Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

Medicine

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Summary

Die praktische Anwendung und Leistung der Methoden für die Generation von repräsentativen Gewebeproben von porcinen Tiermodellen für ein breites Spektrum an nachgeschalteten Analysen in Biobank Projekte gezeigt, darunter Volumetrie, systematische Stichproben und differenzierte Aufbereitung von Gewebeproben für qualitative und quantitative morphologische und molekulare Analysen Arten.

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

In der translationalen medizinischen Forschung haben Schweine Modelle stetig populärer geworden. In Anbetracht des hohen Wertes der einzelnen Tiere, besonders der gentechnisch veränderten Schwein, Modelle und oft zeitlich begrenzte Anzahl der verfügbaren Tiere dieser Modelle, Einrichtung (Biobank) Sammlungen von adäquat verarbeiteten Gewebeproben eignet sich für eine breites Spektrum an nachfolgende Analysemethoden, einschließlich nicht angegebene zum Zeitpunkt der Probenahme, Analysen stellen sinnvolle Ansätze für die translationale Wert des Modells voll nutzen. Im Hinblick auf die Besonderheiten des porcinen Anatomie wurden umfassende Richtlinien für standardisierte Generation Vertreter, qualitativ hochwertige Proben aus verschiedenen porcinen Organen und Geweben vor kurzem eingerichtet. Diese Richtlinien sind wesentliche Voraussetzungen für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und ihre Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien und Ermittler. Die Aufzeichnung der Grunddaten wie Orgel Gewichte und Volumina, die Bestimmung der Probenahme Standorte und der Anzahl der Gewebeproben erzeugt werden, sowie Ausrichtung, Größe, Verarbeitung und trimmen Richtungen sind relevante Faktoren Bestimmung der Generalizability und Nutzbarkeit der Probe zur molekularen, qualitative und quantitative morphologische Analysen. Hier ist eine anschauliche, praktische, schrittweise Demonstration der wichtigsten Techniken zur Erzeugung von Vertreter, Mehrzweck-Biobank Exemplar von porcinen Gewebe präsentiert. Die hier beschriebenen Methoden umfassen Bestimmung der Organgewebe/Volumen und Dichte, die Anwendung eines volumengewichteten systematische Stichproben für parenchymatösen Organen durch Punkt zählen, Bestimmung des Ausmaßes der Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit histologische Einbettung der Proben und Generierung von zufällig orientierte Proben für quantitative stereologischen Analysen, z. B. isotrop einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte erzeugt durch die "Orientator" und "Isector" Methoden und vertikale uniform zufällige (VUR) Abschnitte.

Introduction

In der translationalen Medizin, Schweine sind immer häufiger für den Einsatz als großes Tier1,2,3,4,5, wegen mehrere vorteilhafte Ähnlichkeiten zwischen den Schweinen Modelle und menschliche Anatomie und Physiologie und die Verfügbarkeit von etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen Generation zugeschnitten, gentechnisch veränderte Schweine-Modelle für ein breites Spektrum von Krankheiten Bedingungen1,4.

Jedoch beschränkt sich im Vergleich zu Nager-Modelle, die Zahl der Tiere eines jeweiligen Schwein-Modells, das für Experimente jederzeit zur Verfügung gestellt werden können. Dies liegt an den Schweinen Generierungsintervall von ca. einem Jahr und den finanziellen und zeitintensiven Aufwand für die Erzeugung von porcinen Modelle und Tierhaltung. Daher sind einzelne Tiere von porcinen Modell sowie die Proben, die von diesen Schweinen generiert werden können sehr wertvoll, vor allem, wenn gentechnisch veränderte Schweine Modelle und/oder langfristige experimentelle Probleme (z.B., Spätfolgen der chronische Krankheiten) sind Personen im Alter von2,6,7untersucht.

Im Rahmen einer Studie Leistung weitere Analysen, die nicht in der ersten experimentellen Design der Studie geplant hatte vielleicht später erweisen sich als relevant, z.B.Adresse, verschiedene Fragen, die bisher entdeckt, unerwartete Ergebnisse. Wenn geeignete Beispiele für solche zusätzliche Experimente nicht verfügbar sind, möglicherweise unverhältnismäßig hohe Kosten und zeitintensive Ausgaben erzeugen zusätzliche Schweine und Gewebeproben erforderlich. Um für solche Eventualitäten vorbereitet zu sein, gilt Generation der Biobank Sammlungen von konservierten Back-up Proben von verschiedenen Organen, Geweben oder Bio-Flüssigkeiten, quantitativ und qualitativ geeignet für ein breites Spektrum der nachfolgenden Analysen, eine wichtige Ansatz2,6,7. Porcines Tiermodell optimale Vorteile ableiten, die Verfügbarkeit von angemessenen Biobank Proben auch bietet die einmalige Möglichkeit zum Ausführen eines breiten Spektrums an verschiedenen Analysemethoden für identische Probematerialien auf einer Multi-Organ-Ebene in der gleichen einzelne Tiere, z. B.durch Verteilung der Proben an Wissenschaftler der verschiedenen Arbeitsgruppen organisiert in einem Forschung Netzwerk2,6,7. Darüber hinaus trägt die '' vorausschauende '' Probenahmestrategie in Biobanking auch zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere in einer Studie erforderlich. Die Vorteile von porcinen Modell Biobanking wurden vor kurzem in einem Multi-Organ, Multiomics Studie, Orgel nachgewiesen Übersprechen in einem genetisch veränderten porcinen Modell des langfristigen Diabetes Mellitus, mit Proben aus München MIDY Schwein Biobank 2.

Es gibt einige Anforderungen, die Biobank Proben in der Regel einhalten müssen, um die Zuverlässigkeit und die Interpretierbarkeit der Ergebnisse der anschließend durchgeführten Analysen zu etablieren. Die Proben reproduzierbar erzeugt werden müssen, und sie müssen repräsentativ, d.h.angemessen reflektiert interessierte morphologischen und molekularen Eigenschaften des Gewebes/Organs die Proben7 entnommen wurden. Geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysetypen werden muss die Proben in ausreichenden Mengen genommen und entsprechend den Anforderungen (einschließlich Zeit und Temperatur) der verschiedenen analytischen Methoden, einschließlich beschreibende verarbeitet werden histopathologische Untersuchungen, wie Cryohistology, Paraffin und Kunststoff Histologie, Immunhistochemie, in Situ Hybridisierung, Ultrastrukturforschung Elektron mikroskopische Analysen und klinische diagnostische Laboranalysen, sowie molekulare Analyse von DNA, RNA, Proteinen und Metaboliten.

Um die Bewertung einer Vielzahl deutliche quantitative morphologische Parameter wie Zahlen, Mengen, Längen oder Flächen unterschiedliche Gewebestrukturen durch quantitative stereologischen Analysen ermöglichen, randomisierte Abschnitt Flugzeuge von der histologische Proben der jeweiligen Organe/Gewebe7,8,9,10,11vorbereitet werden müssen. In quantitativen morphologische Studien, die präzise Bestimmung des Gesamtvolumens der Gewebe, Organ oder Fach Orgel, die Proben entnommen wurden (d. h., die Referenz-Raum) ist von entscheidender Bedeutung7,9 , 12 die absoluten Mengen der interessierten Parameter innerhalb der jeweiligen Organ, Gewebe oder Organismus zu berechnen. Schließlich wirkt Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Vorbereitung der histologischen Abschnitte bestimmt und Konto13berücksichtigt werden. Daher sind quantitative stereologischen Analysen, vor allem der archivierten Proben (feste Gewebeproben, eingebettete Gewebe Blöcke, histologische Abschnitte, etc.) aus früheren Studien manchmal stark eingeschränkt oder sogar unmöglich12, besonders wenn Volumetrie der jeweiligen Organe/Gewebe nicht durchgeführt wurde, wenn keine angemessene Stichproben Designs angewendet wurden, um repräsentative Proben zu rechtfertigen, wenn die Zahlen und Mengen zur Verfügung einzelner Samples nicht ausreichen, oder wenn die Verarbeitung der Proben ist unvereinbar mit der Schätzung des quantitativen morphologische Parameter von Interesse. Aufgrund der vielfältigen möglichen Einflussfaktoren die Eignung der Archiv-Mustermaterialien für Analysen deutliche quantitative morphologische Parameter kann nicht eindeutig beantwortet werden, aber die sorgfältige Beurteilung des Einzelfalls abhängig.

So wie die Lage, Größe, Anzahl, Verarbeitung, trimmen Richtung und Ausrichtung der Proben die Ergebnisse der nachfolgenden Analysen betreffen werden, diese Faktoren sind von großer Bedeutung und müssen in den Versuchsplan Studie betrachtet werden. Im Hinblick auf diese Aspekte und Besonderheiten der porcinen Anatomie, umfassende, detaillierte und umfangreiche Sampling-Richtlinien angepasst porcinen Tiermodelle vor kurzem eingerichtet wurden, bieten einen robuste Verweis auf standardisierte, reproduzierbare , und effiziente Erzeugung von redundanten, adäquat verarbeitet, hochwertige Proben aus mehr als 50 verschiedene porcinen Organen und Geweben6,7.

Die methodischen Beschreibungen und das video-Tutorial gezeigt in diesem Artikel bieten detaillierte, anschauliche, verständliche, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für praktische Leistung eine Vielzahl von Techniken für die Volumetrie, Beprobung von porcinen Gewebe und Organe und Verarbeitung von Gewebeproben nach verschiedenen nachgeschalteten Analysemethoden. Die vorgestellten Techniken gehören Methoden zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen und Dichte basierend auf den Prinzipien von Archimedes und Cavalieri9, einschließlich der Bestimmung der Abmessungen der dreidimensionalen Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit der Einbettung in verschiedenen Einbetten von Medien14 während der Verarbeitung für histologische Untersuchung, Anwendung von praktikablen volumengewichteten systematische Stichproben nähert, Verarbeitung von gesampelten Gewebemustern für verschiedene spätere Analysen7,8,9,15und Generation entsprechend orientiert und Beispiele für mögliche quantitative stereologischen Analysen7,8verarbeitet, 9,10,11. Neben ihrer Anwendung in porcinen Biobank Projekte eignen sich die Methoden in der Regel für alle Studien, die quantitative Histo-morphologische Eigenschaften der Organe/Gewebe. Darüber hinaus sind systematische Stichproben Entwürfe besonders vorteilhaft für die Erzeugung von repräsentativen Proben bei Experimenten mit molekulare Analysemethoden Fülle Änderungen, z. B., RNAs, Proteine oder Metaboliten in erkennen verschiedenen Organen und Geweben.

