Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

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Summary

A aplicação prática e o desempenho dos métodos para geração de amostras representativas de modelos animais suínos para um amplo espectro de análises a jusante em biobanco projetos são demonstradas, incluindo volumetria, amostragem aleatória sistemática, diferencial e processamento de amostras de tecidos para tipos de análises qualitativas e quantitativas de morfológico e molecular.

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

Na pesquisa médica translacional, porcinos modelos constantemente tornaram-se mais populares. Atendendo ao elevado valor de animais individuais, particularmente de porcos geneticamente modificados, modelos e muitas vezes limitado número de animais disponíveis desses modelos, criação de coleções (biobanco) de amostras de tecido adequadamente processados adequado para uma amplo espectro de métodos de análises subsequentes, incluindo análises não especificadas no ponto de tempo de amostragem, representam abordagens significativas para aproveitar ao máximo do valor do modelo de translação. Sobre as especificidades da anatomia porcina, orientações abrangentes recentemente foram estabelecidas para geração padronizada de representante, amostras de alta qualidade de tecidos e órgãos diferentes de suínos. Essas diretrizes são pré-requisitos essenciais para a reprodutibilidade dos resultados e a sua comparabilidade entre diferentes estudos e investigadores. A gravação de dados básicos, como pesos de órgão e volumes, a determinação dos locais de amostragem e do número de amostras de tecido para ser gerado, bem como sua orientação, tamanho, processamento e direções de aparamento, é fatores relevantes determinação da generalização e da usabilidade da amostra para análise morfológica molecular, qualitativa e quantitativa. Aqui, uma demonstração ilustrativa, prática, passo a passo das técnicas mais importantes para a geração de representante, espécime biobanco de múltiplos propósitos de tecidos dos suínos é apresentado. Os métodos descritos aqui incluem a determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, a aplicação de um procedimento de amostragem aleatória sistemática volume ponderado para órgãos parenquimatosos por contagem de ponto, determinação do grau de encolhimento de tecido relacionados à incorporação histológica de amostras e geração de amostras aleatoriamente orientadas para análises stereological quantitativas, tais como seções (IUR) isotrópicas uniformes aleatórias geradas pelos métodos "Orientadores" e "Isector" e uniforme vertical seções de (RVU) aleatórias.

Introduction

Em medicina translacional, os porcos são cada vez mais comuns para o uso como animal grande modelos1,2,3,4,5, devido a várias semelhanças vantajosas entre o suíno e anatomia humana e fisiologia e a disponibilidade de métodos biológicos moleculares estabelecidos, permitindo a geração de adaptados, geneticamente modificado modelos de porco para uma ampla gama de condições de doença1,4.

No entanto, em comparação com modelos de roedores, o número de animais de um modelo de porco respectivos que podem ser fornecidos para experiências em qualquer momento é limitado. Isto é devido o intervalo de geração de suíno de cerca de um ano e os esforços financeiros e demorada necessários para a geração de modelos de suínos e criação de animais. Portanto, animais individuais de um modelo de suínos, bem como os exemplos que podem ser gerados a partir destes porcos, são muito valiosos, particularmente se geneticamente modificado modelos suínos e/ou a longo prazo problemas experimentais (por exemplo, complicações tardias de doenças crônicas) são examinadas em indivíduos envelhecidos2,6,7.

No decurso de qualquer estudo, desempenho de análises adicionais, que não tinha sido prevista no projeto inicial do estudo experimental pode mais tarde tornar-se relevante, por exemplo, para endereço distintas questões decorrentes anteriormente descobertos resultados inesperados. Se amostras adequadas para tais experimentos adicionais não estão disponíveis, desproporcionalmente alto custo e demorada despesas talvez seja necessárias gerar porcos adicionais e amostras de tecido. Para estar preparado para tais eventualidades, geração de biobanco coleções de conservadas amostras de backup de diferentes órgãos, tecidos ou bio-líquidos, quantitativamente e qualitativamente adequados para uma ampla gama de análises posteriores, é considerada uma importante abordagem2,6,7. Óptimos benefícios derivar um modelo animal de suínos, a disponibilidade de amostras adequadas biobanco também oferece a possibilidade única de realizar um amplo espectro de métodos de análise de diferentes materiais de amostra idêntico ao órgão multi nível na mesma determinados animais, por exemplo, pela distribuição de amostras aos cientistas de diferentes grupos de trabalho organizados em uma rede de pesquisa2,6,7. Além disso, a estratégia de amostragem ' progressista ' em biobanking também contribui para a redução do número de animais necessários para um estudo. As vantagens do modelo porcina biobanking recentemente foram demonstradas em um órgão multi, multiomics estudo, examinando o órgão conversas cruzadas em um modelo de suínos geneticamente modificado de longo prazo de diabetes mellitus, usando amostras a partir de Munique MIDY porco biobanco 2.

Existem alguns requisitos obrigatórios biobanco amostras geralmente devem cumprir para estabelecer a confiabilidade e interpretabilidade dos resultados das análises realizadas posteriormente. As amostras devem ser geradas reproducibly, e devem ser adequadamente representante, isto é, refletindo as características morfológicas e moleculares interessadas do órgão/tecido as amostras foram colhidas de7. Para ser apropriado para uma ampla gama de tipos de análise a jusante, as amostras devem ser tomadas em quantidades suficientes e processadas de acordo com as exigências (incluindo condições de tempo e temperatura) dos diferentes métodos analíticos, incluindo descritivo análises histopatológicas, tais como cryohistology, parafina e histologia plástica, imuno-histoquímica, hibridação in situ , análises microscópicas de elétron ultraestrutural e análises de diagnóstico de laboratório clínico, bem como moleculares análises de DNA, RNA, proteínas e metabólitos.

Para permitir a avaliação de uma vasta gama de distintos parâmetros morfológicos quantitativos como números, volumes, comprimentos ou áreas de superfície de estruturas distintas de tecido por análises quantitativas de stereological, randomizada seção aviões do amostras histológicas dos respectivos órgãos/tecidos precisam estar preparados7,8,9,10,11. Em estudos quantitativos morfológicos, a determinação precisa do volume total do tecido, órgão ou compartimento do órgão, as amostras foram retiradas (ou seja, o espaço de referência) é de importância crucial7,9 , 12 para calcular as quantidades absolutas dos parâmetros dentro do respectivo órgão, tecido ou organismo interessados. Eventualmente, o efeito de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação durante a preparação de cortes histológicos tem de ser determinado e tidos em conta13. Portanto, análises stereological quantitativas, especialmente das amostras arquivadas (fixada amostras de tecido, tecido incorporado blocos, cortes histológicos, etc.) dos estudos anteriores são, por vezes, severamente limitada ou mesmo impossível12, particularmente se a volumetria dos respectivos órgãos/tecidos não foi realizada, se não há projetos de amostragem adequado foram aplicados para mandado de amostras representativas, se os números e quantidades de amostras individuais disponíveis são insuficientes, ou se o tratamento da amostras é incompatível com a estimativa do quantitativo de parâmetros morfológico de interesse. Devido aos múltiplos fatores influenciam possíveis, a adequação dos materiais de arquivo-amostra para análises de parâmetros morfológicos quantitativos distintos inequivocamente não pode ser respondida, mas depende da avaliação criteriosa de cada caso.

Assim, como a localização, tamanho, número, processamento, direção de aparar e orientação de amostras potencialmente irão afectar os resultados das análises subsequentes, esses fatores são de grande importância e devem ser considerados no projeto experimental de qualquer estudo. No que se refere estes aspectos e as particularidades da anatomia porcina, orientações de amostragem abrangente, detalhado e em grande escala recentemente foram estabelecidos modelos animais adaptados para suínos, fornecendo uma referência robusta para padronizado, reprodutível e eficiente geração de amostras redundantes, adequadamente processadas, alta qualidade de mais de 50 diferentes porcina órgãos e tecidos6,7.

As descrições metodológicas e o tutorial em vídeo mostrado no presente artigo fornecem detalhadas, ilustrativos, compreensível, passo-a-passo as instruções para desempenho prático de uma variedade de técnicas de volumetria, colheita de amostras de tecidos de suínos e órgãos e processamento de amostras de tecido para métodos diferentes de análise a jusante. As técnicas de destaque incluem métodos para determinação de volumes de órgão/tecido e densidades, baseadas nos princípios de Arquimedes e Cavalieri9, incluindo a determinação das dimensões do encolhimento tridimensional de tecido relacionadas com o incorporação em diferentes encastre mídia14 durante o processamento para exame histológico, aplicação do praticável volume ponderado sistemática amostragem aleatória se aproxima, processamento de amostras de amostra para diferentes subsequentes análises7,8,9,15e geração de devidamente orientado e processadas amostras para análises quantitativas de stereological potenciais7,8, 9,10,11. Ao lado de sua aplicação em projetos de suínos biobanco, os métodos comprovados são geralmente apropriados para todos os estudos examinando Propriedades quantitativas de histo-morfológica de órgãos/tecidos. Além disso, projetos de amostragem aleatória sistemática são particularmente benéficos para geração de amostras representativas em experimentos utilizando métodos de análise molecular para detectar alterações de abundância de, por exemplo, RNAs, proteínas ou metabólitos em vários órgãos e tecidos.

