العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويصف هذا البلاغ موريني نماذج لأغراض تجريبية ومنهجيات للعزلة وثقافة البلاعم السنخية من البشر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البلاعم السنخية هي الضامة الميؤوس من شفائهم المتباينة، والمقيم في الرئة الأصلية قبل الولادة. البلاعم السنخية فريدة من نوعها في حياتها الطويلة ودورها الهام في تنمية الرئة ووظيفة، فضلا عن ردودها المترجمة بالرئة بالعدوى والالتهابات. وحتى الآن، لا توجد طريقة موحدة لتحديد الهوية والعزلة، والتعامل مع البلاعم السنخية من البشر والفئران موجود. مثل هذا أسلوب ضروري لإجراء دراسات عن هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامة في مختلف البيئات التجريبية. الأسلوب الموصوفة هنا، الذي يمكن اعتماده بسهولة بأي مختبر، نهج مبسطة لحصاد البلاعم السنخية من سائل الغسل للفيسيولوجيا أو من أنسجة الرئة والحفاظ عليها في المختبر. لأن السنخية الضامة يحدث أساسا كخلايا ملتصقة في الحويصلات الهوائية، هذا الأسلوب ينصب التركيز على إزاحة لهم قبل الحصاد، وتحديد الهوية. الرئة جهاز فاسكولاريزيد عالية، وتسكن مختلف أنواع الخلايا المنشأ النقوي واللمفاوية، والتفاعل، وتتأثر المكروية الرئة. باستخدام مجموعة علامات السطح الموصوفة هنا، الباحثين يمكن بسهولة وبشكل لا لبس فيه تمييز البلاعم السنخية من الكريات البيضاء الأخرى، وتنقية لهم طلبات المتلقين للمعلومات. الأسلوب الثقافة المتقدمة هنا يدعم كلا الإنسان والفأر البلاعم السنخية للنمو في المختبر ، ومتوافقة مع الدراسات الخلوية والجزيئية.

Introduction

المكروية الرئة نظام إيكولوجي فريد معقدة مع قناة الهواء تفصيلاً والمفرج. ويسافر الهواء المستنشق عن طريق القصبة الهوائية وفروع عديدة من القصبات والقصيبات قبل أن تصل إلى الحويصلات الهوائية، التي يحدث فيها تبادل الغازات الجوية الدم. نظراً للتفاعل المباشر مع الغلاف الجوي، يتطلب السطح التنفسي الحماية من الآثار الضارة المحتملة للجسيمات العالقة في الهواء والملوثات. عدد من الحواجز المادية والكيميائية والمناعية حماية الرئتين. جدير بالذكر أن نشر البالعات في السطح التنفسي يخدم نظام الدفاع السطر الأول هام. البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) نوع واحد من البالعات المقيم في الرئة، ويشكلون الغالبية العظمى من تجمع بلعم الرئة. وكما يوحي اسمها، هيئة علماء المسلمين هي أساسا مترجمة إلى التجويف السنخية وتحدث كخلايا لاطئة الذي عينة في الغلاف الجوي المحيط باستمرار والتواصل مع ظهارة السنخية1. في حالة مستقرة الرئتين، أكثر من 95 في المائة البالعات في الفضاء السنخية هي مقياس الدعم الكلي2، تشكيلها قد تغير بسبب الالتهاب أو العدوى أو التعرض المزمن للملوثات.

هيئة علماء المسلمين المشاركة في مجموعة واسعة من الوظائف التي قد تكون محلية إلى الرئتين و/أو ذات الأهمية الشاملة. على سبيل المثال، هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية في التنمية والأداء الأمثل للرئتين؛ المراقبة المناعية؛ وإزالة الحطام الخلوية والغازية المسببة للأمراض، واستنشاق الجسيمات3،،من45،،من67. استنفاد المستهدفة من هيئة علماء المسلمين المعروف أن تنال من إزالة فيروسات الجهاز التنفسي والبكتيريا4،8. وإلى جانب دورها البالعات والمدافعين عن السطر الأول من التوازن الرئوية، معروفة مقياس الدعم الكلي وظيفتها كما عرض مستضد الخلايا في استخلاص تي الخلية9من الحصانة، potentiating فعالية اللقاحات داخل الآنف10 و التأثير على المناعة الذاتية المقيدة-الرئة بعد زرع الرئة11،12. ارتبط نقص في وظيفة صباحا إلى بروتينوسيس السنخية الرئوية (PAP)، شرط الناتجة عن الطفرات الوراثية، خبيثة أو الإصابة التي يعوق إزالة التوتر السطحي الرئوي13،14. يجري الآن بحث زرع الكلي كنهج علاجية للعلاج من PAP 15،16.