Die nächsten Absätze geben eine kurze Einführung in diese Methoden während ihrer praktischen Leistung im Abschnitt Protokoll beschrieben wird.

Bestimmung der Organgewebe/Volumen
Bestimmung der Orgel Gewichte und Volumina ist wichtig in mehrere experimentelle Einstellungen, wie diese Faktoren könnte darauf hindeuten Änderungen, die möglicherweise im Zusammenhang mit experimentell untersucht Faktoren von Interesse. Das Gesamtvolumen der ein Organ/Gewebe ist häufig auch erforderlich, um absolute quantitative Parameter (z.B., die gesamte Zellzahl), von stereologically geschätzten numerische Volumen Dichte (d. h., die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu berechnen des Gewebes)7,12. Neben Techniken mit komplexen technischen Ausstattung, wie die Computertomographie gibt es grundsätzlich drei praktische Methoden häufig verwendet, um das absolute Volumen eines Organs oder Gewebes bestimmen. Das Volumen eines Organs kann durch "direkte volumetrische Messung", nach dem Prinzip des Archimedes, d. h., Messung des Volumens von Wasser oder Kochsalzlösung verdrängt durch die Struktur als völlig untergetaucht ermittelt werden. Sind jedoch vergleichsweise große Schweine Organe, diese Ansätze unpraktisch und fehleranfällig Ungenauigkeit, da sie sehr große volumetrische/Messung Flaschen erfordern. Bequemer, kann die Lautstärke von einem Organ/Gewebe aus Gewicht und Dichte7,12,16, berechnet die effizient ermittelt werden können, mit dem "eintauchen-Methode"7,12 ,16 (Protokoll Schritt 1.1.). Organgewebe/Mengen können auch mit Volumetrie Konzepte basieren auf dem "Prinzip von Cavalieri" (1598 – 1647) geschätzt werden. In einfachen Worten das Prinzip von Cavalieri heißt es, wenn zwei Objekte in Ebenen parallel zu einer Grundebene geschnitten sind, und die Profile der Abschnitte durch die beiden Objekte an entsprechenden geschnitten Entfernungen von der Bodenebene haben die gleichen Bereiche, die zwei Objekte haben Sie das gleiche Volumen. So kann das Volumen der beliebig geformte Objekte als das Produkt der ihre Profilbereiche der Abschnitt in parallel, gleich weit entfernt Schnittebenen und der Abstand zwischen der Schnittebenen geschätzt werden. Dies ist verständlich mit die folgende Analogie: betrachten zwei Stapel, bestehend aus der gleichen Anzahl von identischen Münzen sind nebeneinander, einen Stapel mit den Münzen ordentlich übereinander nachgeben eine zylindrische Form des Stapels Münze, und die andere Stapel von Münzen mit außermittig positioniert Münzen (Abb. 3A). Die Formen der beiden Münze-Stacks sind, zwar unterschiedlich deren Volumen sind die gleichen, da die Bereiche der Münzen auf entsprechenden Ebenen der beiden Stapel (d.h., die Bereiche von Profilen von parallelen Abschnitten durchschneiden beide Münze-Stacks in gleichen Abständen von der den Boden) sind identisch. Schätzung der Mengen an Schweinen Organen und Geweben mit Cavalieri Prinzip7,12,15 ist in Schritt 1.2 beschrieben.

Bestimmung des Ausmaßes der Gewebe Schrumpfung im Zusammenhang mit histologische Einbettung
In den Analysen über mehrere quantitative morphologischen Parametern gemessen in histologische Gewebeschnitte wirkt Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung während der Verarbeitung für Histologie Gewebe ermittelt und berücksichtigt werden. Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen kann variabel sein und richtet sich sowohl auf das Gewebe, dessen Verarbeitung und Einbetten von mittleren8,13,17,18,19. Im Allgemeinen auftreten Einbettung im Zusammenhang mit Änderungen des Volumens der eine Gewebeprobe (d. h.vor allem Schrumpfung) in allen drei Dimensionen von Raum und daher, wirkt sich auf alle Maßparameter durch quantitative stereologischen Analysen8 geschätzt . Grundsätzlich kann das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen, ausgedrückt als die lineare Gewebe Schrumpfungsfaktor (fS), geschätzt werden, wie in Schritt 1.3 gezeigt. und für die Korrektur (Schrumpf-Sensitive) quantitative morphologische Parameter14verwendet.

Volumengewichteten systematische Stichproben der Organe/Gewebe
Für die Einrichtung einer Biobank-Sammlung von porcinen Orgel/Gewebeproben erwiesen volumengewichteten systematische Stichproben Ansätze wie in Schritt 2 beschriebenen sich praktische, zeitsparende und effiziente Techniken für Generation des Vertreters, Mehrzweck-Gewebe Proben7,8,9,15.

Generation von isotropen einheitliche zufälligen Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige für quantitative stereologischen Analysen
Biobank Gewebeproben müssen für eine Vielzahl von verschiedenen stereologischen quantitative Analysemethoden für die Schätzung von maximal Parameter geeignet, die nicht ohne einen entsprechend vorbereiteten Probe ermittelt werden konnte. Fast alle quantitativen stereologischen Parameter können bestimmt werden, mit "isotrop (parteilos) einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte"8,9. In IUR Abschnitten ist die dreidimensionale Ausrichtung der Schnittebene von der Gewebeprobe randomisiert. Kann dies durch Randomisierung der Position der Gewebeprobe relativ zur Position der Schnittebene, wie in der "Isector" Methode11 (Protokoll Schritt 3.1) oder durch Randomisierung der Ausrichtung der Schnittebene bezogen auf die Gewebeprobe, wie in der "Orientator" Methode10 (Protokoll Schritt 3.2). In Gewebeproben, wie Haut oder Schleimhaut Exemplar zeigt eine natürlicherweise, oder definierte und einwandfrei identifizierbare vertikale Achse, Vorbereitung der "einheitlichen zufällige (VUR) Vertikalschnitten" (Protokoll Schritt 3.3.) streng geschnittene innerhalb der Ebene von ihren vertikale Achse ist vorteilhaft8,20. Für eine vollständige Diskurs der die theoretischen Grundlagen der IUR/VUR Probenahme und eine umfassende Diskussion über nachgeschaltete quantitative stereologischen Potenzialanalysen wird der interessierte Leser zu den Lehrbüchern der quantitativen Stereologie im Leben bezeichnet. Wissenschaften8,9.

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Protocol

Alle beschriebene Methoden verwenden hier Gewebeproben von toten Tieren stammen und uneingeschränkt mit den deutschen gesetzlichen Bestimmungen des Tierschutzes.