Os próximos parágrafos fornecem uma breve introdução a estes métodos, enquanto seu desempenho prático é descrito na seção de protocolo.

Determinação de volumes de órgão/tecido
Determinação de volumes e pesos de órgãos é importante em várias configurações de experimentais, como esses fatores podem indicar alterações, potencialmente relacionadas com experimentalmente examinaram fatores de interesse. O volume total de um órgão/tecido também comumente é necessária para calcular parâmetros quantitativos absolutos, (por exemplo, o número total de células), de densidades de volume numérico stereologically estimado (ou seja, o número de células por unidade de volume de tecido)7,12. Além de técnicas usando equipamentos técnicos complexos, tais como tomografias computadorizadas, existem basicamente três métodos práticos comumente usados para determinar o volume absoluto de um órgão ou tecido. O volume de um órgão pode ser determinado por "medição volumétrica direta" de acordo com o princípio de Arquimedes, ou seja, a medição do volume de água ou solução salina deslocadas pela estrutura quando completamente submersa. Entretanto, para comparativamente grandes órgãos de suínos, essas abordagens são impraticáveis e propenso a imprecisão, já que exigem grande volumétrico/medição de balões. Mais convenientemente, o volume de um órgão/tecido pode ser calculado a partir de seu peso e densidade7,12,16, que eficientemente pode ser determinado usando o "método de submersão"7,12 ,16 (etapa de protocolo 1.1.). Volumes de órgão/tecido também podem ser estimados utilizando abordagens volumetria baseadas no "princípio de Cavalieri" (1598-1647). Em termos simples, o princípio de Cavalieri afirma, que, se dois objetos são seccionados em planos paralelos a um plano de terra, e os perfis das seções cortam-se os dois objetos no correspondente distâncias desde o plano de chão tem as mesmas áreas, os dois objetos tem o mesmo volume. Assim, o volume de objetos arbitrariamente em forma pode ser calculado como o produto de suas áreas de perfil seção em planos de corte paralelos, igualmente distante e a distância entre os planos de secção. Isto é compreensível, com a seguinte analogia: considere duas pilhas consiste o mesmo número de moedas idênticas são colocadas lado a lado, uma pilha com o enfermeiro de moedas empilhado um sobre o outro, produzindo uma forma cilíndrica de pilha de moedas e o outro pilha de moedas com descentralizado posicionado moedas (Figura 3A). Embora as formas de ambas as pilhas de moedas são diferentes, seus volumes são iguais, desde as áreas das moedas em níveis correspondentes de ambas as pilhas (ou seja, as áreas de perfis de secções paralelas de cortar através de duas pilhas de moedas em distâncias iguais da à terra) são idênticos. Estimativa dos volumes de suínos órgãos e tecidos, usando o Cavalieri princípio7,12,15 é descrita na etapa 1.2.

Determinação do grau de encolhimento de tecidos relacionado à incorporação histológica
Nas análises de vários parâmetros morfológicos quantitativos medidos em secções histológicas do tecido, o efeito de retração de tecido incorporação relacionados ocorrem durante o processamento para a histologia de tecido deve ser determinada e tidos em conta. O grau de encolhimento relacionados com incorporação de tecido pode ser variável e depende tanto sobre o tecido, seu processamento e a incorporação média8,13,17,18,19. Geralmente, alterações relacionadas com a incorporação do volume de uma amostra de tecido (ou seja, principalmente de encolhimento) ocorrem em todas as três dimensões do espaço e, portanto, afeta todos os parâmetros dimensionais estimados por análises quantitativas de stereological8 . Basicamente, o grau de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação, expressado como o fator de encolhimento de tecido linear (fS), pode ser estimado como mostrado na etapa 1.3. e usado para a correção dos parâmetros morfológicos quantitativos (encolhimento-sensível)14.

Volume ponderado amostragem aleatória sistemática dos órgãos/tecidos
Criação de uma coleção de biobanco de amostras de suínos órgão/tecido, abordagens de amostragem aleatória sistemática volume ponderada como descritas na etapa 2 provaram para ser práticas, economia de tempo e eficientes técnicas para geração de representante, 7,8,9,15de amostras de tecido de múltiplos propósito.

Geração de seções isotrópico uniforme aleatório e seções verticais uniforme aleatório para análises quantitativas de stereological
Amostras de tecido do Biobanco precisam ser apropriado para uma ampla gama de métodos de análise stereological quantitativos diferentes para estimativa de um máximo de parâmetros que não pôde ser determinado sem um espécime adequadamente preparado. Quase todos os parâmetros quantitativos de stereological podem ser determinados, usando "isotrópica (independente) uniforme aleatório (IUR) seções"8,9. Nas seções IUR, a orientação tridimensional do plano de corte da amostra de tecido é aleatório. Isto pode ser conseguido por randomização da posição da amostra de tecido em relação à posição do avião seção, como aplicado na "Isector" método11 (passo 3.1 do protocolo), ou por randomização da orientação do plano relativo a secção a amostra de tecido, como o método de "Orientadores"10 (passo 3.2 do protocolo). Em amostras de tecidos, tais como pele ou mucosa espécime exibindo um eixo vertical naturalmente presente, ou definido e devidamente identificável, preparação de "vertical uniforme aleatório (RVU) seções" (etapa de protocolo 3.3.) estritamente seccionado dentro do plano de sua eixo vertical é vantajoso8,20. Para um discurso completo dos fundamentos teóricos da amostragem de IUR/RVU e uma discussão abrangente de potenciais a jusante análises quantitativas de stereological, o leitor interessado é referido nos livros de stereology quantitativa na vida Ciências8,9.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui usam amostras de tecido derivadas de animais mortos e em total conformidade com os regulamentos legais alemãs do bem-estar animal.