مقياس الدعم الكلي المعروف أن تنشأ أثناء امبريوجينيسيس وأن تستمر في الرئتين طوال الحياة دون محلها تعميم الكريات البيضاء2،17. وعلى الرغم من دوران الساعة غير قابل للكشف في الرئتين التماثل الساكن، أبلغ مستويات متفاوتة من دوران صباحا في بعض الشروط السريرية بما في ذلك الإصابة بفيروس الإنفلونزا4، تشعيع ميلوابلاتيفي18، والتعرض إلى الذيفان في سن 19، وتبلغ من العمر20. يعتقد أن مقياس الدعم الكلي لتجديد ذاتيا عن طريق انتشار منخفضة الدرجة17،21، ولكن المطالبة ببعض الدراسات التي أجريت مؤخرا أن وحيدات يمكن أن تؤدي إلى عدد سكان من الرئة داخل الأوعية الضامة22،23 في إطار الظروف التجريبية، لكن الأداء الوظيفي لهذه الضامة الرئوية المحولة حديثا لم يتم تعريفها في أمراض الرئة. وعلاوة على ذلك، فهم عتبة التحفيز في سياق التنشيط صباحا منطقة يحتمل أن تكون مثيرة لاهتمام، والرئة محاولات للحفاظ على توازن بين الإشارات التحريضية والآلات إيمونوريجولاتوري.

التغييرات الفسيولوجية أو باثولوجي التي تؤدي إلى فقدان التنظيم المناعي مهمة تقييم في ظروف سريرية مختلفة (مثل التهابات الجهاز التنفسي وأمراض التهاب الرئة وأمراض الرئة تليفية). ومع ذلك، تزايد الاعتراف هيئة علماء المسلمين كمؤشرات أو حتى محددات الصحة الرئوية11،24. حاليا، لا تتوفر أية بروتوكولات موحدة للحصاد، وتميز، و/أو الحفاظ على هيئة علماء المسلمين من البشر ونماذج مورين الإكلينيكية. عدم وجود توافق في الآراء بشأن السلائف صباحا وتعمل، وعدم وجود منهجية مفصلة كان الحاجز الرئيسي في دور (أدوار) أتاح للساعة في الصحة الرئوية وأمراض. ويوفر البروتوكول التالي تحديد نهائي، والعزلة، و في المختبر استراتيجية الثقافة إلى حد كبير تحسين فهم السلوك صباحا، وتيسير الدراسات التشخيصية والعلاجية التي استهدفت صباحا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) والمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) في مستشفى القديس يوسف والمركز الطبي.

1-عزل هيئة علماء المسلمين من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل (بال)