(1) Volumetrie

  1. Untertauchen Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ (Abbildung 1 und Abbildung 2) 7 , 12 , 16
    1. Bereiten Sie Materialien: Skalpell Klingen, Papierhandtücher, feine Pinzette, standard-Labor-Waagen, Glas oder Plastikbecher, 0,9 % Kochsalzlösung und selbstgebauten Probenhalter (Abbildung 2A).
    2. Schneiden Sie ein Stück des Gewebes (maximale Größe: 2 x 2 x 2 cm3) aus dem Organ/Gewebe, speziell aus dem Orgel-Fach von Interesse. Kleinen Organe, wie die Hypophyse und die Zirbeldrüse sind gemessene Versicherungsjahren.
      Achtung: Sicherstellen Sie, dass die Größe der Stichprobe vor allem kleiner ist als der Innendurchmesser des Bechers (Schritt 1.1.5 ff.) und seine Füllhöhe komplett eintauchen der Probe zu ermöglichen, ohne Kontakt mit den inneren Wänden des Bechers in Schritt 1.1.7.
    3. Wischen Sie sorgfältig die Probe mit einem Papiertuch entfernen überschüssiges Blut/Gewebeflüssigkeit.
    4. Wägen Sie die Probe auf eine Präzisionswaage und nehmen Sie das Gewicht der Probe (mS). Bestimmen Sie das Gewicht der kleine Gewebeproben, die nächste mg (Abbildung 1A).
    5. Ein Becherglas gefüllt mit Raumtemperatur 0,9 % Kochsalzlösung auf die Waage. Nicht füllen Sie vollständig die Becher, um eine Überflutung der Gewebeprobe im anschließenden Schritt ohne überlaufen zu ermöglichen.
      Achtung: Verwenden Sie eine Becher Größe angebracht, die Größe und Gewicht der Gewebe Proben gemessen werden und der effektiven Messbereich der Skala. Für größere Probenmengen bis zu 2 x 2 x 2 cm-3, eine Becher-Größe von 50 – 100 mL eignet sich in Kombination mit einem Maßstab von etwa 100 mg messen, bis 500 g, während für kleine Proben verwenden Becher von 5 – 10 mL Volumen in Kombination mit Präzision Skalen mit Messbereiche von ca. 0,1 mg bis 20 g.
    6. Tauchen Sie die Probenhalter (d. h., eine steif genug Schleife von dünnen Draht oder etwas ähnliches, Abbildung 2A) in den Salinen zu einer markierten Stelle (Pfeile in Abb. 1 b, 2 bund Abbildung 2). Dann (Tara) die Anzeige der Waage auf Null zurückgesetzt.
    7. Befestigen Sie vorsichtig die Gewebeprobe, die Probenhalter und völlig Eintauchen der Probe in den Salinen, bis die markierte Position auf dem Probenhalter (Pfeile in Abb. 1 b, 2 bund Abbildung 2) erreicht ist.
      Achtung: Die getauchten Probe und der Probenhalter müssen Kontakt mit der inneren Wände oder den Boden des Bechers oder die Oberfläche der Salinen nicht haben.
    8. Der Probenhalter und der getauchten Probe in dieser Position halten, erfassen die Gewichtsanzeige auf der Skala (mL), bezogen auf das Gewicht der Kochsalzlösung durch die Gewebeprobe vertrieben wurden (Abbildung 1 C, 2 b, und Abbildung 2).
    9. Berechnen Sie das Volumen der Probe (VS) von mLund die Dichte der Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (20 ° C) (ρsaline = 1,0048 g/cm ³) als VS mL= / Ρsaline [g/g/cm ³] (Abbildung 1).
    10. Berechnen Sie die Dichte der Gewebeprobe (ρProbe) vom Gewicht (d.h., Masse) der Probe (mS) und seinem Volumen (VS): ρProbe = mS /VS[g/cm ³] (Abbildung 1).
    11. Wiederholen Sie für Organe gemessen in totodie Messung dreimal und berechnen Sie die durchschnittliche Orgel Dichte aus den einzelnen Messwerten. Führen Sie für große Organe/Gewebe wiederholte Messungen mit verschiedenen Proben des gleichen Organ/Gewebe/Organ-Fachs, und berechnen Sie die durchschnittliche Dichte von Einzelmessungen, entsprechend.
    12. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Fachs Organ/Gewebe/Organ von seinem Gewicht und Dichte (Abbildung 1).
  2. Anwendung des Cavalieri-Methode zur Bestimmung des porcinen Orgel Bände 7
    1. Bereiten Sie Materialien: Lineal, Bremssattel, Messer, Scheren, Pinzetten, wasserfesten Stift, Kunststoff-Folien, Scanner, Foto-Kamera und Kreuz Gitter auf Kunststoff-Folien gedruckt.
    2. Legen Sie das gesamte Organ/Gewebe auf eine glatte Oberfläche (schneiden Base) und Messen Sie die Länge (l) der Orgel entlang seiner Längsachse (Abb. 3 b, Abb. 5A).
    3. Schneiden Sie die komplette Organgewebe in äquidistanten parallele Scheiben orthogonal zur längs-Orgel Achse (Abbildung 3, Abbildung 5 b). Wählen Sie eine Distanz d zwischen zwei Abschnitten (d.h. die Stationspunkte Intervall/Schnittdicke, in der Regel ca. 1 cm) klein genug, um eine ausreichende Anzahl von Gewebe/Organ Platten zu erhalten. Nach dem Zufallsprinzip positionieren des ersten Abschnitts innerhalb einer Entfernung zwischen 0 und strukturierendes Abstand vom Rand der Orgel. Beurteilen Sie beim Schneiden visuell die Position und Ausrichtung der einzelnen Schnittebene, etwa parallel Organgewebe Platten von etwa gleichmäßiger Dicke zu erhalten.
      Hinweis: Die erforderliche Anzahl von Gewebe/Organ Platten richtet sich nach der Form und der Größe der untersuchten Organ/Gewebe. Wenn kleine Organe oder Proben in dünne Platten von ≤5 mm geschnitten werden müssen, die Proben in Agar vor dem Schneiden einbetten (siehe Punkt 1.3.3.) und ein technisches Gerät zum Schneiden der Agar eingebettete Probe verwenden. Empirisch empfehlenswert Stationspunkte Intervalle für die meisten Schweine Organe und Gewebe, sowie Beispiele für slicing-Geräte sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7angegeben.
    4. Legen Sie alle Organgewebe/Platten auf der gleichen Fläche nach unten auf die schneiden-Basis (d. h., konsequent auf entweder der rechten oder der linken Schnittebene von jeder Orgel Platte, Abbildung 3D, Abbildung 5) und zählen Sie die Platten (n).
    5. Erhalten Sie Schnittprofile der Gewebe-Platten, indem eine der folgenden Vorgehensweisen:
      1. Legen Sie vorsichtig die Gewebe-Platten auf entsprechend gekennzeichneten Kunststoff-Folien, unter Beibehaltung der Ausrichtung ihrer oberen und unteren Abschnitt Oberflächen. Zeichnen Sie die Umrisse der Gewebe-Platten auf den Kunststoff Folien mit einem wasserfesten Stift (Abbildung 3E1-2).
      2. Nehmen Sie fotografische Bilder von Gewebe-Platten, halten Sie die Kamera senkrecht über den Abschnitt Oberflächen (Abbildung 3F). Legen Sie für die Kalibrierung eine Größe Lineal neben den Gewebe-Platten.
      3. Scannen Sie die Gewebe-Platten auf einen Flachbett-Scanner, unter Beibehaltung der Ausrichtung ihrer oberen und unteren Abschnitt Oberflächen (Abbildung 3). Legen Sie für die Kalibrierung eine Größe Lineal neben den Gewebe-Platten.
    6. Messen Sie die Bereiche der Profile (vektorisierte, fotografierte oder gescannten) Abschnitt alle Gewebe-Platten durch eine der folgenden Vorgehensweisen:
      1. Überlagern Sie oder überlagern Sie die vektorisierte Orgel Platte Profile mit einem entsprechend dimensionierte, kalibrierten Raster gleichmäßig verteilte Kreuze auf einen Kunststoff Transparenz und zählen alle Kreuze schlagen den Profilbereich (Abbildung 3E3-4; im Vergleich zu gedruckt Abbildung 5). Berechnen Sie die Abschnitt Profil Fläche von jeder Orgel-Platte durch Multiplikation der Anzahl der Kreuze schlagen den Profilbereich durch die Fläche, die ein Kreuz entspricht.
        Hinweis: Schätzungen um präzise genug Volumen zu erhalten, wählen Sie ein Kreuzraster mit einer ausreichend geringen Abstand zwischen angrenzenden Kreuze, damit ein Durchschnitt von mindestens 100 kreuzt trifft die Abschnitt Oberflächen der Platten ein Organ in jedem untersuchten Fall der Studie . Empirisch empfehlenswert Kreuzraster Größen für die meisten Schweine Organe und Gewebe sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7angegeben.
      2. Messen Sie die Bereiche der Gewebe-Platten in den digitalen Bildern der Fotos/Scans mit geeigneten handelsüblichen oder Freeware Morphometrie Soft- und Hardware-Applikationen (Abbildung 3 H), z. B. eine kommerzielle Bild Analyse System21, oder ImageJ22.
        Achtung: Beachten Sie, dass man Gewebe Platte (entweder der erste oder der letzte) befindet sich auf dem Scanner bzw. auf seine natürliche Oberfläche, ruht, steht vor der Kamera mit seiner natürlichen Oberfläche. Daher das gescannte Bild, das Foto von dieser Platte, wird eine Abschnitt Oberfläche nicht angezeigt. Daher ist kein Abschnitt Bereich Profil im gescannten Bild/Foto Bild von diesem Gewebe-Platte (Abbildung 3I) gemessen. Auch Anmerkung über Projektion präsentieren in gescannte Bilder und Fotos von Organgewebe/Platten, d. h., messen nur die Bereiche der tatsächlichen Abschnitt Profile, aber nicht des Gewebes im Bild liegende Abschnitt Plattenoberfläche (Abbildung 12 G-H).
    7. Berechnen Sie das Volumen der geschätzten Orgel als Produkt aus der Summe aller entsprechenden Abschnitt Profil Flächen alle Gewebe-Platten pro Fall (d.h., konsequent von rechts oder links, bzw. die oberen oder unteren Abschnitt Oberfläche von jedem Organ Platte und die durchschnittliche Dicke der Platten (d.h. der Quotient aus der gemessenen Länge der vertikalen Orgel-Achse (l) und die Anzahl der Platten)15.
  3. Bestimmung über das Ausmaß der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie
    1. Materialien vorbereiten: Mikrotom Blades, Pinzetten, Agar, metallischen Gussformen, digitale Scanner und Größe Herrscher (z.B. Millimeterpapier).
    2. Schneiden Sie eine frische, Abschnitt Fläche aus einem festen Gewebeprobe.
      Hinweis: Wenn Proben von leicht mit verformbaren (weich) Gewebe (Fettgewebe, gallertartigen Gewebe), Einbetten der festen Gewebeprobe in Agar vor Stationspunkte (Abb. 4A).
    3. Probe in Agar einbetten:
      1. Standard-Agar Pulver für Mikrobiologie Kulturmedium mit einem entsprechenden Volumen des Wassers verwendet (etwa 0,5 – 1 g Agar/10 mL Wasser) in ein Becherglas. Rühren Sie die Mischung und erhitzen in der Mikrowelle bei 700 W bis das Kochen für 3 – 5 s. umrühren und zum Kochen wieder für 3 – 5 s bringen.
      2. Optional, um den Kontrast des Nährbodens um die Gewebeprobe zu erhöhen, färben die flüssigen Agar, z.B.mit schwarzer Tinte (1 mL Tinte zu 10 mL heißen flüssigen Agar hinzufügen und kräftig rühren).
      3. Gießen Sie das heißen Agar in eine Gussform (z.B. eine Metallform verwendet für Paraffin einbetten, Abb. 10A-D) und Tauchen Sie die festen Gewebeprobe im warmen Agar. Lassen Sie das Agar bis zum Erstarren abkühlen, entfernen Sie den Schimmel und schneiden Sie den Agar-Block mit dem eingebetteten Gewebe mit einem Mikrotom oder Rasierklinge.
        Achtung: Beim Umgang mit heißen flüssigen Agar, tragen Sie Schutzbrille und Handschuhe. Gewebeproben der Prozess behoben in Formaldehyd-Lösung unter dem Auspuff Haube und Schutzbrille und Labor Handschuhe tragen.
    4. Legen Sie die Probe mit seiner Sektion Oberfläche nach unten auf einen Flachbett-Scanner zusammen mit einem Lineal Größe und Scannen Sie die Abschnitt-Oberfläche (Abb. 4AB).
    5. Ermitteln Sie Bereich der Oberfläche des festen Gewebeprobe (f) in der digitalen Scan, unter Verwendung eines in Schritt 1.2.6 (Abbildung 4 b) beschriebenen Techniken Abschnitt.
    6. Einbetten der Probenmaterials in Kunststoff einbetten Mittel, wie Epoxy (z.B.Verfahrensweisen) oder Glycolmethacrylate/Methylmethacrylate (GMA/MMA)23,24,25 () folgende Standardprotokolle23, Abbildung 4). Sicherstellen Sie, dass die Abschnitt Oberfläche der festen Probe gescannt im vorherigen Schritt (1.3.4) in Kunststoff eingebettet Probe erhalten bleibt.
      Hinweis: Um die Ausrichtung der Abschnitt Oberfläche der Probe während der Verarbeitung der Probe zu erhalten, konsequent legen Sie die Probe mit der vorgesehenen Abschnitt Oberfläche nach unten in die einbettende Kassette oder die Gussform, oder markieren Sie den gewünschten Abschnitt Oberfläche (oder der gegenüberliegenden Seite der Probe) mit Tinte.
    7. Schneiden einen histologischen Abschnitt aus dem Kunststoff Block entspricht der Originaloberfläche Abschnitt der festen Gewebeprobe (Schritt 1.3.2) mit ein Mikrotom (Abbildung 4), Abschnitt auf einen Glasobjektträger (Abb. 4) montieren und färben es routinemäßig) z.B., Hämatoxylin und Eosin färben, H & E)24,25.
      Achtung: Um eine histologische Abschnitt ungefähr in der gleichen Ebene wie die Originaloberfläche Abschnitt der festen Gewebeprobe zu erhalten, sorgfältig ausrichten der Kunststoffblock in die Halterung des Mikrotom vor dem Schneiden.
    8. Legen Sie die Folie mit dem verschmutzten Bereich nach unten auf einen Flachbett-Scanner zusammen mit einem Lineal Größe und Scannen Sie den Abschnitt (Abb. 4E).
    9. Ermitteln Sie die Fläche des Abschnitts Kunststoff eingebettet Gewebeprobe (A-e) in der digitalen Scan, unter Verwendung eines in Schritt 1.2.6 (Abb. 4F) beschriebenen Techniken.
    10. Berechnen Sie die durchschnittliche Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung (für die jeweiligen Gewebe und Einbetten von Medium) aus den gemessenen Bereichen entsprechende Schnittprofile von Gewebeproben vor und nach dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium. Die lineare Schrumpfung Faktor fs wird berechnet als die Quadratwurzel aus dem Quotienten aus den Bereichen der Abschnitt Profile von n Gewebeproben nach dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium (A-e) und den Bereichen der entsprechenden Abschnitt Profile von der gleichen Gewebeproben vor dem Einbetten in Kunststoff einbetten Medium (f) (Abbildung 4)14.