1. a volumetria

  1. Técnica de submersão para a determinação das densidades de tecido/órgão (Figura 1 e Figura 2) 7 , 12 , 16
    1. Preparar materiais: bisturi lâminas, toalhas de papel, pinça fina, balanças de laboratório padrão, vidro ou copos de plástico, soro fisiológico a 0,9% e suportes de construção própria amostra (Figura 2A).
    2. Impostos especiais de consumo um pedaço de tecido (tamanho máximo: 2 x 2 x 2 cm3) do órgão/tecido, especificamente do compartimento do órgão de interesse. Pequenos órgãos, como a hipófise, ou glândula pineal, são medidos em toto.
      Cuidado: Certifique-se que o tamanho da amostra é notavelmente menor do que o diâmetro interno do copo (passo 1.1.5 e segs.) e seu nível de enchimento, para permitir a completa imersão da amostra sem contato com as paredes internas do copo na etapa 1.1.7.
    3. Limpe cuidadosamente a amostra com uma toalha de papel para remover o excesso de sangue/tecido fluido.
    4. Pesar a amostra em uma escala de precisão e registar o peso da amostra (mS). Determine o peso das amostras pequenas a mg (figura 1A).
    5. Coloca um copo cheio com soro fisiológico a 0,9% temperatura na escala. Não encha completamente o copo, para permitir uma submersão da amostra de tecido na etapa subsequente sem transbordar.
      Atenção: Utilize um tamanho de copo apropriado para o tamanho e peso da amostra de tecido a ser medido e a faixa de medição eficaz da escala. Para amostras maiores até 2 x 2 x 2 cm3, um tamanho do copo de 50 – 100 mL é adequado em combinação com uma escala de medição de aproximadamente 100 mg de 500g, enquanto para pequenas amostras, usar copos de vidro de 5 a 10 mL em combinação com balanças de precisão com de medição varia entre cerca de 0,1 mg e 20 g.
    6. Submergi o porta-amostras (ou seja, um loop suficientemente rígido de arame fino ou algo semelhante, Figura 2A) em solução salina para uma posição marcada (setas na figura 1B, Figura 2Be Figura 2). Em seguida, redefina (Tara) a exibição da escala a zero.
    7. Cuidadosamente, anexar a amostra de tecido para porta-amostras e mergulhe completamente a amostra em solução salina até atingir a posição marcada no porta-amostra (setas na figura 1B, Figura 2Be Figura 2).
      Atenção: A amostra submersa e o titular da amostra não devem ter contato com as paredes internas ou o fundo do copo ou da superfície da solução salina.
    8. Mantendo o porta-amostras e a amostra submersa nessa posição, gravar o peso exibido na escala (mL), referindo-se ao peso de soro deslocado pela amostra de tecido (Figura 1 C, Figura 2B, e A Figura 2).
    9. Calcular o volume da amostra (VS) de mLe a densidade do soro fisiológico em temperatura ambiente (20 ° C) (solução salina ρ = 1,0048 g/cm ³) como VS = mL/ Ρsalina [g/g/cm ³] (Figura 1).
    10. Calcular a densidade da amostra de tecido (ρamostra) do peso da amostra (mS) e seu volume (VS) (ou seja, em massa): ρamostra = m S /VS[g/cm ³] (Figura 1).
    11. Para órgãos medidos em toto, repita a medição três vezes e calcular a densidade do órgão média de valores de medição. Para grandes órgãos/tecidos, realizar medições repetidas com diferentes amostras do mesmo órgão/tecido/órgão compartimento e calcular a densidade média de medições simples, em conformidade.
    12. Calcule o volume total do compartimento de órgão/tecido/órgão de seu peso e densidade (Figura 1).
  2. Aplicação do Cavalieri-método para determinação de Volumes de órgãos suínos 7
    1. Preparar materiais: régua, paquímetro, faca, tesoura, pinça, caneta impermeável, transparências de plástico, scanner, foto câmera e grades cruzadas impressos em transparências de plástico.
    2. Colocar o órgão/tecido inteiro sobre uma superfície lisa (base de corte) e medir o comprimento (l) do órgão ao longo do eixo longitudinal (Figura 3B, Figura 5A).
    3. Corte o órgão/tecido completo em fatias paralelas equidistantes ortogonais ao eixo longitudinal do órgão (Figura 3, Figura 5B). Escolha uma distância d entre duas seções (ou seja, a espessura de corte intervalo/seção, geralmente aproximadamente 1 cm) suficientemente pequenas para receber um número suficiente de tecido/órgão lajes. Aleatoriamente, posicione a primeira seção dentro de uma distância entre 0 e o intervalo de corte da margem do órgão. Ao corte, juiz visualmente a posição e orientação de cada plano de corte, para obter aproximadamente paralelo órgão/tecido lajes de espessura mais ou menos uniforme.
      Nota: O número necessário de placas de tecido/órgão varia de acordo com a forma e o tamanho do órgão/tecido examinado. Se pequenos órgãos ou amostras precisam ser seccionado em placas finas de ≤ 5 mm, incorporar as amostras em ágar antes da corte (consulte a etapa 1.3.3.) e usar um dispositivo técnico para corte da amostra incorporado no ágar. Empiricamente recomendáveis intervalos de corte para tecidos e órgãos mais suínos, bem como exemplos de dispositivos de corte, são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos7.
    4. Coloque todas as lajes de órgão/tecido na mesma superfície voltada para baixo sobre a base de corte (ou seja, consistentemente sobre o direito ou o plano de corte à esquerda de cada laje do órgão, a Figura 3D, Figura 5) e contar as lajes (n).
    5. Obter perfis de seção das placas de tecido por uma das seguintes abordagens:
      1. Coloque cuidadosamente as lajes de tecido em transparências de plástico devidamente rotuladas, mantendo a orientação de suas superfícies superior e inferior da seção. Traçar os contornos das placas tecido sobre as transparências de plástico usando uma caneta à prova d'água (Figura 3E1-2).
      2. Com imagens fotográficas de lajes o tecido, segurando a câmera na vertical acima as superfícies de seção (Figura 3F). Para a calibração, coloque uma régua de tamanho próximo as lajes de tecido.
      3. Digitalize as lajes de tecido em um scanner de mesa, mantendo a orientação de suas superfícies superior e inferior da seção (Figura 3). Para a calibração, coloque uma régua de tamanho próximo as lajes de tecido.
    6. Medir as áreas dos perfis de seção (rastreados, fotografados ou digitalizadas) de todas as lajes de tecido por uma das seguintes abordagens:
      1. Sobreposição ou sobrepor os perfis de laje de órgão rastreados com uma grade de tamanho adequado, calibrado de cruzes igualmente espaçados, imprimido em uma transparência do plástica e contar tudo atravessa atingindo área de perfil (Figura 3E3-4; comparar com Figura 5). Calcule a área de seção de perfil de cada laje órgão multiplicando o número de cruzes, atingindo a área de perfil pela área correspondente a uma cruz.
        Nota: Para receber volume suficientemente precisa estima, escolher uma grade cruzada com uma distância suficientemente pequena entre cruzes adjacentes, para que uma média de pelo menos 100 cruza baterá as superfícies de seção das placas de um órgão em cada caso examinado do estudo . Tamanhos de grade Cruz empiricamente recomendável para tecidos e órgãos mais suínos são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos7.
      2. Medir as áreas das placas tecido nas imagens digitais das varreduras/fotos usando apropriado disponível comercialmente ou freeware morfometria macio - e aplicações de hardware (Figura 3 H), como uma imagem comercial análise sistema21, ou ImageJ22.
        Cuidado: A laje de tecido nota que um (o primeiro ou o último) é colocado no scanner descansando em sua superfície natural, respectivamente, enfrenta a câmara com sua superfície natural. Portanto, o digitalizada da imagem, a imagem da foto desta laje, não mostrará uma superfície de seção. Portanto, nenhum perfil de área de secção é medido na imagem digitalizada da imagem/foto desta laje de tecido (Figura 3I). Também nota projeção excessiva presentes em imagens digitalizadas e fotografias de lajes de órgão/tecido, ou seja, somente medir as áreas dos perfis de seção real, mas não do tecido na imagem do outro lado da superfície de seção de laje (Figura 12 G-H).
    7. Calcular o volume estimado de órgãos como o produto da soma de todas as áreas de perfil seção correspondente de todas as lajes de tecido por caso (isto é, consistentemente à direita ou à esquerda, respectivamente, a superfície da seção superior ou inferior de cada órgão da laje e a espessura média das lajes (ou seja, o quociente do comprimento medido do eixo vertical do órgão (l) e o número de lajes)15.
  3. Determinação do grau de encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia
    1. Preparar materiais: lâminas micrótomo, fórceps, ágar, moldes de fundição de metais, scanner digital e régua de tamanho (por exemplo, papel milimetrado).
    2. Corte uma fresco, superfície de seção de avião de uma amostra de tecido fixo.
      Nota: Se usando amostras de facilmente deformáveis () moles (tecido adiposo, tecidos gelatinosos), incorporar a amostra de tecido fixo em agar antes da corte (Figura 4A).
    3. Para incorporar a amostra em ágar:
      1. Misture pó de ágar padrão usado para a Microbiologia de meio de cultura com um volume adequado de água (aproximadamente 0,5-1 g ágar/10 mL de água) num copo de vidro. Agitar a mistura e aquecê-lo em um forno de microondas em 700 W até ferver por 3-5 s. agitar a mistura e leve para ferver novamente por 3 – 5 s.
      2. Opcionalmente, para aumentar o contraste do ágar para a amostra de tecido, tingir o ágar líquido, por exemplo, com tinta preta (Adicionar tinta 1 mL a 10 mL de ágar líquido quente e agite vigorosamente).
      3. Despeje o ágar quente em um molde de fundição (por exemplo, um molde de metal usado para parafina de incorporação, Figura 10A-D) e a amostra de tecido fixo em ágar quente, mergulhe. Deixe o ágar esfriar até solidificação, remover o molde e corte o bloco de ágar com o tecido incorporado usando um micrótomo ou lâmina de barbear.
        Atenção: Durante a manipulação de ágar líquido quente, use luvas e óculos de proteção. Amostras de tecido do processo fixadas em solução de formaldeído sob uma exaustão coifa e usam óculos de proteção e luvas de laboratório.
    4. Colocar a amostra com sua superfície de seção voltada para baixo em um scanner de mesa, juntamente com uma régua de tamanho e escanear a superfície de seção (Figura 4AB).
    5. Determine a área da superfície de seção da amostra de tecido fixo (f) na varredura digital, usando uma das técnicas descritas no passo 1.2.6 (Figura 4B).
    6. Incorporar a amostra em meio de encastre plástico, tais como epóxi (por exemplo, Epon) ou glycolmethacrylate/metilmetacrilato (GMA/MMA)23, seguir protocolos padrão23,24,25 ( A Figura 4). Certifique-se de que a superfície da seção da amostra fixa verificada na etapa anterior (1.3.4) é mantida na amostra de plástico-embutido.
      Nota: Para manter a orientação da superfície de seção da amostra durante o processamento da amostra, consistentemente colocar a amostra com sua superfície de seção pretendido virado para baixo, para a incorporação da fita ou do molde de fundição, ou marcar a seção pretendida superfície (ou do lado oposto da amostra) com tinta.
    7. Cortar uma seção histológica do bloco plástico correspondente à superfície da seção original da amostra de tecido fixo (etapa 1.3.2) usando um micrótomo (Figura 4), montar a seção sobre uma lâmina de vidro (Figura 4) e manchá-la rotineiramente ( por exemplo, hematoxilina e eosina mancham, H & E)24,25.
      Atenção: Para receber uma seção histológica aproximadamente no mesmo plano que a superfície original da seção da amostra de tecido fixo, ajuste cuidadosamente a posição do bloco de plástico no monte do micrótomo antes de seccionamento.
    8. Coloque o slide com a seção manchada virado para baixo em um scanner de mesa, juntamente com uma régua de tamanho e digitalizar a seção (Figura 4E).
    9. Determine a área da seção da amostra de tecido de plástico-embutido (Ae) na varredura digital, usando uma das técnicas descritas na etapa 1.2.6 (Figura 4F).
    10. Calcule o encolhimento médio relacionados com incorporação de tecido (para o respectivo tecido e incorporação médio) das áreas medidas de perfis de seção correspondente de amostras de tecido antes e após a incorporação em plástico médio de incorporação. O fator de encolhimento linear fs é calculado como a raiz quadrada do quociente das áreas de perfis de seção de n amostras de tecido após a incorporação em plástico incorporação médio (Ae) e as áreas do perfis de seção correspondente das amostras de tecido mesmo antes da incorporação em plástico incorporação médio (f) (Figura 4)14.

