀折叠)8。此外, 在厚的部分, 可能有一个相对更强的压缩部分-平面附近的组织区域, 而该节是从组织块切割 (导致截面的 Z 轴的差异变形)19.这些影响还可能会扭曲在该节内组织结构的数量的估计, 通过不同的定量视学分析方法, 如光学 disector。因此, 预测、监测和矫正嵌入相关组织收缩是不可行的石蜡嵌入组织样本8

相比之下, 嵌在塑料树脂中的组织样品的体积收缩程度, 如全球海洋环境状况评估/甲基丙烯酸甲酯或环氧树脂, 显著降低, 更重要的是, 更均匀。因此, 在具有假定的均匀、各向同性和整体收缩的塑料树脂中嵌入, 有利于几种不同数量形态学参数的分析方法17,18。在与塑料树脂嵌入有关的组织收缩估计过程中, 在嵌入过程中不应另外扭曲固定组织的形状, 以便对固定和嵌入的相应截面剖面区域进行比较。样品.这可能是困难的软或容易压缩的组织样本, 如脂肪或肺组织, 或在组织样本与高液含量。在此, 在组织切片之前, 在琼脂中嵌入固定样品有助于稳定组织样品在随后的塑料嵌入过程中的形状 (协议步骤 1.3., 图 4)。为了获得可靠的数据, 应使用相同组织的不同样本, 对嵌入相关组织收缩进行反复测量。嵌入相关组织收缩的程度表示为线性组织收缩因子fs (协议步骤 1.3.9, 图 4G)。使用fs 对不同组织结构的各种长度、表面积和体积参数进行收缩校正的公式示例提供了几个定量视学研究14, 21,27

不同下游分析类型的点计数和组织标本处理的体积加权系统随机抽样

所提出的猪器官体积加权抽样技术决定了组织内随机抽样的位置, 并随后生成所有必要的样本, 通过抽样切除的组织样本进行进一步的不同分析。这些位置7。在体积加权系统随机抽样机制中, 检查器官/组织总容积内的每个可能取样位置都有完全相同的随机抽样机会, 通过收集一个足够数量的标本。因此, 使用体积加权系统随机抽样设计来生成来自实质器官的样本, 有效地防止分析结果可能有偏差 (可能意外的和不可识别的) 不同的不相等分布在器官不同部位的功能性或形态学组织特性,如例如, 对于肝实质不同区域的猪肝细胞的平均体积和体积密度,28.猪器官的 "组织-slabbing 和抽样" 策略很容易理解, 符合下游分析方法的技术要求, 可以快速进行并适应特定研究的需要,从而避免了系统的抽样偏差, 减少了实验的变异性, 提高了整体实验的精确度, 同时比抽样策略效率更高, 每个抽样位置随机确定为9 ,15。必须生成的标本数量, 显然取决于所检查的参数及其在取样器官/组织不同位置的样品中的变异性。对于生成生物库样本集的设计, 允许通过各种不同的分析方法检查最大的不同参数 (未指定采样时间), 因此前瞻性抽样策略通常会安排每器官/组织产生相对较高数量的多余样本。

定量视学分析的各向同性均匀随机 (产学研) 剖面和垂直均匀随机 (VUR) 截面的生成

一些用于生成产学研和 VUR 部分用于定量视学分析的技术有一些复杂的理论基础, 因此许多科学家经常 (不必要地) 回避解释, 尽管它们的实际实现是相当容易的。VUR 节是特别容易产生的, 是最佳的表面密度/面积估计结合摆线测试系统8,9,20。由于剖面平面的熟悉方向, 通常会更喜欢它们。但是, 与产学研节相反, VUR 节不适用于估计长度参数89

在制备产学研和 VUR 段时, 关键步骤基本上是在嵌入塑料树脂过程中维持固定试样的产学研或 VUR 截面表面, 并确保始终可以识别 VUR 截面的垂直轴 (步骤 3,图 9, 图 10, 图 11)。

今后, 以上所述方法的广泛应用可能大大有助于建立一贯的高质量标准, 以便从猪和其他大型动物模型中生成可比较的多用途生物库样品。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢丽莎 Pichl 出色的技术援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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References

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