(2) volumengewichteten systematische Stichproben durch Punkt zählen und Verarbeitung von Gewebe Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analyse7

  1. Bereiten Sie Materialien: Lineal, Bremssattel, Messer, Scheren, Pinzetten, wasserfesten Stift Punkt/Kreuz Gitter auf Kunststoff-Folien und zufällige Anzahl Tabellen gedruckt.
    Hinweis: Kopiervorlagen für grenzüberschreitende Netze (5 – 60 mm) werden in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7bereitgestellt.
  2. Das Organ/Gewebe auf eine glatte Oberfläche (schneiden Base) und Messen Sie die Länge (l) der Orgel entlang seiner Längsachse (Abbildung 5A, Abbildung 6A).
  3. Schneiden Sie die komplette Organgewebe in äquidistanten parallele Scheiben orthogonal zu seiner Längsachse (Abb. 5 b). Wählen Sie eine Distanz d zwischen zwei Abschnitten (d. h., die Stationspunkte Intervall/Schnittdicke, in der Regel ca. 1 cm) klein genug, um eine ausreichende Anzahl von Gewebe/Organ Scheiben zu erhalten. Nach dem Zufallsprinzip positionieren des ersten Abschnitts innerhalb einer Entfernung zwischen 0 und strukturierendes Abstand vom Rand der Orgel. Beurteilen Sie beim Schneiden visuell die Position und Ausrichtung der einzelnen Schnittebene, annähernd parallel Organgewebe Platten von etwa gleichmäßiger Dicke zu erhalten.
    Hinweis: Die erforderliche Anzahl von Gewebe/Organ Platten richtet sich nach der Größe der untersuchten Organ/Gewebe und die Zahl der aufgenommenen Gewebe Standorte. Wenn kleine Organe oder Proben in dünne Platten von ≤5 mm geschnitten werden müssen, die Proben in Agar vor dem Schneiden einbetten (siehe Punkt 1.3.3.) und technische Geräte zum Schneiden der Agar eingebettete Probe verwenden. Empirisch empfehlenswert Stationspunkte Intervalle für die meisten Schweine Organe und Gewebe, sowie Beispiele für das Schneiden von Geräten sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7angegeben.
  4. Legen Sie alle Organgewebe/Platten auf der gleichen Fläche nach unten auf die schneiden-Basis (Abb. 6 b).
  5. Überlagerung die Gewebe-Platten mit einer entsprechend großen Kreuzraster auf ein Kunststoff transparent gedruckt, indem man die Regionen in äußerster links über einen beliebigen Punkt aus dem Gewebe (Abbildung 5-D, Abbildung 6 b) oberen Kreuz des Rasters.
    Hinweis: Wählen Sie ein Kreuzraster mit einer ausreichend geringen Abstand zwischen angrenzenden Kreuze, so dass jeweils untersuchten der Studie mindestens doppelt so viele Kreuze Abschnitt Fläche(n) Gewebe Fach schlagen zu untersuchenden, als die Anzahl der Samples, die zu Dieses Fach Gewebe entnommen Sie werden. Empirisch empfehlenswert Kreuzraster Größen für die meisten Schweine Organe und Gewebe sind in das ergänzende Material der "Sampling Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7angegeben.
  6. Markieren Sie und zählen Sie alle Kreuze schlagen das Gewebe (bzw. das Gewebe Sub Fach zu untersuchenden). Wenden Sie einen einheitlichen Modus des Zählens und Nummerierung der Kreuze schlagen das Gewebe Fach zu untersuchenden in alle Gewebe-Platten, z. B.durch fortlaufende Nummerierung der jeweiligen Kreuze in jeder Zeile für Zeile von links nach rechts und von konsequent an von oben nach unten, oder, z. B.durch eine Nummerierung der Kreuze in einem Gewebe Platte nacheinander im Uhrzeigersinn, beginnend mit dem Kreuz am nächsten an die 12:00 Position, wie in Abbildung 5Eexemplarisch dargestellt.
  7. Teilen Sie die Anzahl der Kreuze schlagen das Gewebe/Gewebe Fach zu Stichprobe (n) durch die Anzahl der Samples generiert werden, um das systematische Abtastintervall (i) zu erhalten.
  8. Bestimmen Sie die erste Probenahme-Position durch eine zufällige Zahl X im Intervall zwischen 1 und ichdie Wahl. Hierzu verwenden Sie eine Zufallszahl Tabelle. Markieren Sie die erste Probenahme-Position (X) und jeden nächsten X + i, X + 2ich, X + 3i, etc., Kreuz schlagen das Gewebe/Gewebe-Fach auf die Kunststoff Transparenz abgetastet werden verwenden einen wasserfesten Stift (Abb. 5F).
    Hinweis: Zufällige Anzahl Tabellen können bequem und schnell generiert werden mit Hilfe eines Online-Zufallszahlen-Generators.
  9. Markieren Sie das Gewebe entsprechend den markierten Standorten durch leicht anheben der Kunststoff Transparenz und platzieren ein kleines Stück Papier sauber, leere Konfetti auf der Oberfläche der Gewebe-Platte mit der Pinzette (Abbildung 5, Abbildung 6E Kreuze ).
  10. Verbrauchsteuern Sie Probe des Gewebes der beprobten Standorte (Abbildung 5 H, Abb. 6F, Abb. 7A) und weiter unterteilen sie für verschiedene Arten von nachfolgenden Analysen (Abbildung 6, Abbildung 7A-B), wie in angegeben Tabelle 1.
  11. Nach der Probenahme, die Kunststoff Folien mit warmem Wasser und Seife, trocknen, reinigen und wiederverwenden.

3. Generation der isotropen einheitliche zufällige (IUR) Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige (VUR) für Quantitative stereologischen Analysen

  1. "Isector" Technik
    1. Materialien vorbereiten: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, sphärische Gussformen (z.B.casting Formen für Pralinen, die von Konditor Zulieferanten bezogen werden können), Foldback Klammern und Zange.
    2. Legen Sie einen ausreichend großen Stück (1 x 1 x 1 cm3) feste, systematisch nach dem Zufallsprinzip beprobt Gewebe in einer kugelförmigen Gussform, halten Sie zusammen mit Foldback-Klammern, und füllen Sie den Schimmel mit warmen flüssigen Agar (Abb. 8A-E).
    3. Entfernen Sie nach Erstarrung des Agar Agar-Kugel (Abb. 8F) aus der Gussform.
    4. Die Agar-Kugel Rollen mit der eingebetteten Gewebeprobe über den Tisch zu stoppen, und an eine zufällige Position Abschnitt.
      Hinweis: Die resultierende Schnittebene ist ein IUR Abschnitt (Abbildung 8F-G).
    5. Fahren Sie mit der Gewebeprobe einbetten in Kunstharz wie GMA/MMA, Aufrechterhaltung der Ausrichtung des Abschnitts IUR Flugzeug (siehe 1.3.5).
  2. "Orientator" Technik
    1. Bereiten Sie die Materialien: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, Pinzetten, zufällige Zahl Tabelle(n) Drucke gleichwinklig und Kosinus gewichtet Kreise.
      Hinweis: In früheren Publikationen8,26angeboten Kopiervorlagen der Kreise.
    2. Legen Sie die Probe fixierte Gewebe (oder Agar eingebettet fixierte Gewebe) auf einen Druck von einem gleichwinklig Kreis mit einer Kante parallel zur 0-180 ° Richtung (Abbildung 9A, Abb. 10E).
    3. Bestimmen Sie einen zufälligen Winkel mithilfe der zufällige Zahl Tabelle. Finden Sie die entsprechenden Markierungen auf der Skala des gleichwinklig Kreises, die die Probe auf ruht. Mit diesen Markierungen Schnittfläche ein durch die Probe (oder rund um die eingebetteten Gewebeprobe Agar), mit der Schnittebene ausgerichtet parallel zur Richtung des zufälligen Winkels an der Skala der gleichwinklig Kreis und senkrecht zur der Oberfläche der Probe (Abbildung 9 b-C, Abbildung 10F) ruhen.
    4. Platzieren Sie den Gewebe-Block mit der Sektion Oberfläche erzeugt im vorherigen Schritt vor Nachteil auf einem Kreis Kosinus gewichtet mit der Kante der ruhenden Oberfläche platziert parallel zur Richtung 1: 1 (Abbildung 9, Abbildung 10 H).
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.3 und schneiden Sie einen neuen Abschnitt durch die Probe in einem zufälligen Winkel über die zufällige Zahl Tabelle (Abbildung 9E-F, Abbildung 10I-J) ermittelt.
      Hinweis: Die resultierende Schnittebene ist ein IUR-Abschnitt.
    6. Gegebenenfalls ermitteln Sie die Fläche des Profils IUR Abschnitt der festen Gewebeprobe zur Bestimmung der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung (Abbildung 9-J) zu, wie unter Punkt 1.3 beschrieben und fahren Sie mit der Gewebeprobe aus Kunststoff einbetten Harz wie GMA/MMA.
  3. Generation von vertikalen einheitliche zufällige (VUR) Abschnitte
    1. Materialien vorbereiten: Razor oder Mikrotom klingen, Agar, Zange, zufällige Zahl Tabelle(n) und Drucke von gleichwinklig Kreisen.
      Hinweis: In früheren Publikationen8,26angeboten Kopiervorlagen der Kreise.
    2. Definieren Sie eine vertikale Achse innerhalb der festen Gewebeprobe, die immer während der nachfolgenden Schritte im Abschnitt Beispiel erkennbar ist.
      Hinweis: In der Regel wird die Achse senkrecht auf die natürliche Oberfläche der Gewebeprobe der vertikalen Achse gewählt.
    3. Gegebenenfalls Betten Sie die Probe in Agar (Abbildung 11 b ein).
      Hinweis: Agar-Einbettung vor VUR - oder IUR-Schneiden der festen Probe ist im allgemeinen empfehlenswert für kleine, dünne, zerbrechliche oder weichen Proben. Auch Agar-Einbetten der Proben erleichtern die Positionierung der VUR geschnittenen Probe während der nachfolgenden Einbettung der Probe in Kunstharz Medium.
    4. Legen Sie die Probe auf einen Druck von einem gleichwinklig Kreis mit der vertikalen Achse, die orthogonal zur Ebene der Tabelle/Papier-Tabelle (Abbildung 11) ausgerichtet.
    5. Schneiden Sie die Probe in einem zufälligen Winkel (bestimmt mit einer zufälligen Nummer Tabelle) mit die Schnittebene orthogonalen an den Tisch und parallel zur vertikalen Achse eine VUR Schnittebene (Abbildung 11) erhalten.
    6. Ggf. bestimmen Sie den Bereich des Profils IUR Abschnitt der festen Gewebeprobe zur Bestimmung der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung wie in Schritt 1.3 (vgl. Abbildung 9-J) beschrieben und fahren Sie mit der Gewebeprobe in einbetten Kunststoff-Harz wie GMA/MMA.