2. volume ponderado amostragem aleatória sistemática por ponto contando e processamento de tecido subamostras para diferentes tipos de análise a jusante7

  1. Preparar materiais: régua, paquímetro, faca, tesoura, pinça, caneta impermeável, ponto/cruz grades impressas em transparências de plástico e tabelas de números aleatórias.
    Nota: Copiar modelos para atravessar grades (5 a 60 mm) são fornecidos no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos7.
  2. Colocar o órgão/tecido sobre uma superfície lisa (base de corte) e medir o comprimento (l) do órgão ao longo do eixo longitudinal (Figura 5A, figura 6A).
  3. Corte o órgão/tecido completo em fatias paralelas equidistantes ortogonal ao seu eixo longitudinal (Figura 5B). Escolha uma distância d entre duas seções(ou seja, o intervalo corte/espessura, geralmente aproximadamente 1 cm) pequenas o suficiente para obter um número suficiente de fatias de tecido/órgão. Aleatoriamente, posicione a primeira seção dentro de uma distância entre 0 e o intervalo de corte da margem do órgão. Ao corte, juiz visualmente a posição e orientação de cada plano de corte para obter placas de órgão/tecido aproximadamente paralelo de espessura mais ou menos uniforme.
    Nota: O número necessário de placas de tecido/órgão depende do tamanho do órgão/tecido examinado e o número de locais de amostra de tecido. Se pequenos órgãos ou amostras precisam ser seccionado em placas finas de ≤ 5 mm, incorporar as amostras em ágar antes da corte (consulte a etapa 1.3.3.) e usar dispositivos técnicos para corte da amostra incorporado no ágar. Empiricamente recomendáveis intervalos de corte para tecidos e órgãos mais suínos, bem como exemplos de dispositivos de corte são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos7.
  4. Coloque todas as lajes de órgão/tecido na mesma superfície voltada para baixo sobre a base de corte (Figura 6B).
  5. As lajes de tecido com uma grade de tamanho apropriado Cruz impresso em uma transparência de plástico, colocando-a mais externa de sobreposição que sobraram superior transversal da grade um ponto aleatório fora o tecido (Figura 5-D, Figura 6B).
    Nota: Escolher uma grade cruzada com uma distância suficientemente pequena entre cruzes adjacentes, para que em cada caso examinado do estudo, pelo menos duas vezes tantas cruzes vão bater no que respeita a seção do compartimento de tecido a amostra, como o número de amostras que devem ser retirado naquele compartimento de tecido. Tamanhos de grade Cruz empiricamente recomendável para tecidos e órgãos mais suínos são indicados no Material complementar de ""tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos7.
  6. Marcar e contar todas as cruzes batendo o tecido (respectivamente, o tecido sub compartimento a amostra). Aplicar consistentemente um modo uniforme de contagem e numeração das cruzes atingindo o compartimento de tecido para ser amostrados em todas as lajes do tecido, por exemplo, por numeração consecutiva das respectivas cruzes em cada linha por linha, da esquerda para a direita e de cima para baixo, ou, por exemplo, numerando as cruzes em uma laje de tecido após o outro no sentido horário, começando com a Cruz mais próxima para a posição 12:00, como exemplarily demonstrado na Figura 5E.
  7. Divida o número de cruzes, atingindo o compartimento de tecido/tecido para ser incluídos na amostra (n) pelo número de amostras a serem gerados para obter o intervalo de amostragem sistemática (i).
  8. Determine a posição de amostragem primeira, escolhendo um número aleatório x no intervalo entre 1 e eu. Para isso, use uma tabela de números aleatórios. Marcar a primeira posição de amostragem (x) e cada próximo x + i, x + 2eu, x + 3i, etc., Cruz atingindo o compartimento de tecido/tecido a amostra sobre a transparência do plástica usando uma caneta à prova d'água (Figura 5F).
    Nota: Tabelas de números aleatórias podem ser convenientemente e rapidamente geradas usando um gerador de números aleatórios on-line.
  9. Marca o tecido locais correspondente para o marcado cruza levantando ligeiramente a transparência do plástica e colocar um pequeno pedaço de papel de confete limpo, em branco sobre a superfície da laje tecido usando um par de pinças (Figura 5, Figura 6E ).
  10. Amostra de tecido nos locais amostrados (Figura 5 H, Figura 6F, Figura 7A) impostos especiais de consumo e subdividir mais-los para diferentes tipos de análises subsequentes (Figura 6, Figura 7A-B), conforme especificado no Tabela 1.
  11. Após a amostragem, limpe as transparências de plástico com água morna e sabão, secar e reutilizá-los.

3. geração de seções isotrópico uniforme aleatório (IUR) e Vertical uniforme aleatório (RVU) seções para análises quantitativas de Stereological

  1. Técnica de "Isector"
    1. Preparar materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, moldes de fundição esférico (por exemplo, fundição moldes para bombons, que podem ser obtidos a partir de fornecedores de confeiteiro), foldback grampos e pinças.
    2. Coloque um tecido de tamanho adequado parte (1 x 1 x 1 cm3) fixo, sistematicamente aleatoriamente amostrada em um molde de fundição esférico, segure juntos pela foldback braçadeiras e encher o molde com ágar líquido morno (Figura 8A-E).
    3. Retire a esfera de ágar (Figura 8F) do molde de fundição após a solidificação do ágar.
    4. Rolar a esfera de ágar com a amostra de tecido incorporado através da mesa, parar e seção-lo em uma posição aleatória.
      Nota: O plano de corte resultante é uma seção IUR (Figura 8F-G).
    5. Proceder para incorporar a amostra de tecido em resina plástica como GMA/MMA, mantendo a orientação da seção de IUR de avião (ver 1.3.5).
  2. Técnica de "Orientadores"
    1. Preparar os materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, fórceps, (s) de número aleatório, impressões de círculos equiangular e cosseno ponderado.
      Nota: Copiar modelos de círculos são fornecidos em anteriores Publicações8,26.
    2. Colocar a amostra de tecido fixo (ou de tecido fixo incorporado no ágar) em uma impressão de um círculo equiangular com uma aresta paralela para o 0-180 direção ° (Figura 9A, Figura 10E).
    3. Determine um ângulo aleatório usando a tabela de números aleatória. Encontre as marcas correspondentes à escala do círculo equiangular, que baseia-se a amostra. Usando estas marcas, cortar uma parte através da amostra (ou por meio de agar em torno da amostra de tecido incorporado), com o plano de corte sendo orientado paralela à direção do ângulo aleatório indicada na escala do círculo equiangular e vertical para a superfície da amostra (Figura 9B-C, Figura 10F) a descansar.
    4. Coloque o bloco de tecido com a superfície de seção gerada na etapa anterior, enfrentando a desvantagem em um círculo de cosseno ponderada com a aresta da superfície de descanso colocada paralela à direção de 1-1 (Figura 9, Figura 10 H).
    5. Repita a etapa 3.2.3 e cortar uma nova secção através da amostra em um ângulo aleatório determinado usando a tabela de números aleatória (Figura 9E-F, Figura 10I-J).
      Nota: O plano de corte resultante é uma seção IUR.
    6. Se for o caso, determinar a área do perfil seção IUR da amostra de tecido fixo para determinação do encolhimento a incorporação relacionados ao tecido (Figura 9-J), conforme descrito na etapa 1.3 e prossiga para incorporar a amostra de tecido em plástico resina como GMA/MMA.
  3. Geração de seções verticais uniforme aleatório (RVU)
    1. Preparar materiais: lâminas de barbear ou micrótomo, ágar, fórceps, (s) de número aleatório e impressões de círculos equiangular.
      Nota: Copiar modelos de círculos são fornecidos em anteriores Publicações8,26.
    2. Defina um eixo vertical dentro a amostra de tecido fixo que é sempre reconhecível nas seções a amostra durante as etapas subsequentes.
      Nota: Normalmente, o eixo vertical à superfície natural da amostra de tecido é escolhido como o eixo vertical.
    3. Se for caso disso, incorpore a amostra em ágar (Figura 11B).
      Nota: Ágar-incorporação antes VUR - ou IUR-seccionamento da amostra fixa é geralmente recomendado para amostras pequenas, finas, frágeis ou macias. Também use o ágar-incorporação de amostras para facilitar o posicionamento da amostra VUR seccionada durante a subsequente incorporação da amostra em meio de resina plástica.
    4. Coloca a amostra em uma impressão de um círculo equiangular, com eixo vertical, sendo orientado ortogonalmente ao plano da tabela tabela/papel (Figura 11).
    5. Cortar a amostra em um ângulo aleatório (determinado usando uma tabela de números aleatória) com o plano de corte ortogonal à tabela e paralelo ao eixo vertical para receber um plano de corte de RVU (Figura 11).
    6. Se for o caso, determinar a área do perfil da amostra de tecido fixo para determinação do encolhimento de tecido incorporação-relacionados, conforme descrito na etapa 1.3 (compare a Figura 9-J) seção IUR e proceder para incorporar a amostra de tecido em resina plástica como GMA/MMA.

