Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

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Summary

L’application pratique et les performances des méthodes pour la génération d’échantillons de tissus représentant des modèles animaux porcins pour un large éventail d’analyses en aval dans les projets de la biobanque sont démontrées, y compris la volumétrie, l’échantillonnage aléatoire systématique, et le traitement différencié des échantillons de tissus pour les types d’analyses qualitatives et quantitatives, morphologiques et moléculaires.

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Blutke, A., Wanke, R. Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models. J. Vis. Exp. (133), e57276, doi:10.3791/57276 (2018).

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Abstract

Pour la recherche translationnelle, modèles porcines sont progressivement devenus plus populaires. Étant donné la valeur élevée de chaque animal, en particulier des porcs génétiquement modifiés, modèles et le nombre souvent limité d’animaux disponibles de ces modèles, création de collections (biobanque) des échantillons de tissu suffisamment transformés adapté pour un large spectre des méthodes d’analyses subséquentes, y compris les analyses non précisés à l’instant d’échantillonnage, représentent des approches utiles pour profiter pleinement de la valeur translationnelle du modèle. En ce qui concerne les particularités de l’espèce porcine anatomie, des lignes directrices exhaustives ont récemment été établies pour génération normalisée de représentant, échantillons de haute qualité provenant de différents organes porcins et tissus. Ces lignes directrices sont des conditions essentielles pour la reproductibilité des résultats et la comparaison entre différentes études et les enquêteurs. L’enregistrement des données de base, tels que le poids des organes et volumes, la détermination des sites d’échantillonnage et du nombre d’échantillons de tissus à générer, ainsi que leur orientation, taille, traitement et directions de coupe, est des facteurs pertinents détermination de la généralisation et la convivialité de l’échantillon pour des analyses morphologiques moléculaires, qualitatives et quantitatives. Ici, une démonstration illustrative, pratique, étape par étape des techniques plus importantes pour la production de représentant, biobanque multi-usages spécimen provenant de tissus porcins est présenté. Les méthodes décrites ici incluent la détermination de volumes d’organes et de tissus et de la densité, l’application d’une procédure d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume pour les organes parenchymateux par comptage point, détermination de l’étendue du retrait de tissu associés à enrobage histologique des échantillons et génération d’échantillons orientés au hasard pour des analyses quantitatives stéréologiques, comme isotrope uniforme aléatoire (IUR) sections générées par les méthodes « Orientation » et « Isector » et vertical uniforme sections (RVU) aléatoires.

Introduction

Dans la médecine translationnelle, les porcs sont plus en plus courants pour une utilisation comme modèles de grand animaux1,2,3,4,5, en raison de nombreuses similitudes avantageux entre le porc et anatomie et physiologie et la disponibilité de méthodes biologiques moléculaires établies permettant la génération d’adapté, modifié génétiquement des modèles de porc pour un large éventail de maladies conditions1,4.

Toutefois, par rapport aux modèles de rongeurs, le nombre d’animaux d’un modèle de cochon respectifs qui peuvent être fournis pour expériences en tout temps est limité. Cela est dû à l’intervalle de génération porcin d’environ un an et les efforts financiers et beaucoup de temps requis pour la génération de modèles de porcins et de l’élevage. Par conséquent, les animaux individuels d’un modèle porcin, ainsi que les échantillons qui peuvent être générés de ces porcs, sont très précieux, en particulier si génétiquement modifiée modèles porcines et/ou des problèmes expérimentaux à long terme (p. ex., complications tardives de maladies chroniques) sont examinées dans les individus âgés de6,2,7.

Dans le cadre de toute étude, exécution d’analyses supplémentaires, qui ne était pas prévue dans le protocole expérimental de l’étude initial pourrait plus tard se pour révéler pertinentes, par exemple, à l’adresse des questions distinctes découlant précédemment découvert résultats inattendus. Si les échantillons appropriés pour de telles expériences supplémentaires ne sont pas disponibles, coût disproportionnellement plus élevé et les dépenses de beaucoup de temps peuvent être nécessaires de produire des porcs supplémentaires et des échantillons de tissus. Pour être préparé à ces éventualités, génération de biobanque collections d’échantillons de sauvegarde conservées des différents organes, de tissus ou liquides bio, quantitativement et qualitativement adaptées pour un large éventail d’analyses ultérieures, est considéré comme un important approche2,6,7. Découlant des prestations optimales un modèle animal porcin, la disponibilité des échantillons adéquats biobanque offre également la possibilité unique pour effectuer un large éventail de méthodes d’analyse différentes sur les matériaux des échantillons identiques sur un niveau de plusieurs organes dans la même chaque animal, par exemple, par la distribution d’échantillons à des scientifiques de différents groupes de travail organisés en un réseau de recherche sur2,6,7. En outre, la stratégie d’échantillonnage '' tourné vers l’avenir '' dans les biobanques contribue également à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans une étude. Les avantages du modèle porcin biobanques ont récemment été démontrés dans un multi-organes, étude multiomics, orgue la diaphonie dans un modèle porcin génétiquement modifié du diabète à long terme, sur des échantillons de la biobanque de porc Munich MIDY 2.

Il y a certaines exigences obligatoires biobanque échantillons doivent généralement respecter pour établir la fiabilité et la facilité d’interprétation des résultats des analyses effectuées par la suite. Les échantillons doivent être générés de façon reproductible, et ils doivent être représentatifs, c'est-à-diresuffisamment reflétant les caractéristiques morphologiques et moléculaires intéressées des tissus ou d’organes les échantillons ont été prélevés à7. Pour convenir à un large éventail de types d’analyses en aval, les échantillons doivent être pris en quantité suffisante et traitées selon les demandes (y compris les conditions de temps et température) différentes méthodes d’analyse, y compris les descriptifs analyses histopathologiques, tels que cryohistology, paraffine et plastique histologie, immunohistochimie, hybridation in situ , analyses microscopiques électron ultrastructurales et bilans diagnostiques de laboratoire clinique, aussi bien que moléculaires analyses d’ADN, d’ARN, de protéines et de métabolites.

Pour permettre l’évaluation d’un large éventail de distinctes paramètres morphologiques quantitatifs tels que des nombres, des volumes, longueurs ou des surfaces de structures tissulaires distinctes par des analyses quantitatives stéréologiques, section randomisée des avions de la des échantillons histologiques des tissus/organes respectifs doivent être préparés à7,8,9,10,11. Dans des études morphologiques quantitatifs, la détermination précise du volume total des tissus, organes ou compartiment de l’orgue, les échantillons ont été prélevés de (c.-à-d., l’espace de référence) est d’une importance cruciale7,9 , 12 pour calculer les quantités absolues des paramètres au sein de l’organe respectif, des tissus ou organisme intéressés. Finalement, l’effet du retrait de tissu incorporation liées au cours de la préparation des coupes histologiques doit être déterminé et pris en compte13. Par conséquent, des analyses quantitatives stéréologiques, notamment des échantillons archivés (corrigé d’échantillons de tissus, tissus incorporé blocs, coupes histologiques, etc.) dans les études précédentes sont parfois12sévèrement limité, voire même impossible, surtout si la volumétrie des tissus/organes respectifs ne faisait pas, si aucun de ses designs d’échantillonnage adéquates ont été appliqués pour justifier des échantillons représentatifs, si les nombres et les quantités d’échantillons individuels disponibles ne suffisent pas, ou si le traitement de la échantillons est incompatible avec l’estimation du ou les paramètres morphologique quantitatif d’intérêt. En raison des multiples facteurs d’influence possibles, l’aptitude des matériaux archive-échantillon pour des analyses des paramètres morphologiques quantitatifs distincts impossible de répondre sans équivoque, mais dépend de l’évaluation minutieuse de chaque cas individuel.

Ainsi, comme l’emplacement, taille, nombre, traitement, direction de coupe et l’orientation des échantillons potentiellement affecte les résultats des analyses ultérieures, ces facteurs sont d’une grande importance et doivent être envisagées dans le protocole expérimental d’aucune étude. En ce qui concerne ces aspects et les particularités de l’anatomie porcin, directives d’échantillonnage complet, détaillé et à grande échelle des modèles animaux adaptés aux porcins ont récemment été créées, offrant une solide référence à standardisées et reproductibles et la production efficace de redondants, suffisamment transformés, qualité des échantillons de plus de 50 différents porcine organes et tissus6,7.

Les descriptions méthodologiques et le didacticiel vidéo montré dans le présent article prévoient détaillées, exemples, compréhensible, instructions étape par étape pour une performance pratique d’une variété de techniques de volumétrie, prélèvement d’échantillons de tissus porcins et organes et traitement des échantillons de tissus pour analyse en aval différentes méthodes. Les techniques recommandés incluent des méthodes pour la détermination des volumes d’organes et de tissus et de densités fondées sur les principes d’Archimède et Cavalieri9, y compris la détermination des dimensions de rétrécissement en trois dimensions des tissus associés à la intégration dans différents encastrement médias14 pendant le traitement pour examen histologique, application d’échantillonnage aléatoire systématique possible pondérée en fonction du volume s’approche, traitement des échantillons de tissus prélevés pour différents ultérieures analyses7,8,9,15et génération de convenablement orienté et traitement échantillons pour potentiel des analyses quantitatives stéréologique7,8, 9,10,11. À côté de leur application dans des projets porcins biobanque, les méthodes démontrées sont généralement appropriées pour toutes les études examinant les propriétés histo-morphologiques quantitatifs des organes/tissus. En outre, conceptions de l’échantillonnage aléatoire systématique sont particulièrement bénéfiques pour la génération d’échantillons représentatifs dans les expériences à l’aide de méthodes d’analyse moléculaire pour détecter les altérations de l’abondance de, par exemple, ARN, protéines ou métabolites dans différents organes et tissus.