  1. تخدير ماوس C57BL/6 عمرها 8 أسبوع مع الكيتامين (87.5 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (12.5 مغ/كغ من وزن الجسم) كوكتيل عبر حقن داخل. المتابعة عند بلوغ الماوس التخدير الجراحي مع فقدان ردود الفعل واسترخاء العضلات.
  2. ضع الماوس على سطح تشريح مع الجانب البطني مواجها لأعلى. تطبيق مرهم البيطرية العيون في العيون منع الجفاف ومسح كامل السطح البطني للماوس مع منصات الإعدادية الكحول العقيمة مشبعة بالكحول 70% لتطهير.
  3. جبل الماوس مع كل أربعة أرجل مقيدة.
  4. فتح تجويف البطن برفق مع أدوات التشريح الجزئي. ويجب الحرص على فتح مجال قدر ممكن دون الأضرار بأي أجهزة الحشوي أو خلق الأنسجة المتدلية.
  5. برفق فتح تجويف الصدر ببطء إينسيسينج القفص الصدري من خلال منصف. ومن الناحية المثالية، يمكن اقتطعت القفص الصدري من الجانب إلى الجانب. ويجب الحرص الشديد ليس تصيب الجنب الرئتين أثناء فتح تجويف الصدر.
  6. موقع الأجوف فينا أقل شأنا وجعل شق ينزف الماوس. استخدام منصات القطن ماص لامتصاص الدم.
  7. ضخ 10 مل الفوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS) في البطين الأيمن (باستخدام 10 مل المحاقن والإبر ز 25) لمسح خلايا الدم الجائل. استيعاب تدفق الدم مع منصات القطن ماصة. بمجرد perfused تماما، ستظهر متبيض الرئتين وثم مستعدون للغسل.
  8. بلطف قص فتح الجلد والعضلات في الرقبة لفضح مجرى الهواء. عناية المكوس العضلات المجاورة، والغضاريف، والأنسجة الدهنية دون إلحاق الضرر بالقصبة الهوائية.
  9. إجراء شق صغير (< 2 مم) في القصبة الهوائية الخلفي للحنجرة. ينبغي أن يكون هذا الشق فقط ما يكفي لإدخال قسطرة في حين يزال مربوطا القصبة الهوائية إلى الحنجرة. إدراج قسطرة 22 ز 1 بوصة دون إبرة في القصبة الهوائية إلى الرئتين. تأمين القسطرة مع خياطة مزين حرير (4-0؛ وعدم الامتصاص) مع عقده مربعة.
    ملاحظة: القسطرة يحتاج إلى تهذيب استناداً إلى حجم الماوس. قصيرة أو طويلة للغاية بالقسطرة تميل إلى تسرب أو تمزق مجرى الهواء أثناء الغسل. يجب أن يكون طول القسطرة مثل أنه عندما تم إدخالها بالكامل يبقى نصيحة جيدا داخل القصبة الهوائية ولا تصل إلى الشعب الهوائية الأولية.
  10. إرفاق 1 مل حقنه مليئة المثلج بال المخزن المؤقت (Ca2 + و Mg2 + مجاناً برنامج تلفزيوني + 1 ملم حمض الإيثيلين، يدتا) بالقسطرة وغرس المخزن المؤقت ببطء إلى الرئتين. وهذا سوف تضخم الرئتين. الاحتفاظ بحقنه تعلق بالقسطرة لمدة خمس ثوان وثم نضح السوائل الغسل بلطف سحب المكبس. وهذا سوف تنكمش الرئتين. جمع السائل في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
  11. كرر "الخطوة 1، 10" لتسع مرات أكثر وتجمع السائل الغسل. عدم تجاوز المخزن المؤقت 1 مل كل تدفق، التي قد تتجاوز قدرة الرئة وتؤدي إلى تمزق.
  12. Euthanize الماوس مع CO2 جرعة IACUC الموافقة على البروتوكول.
  13. الطرد المركزي السائل 10 مل BAL في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بيليه خلية يحتوي على خلايا بال.
    تنبيه: بيليه قد تكون صغيرة جداً، لذا توخي الحذر عند يسفط المادة طافية.
  14. ريسوسبيند خلايا ال 100 ميكروليتر من تدفق/الفرز المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + + + يدتا 1 مم 2% الحرارة إبطال مصل الدم البقري الجنين (FBS) 25 مم حمض N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (حبيس)).
  15. منع الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc الماوس (استنساخ 2.4G2، 10 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  16. أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع الأسفار ناقص واحد (FMO) ووصمة عار واحد يتحكم11،25. تقييم ال (انظر الجدول للمواد) يليه الخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل ببرمجيات التحليل المناسب (انظر الجدول للمواد).
  17. عزل هيئة علماء المسلمين بخلية تنشيط fluorescence أرز (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الماوس 1 مل أنا المتوسطة الثقافة عندما تهدف هيئة علماء المسلمين للثقافة في المختبر أو في فيفو نقل الخلية. وبدلاً من ذلك، (انظر الجدول للمواد) تستكمل فرز هيئة علماء المسلمين في المخزن المؤقت لتحلل 1 مل مع 10 ميكروليتر/مل β-ميركابتوثانول لاستخراج الحمض النووي الريبي.