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Representative Results

Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/organ

Abbildung 12A -B zeigt die repräsentative Bestimmung der Dichte und Volumen einer porcinen Niere mit der Überflutung Technik im Schritt 1.1 (Abbildung 1, Abbildung 2) beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Dichtemessungen zusätzliche porcinen Organe und Gewebe sind in Tabelle 2. Eine umfassendere Liste der Referenz dichten vielfältige porcinen Gewebe und Organe entnehmen Sie bitte der "Sampling-Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7. Die Gültigkeit des Gewebes Dichte Messwerte erhalten mit der Überflutung-Methode kann durch wiederholte Messungen der gleichen Probe und unabhängige Exemplare geschätzt werden. Die meisten Schweine Gewebe Anzeigewerte Dichte etwas höher als Wasser (ρWasser ≈ 1,0), wohingegen Gewebe schwimmen in Kochsalzlösung (Fettgewebe, Lungengewebe) dichten anzeigen < 1.0.

Cavalieri Methode zur Bestimmung der Orgel Bände

Abbildung 12 -F zeigt die repräsentative Bestimmung des Volumens der Schweine Nieren (die selben Organ wie dargestellt in Abbildung 12A-B). Die Bereiche der Abschnitt Oberflächen der Orgel Platten wurden durch das Punkt-zählen, mit einer überlagerten Kreuzraster auf ein Kunststoff transparent gedruckt sowie planimetrischen Messung der Abschnitt Bereiche der Orgel Platten in einem gescannten Bild der Platten (gebührenpflichtig bestimmt. Aufmerksamkeit auf übermäßige Projektion des Gewebes hinter den Platten Abschnitt Oberflächen, Abbildung 12 G-H). Die Genauigkeit der Organgewebe/Volumen, die Daten, die von der Leistung des Cavalieri-Ansatzes (Schritt 1.2, Abbildung 3) an die jeweilige Lautstärke im Vergleich geschätzt werden können berechnet aus dem Gewicht und Dichte der Organgewebe. Die Bände der Niere untersucht in Abbildung 12 durch das Untertauchen-Methode bestimmt und Cavalieri Methode(n) unterscheiden sich um weniger als 1 % von einander. Als Maß für die Genauigkeit der Cavalieri Volumen schätzt kann seine Koeffizienten des Fehlers (CE) als beschrieben früheren15berechnet werden.

Bestimmung der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie

Repräsentative Ergebnisse über das Ausmaß der Gewebe schrumpfen im Zusammenhang mit Einbettung von porcinen Gewebeproben (kortikale renal Gewebe) in Kunststoffen (GMA/MMA oder Epoxy) für quantitative histomorphologische Untersuchung sind in Tabelle 2 (zuvor dargestellt. unveröffentlichte Daten). Die lineare Schrumpfung Faktoren, die in Tabelle 2 angegebenen waren bestimmt, wie in Schritt 1.3 (Abbildung 4) beschrieben. Sie beziehen sich auf eine dreidimensionale Volumenreduktion von 29 % für die Einbettung von GMA/MMA und 22 % für Epoxy Einbettung von porcinen kortikalen renal Gewebe. Abbildung 13 zeigt repräsentative Beispiele für angemessen und ungenügend vorbereiteten Proben von Agar eingebettet, Formalin fixiert Fettgewebe zur Messung der Probe Abschnitt Fläche vor dem Einbetten von Kunststoff.

Volumengewichteten systematische Stichproben durch Punkt zählen und Verarbeitung von Gewebe Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analyse

Die "speziellen" und Punkt-zählen"Technik für volumengewichteten systematische Zufallsstichprobe von parenchymatösen Organen (Schritt 2, Abbildung 5, Bild 6, Bild 7) stellt eine bewährte, robuste Methode zur Erzeugung von Vertreter Proben für mehrere nachfolgende Arten von Analysen2,7. Repräsentative Ergebnisse der Generation systematisch zufällig ausgewählte, hochredundante Biobank Probe von verschiedenen Schweine-Organen und Geweben, mit nachfolgenden differentielle Verarbeitung von den ausgeschnittenen Gewebeproben für mehrere verschiedene flussabwärts mit der Sampling-Technik in Schritt 2 (Abbildung 5, Abbildung 7und exemplarisch demonstriert in Abbildung 6) beschriebenen Analysemethoden bisher veröffentlichten2. Für die Generation der Biobank Proben des Lebergewebes in einem vorherigen porcinen Biobank Studie2, z. B. Schweine Leber wurden komplett in ca. 20 Platten von 2-3 cm dicke, überlagert mit geschnitten ein mit einem 3 cm Raster, überqueren, wie in Schritt beschrieben 2. und 16. Gewebe Standorte von ca. 2 x 2 x 2 cm3 wurden systematisch nach dem Zufallsprinzip beprobt und herausgeschnitten, in jedem Fall. Aus jedem der ausgeschnittenen Proben fünf Teilstichproben wurden anschließend für molekulare Analysen (bei-80 ° C eingefroren) der beprobten Standorte erzeugt, eine Teilstichprobe für Cryohistology, eine Teilstichprobe wurde behoben in Methacarn Lösung, und in Formaldehyd-Lösung für nachfolgende Paraffin einbetten und histologischen- und Immunhistochemische Untersuchung. Die Generation der 74 verschiedenen Proben pro Fall (bis Einfrieren oder Übertragung der Proben in Fixierung Lösung) wurde innerhalb von ca. 20 min auf durchschnittlich2erreicht. Der Praktikabilität/Erfolg der beschriebenen Probenahme und Unterabtastung Ansatz kann durch Beurteilung der Qualität der erzeugten Proben geschätzt werden (d.h., Qualität der RNS oder Protein isoliert, Erhaltung der die histomorphologische und Ultrastrukturforschung Eigenschaften von Gewebeproben, deren Eignung für Immunohistologische Analysen, etc.)2

Generation von isotropen einheitliche zufällige (IUR) Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige (VUR) für Quantitative stereologischen Analysen