Les sections suivantes fournissent une brève introduction à ces méthodes, tandis que leur performance pratique est décrite dans la section protocole.

Détermination des volumes d’organes et de tissus
Détermination du poids des organes et des volumes est importante dans plusieurs paramètres expérimentaux, que ces facteurs pourraient indiquer des changements, potentiellement liées à expérimentalement examiné les facteurs d’intérêt. Le volume total d’un organe ou le tissu est aussi communément requis pour calculer les paramètres quantitatifs absolues, (par exemple, le nombre total de cellules), des densités de volume numérique stereologically estimé (c.-à-d., le nombre de cellules par unité de volume du tissu)7,12. En dehors des techniques utilisant des équipements techniques complexes, comme la tomographie par ordinateur, il existe essentiellement trois méthodes pratiques habituellement utilisées pour déterminer le volume absolu d’un organe ou tissu. Le volume d’un organe peut être déterminé par « mesure volumétrique directe » selon le principe d’Archimède, c'est-à-dire, en mesurant le volume d’eau ou une solution saline déplacés par la structure lorsqu’il est complètement submergé. Toutefois, pour relativement grandes orgues porcins, ces approches sont impraticable et enclin à l’imprécision, car ils nécessitent des flacons volumétrique/de mesure très large. Plus commodément, le volume d’un organe/tissu peut être calculé à partir de son poids et la densité7,12,16, qui peut efficacement être déterminé à l’aide de la « méthode de submersion »7,12 ,16 (étape de protocole 1.1.). Volumes d’organes et de tissus peuvent également être estimés à l’aide de la volumétrie des approches basées sur le « principe de Cavalieri » (1598-1647). En termes simples, le principe de Cavalieri stipule, que si deux objets sont sectionnées dans des plans parallèles à un plan de masse, et les profils des sections coupent par le biais de deux objets au correspondant distance depuis le plan de masse ont les mêmes zones, les deux objets ont le même volume. Ainsi, on peut estimer le volume d’objets façonnés arbitrairement comme le produit de leurs zones de profil de section dans les plans de coupe parallèle, tout aussi lointain et la distance entre les plans de coupe. C’est compréhensible avec l’analogie suivante : considérons deux cheminées comprenant le même nombre de pièces identiques sont placées côte à côte, une pile avec la pièces de monnaie ordonnée empilée les uns sur les autres ce qui donne une forme cylindrique de la pile de la pièce et l’autre empilement de pièces de monnaie avec décentré placé pièces (Figure 3 a). Bien que les formes des deux cheminées de la pièce sont différents, leurs volumes sont identiques, depuis les zones des pièces à des niveaux correspondants de deux piles (c'est-à-direles zones des profils de sections parallèles coupent par les deux cheminées de la pièce à égale distance de la au sol) sont identiques. Estimation des volumes d’organes porcins et de tissus en utilisant le principe de Cavalieri7,12,15 est décrit à l’étape 1.2.

Détermination de l’étendue du retrait des tissus associé à enrobage histologique
Dans les analyses de plusieurs paramètres morphologiques quantitatifs mesurés dans des coupes de tissus histologiques, l’effet de rétraction tissulaire liées à enrobage survenant pendant le traitement pour l’histologie des tissus doit être déterminé et pris en compte. L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage peut être variable et dépend à la fois sur le tissu, son traitement et l’incorporation moyenne8,13,17,18,19. Généralement, les changements liés à enrobage du volume d’un échantillon de tissu (c'est-à-dire, pour la plupart de rétrécissement) se produisent dans les trois dimensions de l’espace et, par conséquent, affecte tous les paramètres dimensionnels estimées par des analyses quantitatives stéréologiques8 . Fondamentalement, l’ampleur du retrait de tissu incorporation liées, exprimé comme le facteur de rétrécissement des tissus linéairefS, peut être estimée comme indiqué dans l’étape 1.3. et utilisés pour la correction des paramètres morphologiques quantitatifs (rétrécissement sensible)14.

Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume des organes/tissus
Création d’une biobanque de collection des échantillons d’organes et de tissus porcins, approches d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume tel que décrits à l’étape 2 se sont avérés pour être pratiques, rapide et efficaces des techniques de génération de représentant, tissu multi-usage échantillons7,8,9,15.

Génération d’isotrope uniforme aléatoire et des sections verticales uniforme aléatoire pour les analyses quantitatives stéréologiques
Biobank échantillons de tissus doivent être adapté pour un large éventail de méthodes différentes analyse stéréologique quantitative pour l’estimation d’un maximum de paramètres qui ne peut être déterminée sans un spécimen bien préparé. Presque tous les paramètres stéréologiques quantitatives peuvent être déterminés, en utilisant « isotrope (indépendant) uniforme aléatoire (IUR) sections »8,9. Dans les sections IUR, l’orientation tridimensionnelle du plan de la section de l’échantillon de tissu est aléatoire. Ceci peut être réalisé par randomisation de la position de l’échantillon de tissu par rapport à la position de l’avion de la section, tel qu’appliqué dans le « Isector » méthode11 (étape 3.1 du protocole), ou par randomisation de l’orientation du plan de la section relative à la échantillon de tissu, comme dans la méthode « Orienteur »10 (étape 3.2 du protocole). Dans les échantillons de tissus, comme la peau ou la muqueuse spécimen affichant un axe vertical naturellement présent, ou défini et correctement identifiable, préparation des « vertical uniforme aléatoire (RVU) sections » (pas de protocole 3.3.) sectionné strictement dans le plan de leur axe vertical est avantageuse8,20. Pour un discours complet des fondements théoriques de l’échantillonnage IUR/VUR et un examen approfondi des potentiels en aval analyses stéréologiques quantitatives, le lecteur intéressé est dénommé les manuels de stéréologie quantitative dans la vie Sciences8,9.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici utilisent des échantillons de tissus provenant d’animaux morts et respectez les réglementations allemandes du bien-être animal.