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Representative Results

Técnica de submersão para determinação da densidade do tecido/órgão

Figura 12A -B mostra a determinação representativa da densidade e do volume de um rim suíno utilizando a técnica de submersão descrita no passo 1.1 (Figura 1, Figura 2). Resultados mais representativos das medições de densidade de tecidos e órgãos de suínos adicionais são apresentados na tabela 2. Uma lista mais abrangente de densidades de referência de diversos tecidos dos suínos e órgãos é mostrada no "Tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos"7. A validade dos valores de medição de densidade de tecido obtidos usando o método de submersão pode ser estimada por medidas repetidas da mesma amostra e de amostras independentes. Tecidos mais porcinos exibem valores de densidade ligeiramente superiores a água (ρágua ≈ 1,0), enquanto os tecidos nadando em solução salina (tecido adiposo, tecido pulmonar) exibir densidades < 1.0.

Cavalieri método para determinação de volumes de órgão

Figura 12 -F mostra a determinação representativa do volume do rim suíno (o mesmo órgão como mostrado na Figura 12A-B). As áreas das superfícies das placas órgão seção foram determinadas pela contagem de ponto, usando uma grade cruz sobreposta, impressa em uma transparência de plástico, bem como pela medição planimétrica das áreas de lajes de órgão em uma imagem digitalizada das placas (pagando seção atenção ao excesso de projeção do tecido localizado atrás das superfícies de seção de lajes, Figura 12 G-H). A precisão do volume do órgão/tecido dados obtidos pelo desempenho da abordagem Cavalieri (etapa 1.2, Figura 3) podem ser estimados em comparação ao respectivo volume calculado a partir do peso e densidade do órgão/tecido. Os volumes do rim examinados na Figura 12 determinados pelo método de submersão e o método ou métodos Cavalieri diferem por menos de 1% do outro. Como uma medida da precisão das estimativas de volume de Cavalieri, seu coeficiente de erro (CE) pode ser calculado, como descrito anteriormente15.

Determinação do encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia

Resultados representativos do grau de encolhimento de tecido relacionado a incorporação de amostras de tecido dos suínos (tecido renal cortical) de resinas plásticas (GMA/MMA ou epóxi) para análise quantitativa histomorphological são mostrados na tabela 2 (anteriormente dados não publicados). Os fatores de encolhimento linear indicados no quadro 2 foram determinados conforme descrito na etapa 1.3 (Figura 4). Eles se referem a uma redução de volume tridimensional de 29% para a incorporação de GMA/MMA e 22% para a incorporação de epóxi de tecido renal cortical suíno. A Figura 13 mostra exemplos representativos das amostras adequadamente e insuficientemente preparados de ágar-incorporado, fixada em formol tecido adiposo para medição da amostra seção superfície antes da incorporação de plástico.

Volume ponderado amostragem aleatória sistemática por ponto de contagem e processamento de tecido subamostras para diferentes tipos de análise a jusante

A técnica de "corte e contagem de ponto" para ponderada por volume de amostragem aleatória sistemática dos órgãos parenquimatosos (etapa 2, Figura 5, Figura 6, Figura 7) representa um método estabelecido, robusto para geração de representante amostras para vários tipos de subsequentes de análises2,7. Resultados representativos da geração de espécime de biobanco sistematicamente aleatoriamente amostrada, altamente redundante de vários suínos órgãos e tecidos, com subsequente diferencial de processamento das amostras de tecido extirpado para múltiplas diferentes a jusante métodos de análise usando a técnica de amostragem descrita na etapa 2 (exemplarily demonstrada na Figura 6, Figura 7eFigura 5) tem sido anteriormente publicado2. Para geração de biobanco amostras de tecido do fígado em um anterior biobanco suínos estudo2, por exemplo, suínos fígados foram completamente seccionados em aproximadamente 20 chapas de 2-3 cm de espessura, sobreposta com um com um 3cm atravessar a grade, conforme descrito na etapa 2 e 16 locais de tecido de aproximadamente 2 x 2 x 2 cm3 foram sistematicamente aleatoriamente amostradas e extirpados em cada caso. De cada uma das amostras extirpadas, cinco subamostras foram geradas posteriormente para análises moleculares (congeladas a-80 ° C) dos locais amostrados, uma subamostra para cryohistology, uma subamostra foi fixada em solução de Methacarn e em solução de formaldeído para subsequente parafina histológica e incorporação- e exame imuno-histoquímico. A geração de 74 amostras diferentes por caixa (até a transferência das amostras em solução de fixação ou congelamento) foi alcançada dentro de aproximadamente 20 min, em média2. O sucesso/exequibilidade de amostragem descrita e subamostragem abordagem podem ser estimado por avaliação da qualidade das amostras geradas (ou seja, a qualidade do RNA ou proteína Isola, preservação da histomorphological e ultra-estruturais Propriedades de amostras de tecido, sua adequação para reagidos, análises, etc.)2

Geração de seções isotrópico uniforme aleatório (IUR) e Vertical uniforme aleatório (RVU) seções para análises quantitativas de Stereological

As técnicas demonstradas para uma geração orientada para a frente de isotrópico uniforme aleatório (IUR) secções e secções de RVU de suínos (biobanco) amostras de tecido (passo protocolo 3, Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11), permitindo a análise da maioria dos parâmetros quantitativos de stereological, rapidamente pode ser realizado com alguma prática e sem dificuldades razoáveis ou fontes de erro. Portanto, a geração de IUR-amostras, mostrado na Figura 9 (técnica isector) e na Figura 10 (técnica de orientadores) é totalmente representativa para estes método (s).