2-عزل هيئة علماء المسلمين من الماوس الرئة، تعليق خلية واحدة

  1. تخدير ماوس C57BL/6 عمرها 8 أسبوع مع الكيتامين (87.5 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (12.5 مغ/كغ من وزن الجسم) كوكتيل عبر حقن داخل. المتابعة عند بلوغ الماوس التخدير الجراحي مع فقدان ردود الفعل واسترخاء العضلات.
  2. ضع الماوس على سطح تشريح مع الجانب البطني مواجها لأعلى. تطبيق مرهم البيطرية العيون في العيون منع الجفاف ومسح كامل السطح البطني للماوس مع منصات الكحول العقيمة مشبعة بالكحول 70% لتطهير.
  3. جبل الماوس مع كل أربعة أرجل مقيدة.
  4. فتح تجويف البطن برفق مع أدوات التشريح الجزئي. ويجب الحرص على فتح مجال قدر ممكن دون الأضرار بأي أجهزة الحشوي أو خلق الأنسجة المتدلية.
  5. برفق فتح تجويف الصدر ببطء إينسيسينج القفص الصدري من خلال منصف. ومن الناحية المثالية، يمكن اقتطعت القفص الصدري من الجانب إلى الجانب. ويجب الحرص الشديد ليس تصيب الجنب الرئتين أثناء فتح تجويف الصدر.
  6. موقع الأجوف فينا أقل شأنا وجعل شق ينزف الماوس. استخدام منصات القطن ماص لامتصاص الدم.
  7. ضخ 10 مل المثلج برنامج تلفزيوني في البطين الأيمن (باستخدام 10 مل المحاقن والإبر ز 25) لمسح خلايا الدم الجائل. بمجرد perfused تماما، ستظهر متبيض الرئتين وجاهزة للحصاد.
  8. تشريح خارج الرئتين بقطع القصبة الهوائية والأوعية الدموية والأربطة في أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل البرد المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم). الحفاظ عليه على الجليد حتى الخطوة التالية.
  9. Euthanize الماوس مع CO2 جرعة IACUC الموافقة على البروتوكول.
  10. نقل الرئتين perfused إلى طبق ثقافة عقيمة وخالية من مولد 60 ملم مع 3 مل دميم. مع مساعدة من تشريح الملقط ندف الخطوط الجوية وغيرها من المواد الصلبة غير الرئة الأنسجة، إذا كانت موجودة. تخطر على أنسجة الرئة مع مشرط إلى < حجم 1 مم.
  11. إضافة 300 ميكروغرام/مل "ليبيراسي ليرة تركية" و 5 U/mL الدناز أنا، مزيج من بيبيتينج واحتضانها في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 25 دقيقة. بلطف المزيج مرة واحدة قبل بيبيتينج بعد 10 دقائق.
  12. يمر الرئتين ينتابها 100 ميكرومتر خلية مصفاة مثبتة على أنبوب مخروطي 50 مل. استخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنه 1 مل إلى الهريس حتى كتل الخلية في عامل التصفية. يجب غسل الفلتر مع 20 مل أغسل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS + 2 مم يدتا).
  13. الطرد المركزي في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 20 مل.
  14. كرر الخطوتين 2.12 و 2.13 مرتين، تغيير عامل التصفية والانبوب في كل مرة. مغطس قبل التصفية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لأكثر من خمس دقائق يزيد الغلة صباحا. إعداد تعليق خلية واحدة بإضافة 100 ميكروليتر تدفق/الفرز المخزن المؤقت إلى بيليه الخلية.
  15. منع الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc الماوس (استنساخ 2.4G2، 10 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  16. أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع FMO وعناصر تحكم مفردة-وصمة عار11،25. تقييم الرئة (انظر الجدول للمواد) متبوعاً بالخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل بتحليل البرمجيات.
  17. AMs الفرز قبل أرز خلية (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى الماوس 1 مل أنا المتوسطة الثقافة عندما تهدف هيئة علماء المسلمين للثقافة في المختبر أو في فيفو نقل الخلية. وبدلاً من ذلك، فرز مقياس الدعم الكلي إلى 1 مل تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 10 مل ميكروليتر/β-ميركابتوثانول لاستخراج الحمض النووي الريبي.