1. volumétrie

  1. Technique d’immersion pour la détermination de la densité de tissu ou d’organe (Figure 1 et Figure 2) 7 , 12 , 16
    1. Préparer du matériel : Scalpel lames, serviettes en papier, pinces fines, balances de laboratoire standard, verre ou gobelets en plastique, solution saline à 0,9 % et porte-spécimens se construit (Figure 2 a).
    2. Un morceau de tissu de l’accise (taille maximale : 2 x 2 x 2 cm3) de l’organe/tissu, spécifiquement dans le compartiment de l’organe d’intérêt. Petits organes, tels que l’hypophyse et la glande pinéale, sont mesurées dans sa totalité.
      ATTENTION : Veiller à ce que la taille de l’échantillon est notamment plus petite que le diamètre intérieur du bécher (étape 1.1.5 et suiv.) et son niveau de remplissage pour permettre une immersion complète de l’échantillon sans contact avec les parois du bécher dans étape 1.1.7.
    3. Avec soin de prélever l’échantillon avec un essuie-tout pour enlever l’excès de sang/tissu liquide.
    4. Peser l’échantillon sur une échelle de précision et d’enregistrer le poids de l’échantillon (mS). Déterminer le poids des échantillons de tissus petit à mg près (Figure 1 a).
    5. Placer un bécher rempli de salin de 0,9 % à température ambiante sur la balance. Ne pas remplir complètement le bécher, pour permettre une immersion de l’échantillon de tissu dans l’étape ultérieure sans débordement.
      ATTENTION : Utilisez une taille de bécher appropriée à la taille et poids des échantillons de tissus doivent être mesurés et la plage de mesure efficace de l’échelle. Pour plus grands échantillons jusqu'à 2 x 2 x 2 cm3, une taille de bécher de 50 – 100 mL est indiquée en association avec une échelle mesurant environ 100 mg à 500 g, alors que pour les petits échantillons, utilisez béchers de volume 5 – 10 mL en combinaison avec les balances de précision avec gammes de mesure entre environ 0,1 mg et 20 g.
    6. Plonger le porte-échantillon dans la solution saline (c.-à-d.une boucle suffisamment rigide de fil de fer mince ou quelque chose de similaire, Figure 2 a) à un emplacement marqué (flèches dans la Figure 1 b, 2 b Figureet Figure 2). Réinitialisez ensuite, (tare) l’affichage de la balance à zéro.
    7. Fixez soigneusement l’échantillon de tissu pour le porte-échantillon et submerger complètement l’échantillon dans la solution saline jusqu'à ce que la position marquée sur le porte-échantillon est atteinte (flèches dans la Figure 1 b, 2 b Figureet Figure 2).
      ATTENTION : L’échantillon submergé et le porte-échantillon, ne doivent pas avoir le contact avec les parois ou le fond du bécher ou la surface de la solution saline.
    8. Tout en maintenant le porte-échantillon et l’échantillon immergé dans cette position, enregistrer le poids affiché sur la balance (mL), se référant au poids d’une solution saline déplacé par l’échantillon de tissu (Figure 1 C, la Figure 2 b, et La figure 2).
    9. Calculer le volume de l’échantillon (V-S) de mLet la densité d’une solution saline à température ambiante (20 ° C) (ρsaline = 1,0048 g/cm³) comme VS = mL/ Ρsaline [g/g/cm³] (Figure 1).
    10. Calculer la masse volumique de l’échantillon de tissu (ρéchantillon) du poids (c.-à-d., masse) de l’échantillon (mS) et son volume (VS) : ρéchantillon = mS /VS[g/cm³] (Figure 1).
    11. Pour dans sa totalitéorganes mesurés, recommencez la mesure trois fois et calculer la densité d’orgue moyen des valeurs de mesure unique. Pour les grands organes/tissus, effectuer des mesures répétées avec différents échantillons du même compartiment organes/tissus/organes et calculer la densité moyenne des mesures simples, en conséquence.
    12. Calcule le volume total du compartiment organes/tissus/organes de son poids et la densité (Figure 1).
  2. Application de la méthode pour la détermination des Volumes d’organes porcins Cavalieri 7
    1. Préparer du matériel : règle, étrier, couteau, ciseaux, pinces, stylo imperméable à l’eau, en plastique transparents, scanner, photo caméra et grilles de croix imprimés sur des transparents en plastique.
    2. Placer l’ensemble organe/tissu sur une surface plate (base de coupe) et mesurer la longueur (l) de l’organe selon son axe longitudinal (Figure 3 b, Figure 5 a).
    3. Couper l’organe/tissu complet en tranches parallèles équidistantes orthogonal à l’axe longitudinal d’orgue (Figure 3, Figure 5 b). Choisissez une distance d entre deux sections (c.-à-d., l’épaisseur d’intervalle/section sectionnement, habituellement environ 1 cm) suffisamment petites pour recevoir un nombre suffisant de dalles de tissus ou d’organes. Au hasard de positionner la première section à une distance comprise entre 0 et l’intervalle de sectionnement de la marge de l’orgue. Tout en découpage, visuellement juge la position et l’orientation de chaque plan de coupe, pour obtenir approximativement parallèle organe/tissu dalles d’épaisseur à peu près uniforme.
      Remarque : Le nombre de dalles de tissus ou d’organes nécessaires dépend de la forme et la taille de l’organe ou le tissu examiné. Si petits organes ou échantillons doivent être sectionnées en dalles minces de plus de 5 mm, incorporez les échantillons dans la gélose avant incision (Voir l’étape 1.3.3) et utiliser un dispositif technique pour trancher de l’échantillon de gélose incorporé. Des intervalles de sectionnement empiriquement recommandables pour plus porcines organes et tissus, ainsi que des exemples de dispositifs de tranchage, sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »7.
    4. Placez toutes les dalles d’organes et de tissus sur la même surface vers le bas sur la base du découpage (c'est-à-dire, toujours sur la droite ou le plan de la section gauche de chaque dalle orgue, Figure 3D, Figure 5) et compter les dalles (n).
    5. Obtenir des profils de section des dalles tissulaire par l’une des approches suivantes :
      1. Placer soigneusement les dalles de tissus sur des transparents en plastique correctement identifiés, tout en maintenant l’orientation de leurs surfaces de section supérieure et inférieure. Tracez les contours de la dalle de tissus sur les plastiques transparents à l’aide d’un stylo imperméable à l’eau (3E de la Figure1-2).
      2. Prenez des images photographiques des dalles tissu, tenant l’appareil verticalement au-dessus des surfaces de section (Figure 3F). Pour l’étalonnage, placez une règle de taille à côté des plaques de tissu.
      3. Scan les dalles de tissu sur un scanner à plat tout en maintenant l’orientation de leurs surfaces de section supérieure et inférieure (Figure 3). Pour l’étalonnage, placez une règle de taille à côté des plaques de tissu.
    6. Mesurer les surfaces des profils section (tracés, photographiée ou scannée) de toutes les dalles de tissu par l’une des approches suivantes :
      1. Superposition ou superposer les profils tracés orgue de dalle avec une taille appropriée, une grille calibrée de croisements équidistants imprimé sur une transparence en plastique et le comte tous les croisements frapper la zone de profil (3E de la Figure3-4; comparez à Figure 5). Calculer l’aire de profil section de chaque dalle orgue en multipliant le nombre de croisements frapper la zone profil de la zone correspondant à une croix.
        Remarque : Pour recevoir le volume suffisamment précis estime, choisissez une grille croisée avec une distance suffisamment fines entre Croix adjacentes, afin qu’une moyenne d’au moins 100 traverse frappera les surfaces de section des dalles d’un orgue dans chacun des cas examinés de l’étude . Tailles de grille Croix empiriquement recommandable pour des organes et des tissus plus porcine sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »7.
      2. Mesurer les surfaces des dalles tissulaire dans les images numériques des scans/photos à l’aide disponible dans le commerce ou freeware morphométrie soft - et appropriés applications matérielles (Figure 3 H), comme une image commerciale analyse système21, ou ImageJ22.
        ATTENTION : Dalle de tissu remarque que l’un (le premier ou le dernier) est placé sur le scanner reposant sur sa surface naturelle, respectivement, fait face à la caméra avec sa surface naturelle. Donc le numérisée d’image, l’image de cette dalle, ne s’affichent pas une surface de section. Par conséquent, aucun profil de zone de section n’est mesurée à l’image de l’image/photo scannée de cette dalle de tissus (Figure 3I). Remarque aussi de projection trop présents dans les images numérisées et des photographies des dalles d’organes et de tissus, c'est-à-dire, seulement mesurer les surfaces des profils section réelle, mais pas du tissu de l’image se trouvant derrière la surface de section de dalle (Figure 12 G-H).
    7. Calculer le volume de l’orgue estimé comme le produit de la somme de toutes les zones de profil section correspondantes de tous les blocs de tissu par cas (c'est-à-dire, toujours de la droite ou la gauche, respectivement, la surface de section supérieure ou inférieure de chaque organe de dalle et l’épaisseur moyenne des dalles (c.-à-d., le quotient de la longueur mesurée de l’axe vertical orgue (l) et le nombre de dalles)15.
  3. Détermination de l’étendue du retrait des dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie
    1. Préparer du matériel : Microtome lames, pinces, agar, moules de coulée de métal, scanner numérique et règle de taille (par exemple, papier millimétré).
    2. Couper une surface de section plane frais, auprès d’un échantillon de tissu fixe.
      Remarque : Si à l’aide d’échantillons de facilement déformables () tissus (tissu adipeux, tissus gélatineux), incorporez l’échantillon de tissu fixe dans la gélose avant découpe (Figure 4 a).
    3. Pour incorporer des exemples dans la gélose :
      1. Mélanger la poudre d’agar standard utilisé pour le milieu de culture de microbiologie avec un volume approprié d’eau (environ 0,5 à 1 g agar/10 mL d’eau) dans un bécher en verre. Agiter le mélange et chauffer dans un four à micro-ondes à 700 W jusqu'à ébullition pendant 3 à 5 s. agiter le mélange et faire bouillir à nouveau pour 3 à 5 s.
      2. Éventuellement, pour augmenter le contraste de la gélose à l’échantillon de tissu, teindre la gélose liquide, par exemple, à l’encre noire (Ajouter encre 1 mL à 10 mL d’agar liquide chaud et remuez vigoureusement).
      3. Verser l’agar chaud dans un moule de coulée (p. ex., un moule métallique utilisé pour paraffine déguisant, Figure 10 a-D) et submerger l’échantillon de tissu fixe dans l’agar chaud. Laissez l’agar refroidir jusqu'à solidification, enlever le moule et couper le bloc de gélose avec le tissu incorporé à l’aide d’un microtome ou une lame de rasoir.
        ATTENTION : Lors de la manipulation agar liquide chaud, porter des gants et des lunettes de protection. Des échantillons de tissus de processus fixés en solution de formaldéhyde dans un pot d’échappement hotte et portent des lunettes de protection et des gants de laboratoire.
    4. Placer l’échantillon avec sa surface de section vers le bas sur un scanner à plat, avec une règle de taille et de balayer la surface de la section (Figure 4 aB).
    5. Déterminer l’aire de la surface de la section de l’échantillon de tissu fixe (f) lors de l’analyse numérique, en utilisant une des techniques décrites dans l’étape 1.2.6 (Figure 4 b).
    6. Incorporer l’échantillon dans le milieu d’inclusion plastique, tels que l’époxy (p. ex., Epon) ou glycolmethacrylate/méthacrylate de méthyle (MMA/GMA)23, suivant des protocoles standard23,24,()25 La figure 4). S’assurer que la surface de la section de l’échantillon fixe scanné à l’étape précédente (1.3.4) est maintenue dans l’échantillon de plastique incorporé.
      NOTE : Pour maintenir l’orientation de la surface de la section de l’échantillon au cours du traitement de l’échantillon, toujours placer l’échantillon avec sa surface de section prévue vers le bas dans la cassette d’encastrement ou sur le moule de coulée ou de marquer la section prévue surface (ou l’autre côté de l’échantillon) avec de l’encre.
    7. Couper une coupe histologique du bloc plastique correspondant à la surface de section initiale de l’échantillon de tissu fixe (étape 1.3.2) en utilisant un microtome (Figure 4), monter la section sur une lame de verre (Figure 4) et souiller régulièrement) par exemple, l’hématoxyline et éosine tacher, H & E)24,25.
      ATTENTION : Pour recevoir une coupe histologique approximativement dans le même plan que la surface de section initiale de l’échantillon de tissu fixe, ajuster soigneusement la position du bloc en plastique dans le bâti du microtome avant découpe.
    8. Placez le chariot avec la section tachée vers le bas sur un scanner à plat avec un dirigeant de la taille et la section (Figure 4E) analyse.
    9. Déterminer l’aire de la section de l’échantillon de tissu plastique-encastré (Ae) lors de l’analyse numérique, en utilisant une des techniques décrites dans l’étape 1.2.6 (Figure 4F).
    10. Calculer le retrait moyen tissulaire liées à enrobage (pour les tissus respectifs et le milieu d’inclusion) des zones mesurées des profils de section correspondante d’échantillons de tissus avant et après incorporation en plastique enrobage moyen. Le facteur de retrait linéaire fs est calculé comme la racine carrée du quotient des domaines des profils section des échantillons de tissus n après incorporation en plastique enrobage moyen (A,e) et les domaines de la des profils de section correspondants des mêmes échantillons tissulaires avant l’intégration en plastique enrobage moyen (unf) (Figure 4)14.