Die Techniken gezeigt für eine nach vorne orientierte Generation von isotropen einheitliche zufällige (IUR) Abschnitten und VUR von Schweinen (Biobank) Gewebeproben (Protokoll Schritt 3, Abbildung 8, Bild 9, Bild 10, Abbildung 11), so dass für die Prüfung der meisten quantitativen stereologischen Parameter, kann schnell erreicht werden, mit etwas Übung und ohne angemessene Schwierigkeiten und Fehlerquellen. Daher ist die Generation der IUR-Proben dargestellt in Abbildung 9 (Isector Technik) und Abbildung 10 (Orientator Technik) absolut repräsentativ für diese Methode(n).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der "untertauchen Technik" zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ. (A) Maßeinheit für das Gewicht der Probe (z.B.Masse, mS). (B) Waage tariert, das Gewicht der Becher gefüllt mit 0,9 % Kochsalzlösung von 20 ° C und einem Probenhalter untergetaucht in den Salinen an eine definierte, markierten Position. (C) vollständige Eintauchen der Probe in die markierte Position der Probenhalter ohne Kontakt zu den Innenwänden oder den Boden des Bechers. Die Gewichtsanzeige im Balance ist das Gewicht des Volumens der Kochsalzlösung versetzt von der Probe). Die Dichte der Probe wird berechnet, wie angegeben (hier: ρProbe = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1,141 g/cm ³). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: "Eintauchen-Technik" zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ. (A) verschiedene Probenhalter aus dünnem Draht gebaut. Von links nach rechts: eine Schleife von dünnen Draht Faden durch eine dünne Injektionskanüle, eine spiralförmige Korb aus Draht, klein und zerbrechlich Exemplare zu halten und eine einfache Schlinge des dünnen Draht. Pfeile in der A-C zeigen die Positionen, auf die der Probenhalter in Kochsalzlösung getaucht sind. (B, C) Positionierung der Probenhalter beim Eintauchen der Probe in Kochsalzlösung (Vergleiche Abbildung 1 C). (B) komplette porcinen Hypophyse in einer Korb-förmigen Probenhalter platziert. (C) Stichprobe von porcinen Myokard. Beachten Sie das komplette Eintauchen der Proben in Kochsalzlösung ohne die Wände oder den Boden des Bechers zu kontaktieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Anwendung des Cavalieri-Methode zur Bestimmung des porcinen Orgel Bände. (A) Münze Stapeln Beispiel für das Verständnis des Cavalieri-Prinzips. Details finden Sie in der Einführung. (B-H) Schematische Demonstration der Volumen Schätzung einer Niere Perfusion fixiert. (B) Messung der Länge (l) der Niere entlang seiner Längsachse. (C) Schneiden der komplette Orgel in n gleich dick (d) parallele Scheiben senkrecht zur Achse längs Orgel. (D) Orgel Platten platziert auf der gleichen Fläche nach unten. Beachten Sie, dass die erste Bramme (rechts) Gewebe auf seine natürliche Oberfläche, d.h.platziert wird, verfügt nicht über einen Abschnitt Oberfläche. (E-H) Verschiedene Ansätze festzustellen, die Abschnitt Flächen der Gewebe-Platten. (E) Tracing im Überblick jede Orgel-Platte mit einem wasserfesten Stift auf einen Kunststoff Transparenz Überlagerung der skizzierten Orgel Platte Profile mit einer entsprechend großen Kreuz Raster gedruckt auf einer Kunststoff Transparenz kalibriert Zählung der Kreuze schlagen die Profilbereich. Der Orgel Platte Abschnitt Profilbereich errechnet sich aus der Anzahl der Kreuze schlagen den Abschnitt Profilbereich und die Fläche, die ein Kreuz entspricht. (F,G) Bestimmung der Abschnitt Bereiche der Orgel Platten in Foto Aufnahmen im Hochformat zu den Abschnitt Flächen (F) oder in gescannte Bilder der Gewebe-Platten (G), mit Machthabern zur Kalibrierung. (H) Bestimmung der Abschnitt Bereiche der Gewebe-Platten in den digitalen Bildern der Fotos/Scans mit entsprechenden Morphometrie-Software-Anwendungen. (ich) Berechnung der geschätzten Volumen von der Orgel als Produkt aus der kumulativen Bereich der entsprechende Abschnitt Oberflächen alle Orgel-Platten, multipliziert mit der mittleren Dicke des Organs Platten15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Bestimmung der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie. (A) Schneiden von einer frischen, Flugzeug-Abschnitt Oberfläche aus einer festen Gewebeprobe (Stabilisierung der Form leicht verformbare (Weichteile) wie Fettgewebe oder Lunge Gewebe durch die Einbettung in Agar vor-Schnitt). Der Abschnitt Oberfläche der Probe mit einem Lineal Größe scannen. (B) planimetrische Bestimmung des Bereichs der Abschnitt Oberfläche der festen Gewebeprobe (A-f). (C) Routine Einbettung der Probe in Kunststoff einbetten Medium. (D) Vorbereitung der histologischen Teil der Kunststoffblock mit Erhaltung der Schnittebene der Probe. Montage des Abschnitts auf einem Objektträger und Routine Färbung der Folie. (E) Scannen der Folie mit einem Lineal Größe. (F) planimetrische Bestimmung des Gebiets des Abschnitts der Kunststoff eingebettete Probe (A-e). (G) Berechnung des Umfangs der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen als Quotient aus der gemessenen Bereichen der entsprechende Abschnitt Profile von Gewebeproben vor und nach dem Einbetten in Kunststoff einbetten mittlere14. Bilder auf der rechten Seite zeigen die Abschnitt-Oberfläche einer Formaldehyd-feste Stichprobe von Fettgewebe eingebettet in Tusche geschwärzt Agar vor dem Einbetten in Kunstharz (oben) und die entsprechende Streckenprofil (HE-Färbung) der GMA/MMA-embedded Probe (unten). Skalieren von Balken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Schematische Darstellung der volumengewichtete systematische Zufallsstichprobe. Systematische Stichproben von sechs Standorten der Gewebe innerhalb der Nierenrinde einer Perfusion-feste Niere im dargestellten Beispiel. (A) Messung der Länge (l) der Niere entlang seiner Längsachse. (B) komplette Schnitt des gesamten Organs in gleich Dicke (d) parallele Scheiben senkrecht zur Achse längs Orgel. (C) Organgewebe/Platten platziert auf der gleichen (d. h., entweder rechts oder links) Oberfläche nach unten. (D) Überlagerung der Gewebe-Platten mit einer entsprechend großen Kreuzraster auf ein Kunststoff transparent gedruckt. Die Regionen in äußerster links oberen Kreuz des Rasters wird über einen beliebigen Punkt außerhalb des Gewebes (gekennzeichnet durch einen blauen Punkt, ) gesetzt. (E) zählen und Nummerierung der alle Kreuze schlagen die Nierenrinde. Im vorliegenden Beispiel sind die Kreuze schlagen der Nierenrinde in einer Niere Platte nach der anderen (von links nach rechts), in jeder Platte Verfahren im Uhrzeigersinn, beginnend mit dem Kreuz am nächsten an die 12:00 Position durchnummeriert. Hier treffen 36 Kreuze der Nierenrinde. Sechs Probenahme Positionen sollen beprobt werden. Also jeder sechste Position wo ein Kreuz das Gewebe trifft abgetastet (36/6 = 6). (F) im vorliegenden Beispiel wird die Position des vierten überqueren (N ° 4) trifft der Nierenrinde ist zufällig gewählt, als die erste Probenahme-Position. Alle folgenden sechsten cross trifft der Nierenrinde markiert ist auf die Kunststoff-Transparenz mit einem wasserfesten Stift. Im vorliegenden Beispiel handelt es sich um die Positionen 4, 10, 16, 22, 28 und 34. (G) Tagging der entsprechenden Gewebe Standorte durch kleine Papierstückchen sauber, leere Konfetti platziert auf der Oberfläche des Gewebes. (H) Exzision von Gewebeproben aus dem zufällig systematisch beprobten Standorte und Weiterverarbeitung für weitere Analysen. Diese Zahl wurde von Albl Et Al. (2016), Zahlen S236 und S237, Seite 186 (Ergänzungen)7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: volumengewichteten systematische Stichproben der Nierenrinde ein Schwein Niere (siehe Abbildung 5) und Regeln für die Punkt-Zählung. (A) frisches Schwein Niere. (B) Niere geschnitten in gleich dicke parallele Scheiben senkrecht zur Achse längs Orgel, überlagert mit cross-Raster gedruckt auf einer Kunststoff Transparenz. Der rote Kreis zeigt die Position der Zufallspunkt verwendet, um die Position der Kreuzraster randomisieren. (C) Darstellung der Punkt zählen Regeln: ein Cross/point zählt als das Gewebe Fach zu schlagen abgetastet (Referenz-Fach), wenn die rechte obere innere Ecke der vertikalen und horizontalen Leiste des Kreuzes (Pfeil) deckt das Gewebe. (D) Kennzeichnung der Kreuze schlagen die Nierenrinde und systematische Stichproben Gewebe Standorte (hier 119 Kreuze schlagen die Nierenrinde und 17 Standorten sind systematisch nach dem Zufallsprinzip Stichprobe mit einer Sampling-Intervall ich = 7). (E) Stichprobe nach dem Zufallsprinzip systematisch Standorte der Nierenrinde von Konfetti Papier getaggt. (F) Proben herausgeschnitten. (G) weitere Unterteilung von ausgeschnittenen Mustern zur Weiterverarbeitung der Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analysearten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Unterteilung von Gewebeproben herausgeschnitten aus systematisch zufällig ausgewählte Gewebe Standorte und Verarbeitung der Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analysearten. (A) schematische Darstellung der Generation von Gewebe Teilproben von einer systematisch zufällig ausgewählte Position der Nierenrinde (native Gewebe) für unterschiedliche Analysen (z. B.FF-PE: Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten Probe und MTC-PE: Methacarn fixiert, Paraffin-eingebetteten Probe für Licht-mikroskopische Histologie; CRYO: Probe für Gefrierschnitte Histologie; -80 ° C: Trockeneis eingefroren Gewebeproben für die molekulare Analyse). (B) Ausrottung systematisch zufällig ausgewählte Standorte der Nierenrinde einer Perfusion-feste Niere, weitere Unterteilung von ausgeschnittenen Gewebeproben und Verarbeitung der Teilproben für qualitative und quantitative morphologische Analysen. Platten der Perfusion-feste porcinen Niere (1), Kreuz-Grid (2), Kreise zufällige Zahl Tabelle (3), gleichwinklig und Kosinus gewogen (4) für die Erzeugung von IUR Abschnitte (siehe Abbildung 9, Abbildung 10), verschiedene Fixierung Lösungen (5, 6, 7) und Probe Container für Elektron mikroskopisch kleine Proben (8). Diese Zahl wurde von Albl Et Al. modifiziert (2016), Abbildung S239, Seite 186 (Ergänzungen)7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: "Isector" Abschnitt Vorbereitung von Formalin fixiert porcinen Gewebe. (A) Stichprobe von porcinen Nierenrinde Perfusion fixiert. (B) sphärische Gussformen. (C) flüssigen Agar. (D-E) Agar-Einbetten der Proben in sphärische Gussformen. (F) Agar Kugel mit eingebetteten Gewebeprobe. (G) Agar Kugel mit eingebetteten Gewebe geschnitten an eine zufällige Position (IUR Schnittebene). Diese Zahl wurde von Albl Et Al. modifiziert (2016), Abbildung S6, Seite 14 (Ergänzungen)7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Schematische Darstellung der "Orientator" Technik für die Vorbereitung der IUR Abschnitte. (A) Probe(n) von festen Gewebe platziert auf einem gleichwinklig Kreis (ci1) mit einer Kante parallel zur 0-180 ° Richtung (gekennzeichnet durch eine rote Linie). (B) Berandungen der Probe in einem zufälligen Winkel (grüne Linie). (B, C) Neu erzeugten Abschnitt Oberfläche der Gewebeprobe (angegeben in grüner Farbe). (D) Probe platziert auf einem Kosinus wog Kreis (ci2) mit der Sektionaltore Oberfläche erzeugt im vorherigen Schritt vor Nachteil und die Kante der ruhenden Oberfläche parallel zur Richtung 1: 1 (angezeigt durch eine rote Linie). (E) der zweite Abschnitt durch die Probe in einem zufälligen Winkel schneiden. (F) resultierende zufällig isotrop Abschnitt Flugzeug der Probe (angegeben in blauer Farbe). (G) Bestimmung des Bereichs der Sektion IUR festen Gewebeprobe zur Abschätzung der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen wie unter Punkt 1.3 beschrieben. (H) Einbetten der Gewebeprobe in Kunstharz. (ich) Berandungen der Kunststoffblock ist geschnitten (Parallel zur Ebene IUR) auf ein Mikrotom. (J) Montage der IUR Kunststoff-Abschnitte auf Objektträgern. Diese Zahl wurde von Albl Et Al. modifiziert (2016), Abbildung S8, Seite 15 (Ergänzungen)7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10: "Orientator" Technik für die Vorbereitung der IUR Abschnitte von Agar eingebettete Gewebeproben. (A-D) Optional eine kann Agar-einbetten eine systematisch zufällig ausgewählte Probe von festen Gewebe (Agar-Einbetten eignet sich für kleine Gewebeproben, so dass die erste oder beide zufällig Abschnitte innerhalb der Agar positioniert werden können, ohne das Gewebe zu schneiden). (E) Positionierung der Agar-Block auf einem gleichwinklig Kreis (ci1) mit einer Kante parallel zur Richtung 1: 1 (angezeigt durch eine rote Linie). (F, G) Schneiden des Blocks in einem zufälligen Winkel (hier: 15-15, grüne Linie) über eine zufällige Zahl Tabelle (Rnt, grüner Pfeil) ermittelt. (H) nachfolgende Positionierung der Agar-Block auf der Abschnitt Oberfläche schneiden in F auf einem Kosinus-gewichtete Kreis (ci2) mit der Kante der ruhenden Fläche parallel zur Richtung 1: 1 (angezeigt durch eine rote Linie) platziert. (ich) zweiten Schnitt durch die Probe in einem zufälligen Winkel (hier: 20-20, angezeigt durch eine blaue Linie), bestimmt durch eine zufällige Zahl Tabelle (Rnt, blauer Pfeil) verwenden. (J) resultierende IUR Abschnitt Flugzeug von der Gewebeprobe. Diese Zahl wurde von Albl Et Al. modifiziert (2016), Abbildung S9, Seite 16 (Ergänzungen)7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11: Schematische Darstellung der VUR Abschnitt Vorbereitung. (A) feste Gewebeprobe mit einer definierten (identifizierbar) vertikalen Achse (z.B.senkrecht zu seiner natürlichen Oberfläche). (B) feste Gewebeprobe eingebettet in Agar. (C) Positionierung der the(agar-embedded) Gewebeprobe auf einen Druck von einem gleichwinklig Kreis (ci1). VA: vertikale Achse. (D) Berandungen der Probe in einem zufälligen Winkel (zufällige Zahlentabelle; hier: 30-30 Richtung, durch eine blaue Linie) mit der Schnittebene wird orthogonal orientiert sich an den Tisch und Parallel zur vertikalen Achse der Probe. Daraus resultierende VUR Schnittebene von der Gewebeprobe (angegeben in blauer Farbe). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12: Vertreter Volumetrie ein Schwein Niere. (A-B) Eintauchen-Technik. (A) Ermittlung der Niere Gewicht (mKind). (B) Bestimmung des Gewichts des Volumens der Kochsalzlösung durch die Niere (mdispl.saline) vertrieben. Die Niere ist an einer Schnur aufgehängt und vollständig untergetaucht in Kochsalzlösung ohne zu berühren den Boden oder die Wände des Bechers. Das berechnete Volumen der Niere ist 92,6 cm ³. (C-D) Cavalieri Technik, Planimetrie durch Punkt zählen. (C) Messung der Länge (l) der Niere entlang seiner Längsachse. (D) Bestimmung der Abschnitt Profilbereiche der Niere Platten von Punkt zählen nach Überlagerung von einem Raster gleichmäßig verteilte Kreuze auf ein Kunststoff transparent gedruckt. Hier ist die geschätzte Menge der Niere 93,3 cm ³. (E-F) Cavalieri Technik, Planimetrie von gescannten Bildern der Abschnitt Profilbereiche der Niere Platten (F). Hier ist die geschätzte Menge der Niere 92,8 cm ³. In C-E, die natürliche Oberfläche der ersten Runde oder die letzte Platte von der Niere auf den Scanner gelegt oder überlagert durch die Kreuzraster Transparenz ist kein Abschnitt Oberfläche und daher kein Abschnitt Fläche wird in diese Gewebe Platte gemessen. (G-H) Demonstration der Overprojection in gescannte Bilder von Organgewebe/Platten (G) und Organgewebe/Platten mit einem Kreuzraster Transparenz (H) überlagert. Overprojecting Teile des Gewebes der Orgel-Platten werden durch gestrichelte weiße und schwarze Linien angezeigt. Nur die Bereiche der tatsächlichen Abschnitt Profile (d.h. das Gewebe umgeben durch die teilweise angegebenen weiße gepunktete Linie) werden bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 13
Abbildung 13: repräsentative Abbildung der angemessenen (A) und suboptimale (B) Vorbereitung der Agar eingebettete Gewebeproben zur Bestimmung der Gewebe schrumpfen im Zusammenhang mit der Einbettung von Proben in histologischen Kunststoff einbetten Medien. (A) gescannte Bild der Abschnitt Oberfläche einer festen Probe von porcinen subkutanem Fettgewebe vor dem Einbetten in Kunstharz. Die Probe ist eingebettet in Tusche geschwärzt Agar zur Stabilisierung der Form der Probe und klare Benennung der Abschnitt Oberfläche Konturen. (B) undeutlich Gliederung der Abschnitt Oberfläche und eingeschlossene Luftblase (Pfeil) innerhalb der Agar. Skalieren von Balken = 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Analyse Probe Verarbeitung
Typ Methode(n)
Molekulare Analysen RNA-Transkript, Protein, Metaboliten und Lipid Profilierung,
Metabolomik-Analyse, DNA-Analyse
Kleine Stücke * frische (native) Gewebe Frieren Sie in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis ein. Shop bei-80 ° C.
Qualitative morphologische Analysen Histologie
[Lichtmikroskopie, inkl. Immunhistochemie (IHC) & in-situ Hybridisierung]
Frisch (Native) – oder in Situ - korrigiert * Gewebeproben Verwenden Sie unterschiedliche Fixiermittel (z.B. 4 % Formaldehyd-Lösung) und Einbetten von Medien (paraffin, GMA/MMA, epoxy) als angemessen.
Cryohistology
(Gefrierschnitte, inkl. IHC)
Frische (native) Gewebeproben Probe in blockierende Medium einbetten und Einfrieren in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane.
Ultrastrukturforschung Analyse
[Elektronenmikroskopie, inkl. Übertragung (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie]
Kleine Stücke von frischem (Native) – oder in Situ- korrigiert * Gewebeproben Probe in 2,5 – 6,25 % Glutaraldehyd Lösung zu beheben und Einbetten in Kunststoff Epoxidharz.
Quantitative morphologische Analysen Lichtmikroskopie Frisch (Native)- oder in Situ - korrigiert * Gewebeproben Bereiten Sie IUR-Abschnitte (Orientator, Isector-Abschnitte) und/oder VUR-Profile aus Kunststoff eingebettete Gewebeproben.
TEM Kleine Stücke von frischem (Native) — oder von in Situ - korrigiert * Gewebe IUR (Orientator, Isector-Abschnitte) Abschnitte von Epoxy-eingebettete Gewebeproben vorzubereiten.