Figure 1
Figura 1: ilustração esquemática da "técnica submersão" para determinação da densidade do tecido/órgão. (A) medição do peso da amostra (ou seja, massa, m,S). (B) escala tarada para o peso de um copo cheio com soro fisiológico a 0,9% de 20 ° C e um suporte de amostra submergida em solução salina para uma posição definida, marcada. (C) completa submersão da amostra para a posição marcada do porta-amostras sem qualquer contacto com as paredes internas ou o fundo do copo. O exibido na balança é o peso do volume de solução salina deslocada pela amostra). A densidade da amostra é calculada conforme indicado (aqui: ρamostra = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1,141 g/cm ³). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: "Técnica de submersão" para determinação da densidade do tecido/órgão. Titulares de amostra diferente de (A) construídos a partir de arame fino. Da esquerda para a direita: um laço de fio de arame fino através de uma cânula fina de injeção, um cesto helicoidal de fios para segurar as amostras pequenas e frágeis e uma tipoia simples de arame fino. As setas na A-C indicam as posições a que os titulares de amostra são submergidos em solução salina. (B, C) Posicionamento do titular da amostra durante a imersão da amostra em solução salina (compare com 1 Figura C). (B) completa porcina hipófise colocada num suporte em forma de cesta de amostra. (C) amostra de miocárdio porcina. Observe a submersão completa das amostras em solução salina sem contato com as paredes ou o fundo do copo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: ilustração esquemática da aplicação do método para determinação de volumes de órgãos suínos Cavalieri. Moeda (A) pilha de exemplo para a compreensão do princípio de Cavalieri. Consulte Introdução para obter detalhes. (B-H) Demonstração esquemática da estimativa do volume de um fixo de perfusão renal. (B) medição do comprimento (l) do rim ao longo do eixo longitudinal. (C) corte do órgão completo em n igualmente grosso (d) paralela fatias ortogonais ao eixo longitudinal do órgão. (D) lajes de órgãos colocados na mesma superfície virado para baixo. Note que a primeira laje de tecido (à direita) é colocado na sua superfície natural, ou seja, não tem uma superfície de seção. (E-H) Diferentes abordagens para determinar as áreas de superfície de seção das placas de tecido. (E) traçando o contorno de cada laje de órgão com uma caneta impermeável em uma sobreposição de plástico transparência dos perfis de laje de órgão contornada com um tamanho adequado, calibrado Cruz grade imprimido em uma transparência de plástico, contando de cruzes bater o área de perfil. A área de perfil órgão seção de laje é calculada a partir do número de cruzes, atingindo a área de seção de perfil e a área correspondente a uma cruz. (F,G) Determinação de áreas de secção do órgão de lajes em imagens de fotos tiradas na orientação vertical para as superfícies de seção (F), ou em imagens digitalizadas de lajes do tecido (G), com governantes para calibração. (H) determinação das áreas do tecido seção lajes nas imagens digitais das varreduras/fotos usando morfometria apropriado de aplicações de software. (eu) cálculo do volume estimado do órgão como o produto da cumulativa área das superfícies seção correspondente de todos os órgãos lajes multiplicadas pela espessura média do órgão lajes15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: ilustração esquemática da determinação do encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia. (A) corte de uma superfície de seção fresco, avião de uma amostra de tecido fixo (estabilização da forma dos tecidos (macios) facilmente deformáveis como tecido adiposo ou pulmão por incorporação em ágar antes da corte). Varredura da superfície da amostra juntamente com uma régua de tamanho de seção. (B) determinação planimétrica da área da superfície da amostra de tecido fixo (f) de seção. (C) rotina incorporação da amostra em plástico médio de incorporação. (D) preparação de uma seção histológica do bloco de plástico com preservação do plano de corte da amostra. Montagem da seção sobre uma lâmina de vidro e coloração de rotina do slide. (E) digitalização do slide juntamente com uma régua de tamanho. (F) determinação planimétrica da área da seção da amostra do plástico-embutido (Ae). (G) cálculo do grau de encolhimento de tecidos relacionados com a incorporação como o quociente das áreas de perfis de seção correspondente de amostras de tecido medidos antes e após a incorporação em plástico médio14a incorporação. Imagens do lado direito mostram a superfície de seção de uma amostra de formaldeído-fixo de tecido adiposo incorporado em ágar enegrecida de tinta antes de incorporação em resina plástica (topo) e o perfil correspondente seção (mancha) da amostra GMA/MMA-incorporado (parte inferior). Escala de barras = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: ilustração esquemática da amostragem aleatória sistemática volume ponderado. O exemplo apresentado mostra a amostragem aleatória sistemática de seis locais de tecido dentro do córtex renal de um fixo de perfusão renal. (A) medição do comprimento (l) do rim ao longo do eixo longitudinal. (B) completa seccionamento do órgão inteiro fatias igualmente grosso (d) paralela ortogonal ao eixo longitudinal do órgão. (C) lajes de órgão/tecido colocado na mesma (ou seja, à direita ou à esquerda) superfície virado para baixo. (D) sobreposição das placas com uma grade de tamanho apropriado Cruz tecido impresso em uma transparência de plástico. A mais externa esquerda superior transversal da grade é colocada sobre um ponto aleatório fora o tecido (indicado por um ponto azul, ). (E) contagem e numeração de todas as cruzes, atingindo o córtex renal. No presente exemplo, as cruzes, atingindo o córtex renal são numeradas consecutivamente na laje de um rim após o outro (da esquerda para a direita), em cada processo de laje no sentido horário, começando com a Cruz mais próxima para a posição 12:00. Aqui, 36 cruzes bateu o córtex renal. Seis posições de amostragem devem ser amostradas. Portanto, cada sexta posição onde uma cruz atinge o tecido é amostrada (36/6 = 6). (F) no presente exemplo, a posição da quarta Cruz (N ° 4) atingindo o córtex renal é aleatoriamente escolhido como a primeira posição de amostragem. Os seguintes sexto Cruz paquerando o córtex renal é marcado a plástica transparência usando uma caneta à prova d'água. No presente exemplo, estas são as posições 4, 10, 16, 22, 28 e 34. (G) identificação dos correspondentes locais de tecido por pequenos pedaços de papel de confetes em branco, limpo, colocado na superfície do tecido. (H) excisão de amostras dos locais amostrados aleatoriamente sistematicamente e processamento subsequente para mais análises. Esta figura foi modificada de Albl et al. (2016), figuras S236 e S237, página 186 (suplementos)7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Volume ponderado amostragem aleatória sistemática do córtex renal de um rim suíno (consulte a Figura 5) e as regras de contagem de ponto. Rim de porco fresco (A). (B) rim seccionado em igualmente paralelas de espessura ortogonais ao eixo longitudinal do órgão, sobreposto com cruz grade imprimido em uma transparência de plástico. O círculo vermelho indica a posição do ponto aleatório usado para randomizar a posição da grelha transversal. Ilustração (C) das regras de contagem de ponto: um cross/point é contado como bater o compartimento de tecido a ser amostrado (compartimento de referência), se o interior superior direito canto do vertical e barra horizontal da Cruz (seta) cobre o tecido. (D) marcação de cruzes, atingindo o córtex renal e a amostragem aleatória sistemática dos locais de tecido (aqui, 119 cruzes bateu o córtex renal e 17 locais são sistematicamente aleatoriamente amostradas utilizando uma amostragem intervalo eu = 7). (E) amostradas aleatoriamente sistematicamente localizações do córtex renal, marcados pelo papel de confete. (F) extirpado amostras. (G) mais subdivisão de extirpado amostras para processamento posterior de subamostras para tipos diferentes de análise a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: subdivisão de amostras de tecido extirpado da sistematicamente locais aleatoriamente amostras de tecido e processamento de subamostras para tipos diferentes de análise a jusante. (A) ilustração esquemática da geração de subamostras de tecido de um local sistematicamente aleatoriamente amostrada do córtex renal (tecido nativo) para análises diferentes (por exemplo, FF-PE: amostra fixada em formol, parafina e MTC-PE: Amostra de methacarn-fixas, parafina para a luz-microscópica histologia; Criogenia: Amostra para histologia seção congelada; Amostras de tecido de-80 ° c: seco-gelo congelado para análise molecular). (B) excisão dos locais amostrados aleatoriamente sistematicamente do córtex renal de um fixo de perfusão renal, mais a subdivisão das amostras de tecido excisado e processamento das subamostras para análises morfológicas qualitativas e quantitativas. Lajes de rim suíno perfusão-fixo (1), Cruz-grade (2), mesa número aleatória (3), equiangular e cosseno-pesava círculos (4) para geração de seções IUR (consulte a Figura 9, Figura 10), soluções de fixação diferentes (5, 6, 7) e amostra recipiente para amostras microscópicas de elétron (8). Esta figura foi modificada em Albl et al (2016), figura S239, página 186 (suplementos)7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: "Isector" seção de preparação do tecido porcina fixada em formol. (A) amostra de perfusão-corrigido porcina córtex renal. Moldes de fundição esférico (B). (C) ágar líquido. (D-E) Ágar-incorporação de amostras em moldes de fundição esférico. Ágar-ágar (F) esfera com amostra de tecido incorporado. Ágar-ágar (G) esfera com tecido incorporado seccionado em uma posição aleatória (plano de corte IUR). Esta figura foi modificada em Albl et al (2016), figura S6, página 14 (suplementos)7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: ilustração esquemática da técnica "Orientadores" para a preparação das seções IUR. (A) amostra de tecido fixo colocado sobre um círculo equiangular (ci1) com uma borda paralela para o 0-180 direção ° (indicada por uma linha vermelha). (B) Set Sectioning da amostra em um ângulo aleatório (linha verde). (B, C) Recém-gerado superfície de seção da amostra de tecido (indicada em cor verde). (D) amostra colocada em um círculo de cosseno-pesava (ci2) com a superfície secional gerada na etapa anterior, virado para o lado negativo e uma aresta da superfície de repouso paralela à direção de 1-1 (indicada por uma linha vermelha). (E) corte da segunda seção através da amostra em um ângulo aleatório. (F) resultando aleatoriamente isotrópico seção avião da amostra (indicada na cor azul). (G) a determinação da área da seção da amostra de tecido fixo para estimativa de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação, conforme descrito na etapa 1.3 de IUR. (H) incorporação da amostra de tecido em resina plástica. (eu) Set Sectioning do bloco de plástico é seccionado (paralelo ao plano de IUR) em um micrótomo. (J) montagem das IUR plástico-seções em lâminas de vidro. Esta figura foi modificada em Albl et al (2016), figura S8, página 15 (suplementos)7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: técnica de "Orientadores" para a preparação das seções IUR de amostras de tecido incorporado no ágar. (A-D) Opcionalmente, um pode agar-incorporar um espécime sistematicamente aleatoriamente amostrado de tecido fixo (ágar-incorporação é útil para amostras pequenas, para que o primeiro ou ambas as seções aleatórias podem ser posicionadas dentro do ágar sem cortar o tecido). (E) posicionamento do bloco de ágar em um círculo equiangular (ci1) com uma borda paralela à direção de 1-1 (indicada por uma linha vermelha). (F, G) Corte do bloco em um ângulo aleatório (aqui: 15-15, linha verde) determinada usando uma tabela de números aleatória (seta rnt, verde). (H) subsequente posicionamento do bloco de ágar na superfície de seção cortada em F em um círculo de cosseno ponderado (ci2) com a borda da superfície descanso colocado paralela à direção de 1-1 (indicada por uma linha vermelha). (eu) segunda seção corta a amostra em um ângulo aleatório (aqui: 20-20, indicado por uma linha azul), determinado usando uma tabela de números aleatória (seta rnt, azul). (J) resultante IUR seção avião da amostra de tecido. Esta figura foi modificada em Albl et al (2016), figura S9, página 16 (suplementos)7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: ilustração esquemática da preparação de seção VUR. (A) amostra de tecido fixo definido (identificáveis) eixo vertical (por exemplo, vertical, a sua superfície natural). (B) amostra de tecido fixo incorporado em ágar. (C) posicionamento da amostra de tecido the(agar-embedded) em uma impressão de um círculo equiangular (ci1). VA: Eixo Vertical. (D) Set Sectioning da amostra em um ângulo aleatório (tabela de números aleatória; aqui: direção de 30-30, indicada por uma linha azul) com o plano de corte, sendo orientado ortogonalmente à mesa e paralelo ao eixo vertical da amostra. Resultante plano de corte de RVU da amostra de tecido (indicado na cor azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: volumetria de representante de um rim suíno. (A-B) Técnica de submersão. (A) determinação do peso do rim (mcriança). (B) determinação do peso do volume de solução salina deslocada pelo rim (mdispl.saline). O rim é pendurado em uma corda e totalmente submerso em solução salina sem tocar o fundo ou as paredes do copo. O volume calculado do rim é 92,6 cm ³. (C-D) Técnica de Cavalieri, planimetria por contagem de ponto. (C) medição do comprimento (l) do rim ao longo do eixo longitudinal. (D) determinação das áreas seção perfil do rim lajes por ponto contando após a sobreposição de uma grade de cruzes igualmente espaçados impresso em uma transparência de plástico. Aqui, o volume estimado do rim é 93,3 cm ³. (E-F) Técnica de Cavalieri, planimetria das imagens digitalizadas das áreas de perfil seção das placas renal (F). Aqui, o volume estimado do rim é 92,8 cm ³. No C-E, natural redonda superfície da primeira ou a última laje do rim colocados no scanner ou sobrepostas por transparência a grade cruzada não é uma superfície de seção e, portanto, nenhuma área de superfície de seção é medida em laje este tecido. (G-H) Demonstração de overprojection em imagens digitalizadas de lajes de órgão/tecido (G) e nas lajes de órgão/tecido sobrepostas com uma transparência de grade Cruz (H). Overprojecting partes do tecido das placas órgão são indicadas por linhas pontilhadas de brancas e pretas. Somente as áreas de perfis de seção real (ou seja, o tecido, cercado por uma linha pontilhada branca parcialmente indicada) são determinadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Figura 13: ilustração representativa da adequada (A) e de qualidade inferior (B) preparação de amostras de tecido incorporado no ágar para determinação do encolhimento de tecido relacionado com incorporação de amostras em plástico histológico incorporando mídia. (A) digitalizados imagem da superfície de uma amostra fixa de suínos tecido adiposo subcutâneo antes da incorporação em resina plástica de seção. A amostra é incorporado em ágar enegrecida de tinta para a estabilização da forma da amostra e uma identificação clara dos contornos de superfície de seção. (B) linhas indistintas a bolha de ar aprisionado e superfície de seção (seta) dentro do ágar. Escala de barras = 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise Amostra Processamento de
Tipo Método (s)
Análises moleculares Transcrição de RNA, proteínas, metabólito e perfil lipídico,
Metabolomics análise, análise de DNA
Pequenos pedaços * de tecido fresco (nativo) Congele em gelo seco ou nitrogênio líquido. Loja a-80 ° C.
Análises morfológicas qualitativas Histologia
[microscopia de luz, incl. imuno-histoquímica (IHQ) e hibridização in situ]
Fresco (nativo) — ou em situ - fixada * amostras de tecido Use fixadores diferentes (por exemplo, 4% de solução de formaldeído) e incorporação de meios de comunicação (parafina, GMA/MMA, da cola epoxy), conforme o caso.
Cryohistology
(seções congeladas, incl. IHC)
Amostras de tecido frescas (nativo) Incorporar a amostra em meio de bloqueio e congelar-se em isopentano arrefecido a nitrogênio líquido.
Análise ultraestrutural
[microscopia eletrônica, incl. transmissão (TEM) e microscopia eletrônica]
Pequenos pedaços de doce (nativo) — ou em situ- fixada * amostras de tecido Corrigir a amostra em solução de glutaraldeído 2,5 – 6,25% e incorporar em plástico resina epóxi.
Análises morfológicas quantitativas Microscopia de luz Fresco (nativa) - ou em situ - fixo * amostras de tecido Prepare IUR-seções (orientadores-, isector-seções) e/ou VUR-seções de amostras de plástico tecido incorporado.
TEM Pequenos pedaços de doce (nativo) — ou em situ - fixada * tecido Prepare as seções IUR (orientadores-, isector-seções) de amostras de tecido da cola epoxy-incorporado.