2. pondéré en volume un échantillonnage aléatoire systématique par Point de comptage et le traitement des tissus sous-échantillons pour différents types d’analyses en aval7

  1. Préparer du matériel : règle, pied à coulisse, couteau, ciseaux, pinces, stylo imperméable à l’eau, point/Croix grilles imprimés sur des transparents en plastique et les tables de nombre aléatoires.
    NOTE : Modèles de copie pour traverser les grilles (5-60 mm) sont fournis dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »7.
  2. Placez l’organe/tissu sur une surface plate (base de coupe) et mesurer la longueur (l) de l’organe selon son axe longitudinal (Figure 5, Figure 6 a).
  3. Couper l’organe/tissu complet en tranches parallèles équidistantes orthogonal à l’axe longitudinal (Figure 5 b). Choisissez une distance d entre deux sections (c.-à-d., le sectionnement intervalle/section thickness, habituellement environ 1 cm) assez petites pour obtenir un nombre suffisant de tranches de tissus ou d’organes. Au hasard de positionner la première section à une distance comprise entre 0 et l’intervalle de sectionnement de la marge de l’orgue. Tout en découpage, visuellement juge la position et l’orientation de chaque plan de section pour obtenir des dalles d’organe/tissu approximativement parallèles d’épaisseur à peu près uniforme.
    Remarque : Le nombre de dalles de tissus ou d’organes nécessaires dépend de la taille de l’organe/tissu examiné et le nombre d’emplacements de l’échantillon de tissu. Si petits organes ou échantillons doivent être sectionnées en dalles minces de plus de 5 mm, incorporez les échantillons dans la gélose avant incision (Voir l’étape 1.3.3) et utiliser les dispositifs techniques pour trancher de l’échantillon de gélose incorporé. Des intervalles de sectionnement empiriquement recommandables pour les tissus et organes porcins plus, ainsi que des exemples pour le tranchage des dispositifs sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »7.
  4. Placez toutes les dalles d’organes et de tissus sur la même surface vers le bas sur la base de la coupe (Figure 6 b).
  5. Superposition les dalles de tissus avec une grille croisée Fluxsol imprimés sur un plastique transparent en plaçant le plus externe gauche supérieure de croix de la grille au-dessus d’un point au hasard sur le tissu (Figure 5-D, Figure 6 b).
    Remarque : Choisissez une grille croisée avec une distance suffisamment fines entre les croisements adjacentes, ainsi que dans tous les cas examinés de l’étude, au moins deux fois autant de croix va frapper la surface de la section du compartiment du tissu à prélever, comme le nombre d’échantillons qui doivent être tirées de ce compartiment tissulaire. Tailles de grille Croix empiriquement recommandable pour des organes et des tissus plus porcine sont indiqués dans les documents supplémentaires de « Tissu d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale modèles »7.
  6. Marquer et compter tous les croisements frapper le tissu (respectivement, le tissu secondaire compartiment à échantillonner). Toujours appliquer un mode uniform de comptage et de numérotation des croisements frapper le compartiment tissulaire à échantillonner dans toutes les dalles de tissus, par exemple, par une numérotation consécutive des croix respectives dans chaque ligne par ligne, à partir de la gauche vers la droite et de haut en bas, ou, par exemple, en numérotant les croix dans une dalle de tissu après l’autre dans le sens horaire, à partir de la Croix le plus proche de la position de 12:00, exemplairement démontrée dans Figure 5E.
  7. Divisez le nombre de croisements frapper le compartiment/tissu pour être échantillonnée (n) par le nombre d’échantillons doit être généré pour obtenir l’intervalle d’échantillonnage systématique (i).
  8. Déterminer la première position d’échantillonnage en choisissant un nombre aléatoire de x dans l’intervalle entre 1 et i. Pour ce faire, utilisez une table de nombres aléatoires. Marquer la première position d’échantillonnage (x) et chaque prochaine x + i, x + 2j’ai, x + 3i, etc., cross frapper le compartiment/tissu à prélever sur la transparence en plastique à l’aide d’un stylo imperméable à l’eau (Figure 5F).
    NOTE : Tables de numéro aléatoires peuvent être facilement et rapidement générés à l’aide d’un générateur de nombres aléatoires en ligne.
  9. Marquer le tissu emplacements correspondant à la marque traverse en soulevant légèrement la transparence en plastique et en plaçant un petit morceau de papier propre et vide de confettis sur la surface de la dalle du tissu à l’aide d’une paire de pinces (Figure 5, Figure 6E ).
  10. D’accise spécimen de tissu aux endroits échantillonnés (Figure 5 H, 6F Figure, Figure 7 a) et subdiviser davantage pour différents types d’analyses subséquentes (Figure 6, Figure 7 a-B), conformément à la Le tableau 1.
  11. Après le prélèvement, nettoyer les transparents en plastique avec l’eau tiède et au savon, sèche et les réutiliser.

3. génération d’uniforme aléatoire isotrope (IUR) Sections et les Sections verticales aléatoire uniforme (RVU) pour des Analyses quantitatives stéréologiques

  1. Technique de « Isector »
    1. Préparer du matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, moules de coulée sphérique (p. ex., casting de moules pour pralines, qui peuvent être obtenus auprès de fournisseurs de confiseur), foldback pinces et pinces.
    2. Placez un tissu suffisamment taille pièce (1 x 1 x 1 cm3) de fixe, choisi systématiquement au hasard dans un moule de coulée sphériques, tenir ensemble par des colliers foldback et remplissez le moule avec agar liquide chaud (Figure 8 a-E).
    3. Retirez la sphère de la gélose (Figure 8F) le moulage moule après solidification de l’agar.
    4. Rouler la sphère agar avec l’échantillon de tissu incorporé dans l’ensemble de la table, arrêter et il la section à une position aléatoire.
      Remarque : Le plan de section qui en résulte est une section IUR (Figure 8F-G).
    5. Aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu dans une résine plastique telles que GMA/MMA, maintenir l’orientation de la section IUR d’avion (voir 1.3.5).
  2. Technique de le « Orientation »
    1. Préparer le matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, forceps, une ou plusieurs tables nombre aléatoire, impressions de cercles de géométrie et pondérée en fonction du cosinus.
      NOTE : Modèles de copie des cercles sont fournis dans les précédentes publications8,26.
    2. Placer l’échantillon de tissu fixe (ou de tissu fixe agar-encastré) sur une impression d’un cercle de géométrie avec un bord parallèle au 0-180 ° direction (Figure 9 a, Figure 10F).
    3. Déterminer un angle aléatoire en utilisant la table numéro aléatoire. Trouver les marques correspondantes à l’échelle du cercle géométrie, qui dépend de l’échantillon. L’utilisation de ces marques, couper une section à travers l’échantillon (ou par l’intermédiaire de la gélose entourant l’échantillon de tissu embarqué), avec le plan de section étant orienté parallèles à la direction de l’angle aléatoire indiquée sur l’échelle de la géométrie cercle et vertical à la surface de l’échantillon (Figure 9 b-C, Figure 10F) de repos.
    4. Placer le bloc de tissu avec la surface de section générée à l’étape précédente face à la baisse sur un cercle pondérée en fonction du cosinus avec le bord de la surface de repos placé parallèlement à la direction de 1-1 (Figure 9, Figure 10 H).
    5. Répétez l’étape 3.2.3 et couper une nouvelle section à travers l’échantillon à un angle aléatoire déterminé à l’aide de la table numéro aléatoire (Figure 9 e-F, Figure 10I-J).
      Remarque : Le plan de section qui en résulte est une section IUR.
    6. Le cas échéant, déterminer la surface du profil de l’échantillon de tissu fixe pour la détermination du retrait tissulaire liées à enrobage (Figure 9-J) section IUR tel que décrit à l’étape 1.3 et aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu en plastique la résine comme GMA/MMA.
  3. Génération des Sections verticales aléatoire uniforme (RVU)
    1. Préparer du matériel : lames de rasoir ou microtome, agar, forceps, une ou plusieurs tables nombre aléatoire et impressions de géométrie cercles.
      NOTE : Modèles de copie des cercles sont fournis dans les précédentes publications8,26.
    2. Définir un axe vertical au sein de l’échantillon de tissu fixe qui est toujours reconnaissable dans l’échantillon/sections au cours des étapes ultérieures.
      Remarque : En général, l’axe vertical de la surface naturelle de l’échantillon de tissu est choisi comme l’axe vertical.
    3. Le cas échéant, intégrer l’échantillon dans la gélose (Figure 11 b).
      Remarque : L’incorporation de l’Agar avant VUR ou IUR-coupes de l’échantillon fixe est généralement recommandé pour les échantillons de petites, minces, fragiles ou douces. Également utiliser agar-incorporation des échantillons pour faciliter le positionnement de l’échantillon VUR sectionné au cours de l’incorporation subséquente de l’échantillon dans un milieu en résine plastique.
    4. Placez l’échantillon sur une impression d’un cercle en géométrie, l’axe vertical étant orientée perpendiculairement au plan de la table de la table/papier (Figure 11).
    5. Couper l’échantillon à un angle aléatoire (déterminé à l’aide d’un tableau de nombre aléatoire) avec le plan de section orthogonale à la table et parallèle à l’axe vertical pour recevoir un plan de section VUR (Figure 11).
    6. Le cas échéant, déterminer la surface du profil de l’échantillon de tissu fixe pour la détermination du retrait liées à enrobage tissu tel que décrit à l’étape 1.3 (à comparer à la Figure 9-J) section IUR et aller de l’avant pour incorporer l’échantillon de tissu dans résines plastiques tels que GMA/MMA.