Tabelle 1: Verarbeitung von Gewebe Teilproben von systematisch zufällig ausgewählte Standorte für verschiedene nachgelagerte Analysen Arten herausgeschnitten. Abhängig von der experimentellen Design einer Studie und Organgewebe untersucht sollten unterschiedliche Anzahl der Teilproben von jedem Standort systematisch zufällig ausgewählte Gewebe herausgeschnitten und für verschiedene Arten von nachgeschalteten Analysen verarbeitet werden. Detaillierte Protokolle für die meisten Schweine Organe/Gewebe und Studientypen sind in der "Sampling-Guides für Schweine biomedizinische Gewebemodelle"7zur Verfügung gestellt. GMA/MMA: Glycolmethacrylate/Methylmethacrylate. IUR: Isotrope Uniform zufällige. VUR: Vertikale Uniform zufällige. * max. 2 x 2 x 2 mm-3. z. B.Perfusion feste Gewebe oder pulmonale Gewebe der Lunge mit Fixierung Lösung eingeflößt.

Methode Repräsentative Ergebnisse
Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ (Schritt 1.1, Abbildung 1, Abbildung 2) Porcines Organ/Gewebe Ρ (g/cm ³)
Leber 1.071 ± 0,007
Bauchspeicheldrüse 1,062 ± 0,016
Ventrikel Myokard 1.036 ± 0,014
Niere 1.044 ± 0,006
Abdominalen viszeralen Fettgewebe * 0.921 ± 0,032
Schilddrüse 1.061 ± 0,007
Gehirn 1.051 ± 0,007
Nebenniere 1.063 ± 0,025
Skelettartigen Muskel ** 1,074 ± 0,003
Daten sind Mittel ± SD-spezifische Organgewebe/Gewichte in n bestimmt wurden = 18 Schweine (14 weibliche und 4 männliche Schweine, Alter 60 Tagen bis zu 2 Jahren; 30 – 250 kg Körpergewicht). * Fettgewebe aus dem Jejunal Mesenterium. ** Mittelwerte für M. Longissimus Dorsi, M. Tibialis Cranialis, M. Triceps Brachii und M. Gluteobiceps.
Bestimmung der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie (Schritt 1.3, Abbildung 4) Organ/Gewebe Einbetten von medium       fS
Nierenrinde (Schwein) GMA/MMA 0,89 ± 0,02
Epoxy 0,92 ± 0,02
Daten sind Mittel ± SD Messungen von 24 Proben von 12 Schweine. fS: Lineare Schrumpfung Korrekturfaktor.

Tabelle 2: Repräsentative Ergebnisse der dichten von ausgewählten porcinen Organen und Geweben7und lineare Schrumpfung Korrekturfaktoren für Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen des porcinen kortikalen Nierengewebe in anderen Kunststoff Einbetten von Medien.

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Discussion

Generation der Biobank Musterkollektionen von porcinen Tiermodellen erfordert robuste Techniken und Protokolle zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen, die reproduzierbare Generation des Vertreters, redundante Gewebeproben geeignet für ein breites Spektrum von verschiedenen Analysemethoden und Randomisierung der Ausrichtung der Probe Abschnitte für quantitative stereologischen Analysen. In diesem Artikel beschriebenen Methoden sind die Größen von porcinen Organen und Geweben angepasst und wurden entwickelt, um effektiv erfüllen diese Anforderungen2,7. Sie basieren auf anerkannten methodischen Grundsätzen und haben bisher bewiesen ihre Umsetzbarkeit in anderen veröffentlichten Studien2,7,12,21. Die vorgestellten Methoden sind wichtig für verschiedene Arten von Studien, die Gewebe/Organproben, denn sie bilden eine Grundlage für die Generierung von repräsentativen Stichproben und für den Erwerb einer Vielzahl von Parametern, die sonst nicht ermittelt werden konnte. Diese Methoden können schnell mit wenig Aufwand durchgeführt werden, und sind kompatibel mit nahezu allen Arten von nachgeschalteten Analysen. Daher gelten nicht nur für Schweine Tiermodell Biobank Projekte geeignet, sondern eignen sich auch in Studien mit quantitativen histomorphologische Untersuchungen von Gewebeproben von anderen großen Tiermodell-Arten (z.B. Schafe), als sowie in tierärztlichen Untersuchungen. Unter Berücksichtigung der technischen Aspekte der verschiedenen Methoden müssen ein paar wichtige Schritte und Einschränkungen bei der Umsetzung der Protokolle der jeweiligen Techniken berücksichtigt werden.

Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/organ

Bei der Ermittlung des Gewebes, die Dichte der Methode untertauchen (Schritt 1.1, Abbildung 1, Abbildung 2), Pflege ergriffen werden müssen, nicht in den Innenwänden oder den Boden des Bechers mit der Gewebeprobe oder der Probenhalter während der Gewebe ist Probe in Kochsalzlösung getaucht. Andernfalls wird die Waage das Gewicht der Probe und nicht das Gewicht des Volumens der Kochsalzlösung versetzt von der Probe angezeigt. Für sehr klein/leicht Gewebeproben (ein paar mg) beschränkt sich die eintauchen-Methode zur Bestimmung der Dichte Gewebe, wegen der Surface tension der Salinen und der ungünstig hohe Quotient von Probenvolumen, das Volumen der Flüssigkeit eintauchen in den Becher geben, die die Genauigkeit der Messung zu behindern. Hier könnte das Gewicht der Probe für weitere Berechnungen anstelle der Dichte berechnet Volumen verwendet werden. Bestimmung der Dichte Gewebe durch Untertauchen ist auch nicht wirksam für frische (fixierten) Lungengewebe durch die inkonsistente Gehalt an Luft im Gewebe und in einigen Fällen, wo die Organe sind experimentell mit Fixiermittel durchblutet/eingeflößt.

Cavalieri Methode zur Bestimmung der Orgel Bände

Die Methode des Cavalieri Volumetrie von porcinen Organen und Geweben ist umständlicher im Vergleich zur Bestimmung des Volumens Orgel aus dem Organgewicht und Dichte. Allerdings ist es geeignet für Organe, die aufgrund ihrer experimentellen Verarbeitung (z.B., Perfusion-feste Organe oder Lunge mit Fixierung Lösung eingeflößt) angemessen abgewogen werden können nicht. Cavalieri Volumetrie Methode ist hier ideal mit der volumengewichtete systematische Stichproben-Technik beschrieben in Schritt 2 (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 12) kombinierbar. Bei der Vorkalkulation von Organgewebe/Bände aus den Bereichen Schnittprofile parallel, äquidistant Scheiben die Organgewebe (Cavalieri Ansatz, Schritt 1.2, Abbildung 3) Platten Wartung von der Orientierung des Gewebes (obere und untere Schnittebene ), sowie die genaue Bestimmung des Bereichs alle Abschnitt Profile sind von großer Bedeutung. Besonders, wenn digitale Bilder oder Scans von Orgel Platten planimetrisch analysiert werden, müssen Overprojections des Gewebes (außerhalb der geschnittenen Gewebe-Ebene) der Gewebe-Platte (Abbildung 12G-H) sorgfältig geprüft werden zuverlässige Volumen Schätzungen.

Bestimmung der dreidimensionalen Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Verarbeitung von Gewebeproben für Histologie

Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung hängt das Einbetten von Medium und die Art der Gewebe und auch variieren zwischen differentiell Proben des gleichen Gewebes.

Während Gefrierschnitte gelten als praktisch keine Schrumpfung in der X-Y-Ebene anzeigen und Kunststoff einbetten in der Regel wenig Schrumpfung des Gewebes bewirkt, ist Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung besonders umfangreich in Paraffin-eingebetteten Gewebeproben , und wird in der Regel erheblich beeinträchtigen, quantitative morphologische Analysen der Maßparameter in histologischen Abschnitten dieser Proben. Neben der weitgehend von insgesamt dreidimensionale Schrumpfung bewirkt Paraffin einbetten auch eine ungleichmäßige, differential, anisotrope und Variable Schrumpfung der Probe und der verschiedenen anatomischen Strukturen, Gewebetypen und Zelltypen innerhalb das Gewebe Probe8,13. Darüber hinaus kann besonders in dicker histologischen Abschnitte von Paraffin-eingebetteten Gewebeproben, das Ausmaß der Schrumpfung des Gewebes auch deutlich in der X-Y und Z-Richtung des Abschnitts abweichen. Dies kann durch eine differenzierte Schrumpfung der Querschnittsfläche (in X-Y-Richtung) und der Querschnittshöhe (d. h., die vertikale Schnittdicke) sein, beim Dehnen des Abschnitts im Wasserbad warm Gewebe Flotation nach den Schnitt aus dem Gewebe blockieren, und im Verlauf der nachfolgenden Verarbeitung, färben und eindecken Verfahren des Abschnitts montiert auf einem Glas Folie (d.h. eine homogene Zusammenbruch in den Abschnitten z-Achse)8. Darüber hinaus in dicke Abschnitte möglicherweise eine vergleichsweise stärkere Komprimierung der Regionen innerhalb des Abschnitts Abschnitt-Flugzeug-in der Nähe von Gewebe während den Schnitt aus dem Gewebe-Block (führt zu einer differenzierten Verformung der in den Abschnitten z-Achse)19 . Diese Effekte können dann auch die Schätzungen über die Zahl der Gewebestrukturen innerhalb des Abschnitts durch deutliche quantitative stereologischen Analysemethoden, wie z. B. die optische Disector verfälschen. Vorhersage, Überwachung und Korrektur der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen deshalb nicht machbar für Paraffin-eingebetteten Gewebe Proben8.

Im Gegensatz dazu ist das Ausmaß der Volumenschrumpf von Gewebeproben, eingebettet in Kunstharze, wie GMA/MMA oder Epoxy-Kleber, deutlich niedriger und, wichtiger, mehr Uniform. Daher einbetten in Kunstharz mit einer vermeintlich homogenen, isotropen und globalen Schrumpfung des Gewebes für mehrere Analysemethoden unterschiedliche quantitative morphologische Parameter17,18vorteilhaft ist. Bei der Vorkalkulation Gewebe schrumpfen im Zusammenhang mit einbetten in Kunstharz sollte die Form des festen Gewebes nicht zusätzlich während das einbettende Verfahren erlauben für den Vergleich der entsprechenden Abschnitt Profilbereiche der festen und eingebettete verzerrt werden Proben. Dies kann schwierig in weich oder leicht komprimierbar Gewebeproben wie Fettgewebe oder Lunge Gewebe oder in Gewebeproben mit einer hohen Flüssigkeitsgehaltes sein. Hier Einbetten der festen Probe in Agar vor dem Schneiden des Gewebes ist hilfreich, um die Form der Gewebeprobe während der nachfolgenden Kunststoff einbetten Verfahren zu stabilisieren (Protokoll Schritt 1.3., Abbildung 4). Um verlässliche Daten zu erreichen, sollten wiederholte Messungen der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe Schrumpfung, mit verschiedenen Proben des gleichen Gewebes, durchgeführt werden. Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen wird als lineare Gewebe Schrumpfung Faktor fs ausgedrückt (Protokoll Schritt 1.3.9., Abbildung 4). Beispiele für Gleichungen mit fs für Schrumpfung Korrektur verschiedener Länge, Fläche und Volumen-Parameter der verschiedenen Gewebestrukturen in mehrere quantitative stereologischen Studien14, 21,27.

Volumengewichteten systematische Stichproben durch Punkt zählen und Verarbeitung von Gewebe Teilproben für verschiedene nachgelagerte Analysearten

Die vorgestellten volumengewichteten Entnahmetechnik für Schweine Organe Stichproben Standorten innerhalb des Gewebes einmal bestimmt, und anschließend generiert alle notwendige Proben für weitere unterschiedliche Analysen durch Unterabtastung der herausgeschnitten aus Gewebeproben Diese Standorte7. In volumengewichteten systematische Stichproben Regimen, jede mögliche Probenahmeort innerhalb des Gesamtvolumens der Organgewebe geprüft hat genau die gleiche zufällige Chance zu untersuchenden und Generalizability wird gewährleistet durch die Sammlung von einer ausreichende Anzahl von Exemplaren. Mit volumengewichteten systematische Stichproben Designs für Generation von Proben aus parenchymatösen Organen verhindert daher effektiv Analyseergebnisse möglicherweise voreingenommen von (möglicherweise unerwartete und unbekannte) ungleiche Verteilungen von unterschiedlichen funktionelle oder morphologische Gewebeeigenschaften zwischen einzelnen Standorten eines Organs, die nachgewiesen haben, z. B.für die mittlere Lautstärke und die numerische Volumen-Dichte von porcinen Hepatozyten in verschiedenen Regionen das Leberparenchym28 . Die vorgestellten "Gewebe-Sägen und Unterabtastung" Strategie für Schweine Organe leicht verständlich, entspricht den technischen Anforderungen der nachgeschalteten Analysemethoden, schnell durchgeführt und angepasst an die Anforderungen einer bestimmten Studie, wodurch es systematische Probenahme Vorurteile, Verringerung der experimentellen Variabilität und die Präzision des gesamten Experiments, dabei effizienter als Probenahmestrategien, in dem jeder einzelne Probenahmeort zufällig bestimmt wird, erhöht9 ,15. Die Anzahl der Exemplare, die erzeugt werden, natürlich hängt der untersuchten Parameter und ihrer Variabilität innerhalb von Proben aus verschiedenen Orten in die Stichprobe einbezogenen Organgewebe. Für die Generation der Biobank Musterkollektionen so konzipiert, dass für die Prüfung von maximal verschiedener Parameter (zum Zeitpunkt der Probenahme nicht angegeben) durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Analysemethoden plant eine zukunftsorientierte Probenahmestrategie in der Regel Generation der relativ hohen Zahl von redundanten Proben pro Organ/Gewebe.

Generation von isotropen einheitliche Random (IUR) Abschnitten und vertikale einheitliche Random (VUR) für quantitative stereologischen Analysen

Einige der Techniken zur Erzeugung von IUR und VUR Abschnitte für quantitative stereologischen Analysen haben etwas kompliziert theoretische Grundlagen und Erläuterungen sind deshalb oft (unnötigerweise) von vielen Wissenschaftlern gemieden, obwohl ihre praktischen die Umsetzung ist relativ einfach. VUR Abschnitte sind besonders leicht zu generieren und sind optimal für dichte/Fläche Schätzungen in Kombination mit Cycloïde Test Systeme8,9,20. Sie werden oft bevorzugt durch die familiäre Ausrichtung der Schnittebene. Allerdings eignen sich im Gegensatz zu IUR Abschnitte, VUR Abschnitte nicht zur Abschätzung der Längenparameter8,9.

Während der Zubereitung der IUR und VUR Abschnitte die entscheidende Schritt ist grundsätzlich weiterhin die IUR oder VUR Abschnitt Oberfläche der festen Probe beim Einbetten in Kunstharz und um sicherzustellen, dass die vertikale Achse der VUR Abschnitte immer identifiziert werden kann (Schritt 3, Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11).

In Zukunft könnte die breitere Anwendung der oben beschriebenen Methoden wesentlich beitragen, um einheitlich hohe Qualitätsstandards für Generation vergleichbar, Mehrzweck-Biobank Proben aus Schweinen und anderen großen Tiermodellen zu etablieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Lisa Pichl für ausgezeichnete technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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