3-عزل هيئة علماء المسلمين من البشر بال السائل

  1. ترتيب نقل السائل بال البشرية من العيادة إلى المختبر في 4 درجات مئوية.
  2. الطرد المركزي بال السائل (10-50 مل) في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بيليه خلية يحتوي على خلايا بال11.
  3. أغسل بيليه مع 20 مل أغسل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS + 2 مم يدتا) وأجهزة الطرد المركزي في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. ريسوسبيند خلايا BAL في 100 ميكروليتر من تدفق/الفرز المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 2% الحرارة المعطل FBS يدتا 1 مم + 25 مم حبيس).
  5. كتلة الربط جسم غير محدد لمستقبلات Fc بإضافة كتلة Fc البشرية (استنساخ Fc1.3070، 25 ميكروغرام/مل) وحضانة لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  6. أداء جسم تلطيخ جنبا إلى جنب مع FMO وعناصر تحكم مفردة-وصمة عار11،24. تقييم ال (انظر الجدول للمواد) متبوعاً بالخلايا بمحلل خلية خلية واحدة التدفق الخلوي التحليل بتحليل البرمجيات.
  7. AMs الفرز قبل أرز خلية (انظر الجدول للمواد) مباشرة إلى 1 مل ص البشرية الثقافة المتوسطة أو 1 مل تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 10 ميكروليتر/مل β-ميركابتوثانول.