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Representative Results

Technique d’immersion pour détermination de la masse de tissus ou d’organes

Figure 12 a -B montre la détermination représentative de la densité et le volume d’un rein de porc en utilisant la technique d’immersion décrite à l’étape 1.1 (Figure 1, Figure 2). Des résultats plus représentatifs des mesures de la densité des tissus et des organes porcins supplémentaires sont présentés au tableau 2. Une liste plus complète des densités de référence des divers tissus porcins et organes est montrée dans le « Tissu modèles d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale »7. La validité des valeurs de mesure de densité des tissus obtenus à l’aide de la méthode de submersion peut être estimée par des mesures répétées du même échantillon et des échantillons indépendants. Tissus plus porcines affichent des valeurs de densité légèrement supérieures à l’eau (ρeau ≈ 1.0), tandis que tissus nager dans une solution saline (tissu adipeux, du tissu pulmonaire) affichent les densités < 1,0.

Cavalieri méthode pour la détermination des volumes de l’orgue

Figure 12 -F montre la détermination représentative du volume du rein de porc (le même organe tel qu’illustré à la Figure 12 a-B). Les zones de la surface de section des dalles orgue ont été déterminées par point-comptage, en utilisant une grille superposée de croix imprimée sur un plastique transparent, ainsi que par la mesure planimétrique des zones section des dalles d’orgue dans une image numérisée des dalles (payant attention aux projection excessive des tissus situés derrière les surfaces de section de dalles, Figure 12 G-H). L’exactitude du volume d’organes et de tissus les données obtenues par la performance de l’approche de Cavalieri (étape 1.2, Figure 3) peuvent être estimées par comparaison au volume respectif calculée à partir de la masse et la densité de l’organe/tissu. Les volumes du rein examinés Figure 12 déterminée par la méthode de submersion et l’ou les méthodes Cavalieri diffèrent de moins de 1 % par rapport à l’autre. Mesure de la précision de l’estimation de volume de Cavalieri, son coefficient d’erreur (CE) peut être calculée, comme décrit plus tôt15.

Détermination du retrait de dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie

Des résultats représentatifs de l’étendue du retrait des tissus associé à l’incorporation des échantillons de tissu porcin (tissu cortical rénal) dans les résines plastiques (GMA/MMA ou époxy) pour examen quantitative globale figurent au tableau 2 (précédemment données non publiées). Les facteurs de retrait linéaire indiqués dans le tableau 2 ont été déterminés comme décrit dans l’étape 1.3 (Figure 4). Ils se réfèrent à une réduction de volume en trois dimensions de 29 % pour l’incorporation de GMA/MMA et 22 % pour l’incorporation de l’époxy de porcin cortical rénal. La figure 13 montre des exemples représentatifs des échantillons adéquatement et insuffisamment préparés d’agar-embedded, fixés au formol le tissu adipeux pour la mesure de l’aire de surface de section échantillon avant enrobage plastique.

Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume par Point de comptage et de traitement des tissus sous-échantillons pour différents Types d’analyses en aval

La technique « sectionnement et comptage de point » pour l’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume des organes parenchymateux (étape 2, Figure 5, Figure 6, Figure 7) représente une méthode établie et robuste pour la génération de représentant échantillons pour plusieurs types d’ultérieures des analyses2,7. Résultats représentatifs de la génération d’échantillon de la biobanque systématiquement au hasard échantillonnés, extrêmement redondant de différents organes porcins et tissus, avec ultérieure différentielle de traitement des échantillons relatifs à plusieurs différents tissus excisés en aval Méthodes d’analyse à l’aide de la technique d’échantillonnage décrite à l’étape 2 (Figure 5, exemplairement démontrée dans la Figure 6et Figure 7) ont été précédemment publiés2. Génération d’échantillons de la biobanque du tissu hépatique dans une biobanque porcine précédente étude2, par exemple, foie de porc ont été complètement sectionné en environ 20 tranches de 2-3 cm d’épaisseur, superposée avec un avec un 3 cm Croix grille, tel que décrit à l’étape 2 et 16 emplacements de tissu d’environ 2 x 2 x 2 cm3 ont été systématiquement au hasard échantillonnés et excisées dans chaque cas. De chaque échantillon excisé, 5 sous-échantillons générés par la suite pour les analyses moléculaires (congelés à-80 ° C) des sites échantillonnés, un sous-échantillon pour cryohistology, un sous-échantillon a été corrigé dans la solution de Methacarn et l’autre dans une solution de formaldéhyde pour paraffine ultérieur encastrement et histologique- et examen immunohistochimique. La génération des 74 échantillons différents par carton (jusqu’au gel ou le transfert des échantillons en solution de fixation) a été réalisée à environ 20 min, moyenne2. La praticabilité et du succès de l’échantillonnage décrite et sous-échantillonnage approche peut être estimé par évaluation de la qualité des échantillons générés (c.-à-d., la qualité de la RNA - ou protéine isolats, préservation de la histomorphologiques et Propriétés ultrastructurale des échantillons de tissus, leur aptitude à immunohistological, analyses, etc.)2

Génération d’isotrope uniforme aléatoire (IUR) et des Sections verticales aléatoire uniforme (RVU) pour des Analyses quantitatives stéréologiques

Les techniques démontrées pour une génération orienté vers l’avant du isotrope uniforme aléatoire (IUR) sections et les sections VUR porcin (biobanque) d’échantillons de tissus (étape de protocole 3, Figure 8, Figure 9, Figure 10, Figure 11), permettant l’examen de la plupart des paramètres quantitatifs stéréologiques, peut rapidement être accompli avec une certaine pratique et sans difficultés raisonnables ou sources d’erreur. Par conséquent, la génération de IUR-échantillons, illustré à la Figure 9 (technique d’isector) et de la Figure 10 (technique de l’orienteur) est pleinement représentative pour ces méthodes.