Tabela 1: processamento de subamostras de tecido extirpadas de localidades amostradas aleatoriamente sistematicamente para tipos diferentes de análises a jusante. Dependendo do design experimental do estudo e do órgão/tecido sob investigação, diferentes números de subamostras devem ser extirpados de cada local de tecido sistematicamente aleatoriamente amostrada e processados para diferentes tipos de análises a jusante. Protocolos detalhados para tecidos/órgãos mais porcinos e tipos de estudo são fornecidos no "Tecido amostragem guias para suínos biomédica modelos"7. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/metilmetacrilato. IUR: Isotrópico uniforme aleatório. VUR: Vertical uniforme aleatório. * max. 2 x 2 x 2 mm3. por exemplo, tecido de perfusão fixada ou tecido pulmonar dos pulmões instilado com solução de fixação.

Método Resultados representativos
Técnica de submersão para a determinação das densidades de tecido/órgão (etapa 1.1, Figura 1, Figura 2) Órgão/tecido suíno Ρ (g/cm ³)
Fígado 1.071 ± 0,007
Pâncreas ± 1,062 0.016
Miocárdio de ventrículo 1.036 ± 0,014
Rim 1.044 ± 0,006
Tecido adiposo visceral abdominal * 0.921 ± 0.032
Glândula tireoide 1.061 ± 0,007
Cérebro 1.051 ± 0,007
Glândula adrenal 1.063 ± 0.025
Músculo esquelético * * 1.074 ± 0,003
Dados são meios ± pesos de órgão/tecido SD. Specific foram determinados em n = 18 suínos (14 mulheres e 4 suínos machos; idade 60 dias a 2 anos; 30 – 250 kg de peso do corpo). * Tecido adiposo do mesentério jejunal. * * Valores médios para M. gluteobiceps, M. tibial cranialis, M. Tríceps braquial e o M. longissimus dorsi.
Determinação do encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia (etapa 1.3, Figura 4) Órgão/tecido Incorporação de meio       fS
Córtex renal (porco) GMA/MMA 0,89 ± 0,02
Epóxi 0,92 ± 0,02
Dados são meios ± SD das medições das 24 amostras de 12 porcos. fS: fator de correção de encolhimento Linear.

Tabela 2: Resultados representativos das densidades de selecionado porcina órgãos e tecidos7e fatores de correção de encolhimento linear para encolhimento de tecidos relacionados com a incorporação do tecido renal cortical suíno em plástico diferente, incorporando mídia.

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Discussion

Geração de coleções de amostra biobanco de modelos animais suínos requer técnicas robustas e protocolos para a determinação dos volumes de órgão/tecido, a geração pode ser reproduzida de representante, amostras de tecido redundante apropriadas para uma ampla gama de métodos de análise diferentes e para randomização da orientação das seções de amostra para análises quantitativas de stereological. Os métodos descritos no presente artigo são adaptados para os tamanhos de suínos órgãos e tecidos e foram desenvolvidos para efetivamente atender a estas demandas,2,7. Eles são baseados em princípios metodológicos bem reconhecidos e anteriormente provaram sua exequibilidade em diferentes estudos publicados2,7,12,21. Os métodos indicados são importantes para vários tipos de estudos examinando amostras de tecido/órgão, uma vez que fornecem uma base para a geração de amostras representativas e para a aquisição de uma variedade de parâmetros que caso contrário não poderia ser determinado. Esses métodos podem ser executados rapidamente com pouco esforço e são compatíveis com praticamente todos os tipos de análises a jusante. Portanto, eles são considerados adequados não somente para projetos de biobanco modelo animal de suínos, mas também são úteis em estudos envolvendo histomorphological quantitativos de análises de amostras de tecido de outras espécies de grande modelo animal (por exemplo, ovelhas), como bem como em estudos de veterinários. Atendendo os aspectos técnicos dos diferentes métodos, alguns passos críticos e limitações tem que ser considerado durante a implementação dos protocolos das respectivas técnicas.