4. في المختبر الثقافة من AMs

  1. وبعد فرز الخلايا، الحصاد الخلايا التي سينتريفوجينج في 250 g x عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. ريسوسبيند مقياس الدعم الكلي البشرية في 1 مل ص البشرية الثقافة المتوسطة [روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) 1640 تستكمل مع 10% FBS، 20% L-929 الثقافة طافية (كمصدر لمستعمرة بلعم حفز عامل (م-CSF)، 100 يو/مليلتر تركيز النهائي)، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 ملم حمض N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (حبيس)، و 1 x البنسلين/ستربتوميسين (اختياري)]. وبالمثل، ريسوسبيند الماوس مقياس الدعم الكلي في 1 مل الماوس المتوسطة الثقافة صباحا [دميم وتستكمل مع 10% FBS والثقافة L-929 20% بيروفات صوديوم طافية (كمصدر ل M-CSF، 100 يو/مليلتر تركيز النهائي)، 1 مم، 10 مم حبيس 1 x البنسلين/ستربتوميسين (اختياري )].
  3. تعداد تريبان الأزرق-باستثناء الخلايا قابلة للتطبيق بعداد خلايا وضبط تركيز خلية قابلة للتطبيق في 1 × 106/mL.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، تصل إلى 5 × 105 هيئة علماء المسلمين يمكن أن تكون معزولة عن بال السائل التي تم جمعها من ماوس ذكور C57BL/6 أسبوع 8-10 قديمة. العائد صباحا من هضم الرئة الماوس هو متغير وقد يكون أقل قليلاً من السائل الماوس بال. صباحا العائد من السوائل بال البشرية يعتمد على حجم السائل بال، أن إجمالي حجم المياه المالحة التي تستخدم في الغسل، وحالة المريض السريرية.
  4. استناداً إلى الغلة وضرورة التجريبية، بذور الخلايا الموجودة في الشرائح الدائرة أو أطباق الثقافة أو قوارير الثقافة. ومن الناحية المثالية، البذور مقياس الدعم الكلي في 1 × 105/mL مع متوسطة 10 مل في قارورة زراعة الأنسجة T25.
  5. احتضان الخلايا في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 الغلاف الجوي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: سوف تنمو كخلايا ملتصقة هيئة علماء المسلمين وهي النمو البطيء جداً (مضاعفة الوقت > 7 أيام).
  6. في 24 ساعة بعد البذر، ينبغي أن تكون هيئة علماء المسلمين تمسكا وسوف لا يمكن فصل قبل تغيير لطيف للثقافة المتوسطة. إزالة المتوسطة بتطلع من طرف واحد، وتجديد مع الطازجة المتوسطة استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن الآن أن الخلايا تستخدم لتقييم الفيزيولوجيا صباحا أو آثار المنبهات. هيئة علماء المسلمين التي نمت في شرائح الدائرة يمكن أن تكون الملون مريح مع الأجسام المضادة المناسبة، وتعتبر مثالية للتصور مجهرية. لتقييم تدفق سيتوميتريك، يتم حصاد مقياس الدعم الكلي بالحضانة مع الخلية غير الانزيمية الناي بالحل.
  7. نضح المتوسطة الثقافة وإضافة حل الناي بما يكفي لتغطية سطح الثقافة (حوالي 2 مل في قارورة T25) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. إلغاء لا سيكون ضروريا، ولا ينصح كشط الخلايا ميكانيكيا. اضغط برفق الجانبين وإضافة 1-2 مل تدفق/الفرز المخزن المؤقت بلطف "الماصة؛" صعودا ونزولاً فصل معظم الخلايا ملتصقة.
  8. لدراسات الحمض النووي الريبي، والخلايا مباشرة على الطبق الثقافة عن طريق إضافة تحلل المخزن المؤقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نهج سيتوميتريك تدفق لتحديد الماوس AMs يرد في الشكل 1. وهذا يشمل تحليل لمجموعة الحد الأدنى من العلامات السطحية اللازمة في التمييز بين هيئة علماء المسلمين من البالعات الأخرى المقيمة في الرئة أو التسلل إلى الرئة. مطلوب تحليل تفاضلي للتعرف على مقياس الدعم الكلي من الضامة المتداخلة، والخلايا الجذعية، العَدلات، وحيدات، والمشتقة من الوحيدات الضامة الرئوية التي تحدث في الرئتين. مخطط السطح علامات التالية يمكن أن تستخدم لسهولة التمييز بين أنواع هذه الخلايا من بعضها البعض من حيث هي مقياس الدعم الكلي CD45+، CD11c+، سيجليك--و+، CD64+ب--/+F4/80-، CD11b- ; الضامة المتداخلة هي CD45+، CD11b+ب +، CD64+، CD24؛ CD11b + الخلايا الجذعية هي CD45+، CD11b+، CD11c+ب +، CD24+، CD64؛ CD103 + الخلايا الجذعية هي CD45+، CD11c+، CD24+، CD103+ب +، CD11b؛ هي خلايا Dendritic بلاسماسيتويد CD45+، CD317+، سيجليك-ح+، ولي-6 ج+ب-، هي العَدلات CD45+، لي-6 ز+، CD11b+، CD11c- ،-أب-لي-6 جو وحيدات CD45 هي+CD64+/--، Ly-6 C+/--،-أب-. السكان صباحا أبرزها الأحمر (CD11cمرحبا وسيجليك إفمرحبا) وأزرق مخضر (CD11cمرحبا، سيجليك وint)، على التوالي، تمثل AMs التقليدية (السكانية الرئيسية) و (المشتقة من الوحيدات الضامة الرئوية ثانوية السكان) التي تحدث في الفضاء السنخية. تدفق فرز CD45+، CD11cمرحبا، و سيجليكمرحبا الخلايا غلة المنقي الماوس مقياس الدعم الكلي. ويبين الشكل 2 علامات خلية السطحية اللازمة لتحديد دقة وعزله الإنسان مقياس الدعم الكلي. AMs البشرية يتم التعرف لكونه CD45+، CD11b+، هلا-الدكتور+، CD163+، CD169+، و CD206+ BAL الخلايا، ويمكن أن يكون تدفق فرز طلبات المتلقين للمعلومات.