Figure 1
Figure 1 : illustration schématique de la « technique d’immersion » pour la détermination des densités de tissus ou d’organes. (A) mesure du poids de l’échantillon (c'est-à-dire, masse, m,S). Échelle (B) être taré au poids d’un bécher rempli avec du sérum physiologique 0,9 % de 20 ° C et un porte-échantillon immergé dans la solution saline à une position définie, marquée. (C) une immersion complète de l’échantillon à la position marquée du porte-échantillon sans contact les parois ou au fond du bécher. Le poids affiché à l’équilibre est le poids du volume de solution saline déplacé par l’échantillon). La densité de l’échantillon est calculée comme indiqué (ici : échantillon de ρ = mS/VS = mS/ (mL/1.0048) = 5.153/(4.538/1.0048) = 1,141 g/cm³). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : « Technique de Submersion », pour la détermination des densités de tissus ou d’organes. (A) porte-échantillon différent construit à partir de fil de fer mince. De gauche à droite : une boucle de fil de fil de fer mince dans une canule fine injection, un panier hélicoïdal de fil pour tenir les spécimens petits et fragiles et une simple toile de fil de fer mince. Flèches A-C indiquent les positions auxquelles les titulaires de l’échantillon sont immergés dans une solution saline. (B, C) Positionnement du porte-échantillon au cours de l’immersion de l’échantillon en solution saline (cf. Figure 1 C). (B) complet porcine hypophyse placé dans un porte-échantillon en forme de panier. (C) échantillon du myocarde porcin. Notez l’immersion complète des échantillons dans une solution saline sans contact avec les parois ou le fond du bécher. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : illustration schématique de l’application de la méthode de Cavalieri pour la détermination des volumes d’organes porcins. (A) pièce pile exemple pour la compréhension du principe de Cavalieri. Pour plus d’informations, consultez Introduction. (B-H) Démonstration de schématique de l’estimation du volume d’un rein de perfusion-correction. (B) mesure de la longueur (l) du rein selon son axe longitudinal. (C) coupe de l’orgue en n tout aussi épais (d) parallèle tranches orthogonales à l’axe longitudinal d’orgue. (D) dalles orgue placé sur la même surface vers le bas. Notez que la première dalle de tissu (à droite) est placé sur sa surface naturelle, c'est-à-dire, qu’il n’a pas une surface de section. (E-H) Différentes approches pour déterminer les section des surfaces de dalles tissulaire. (E) traçant le plan de chaque dalle d’orgue avec un stylo imperméable à l’eau sur une superposition de transparence en plastique des profils dalle orgue décrit avec une taille appropriée, calibré Croix grille imprimé sur un plastique transparent, comptage des croisements frapper le secteur de profil. La zone de profil section organ dalle est calculée à partir de croisements frappant le secteur de profil de la section et la zone correspondant à une croix. (F,G) Détermination des zones de la section de l’orgue dalles en photos prises en orientation verticale sur les surfaces de section (F), ou dans des images numérisées des dalles tissu (G), avec les dirigeants pour l’étalonnage. (H) Détermination des zones section des dalles tissulaire dans les images numériques des scans/photos à l’aide de logiciels appropriés morphométrie. (j’ai) calcul du volume estimé de l’orgue comme le produit de la cumulative zone des surfaces correspondantes de la section de toutes les dalles d’orgue multipliés par l’épaisseur moyenne de l’orgue dalles15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : illustration schématique de la détermination du retrait de dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie. Coupe (A) d’une surface de section frais, plan auprès d’un échantillon de tissu fixe (stabilisation de la forme de facilement déformables (molles) tels que les tissus adipeux ou pulmonaire en incorporant dans l’agar avant incision). Balayage de la surface de la section de l’échantillon avec un dirigeant de la taille. (B) détermination planimétrique de la superficie de la surface de la section de l’échantillon de tissu fixe (f). (C) Routine intégrant de l’échantillon en plastique enrobage moyen. (D) préparation d’une coupe histologique du bloc plastique avec préservation du plan de la section de l’échantillon. Montage de la section sur une lame de verre et coloration systématique de la diapositive. Balayage (E) de la lame avec un dirigeant de la taille. (F) planimétrique détermination de la superficie de la section de l’échantillon de plastique incorporé (A,e). (G) calcul de l’étendue du retrait de tissu incorporation liées comme le quotient des zones mesurées des profils de section correspondante d’échantillons de tissus avant et après incorporation en plastique enrobage moyen14. Sur le côté droit, les images montrent la surface de la section d’un échantillon de formaldéhyde-correction du tissu graisseux, incorporé dans la gélose noircies d’encre avant l’intégration en résine plastique (en haut) et le profil de section correspondant (coloration HE) de l’échantillon GMA/MMA-incorporé (en bas). Barreaux de l’échelle = 2 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : illustration schématique des pondérée en fonction du volume d’échantillonnage aléatoire systématique. L’exemple présenté montre un échantillonnage aléatoire systématique des six emplacements de tissu dans le cortex rénal d’un rein de perfusion-correction. (A) mesure de la longueur (l) du rein selon son axe longitudinal. (B) complète la section de l’organe entier tranches tout aussi épais (d) parallèle orthogonal à l’axe longitudinal d’orgue. (C) dalles organe/tissu placé sur le même (c'est-à-dire, la droite ou la gauche) surface orientée vers le bas. (D) superposition des dalles avec une grille croisée Fluxsol tissus imprimés sur un plastique transparent. La plus externe gauche supérieure de croix de la grille est placé au-dessus d’un point au hasard à l’extérieur du tissu (indiqué par un point bleu, ). Counting (E) et la numérotation de tous les croisements frapper le cortex rénal. Dans l’exemple présent, les croisements frapper le cortex rénal sont numérotés consécutivement dans la dalle d’un rein après l’autre (à partir de la gauche vers la droite), dans chaque instance de dalle dans le sens horaire, à partir de la Croix le plus proche de la position de 12:00. Ici, les 36 croisements frappé le cortex rénal. Six postes d’échantillonnage doivent être échantillonnés. Par conséquent, chaque sixième position où une croix frappe le tissu est échantillonnée (36/6 = 6). (F) dans le présent exemple, la position de la quatrième cross (N ° 4) frapper le cortex rénal est choisi au hasard comme la première position d’échantillonnage. Chaque sixième cross frapper le cortex rénal est marqué sur la transparence en plastique à l’aide d’un stylo imperméable à l’eau. Dans l’exemple présent, ce sont les positions 4, 10, 16, 22, 28 et 34. (G) marquage des emplacements des tissus correspondants par petits bouts de papier propre et blanc confettis placé sur la surface du tissu. Excision (H) des échantillons de tissus des lieux au hasard systématiquement échantillonnées et traitement subséquent pour approfondir les analyses. Ce chiffre a été modifié d’Albl et coll. (2016), figures S236 et S237, page 186 (suppléments)7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du Volume du cortex rénal d’un rein de porc (voir Figure 5) et les règles de comptage point. Rein de porc frais (A). (B) rein sectionné en tout aussi épaisses tranches parallèles orthogonales à l’axe longitudinal orgue, recouvert de croix grille imprimé sur un plastique transparent. Le cercle rouge indique la position du point aléatoire utilisée pour tirer au hasard la position de la grille de la croisée. Illustration (C) des règles de comptage de point : un cross/point est compté comme frapper le compartiment tissulaire d’être échantillonnés (compartiment de référence), si l’interne supérieure droite angle de l’axe vertical et barre horizontale de la Croix (flèche) couvre le tissu. (D) marquage des croisements frappant le cortex rénal et échantillonnage aléatoire systématique des emplacements de tissu (ici, 119 Croix frappé le cortex rénal et 17 emplacements sont systématiquement aléatoirement échantillonnées en utilisant un échantillonnage intervalle j’ai = 7). (E) au hasard systématiquement échantillonnées emplacements du cortex rénal tagué par papier confetti. (F) prélevés les échantillons. (G) plus subdivision des échantillons excisées pour un traitement ultérieur des sous-échantillons pour types différents analyse en aval. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Subdivision des échantillons de tissus excisés de systématiquement emplacements de tissus prélevés au hasard et le traitement des sous-échantillons pour types différents en aval analyse. Illustration schématique (A) de la génération de sous-échantillons de tissu d’un endroit systématiquement au hasard échantillonné du cortex rénal (tissu natif) pour différentes analyses (par exemple, FF-PE : échantillon fixés au formol et inclus en paraffine et MTC-PE : Exemple Methacarn-fixes et paraffine pour microscope photonique histologie ; CRYO : Échantillon pour histologie surgelé ; Échantillons de tissu-80 ° C:-glace congelée pour l’analyse moléculaire). (B) l’Excision des endroits échantillonnés systématiquement au hasard du cortex rénal d’un rein de perfusion-correction, outre de la subdivision des échantillons de tissus excisés et traitement des sous-échantillons pour analyses morphologiques qualitatives et quantitatives. Dalles de perfusion-correction rein de porc (1), Croix-grille (2), tableau numéro aléatoire (3), géométrie et cosinus-pesé cercles (4) pour la génération des sections IUR (voir Figure 9, Figure 10), des solutions différentes de fixation (5, 6, 7) et échantillon récipient pour échantillons microscopiques électron (8). Ce chiffre a été modifié par Albl et al. (2016), figure S239, page 186 (suppléments)7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : « Isector » section Préparation de tissu porcin fixés au formol. (A) échantillon de perfusion-correction porcine cortex rénal. Moules de coulée sphérique (B). Gélose de liquide (C). (D-E) Agar-incorporation des échantillons dans des moules de coulée sphérique. (F) Agar sphère avec l’échantillon de tissu incorporé. (G) Agar sphère avec mouchoir incorporé sectionné à une position aléatoire (plan de section IUR). Ce chiffre a été modifié par Albl et al. (2016), figure S6, page 14 (suppléments)7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : illustration schématique de la technique de « Orienteur » pour la préparation des sections IUR. (A) ou les échantillons de tissu fixe placée sur un cercle de géométrie (ci1) avec un bord parallèles au 0-180 ° direction (indiquée par une ligne rouge). (B) sectionnement de l’échantillon à un angle aléatoire (ligne verte). (B, C) Généré récemment surface de section de l’échantillon de tissu (indiqué en couleur verte). (D) échantillon placé sur un cercle cosinus-pesé (ci2) avec la surface transversale générée à l’étape précédente face à la baisse et un bord de la surface de repos parallèle à la direction de 1-1 (indiquée par une ligne rouge). Coupe (E) de la seconde section à travers l’échantillon à un angle au hasard. (F) résultant de façon aléatoire isotrope section plane de l’échantillon (indiqué en bleu). (G) Détermination de l’aire de la section IUR de l’échantillon de tissu fixe pour l’estimation de rétraction tissulaire liées à enrobage tel que décrit à l’étape 1.3. Embedding (H) de l’échantillon de tissu en résine plastique. (j’ai) sectionnement du bloc en plastique est sectionné (parallèle au plan de IUR) sur un microtome. (J) montage des sections plastique IUR sur lames de verre. Ce chiffre a été modifié par Albl et al. (2016), figure la S8, page 15 (suppléments)7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : technique « Orienteur » pour la préparation des sections IUR des échantillons de tissu agar-encastré. (A-D) Éventuellement, une gélose-incorporable un spécimen échantillon systématiquement au hasard des tissus fixes (enrobage agar est utile pour des échantillons de tissus petit, afin que le premier ou les deux sections aléatoires peuvent être positionnées dans la gélose sans couper le tissu). Positionnement (E) du bloc de gélose sur un cercle de géométrie (ci1) avec une arête parallèle à la direction de 1-1 (indiquée par une ligne rouge). (F, G) Sectionnement du bloc à un angle aléatoire (ici : 15-15, ligne verte) déterminée à l’aide d’un tableau de numéro aléatoire (rnt, green arrow). La suite (H) positionnement du bloc de gélose sur la surface de la section coupée en FA sur un cercle de pondérée en fonction du cosinus (ci2) avec le bord de la surface de repos placé parallèlement à la direction de 1-1 (indiquée par une ligne rouge). (j’ai) deuxième section coupe à travers l’échantillon à un angle aléatoire (ici : 20-20, indiquée par une ligne bleue), déterminée en utilisant une table de nombre aléatoire (flèche rnt, bleu). (J) qui en résulte en droit l’article plan de l’échantillon de tissu. Ce chiffre a été modifié par Albl et al. (2016), figure S9, page 16 (suppléments)7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : illustration schématique de la section Préparation de VUR. Échantillon de tissu fixe (A) à défini (identifiable) axe vertical (par exemple, verticale à sa surface naturelle). Échantillon de tissu fixe (B) incorporé dans la gélose. (C) positionnement de l’échantillon de tissu de the(agar-embedded) à une impression d’un cercle de géométrie (ci1). VA: axe Vertical. Sectionnement (D) de l’échantillon à un angle aléatoire (tableau numéro aléatoire ; ici : 30-30 direction, indiquée par une ligne bleue) avec le plan de section étant orienté perpendiculairement à la table et parallèle à l’axe vertical de l’échantillon. Plan de section VUR résultant de l’échantillon de tissu (indiqué en bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : volumétrie de représentant d’un rein de porc. (A-B) Technique de submersion. (A) déterminer le poids des reins (mkid). (B) détermination du poids du volume de solution saline déplacé par le rein (mdispl.saline). Le rein est accroché sur une corde et totalement immergé dans une solution saline sans toucher le fond ou les parois du bécher. Le volume calculé du rein est 92,6 cm³. (C-D) Technique de Cavalieri, planimétrie par comptage de point. (C) mesure de la longueur (l) du rein selon son axe longitudinal. (D) Détermination des zones section Profil du rein dalles par point en comptant après que superposition d’une grille de croisements équidistants imprimés sur un plastique transparent. Ici, le volume estimé du rein est 93,3 cm³. (E-F) Technique de Cavalieri, planimétrie des images numérisées des zones Profil section des dalles rein (F). Ici, le volume estimé du rein est de 92,8 cm³. En C-E, le naturel autour de surface de la première ou la dernière dalle du rein placé sur le scanner ou recouvert par la transparence de la grille croisée n’est pas une surface de section et par conséquent, aucune zone de surface de section n’est mesurée dans cette dalle de tissu. (G-H) Démonstration d’overprojection dans les images numérisées des dalles de l’organe ou le tissu (G) et en dalles d’organe/tissu recouvertes d’une transparence de croix grille (H). Overprojecting parties du tissu de la dalle de l’orgue sont indiquées par des lignes pointillées de blancs et noirs. Seules les zones des profils section réelle (c'est-à-dire, le tissu entouré de pointillés blancs partiellement indiqué) sont déterminés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 13
Figure 13 : illustration représentative d’adéquate (A) et sous-optimal (B) préparation des échantillons de tissu agar-encastré pour détermination du retrait de tissu associés à incorporation des échantillons en plastique histologique intégration médias. (A) image numérisées de la surface de la section d’un échantillon fixe de porcin du tissu adipeux sous-cutané avant enrobage en résine plastique. L’échantillon est incorporé dans la gélose noircies d’encre pour la stabilisation de la forme de l’échantillon et clairement identifier le périmètre de rayonnement de surface section. (B) le contour Indistinct de la bulle d’air de surface et emprisonné de section (flèche) dans la gélose. Barreaux de l’échelle = 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Analyse Échantillon Traitement
Type de Méthode (s)
Analyses moléculaires ARN de transcription, protéine, métabolite et profils des lipides,
métabolomique analyse, analyse de l’ADN
Petits morceaux * du tissu (natif) frais Gel sur la glace sèche ou dans l’azote liquide. Conserver à-80 ° C.
Analyses morphologiques qualitatives Histologie
[microscopie photonique, incl. immunohistochimie (IHC) et l’hybridation in situ]
Frais (en natif) — ou in situ - fixée * des échantillons de tissus Utiliser différents fixateurs (p. ex., solution de formaldéhyde de 4 %) et l’incorporation des médias (paraffine, GMA/MMA, époxy), selon le cas.
Cryohistology
(coupes congelées, incl. IHC)
Échantillons de tissu (native) frais Échantillon dans blocage moyen et geler dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide.
Analyses ultrastructurales
[microscopie électronique, avec transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage]
Petits morceaux de frais (natif) — ou in situ- fixée * des échantillons de tissus Difficulté d’échantillon en solution de glutaraldéhyde 2.5 – 6,25 % et incorporer en résine plastique époxy.
Analyses morphologiques quantitatifs Microscopie optique Frais (en natif) - ou in situ - fixe * des échantillons de tissus Préparer IUR-sections (Universidade-, isector-sections) et/ou VUR-sections d’échantillons de tissus incorporé en plastique.
NOUS. Petits morceaux de frais (natif) — ou de in situ - fixée * tissus Préparer les sections IUR (Universidade-, isector-sections) des échantillons de tissu époxy-encastré.