Técnica de submersão para determinação da densidade do tecido/órgão

Durante a determinação de densidades, usando o método de submersão (etapa 1.1, Figura 1, Figura 2), cuidados devem ser tomadas para não tocar as paredes internas ou o fundo do copo com a amostra de tecido ou o titular de amostra, enquanto o tecido de tecido amostra é submerso em solução salina. Caso contrário, a balança irá exibir o peso da amostra, em vez do peso do volume de solução salina deslocada pela amostra. Para amostras de tecido muito pequeno/luz (alguns mg), o método de submersão para determinação da densidade do tecido é limitado, devido a surface tension do soro e o quociente negativamente alto volume de amostra para o volume de líquido submersão no copo, que é impedindo a precisão da medição. Aqui, o peso da amostra pode ser usado para cálculos ainda mais em vez do volume calculado a densidade. Determinação das densidades de tecido por submersão também não é eficaz para o tecido fresco (não fixada) pulmão, devido ao teor de inconsistente de ar no tecido e em alguns casos, onde os órgãos são experimentalmente perfundidos/instilado com fixador.

Cavalieri método para determinação de volumes de órgão

O método de volumetria de Cavalieri de suínos órgãos e tecidos é mais complicado quando comparado a determinação do volume do órgão do peso do órgão e densidade. No entanto, é apropriado para órgãos que não podem ser adequadamente pesados devido ao seu tratamento experimental (por exemplo, órgãos de perfusão-fixo ou pulmões instilados com solução de fixação). Aqui, o método de volumetria de Cavalieri idealmente pode ser combinado com a técnica de amostragem aleatória sistemática ponderada volume descrita na etapa 2 (Figura 5, Figura 6, Figura 12). Durante estimativa dos volumes de órgão/tecido das áreas de perfis de seção de fatias paralelas, equidistantes do órgão/tecido (abordagem Cavalieri, etapa 1.2, Figura 3), a manutenção da orientação do tecido das lajes (superior e inferior plano de corte ), bem como a determinação precisa da área de todos os perfis de seção são de grande importância. Particularmente, se imagens digitais ou scans de órgão lajes são analisados, planimetrically, overprojections do tecido (fora o avião de tecido seccionado) da laje tecido (Figura 12G-H) devem com cuidado ser considerados para fornecer o volume de confiança estimativas.

Determinação do encolhimento de tecido tridimensional relacionados com incorporação durante o processamento de amostras de tecidos para a histologia

O grau de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação depende do meio de incorporação e o tipo de tecidos e pode também variar entre amostras diferencialmente transformadas do mesmo tecido.

Considerando que seções congeladas são consideradas para não exibir virtualmente nenhum encolhimento no plano X-Y, e incorporação de plástico geralmente provoca pequeno encolhimento do tecido, encolhimento de tecido incorporação-relacionados é particularmente extenso em amostras de tecido de parafina e geralmente significativamente prejudicará análises morfológicas quantitativas dos parâmetros dimensionais em cortes histológicos destas amostras. Além da grande extensão do encolhimento global tridimensional, parafina-incorporação também faz com que um não-uniforme, diferencial, anisotrópico e variável do encolhimento da amostra e de diferentes estruturas anatômicas, tipos de tecido e os tipos de células dentro o tecido amostra8,13. Além disso, particularmente no mais espesso cortes histológicos de amostras de tecido de parafina, o grau de encolhimento de tecido também significativamente pode diferir em X-Y e Z-direção da seção. Isto pode ser devido a uma retração diferencial da área de secção (na direção X-Y) e a altura da secção (ou seja, a espessura de corte vertical) durante o alongamento da seção o banho de água de flutuação de tecido quente, depois que a seção é cortada a partir do tecido bloquear e durante os procedimentos de transformação, coloração e lamínula subsequentes da seção montado em um vidro de slide (ou seja, um colapso homogêneo do eixo z das seções)8. Além disso, nas seções espessas, pode haver uma compressão comparativamente mais forte das regiões dentro da seção seção-avião-perto de tecido enquanto a seção é cortada a partir do bloco de tecido (conduzindo a uma deformação diferencial do eixo z das seções)19 . Estes efeitos então podem distorcer também as estimativas do número de estruturas de tecido dentro da seção por métodos de análise stereological quantitativos distintos, tais como o disector óptico. Portanto, previsão, acompanhamento e correção de encolhimento de tecidos relacionados com a incorporação não é viável para amostras de tecido parafina8.

Em contraste, o grau de contração do volume de amostras de tecido incorporado em resinas plásticas, tais como a GMA/MMA ou epóxi, é significativamente menor e, importante, mais uniforme. Portanto, a incorporação em resina plástica com uma assumida homogênea, isotrópico e global encolhimento do tecido é vantajoso para vários métodos de análise de diferentes parâmetros morfológicos quantitativa17,18. Durante estimativa de encolhimento de tecidos relacionado a incorporação em resina plástica, a forma do tecido fixo deve não adicionalmente ser falseada durante o procedimento de incorporação, para permitir a comparação das áreas de perfil seção correspondente do fixo e embutido amostras. Isto pode ser difícil em amostras de tecido macio ou facilmente compressíveis como tecido adiposo ou pulmão, ou em amostras de tecido com um alto conteúdo de fluidos. Aqui, a incorporação da amostra fixa em ágar antes do corte do tecido é útil para estabilizar a forma da amostra de tecido durante o plástico subsequente incorporação de procedimento (etapa de protocolo 1.3., Figura 4). Para obter dados fiáveis, medições repetidas do encolhimento de tecido relacionadas a incorporação devem ser realizadas, utilizando amostras diferentes do mesmo tecido. O grau de encolhimento de tecidos relacionados com incorporação é expresso como o encolhimento de tecido linear fator fs (passo protocolo 1.3.9., Figura 4). Exemplos de equações usando fs para correção de encolhimento de comprimento, superfície e parâmetros de volume das estruturas de diferentes tecidos são fornecidos em vários estudos quantitativos stereological14, 21,,27.

Volume ponderado amostragem aleatória sistemática por ponto contando e processamento de subamostras de tecido para tipos diferentes de análise a jusante

A técnica de amostragem de volume ponderado apresentados por órgãos de suínos determina locais de amostragem aleatória dentro do tecido de uma vez e posteriormente gera todas as amostras necessárias para os mais diferentes análises por subamostragem das amostras de tecido extirpadas da Estes locais7. Em regimes de amostragem aleatória sistemática volume ponderado, cada local de amostragem possível dentro do volume total do órgão/tecido sob exame tem exatamente a mesma chance aleatória de amostrar e generalização é assegurada pela coleção de uma número suficiente de amostras. Portanto, usar projetos de amostragem aleatória sistemática volume ponderado para geração de amostras de órgãos parenquimatosos, efetivamente impede resultados análise possivelmente influenciados por distribuições desiguais (potencialmente inesperadas e não reconhecidas) de distintas Propriedades de tecidos funcionais ou morfológicas em diferentes locais de um órgão, que tem sido demonstrados, por exemplo, para o volume médio e a densidade de volume numérico de hepatócitos suínos em diferentes regiões do parênquima hepático28 . A destaque "tecido-desmonte e subamostragem" estratégia para órgãos de suínos é facilmente compreensível, cumpre com os requisitos técnicos dos métodos de análises a jusante e pode ser rapidamente realizada e adaptada às exigências de um estudo específico, evitando preconceitos de amostragem sistemática, reduzindo a variabilidade experimental e aumentando a precisão do experimento global, apesar de ser mais eficiente do que a amostragem de estratégias em que cada local de amostragem única é determinado aleatoriamente9 ,15. O número de exemplares que têm de ser produzidos, obviamente dependem do parâmetro examinado e sua variabilidade dentro de amostras de diferentes locais do órgão/tecido amostrado. Para geração de coleções de amostra do Biobanco projetado para permitir a análise dos diferentes parâmetros (não especificado no momento da amostragem) no máximo por uma variedade de diferentes métodos analíticos, tal estratégia prospectiva amostragem geralmente agenda geração de números relativamente altos de amostras redundantes por órgão/tecido.

Geração de seções isotrópico uniforme aleatório (IUR) e seções verticais uniforme aleatório (RVU) para análises quantitativas de stereological

Algumas das técnicas utilizadas para geração de IUR e RVU seções para (desnecessariamente) evitaram quantitativos de análises stereological complicaram um pouco bases teóricas, e as explicações são, portanto, muitas vezes por muitos cientistas, embora sua prática implementação é razoavelmente fácil. VUR secções estão particularmente fácil de gerar e são ideal para estimativas de densidade/área de superfície em combinação com sistemas de teste do cycloid8,9,20. Eles são frequentemente preferidos devido à orientação familiar do plano de corte. No entanto, em contraste com seções IUR, seções de RVU não são adequadas para a estimativa dos parâmetros de comprimento-8,9.

Durante a preparação das seções IUR e RVU, o passo fundamental é, basicamente, para manter a superfície de seção IUR ou VUR da amostra fixa durante a incorporação em resina plástica e certifique-se de que o eixo vertical de seções VUR sempre pode ser identificado (passo 3, Figura 9, Figura 10, Figura 11).

No futuro, a mais ampla aplicação dos métodos descritos acima pode contribuir substancialmente para estabelecer padrões de alta qualidade consistentemente para geração de biobanco comparáveis, de múltiplos propósitos de amostras de suínos e outros grandes modelos animais.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Lisa Pichl excelente assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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