Figure 1
الشكل 1 : تحليل سيتوميتريك تدفق الممثل للماوس AMs. (أ) موقع التشريحية لمقياس الدعم الكلي في قسم أنسجة الرئة ماوس (الهيماتوكسيلين وويوزين). يتم الإشارة إلى هيئة علماء المسلمين مع الأسهم وشريط مقياس 60 ميكرومتر. (ب) الممثل التدفق الخلوي النابضة استراتيجية لتحديد الماوس مقياس الدعم الكلي في الخلايا بال. عينات تم تقييمها من قبل محلل خلية والبيانات أسفل استخرجت لإحداث 500 لمقارنة ببرامج التحليل. الأحمر (CD11cمرحبا وسيجليك إفمرحبا) وأزرق مخضر (CD11cمرحبا، سيجليك وint)، على التوالي، هي التقليدية هيئة علماء المسلمين (السكانية الرئيسية) والمشتقة من الوحيدات الضامة الرئوية (السكان البسيطة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليل سيتوميتريك تدفق الممثل لمقياس الدعم الكلي البشرية. (أ) النابضة استراتيجية لتحديد مقياس الدعم الكلي البشرية من السوائل بال من مستلم زرع الرئة بشرية. (ب) مجال مشرق صورة مجهرية لمقياس الدعم الكلي البشرية في سبعة أيام للثقافة. شريط مقياس 400 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هيئة علماء المسلمين هي الضامة المقيم في الرئة الحية الطويلة التي ملء الرئتين تبدأ عند الولادة ودائمة على مدى طوال فترة الحياة26. تم الاعتراف بأدوارهن في7 وعلم الأمراض الرئوية علم وظائف الأعضاء12 وقدرتها على التنبؤ بالمناعة الذاتية الرئوية24 . لأن مقياس الدعم الكلي لها وجود طويل الأجل في الرئتين11،27 و لأنها تشارك في تنشيط وتقدم الاستجابات المناعية11،24، دور (أدوار) في الرئة المزمنة الأخرى التحريضية وتليفيه الأمراض يحتاج إلى تقييم. تاريخيا، هوية الخلط بين هيئة علماء المسلمين وقد أساءوا كثيرا. مع علامات المظهرية اعتمدت مؤخرا25،28، أنه من الممكن الآن التمييز بين الإنسان والفأر هيئة علماء المسلمين من البالعات الرئوية الأخرى (مثلاً، من خلالي الضامة، والخلايا الجذعية الرئوية، والوحيدات المستمدة الضامة الرئوية). وقد تم تحسين الأساليب الموصوفة هنا للعزلة والثقافة في المختبر للماوس ومقياس الدعم الكلي البشرية. على الرغم من أن يمكن اعتماد هذه البروتوكولات لهيئة علماء المسلمين على نطاق واسع من الأنواع الأخرى، ينبغي أن تجري عزم المظهرية المناسبة وضع مجموعة من علامات السطحية "الحد الأدنى المطلوب" لوصف دقيق.

لعزل AMs مورين بالغسل، عثر على إدراج خالب عامل (أي، يدتا) وقبل تقشعر لها اﻷبدان المخزن المؤقت بال مهما في الدراسة الحالية. نظراً لأن هيئة علماء المسلمين ملتصقة بالجدار السنخية، استخدام برنامج تلفزيوني وحدها كانت غير فعالة في إزاحة الخلايا وإنتاج عائد أقل بكثير. تأمين تركيب القسطرة إلى القصبة الهوائية خطوة حاسمة أخرى. وينبغي الحرص على ضمان بمرفق مانعة للتسرب الذي يقلل من فقدان السوائل بال. يلزم الحذر حين لافاجينج ماوس الأصغر سنا (< 6 أسابيع من العمر)، وحساسية الهيكلية من القصبة الهوائية قد يؤدي إلى تمزق أو التسرب أثناء الغسل. تثبيت اثنين من خيوط متتالية غير متداخلة غالباً ما يضمن ارتباط أمن للقسطرة ويمنع تسرب. على الرغم من أن الانفصال غير الانزيمية (أي.، مع مخزن مؤقت تشيلاتور تستكمل) كان فقط إجراء لعزله صباحا في هذه الدراسة، فمن الممكن أن تفكك الانزيمية مع كولاجيناز أثناء الغسل الرئة قد تنتج عائد صباحا أفضل.