Tableau 1 : traitement des sous-échantillons de tissus excisés de lieux systématiquement au hasard échantillonnées pour les types de différentes analyses en aval. Selon le protocole expérimental de l’étude et l’organe/tissu sous enquête, différents nombres de sous-échantillons doivent être excisés de chaque emplacement de tissus prélevés systématiquement au hasard et transformées pour différents types d’analyses en aval. Des protocoles détaillés pour plus porcines organes/tissus et types d’étude sont fournis dans le « Tissu modèles d’échantillonnage Guides pour porcin biomédicale »7. GMA/MMA : Glycolmethacrylate/méthacrylate de méthyle. IUR : Isotrope uniforme aléatoire. VUR : Vertical uniforme aléatoire. * max. 2 x 2 x 2 mm3. par exemple, perfusion fixée tissu ou tissu pulmonaire de poumons instillé avec solution de fixation.

Méthode Résultats représentatifs
Technique d’immersion pour détermination des densités de tissus ou d’organes (étape 1.1, Figure 1, Figure 2) Organe ou le tissu porcin Ρ (g/cm³)
Foie 1.071 ± 0.007
Pancréas 1,062 ± 0,016
Myocarde du ventricule 1.036 ± 0,014
Rein 1.044 ± 0,006
Le tissu adipeux viscéral abdominal * 0,921 ± 0,032
Glande thyroïde 1.061 ± 0.007
Cerveau 1.051 ± 0.007
Glande surrénale 1.063 ± 0,025
Muscle squelettique ** 1,074 ± 0,003
Données sont moyens ± poids d’organes et de tissus spécifiques SD. ont été déterminées en n = 18 porcs (14 femelles et 4 mâles cochons ; âge 60 jours à 2 ans ; 30 et 250 kg de poids corporel). * Le tissu adipeux du mésentère jéjunale. ** Les valeurs moyennes pour le M. longissimus dorsi, M. tibialis cranialis, M. triceps brachial et M. gluteobiceps.
Détermination du retrait de dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie (étape 1.3, Figure 4) Organes/tissus Milieu d’enrobage       fS
Cortex rénal (porc) GMA/MMA 0.89 ± 0,02
Revêtement époxy 0,92 ± 0,02
Les données sont moyen ± SD des mesures des 24 échantillons de 12 porcs. fS: facteur de correction de retrait linéaire.

Tableau 2 : Résultats représentatifs des densités de certains organes et tissus porcins7et les facteurs de correction du retrait linéaire pour rétraction tissulaire liées à enrobage du tissu cortical rein de porc en plastique différente intégrant des médias.

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Discussion

Génération des collections échantillon biobanque de modèles animaux porcins nécessite des techniques robustes et protocoles pour la détermination des volumes d’organes et de tissus, la génération reproductible de représentant, des échantillons de tissu redondant convenant à un large éventail de Méthodes d’analyse différentes et pour la randomisation de l’orientation des sections d’échantillon pour des analyses quantitatives stéréologiques. Les méthodes décrites dans le présent article sont adaptés à la taille des tissus et organes porcins et ont été développés pour répondre efficacement à ces demandes2,7. Ils reposent sur des principes méthodologiques bien reconnus et ont prouvé auparavant leur praticabilité dans différentes études publiées2,7,12,21. Les méthodes recommandés sont importants pour les différents types d’études qui examinent les échantillons de tissus ou d’organes, puisqu’elles fournissent une base pour la production d’échantillons représentatifs et pour l’acquisition d’une variété de paramètres qui autrement ne peut être déterminée. Ces méthodes peuvent rapidement être effectuées avec peu d’effort et sont compatibles avec pratiquement tous les types d’analyses en aval. Par conséquent, ils sont jugés acceptables, non seulement pour les projets de modèle animal porcine biobanque, mais sont aussi utiles dans les études impliquant des analyses histomorphologiques quantitatives d’échantillons de tissus d’autres espèces de gros modèle animal (p. ex., moutons), comme ainsi que dans des études vétérinaires. Compte tenu de la technicité des méthodes différentes, quelques étapes critiques et les limites doivent être considérés lors de la mise en œuvre des protocoles des techniques respectifs.

Technique d’immersion pour détermination de la masse de tissus ou d’organes

Au cours de la détermination des densités à l’aide de la méthode de submersion (étape 1.1, Figure 1, Figure 2), soins il faut ne pas toucher les parois ou le fond du bécher avec l’échantillon de tissu ou le porte-échantillon tandis que le tissu le tissu échantillon est immergé dans une solution saline. Dans le cas contraire, la balance affiche le poids de l’échantillon et non le poids du volume de solution saline déplacé par l’échantillon. Pour les échantillons de tissus très petit/lumière (quelques mg), la méthode d’immersion pour la détermination de la densité des tissus est limitée, le procédé de la solution saline et le quotient négative élevé du volume de l’échantillon pour le volume de liquide d’immersion dans le bécher, qui est entravant l’exactitude de la mesure. Ici, le poids de l’échantillon pourrait servir pour les autres calculs plutôt que le volume calculé la densité. Détermination de la densité des tissus par submersion n’est pas aussi efficace pour les tissus pulmonaire (non fixées) fraîches, en raison du contenu incompatible d’air dans le tissu et dans certains cas, où les organes sont perfusés/instillé expérimentalement avec des fixatifs.

Cavalieri méthode pour la détermination des volumes de l’orgue

La méthode de Cavalieri volumétrie des tissus et organes porcins est plus lourde par rapport à la détermination du volume orgue du poids des organes et densité. Toutefois, il est adapté aux organes ne peuvent correctement être pesée en raison de leur traitement expérimental (p. ex., fixé à la perfusion des organes ou les poumons instillées avec solution de fixation). Ici, la méthode de volumétrie Cavalieri idéalement est cumulable avec la technique d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume décrite à l’étape 2 (Figure 5, Figure 6, Figure 12). Au cours de l’estimation des volumes d’organes et de tissus provenant des régions de profils de section de tranches parallèles et équidistants de l’organe/tissu (Cavalieri approche, point 1.2, Figure 3), le maintien de l’orientation du tissu dalles (plan de section supérieure et inférieure ), ainsi que la détermination précise de la zone de tous les profils de section sont d’une grande importance. En particulier, si des images numériques ou des scans de dalles d’orgue sont analysés planimetrically, overprojections des tissus (à l’extérieur de l’avion de tissus sectionnés) de la dalle de tissus (Figure 12G-H) doivent soigneusement considérer pour fournir fiable volume budget des dépenses.

Détermination du retrait de dimensions liées à l’incorporation des tissus lors du traitement des échantillons de tissus pour histologie

L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage dépend du milieu d’enrobage et le type de tissus et peut également varier entre les échantillons traités différemment du même tissu.

Considérant que les coupes congelées sont réputés ne présenter pratiquement aucun retrait dans le plan X-Y et enrobage plastique provoque généralement peu de rétrécissement du tissu, tissu liées à enrobage rétrécissement est particulièrement vaste dans des échantillons de tissus inclus en paraffine et compromettra généralement significativement les analyses morphologiques quantitatifs des paramètres dimensionnels dans les coupes histologiques de ces échantillons. En plus de la grande partie du retrait global en trois dimensions, enrobage de paraffine entraîne également un rétrécissement non-uniforme, différentiel, anisotrope et variable de l’échantillon et des différentes structures anatomiques, les types de tissus et les types de cellules au sein le tissu échantillon8,13. Par ailleurs, en particulier dans plus épais, les coupes histologiques d’échantillons de tissus inclus en paraffine, l’ampleur du retrait de tissu peut-être être différentes aussi significativement dans le X-Y et la Z-direction de la section. Cela peut être dû à un rétrécissement différentielle de la zone de section (sur axe X-Y) et la hauteur de section (par exemple, l’épaisseur de coupe verticale) au cours de l’étirement de la section dans le bain d’eau chaude tissu flottation après que la section est coupée du tissu bloquer et Pendant les procédures ultérieures de traitement, coloration et recouvrement de la section monté sur une glissière (c.-à-d., un effondrement homogène de l’axe z de la section) de verre8. En outre, en épaisseur importante, il pourrait y avoir une compression relativement plus forte des régions au sein de la section section-avion-près de tissu tandis que la section est découpée dans le bloc de tissu (conduisant à une déformation différentielle de l’axe z de la section)19 . Ces effets peuvent fausser alors également les estimations du nombre de structures tissulaires au sein de la section par des méthodes d’analyse stéréologique quantitatifs distincts, tels que l’optique disector. Par conséquent, prédiction, surveillance et correction de rétraction tissulaire liées à enrobage n’est pas faisable pour des échantillons de tissus inclus en paraffine8.

En revanche, l’ampleur du retrait du volume des échantillons de tissu incorporé dans les résines plastiques, tels que le GMA/MMA ou époxy, est nettement plus faible et, surtout, plus uniforme. Par conséquent, enrobage en résine plastique avec un supposé homogène, isotrope et global rétrécissement du tissu est avantageuse pour plusieurs méthodes d’analyse des différents paramètres morphologiques quantitatifs17,18. Au cours de l’estimation des pertes de tissus associés à enrobage en résine plastique, la forme du tissu fixe ne doit pas en outre être déformée pendant la procédure d’intégration, afin de permettre la comparaison des zones correspondantes du profil section des fixes et embarqués échantillons. Cela peut être difficile dans des échantillons de tissus mous ou facilement compressible tels que les tissus adipeux ou des poumons ou dans des échantillons de tissus à forte teneur en fluide. Ici, incorporation de l’échantillon fixe dans la gélose avant incision du tissu est utile pour stabiliser la forme de l’échantillon de tissu pendant le plastique ultérieur intégrant la procédure (étape de protocole 1.3., Figure 4). Pour obtenir des données fiables, des mesures répétées de la contraction tissulaire liées à enrobage doivent être effectuées, en utilisant différents échantillons du même tissu. L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage est exprimée comme le facteur de rétrécissement tissu linéaire fs (étape de protocole 1.3.9., Figure 4). Des exemples d’équations à l’aide de fs pour correction de rétrécissement de longueur, de superficie et paramètres de volume de structures tissulaires différents figurent dans plusieurs des études quantitatives stéréologique14, 21,,27.

Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume de point de comptage et traitement des sous-échantillons de tissu pour les types de différentes analyses en aval

La technique présentée pondérée en fonction du volume d’échantillonnage pour les organes porcins constate une fois de lieux d’échantillonnage aléatoire dans les tissus et génère par la suite tous les échantillons nécessaires pour approfondir les différentes analyses de sous-échantillonnage des échantillons de tissus excisés de ces lieux7. Dans les régimes pondérée en fonction du volume d’échantillonnage aléatoire systématique, chaque emplacement de l’échantillonnage possible dans le volume total de l’organe/tissu en cours d’examen a exactement la même chance aléatoire à échantillonner et généralisabilité est assurée par la collection d’un nombre suffisant d’échantillons. À l’aide de dessins pondérée en fonction du volume d’échantillonnage aléatoire systématique pour la génération d’échantillons provenant des organes parenchymateux, empêche donc, résultats de l’analyse peut-être biaisées par des distributions inégales (potentiellement inattendues et non reconnues) de distinctes propriétés fonctionnelles ou morphologiques de tissus dans différents endroits d’un organe, qui ont été démontrés, par exemple, pour le volume moyen et la densité de volume numérique des hépatocytes porcines dans différentes régions du parenchyme hépatique28 . La stratégie recommandés « tissus-repoussage et sous-échantillonnage » d’organes porcins est facilement compréhensible, satisfait aux exigences techniques des méthodes d’analyses en aval et peut être rapidement menée et adaptée aux exigences d’une étude spécifique, afin d’éviter des biais d’échantillonnage systématique, réduisant la variabilité expérimentale et en augmentant la précision de l’expérience globale, tout en étant plus efficaces que les stratégies dans lesquels chaque emplacement d’échantillonnage simple est déterminée aléatoirement d’échantillonnage9 ,,15. Le nombre d’échantillons qui doivent être produites, dépendent évidemment le paramètre examiné et sa variabilité dans les échantillons provenant de différents endroits de l’organe/tissu échantillonné. Pour la génération des collections d’échantillons biobanque conçu pour permettre l’examen d’un maximum de paramètres différents (non précisé au moment de l’échantillonnage) par une variété de méthodes d’analyse différentes, une telle stratégie d’échantillonnage prospectif planifie généralement génération d’un nombre relativement élevé d’échantillons redondants par organe ou le tissu.

Génération d’isotrope uniforme aléatoire (IUR) et des sections verticales aléatoire uniforme (RVU) pour des analyses quantitatives stéréologiques

Certaines des techniques utilisées pour la génération des sections IUR et VUR pour quantitative stéréologiques analyses ont compliqué un peu les bases théoriques et les explications sont donc souvent (inutilement) évitées par de nombreux scientifiques, bien que leur pratique mise en œuvre est assez facile. VUR les sections sont particulièrement facile à générer et sont optimal pour les estimations de densité/superficie en combinaison avec test cycloïdes systèmes8,9,20. Ils sont souvent préférées en raison de l’orientation familière du plan de section. Cependant, contrairement aux sections IUR, sections VUR ne conviennent pas pour l’estimation des paramètres de longueur8,9.

Au cours de la préparation des sections IUR et VUR, l’étape critique est, fondamentalement, pour maintenir la surface de section IUR ou RVU de l’échantillon fixe durant l’enrobage en résine plastique et à faire en sorte que l’axe vertical des sections de RVU peut toujours être identifié (étape 3, Figure 9, Figure 10, la Figure 11).

À l’avenir, l’application plus large des méthodes décrites ci-dessus peut-être contribuer de façon substantielle afin d’établir des normes de qualité constamment pour génération d’échantillons comparables, multi-purpose biobanque de porcins et d’autres grands modèles animaux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Lisa Pichl excellente assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Carl Roth GmbH, Germany Agar (powder), Cat.: 5210.3 Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal) Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) n.a. n.a. Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles n.a. n.a. Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China Y10006 and Y10005 Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4% SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration) Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s) Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany PM6000 Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
Sartorius AG, Göttingen, Germany BP61S
Microtome blades Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system National Institute of Health (NIH) ImageJ Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany VideoplanTM image analysis system Out of stock
Photo camera Nikon D40 Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562 Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables n.a. n.a. Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5016 Any kind of razor blades will do.
Ruler Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%) Carl Roth GmbH, Germany Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany BRAUN Surgical blades N°22 Any kind of scalpel blades will do.
Scanner Hewlett-Packard hp scanjet 7400c Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices n.a. n.a. Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 Any other kind of waterproof pen will do as well.

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