عائد الساعة البشرية من السوائل BAL متغيراً. هيئة علماء المسلمين تشكل ما يقرب من 10 في المائة من كافة الخلايا بال التي تم جمعها من متلقي زرع الرئة البشرية في معهد نورتون الصدر أثناء المتابعة الروتينية زرع الرئة بعد، وإجمالي العائد صباحا يعتمد على عدة متغيرات. وتشمل هذه المتغيرات حالة المريض السريرية، وحجم المياه المالحة التي تستخدم في الغسل، وحجم السوائل BAL المجهزة لعزل صباحا. إجراءات قبل الغسل (مثلاً إبرة الخزعات) التي تنتج في ميكروهيمورهاجي تغيير التركيبة الخلوية للخلايا بال؛ ومع ذلك، يسمح تنفيذ العلامات المظهرية لإجراء الكشف لا لبس فيها وتحديد خصائص تجمع صباحا البشرية (الشكل 2).

استخدام L-929 تكييف المتوسطة (مصدرا للخدمات القطرية م) أمر ضروري للصيانة في المختبر من هيئة علماء المسلمين. أننا نؤمن بأن مكملات لتنقية م-قوات الأمن المركزي سيكون كافياً للحفاظ على مقياس الدعم الكلي في الثقافة؛ ومع ذلك، بتركيز أمثل يحتاج إلى توضع لكل البشرية والماوس مقياس الدعم الكلي. الخلايا المستزرعة يمكن استخدامها لإجراء دراسات عن الالتقام، واستجابة لالتهاب أو مستضد العرض التقديمي، وحالة النضج/التنشيط أو أي مقايسة أخرى يقتضي الحفاظ على الخلايا الحية تحليل وقت الدورة11،24 . خلال هذه الدراسة، كان لم تحاول الحفاظ على هيئة علماء المسلمين كخط مثقف بشكل مستمر ودراسات محطة قصيرة الأجل فقط (< 30 يوما منذ موسم الحصاد) تم تنفيذها. ولذلك قيداً واضحة لهذا الأسلوب الافتقار إلى بيانات ثقافة طويلة الأجل، لا سيما بشأن استقرار الخلايا (أي، ما إذا كان مقياس الدعم الكلي يمكن أن تنمو محدود أو المستمر خط، استجابة مقياس الدعم الكلي للمنتجة ونعد، و الانجراف المظهرية و/أو قد) بعد ثقافة الجارية. هيئة علماء المسلمين طويلة معيشة الخلايا الحية، ويتوقع بعض درجة من الاختلاف بين الخلايا المعزولة من الرئتين صحية ومن تلك التي تمر في الجهاز التنفسي أو الاستجابات الالتهابية/الذاتية.

إجمالاً، الأسلوب قدم هنا الوثائق اتباع نهج مبسط لعزل ووصف، والحفاظ على البشرية والماوس مقياس الدعم الكلي في نظام ثقافة خلية. على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون كذلك الأمثل على أساس الاحتياجات الفردية التجريبية، قد تستخدم كبروتوكول مبتدئاً تشريح صلة وظيفية من هيئة علماء المسلمين في الطب الرئوي وأمراض الجهاز التنفسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.

Acknowledgments

ونحن نشكر برندرغاست كلير للمساعدة في تحرير المخطوطة. دكن معتمد ببحث منح (#2095) من مؤسسة فلين ومعتمد TM من المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01HL056643 و R01HL092514). دكن تطوير الأساليب وتصميم الدراسة وكتبت المخطوطة؛ أم ساعدت الدراسات الحيوانية وعينه سريرية المشتريات؛ SB ساعد تدفق سيتوميتريك تحليل وفرز الخلايا؛ TM الإشراف على الدراسات واستعرض المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506, (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210, (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13, (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191, (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148, (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24, (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10, (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82, (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7, (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145, (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16, (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159, (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20, (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136, (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6, (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514, (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38, (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35, (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518, (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74, (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9, (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9, (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16, (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71, (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics