अलगाव और इन विट्रो संस्कृति Murine और मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज

Immunology and Infection

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Summary

इस संचार के अलगाव और प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए मनुष्यों और murine मॉडल से वायुकोशीय मैक्रोफेज की संस्कृति के लिए तरीके का वर्णन करता है ।

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Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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Abstract

वायुकोशीय मैक्रोफेज के जंम के पूर्व मूल के टर्मिनल विभेदित, फेफड़े के निवासी मैक्रोफेज हैं । वायुकोशीय मैक्रोफेज उनके लंबे जीवन में अद्वितीय है और फेफड़ों के विकास और कार्य में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका है, साथ ही साथ अपने फेफड़ों में संक्रमण और सूजन के लिए स्थानीय प्रतिक्रियाओं । तिथि करने के लिए, पहचान, अलगाव, और मनुष्यों और चूहों से वायुकोशीय मैक्रोफेज की हैंडलिंग के लिए कोई एकीकृत विधि मौजूद है । इस तरह के एक विधि विभिंन प्रयोगात्मक सेटिंग्स में इन महत्वपूर्ण जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अध्ययन के लिए आवश्यक है । विधि यहां वर्णित है, जो आसानी से किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा सकता है, bronchoalveolar लेवेज द्रव से या फेफड़े के ऊतकों से कटाई वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण है और उंहें इन विट्रो मेंबनाए रखने । क्योंकि वायुकोशीय मैक्रोफेज मुख्य रूप से alveoli में अनुयाई कोशिकाओं के रूप में होते हैं, इस पद्धति का ध्यान उंहें कटाई और पहचान से पहले विघटित पर है । फेफड़ों एक उच्च संवहनी अंग है, और माइलॉयड और लसीकावत् मूल के विभिन्न सेल प्रकार निवास, बातचीत, और फेफड़ों microenvironment से प्रभावित हैं । सतह मार्करों के सेट का उपयोग करके यहां वर्णित है, शोधकर्ताओं को आसानी से और स्पष्ट रूप से अंय ल्यूकोसाइट्स से वायुकोशीय मैक्रोफेज भेद कर सकते हैं, और उंहें बहाव अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध । इस के साथ विकसित संस्कृति विधि दोनों मानव और माउस वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए इन विट्रो विकास में समर्थन करता है, और सेलुलर और आणविक अध्ययन के साथ संगत है ।

Introduction

फेफड़ों microenvironment एक विस्तृत हवा नाली और vasculature के साथ एक विशिष्ट जटिल पारिस्थितिकी तंत्र है । सांस हवा श्वासनली के माध्यम से यात्रा और ब्रांकाई और ब्रांकिओल्स की कई शाखाओं के माध्यम से alveoli, जहां रक्त हवा गैस विनिमय होता है तक पहुंचने से पहले । वातावरण के साथ सीधी बातचीत के कारण, श्वसन सतह हवाई कणों और प्रदूषकों के संभावित हानिकारक प्रभावों से सुरक्षा की आवश्यकता है । शारीरिक, रासायनिक, और immunologic अवरोधों की एक संख्या फेफड़ों की रक्षा । विशेष रूप से, श्वसन सतह पर फ़ैगोसाइट की तैनाती एक महत्वपूर्ण पहली लाइन रक्षा प्रणाली का कार्य करता है । वायुकोशीय मैक्रोफेज (एंस) फेफड़ों के निवासी फ़ैगोसाइट का एक प्रकार हैं, और वे फेफड़ों मैक्रोफेज पूल के विशाल बहुमत बनाते हैं । के रूप में उनके नाम का सुझाव है, एंस के मुख्य रूप से वायुकोशीय लुमेन के लिए स्थानीयकृत रहे है और sessile कोशिकाओं है कि लगातार परिवेश वातावरण नमूना और वायुकोशीय उपकला1के साथ संवाद के रूप में होते हैं । स्थिर राज्य फेफड़ों में, वायुकोशीय अंतरिक्ष में फ़ैगोसाइट के ९५% से अधिक एंस के2, जिनकी संरचना सूजन, संक्रमण, या प्रदूषकों के लिए पुरानी जोखिम के कारण बदल सकते हैं ।

एंस के कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है कि फेफड़ों के लिए स्थानीय हो सकता है में भाग लेने के लिए और/ उदाहरण के लिए, एंस के विकास में आवश्यक है और फेफड़ों के इष्टतम कार्य; प्रतिरक्षा निगरानी; और सेलुलर मलबे की मंजूरी, रोगजनकों पर हमला, और सांस कणों3,4,5,6,7। एम्स के लक्षित घट श्वसन वायरस और बैक्टीरिया की मंजूरी ख़राब करने के लिए जाना जाता है4,8. फ़ैगोसाइट और फुफ्फुसीय homeostasis के एक पहली लाइन रक्षक के रूप में उनकी भूमिका के अलावा, एंस के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है प्रतिजन-में पेश कोशिकाओं टी सेल उन्मुक्ति9, potentiating intranasal वैक्सीन की प्रभावकारिता10 और फेफड़े प्रत्यारोपण11,12के बाद फेफड़ों प्रतिबंधित उन्मुक्तिकोप्रभावित. AM समारोह में कमी फुफ्फुसीय वायुकोशीय proteinosis (पीएपी), एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन, द्रोह या संक्रमण है कि फुफ्फुसीय सर्फेक्टेंट13,14की मंजूरी बाधित से उत्पंन हालत से जोड़ा गया है । एम्स की रोपाई अब पीएपी 15,16के इलाज के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के तौर पर तलाशी जा रही है ।

एंस के लिए embryogenesis के दौरान उत्पंन और जीवन भर फेफड़ों में ल्यूकोसाइट्स2,17परिसंचारी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा रहा बिना बनाए रखने के लिए जाना जाता है । हालांकि, am टर्नओवर समस्थिति फेफड़ों में undetectable है, am टर्नओवर का स्तर अलग इंफ्लूएंजा वायरस4द्वारा संक्रमण सहित कुछ नैदानिक स्थितियों में सूचित किया गया है, myeloablative विकिरण18, endotoxin के लिए जोखिम 19, और वृद्धावस्था20। एंस के एक कम ग्रेड प्रसार17,21के माध्यम से स्वयं को नवीनीकृत माना जाता है, लेकिन कुछ हाल के अध्ययनों का दावा है कि monocytes intravascular फेफड़ों की आबादी को जंम दे सकते है मैक्रोफेज22,23 के तहत प्रयोगात्मक स्थितियों, लेकिन इन नए परिवर्तित फुफ्फुसीय मैक्रोफेज की कार्यक्षमता अभी तक फेफड़ों के रोगों में परिभाषित किया जाना है । इसके अलावा, AM सक्रियकरण के संदर्भ में उत्तेजना की दहलीज को समझना एक संभावित दिलचस्प क्षेत्र है, के रूप में फेफड़ों के लिए भड़काऊ संकेतों और immunoregulatory मशीनरी के बीच एक संतुलन बनाए रखने का प्रयास करता है ।

शारीरिक या रोग परिवर्तन है कि प्रतिरक्षा विनियमन के नुकसान के लिए नेतृत्व के लिए विभिंन नैदानिक सेटिंग्स में मूल्यांकन महत्वपूर्ण है (जैसे, श्वसन संक्रमण, भड़काऊ फेफड़ों के रोग और fibrotic फेफड़ों के रोग) । फिर भी, एम्स तेजी से संकेतक या फेफड़े के स्वास्थ्य के11,24के निर्धारकों के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं । वर्तमान में, कोई एकीकृत प्रोटोकॉल संचयन, निस्र्पक, और/या मनुष्यों और नैदानिक murine मॉडल से एंस को बनाए रखने के लिए उपलब्ध हैं । am पुरोगामी और phenotypes पर एक आम सहमति की कमी है, और एक विस्तृत पद्धति के अभाव फुफ्फुसीय स्वास्थ्य और रोग में हूं की भूमिका (ओं) को समझने में प्रमुख अंधी गली गया था । निंनलिखित प्रोटोकॉल एक निश्चित पहचान, अलगाव प्रदान करता है, और इन विट्रो संस्कृति रणनीति है कि बहुत व्यवहार कर रहा हूं की समझ अग्रिम होगा और सुविधाजनक बनाने के नैदानिक और चिकित्सीय अध्ययन लक्षित कर रहा हूं ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और सेंट जोसेफ अस्पताल और चिकित्सा केंद्र में संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. Murine Bronchoalveolar लेवेज (BAL) द्रव से एम्स का अलगाव

  1. Anaesthetize एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से एक आठ सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस के साथ ketamine (८७.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और xylazine (१२.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) कॉकटेल । आगे बढ़ना है जब माउस सजगता और मांसपेशियों की छूट के नुकसान के साथ सर्जिकल संज्ञाहरण प्राप्त है ।
  2. ventral ओर का सामना करना पड़ के साथ एक विच्छेदन सतह पर माउस रखें । निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र पशु चिकित्सक मरहम लागू करें और संक्रमित करने के लिए ७०% isopropanol के साथ संतृप्त बाँझ शराब तैयारी पैड के साथ माउस के पूरे ventral सतह पोंछ ।
  3. सभी चार पैर रोका के साथ माउस माउंट ।
  4. धीरे सूक्ष्म विच्छेदन उपकरण के साथ उदर गुहा खोलो । देखभाल किसी भी आंत अंगों को नुकसान पहुंचाने या हैंगिंग ऊतक बनाने के बिना संभव के रूप में ज्यादा क्षेत्र के रूप में खोलने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  5. धीरे मध्यावकाश के माध्यम से रिब पिंजरे incising द्वारा वक्ष गुहा को धीरे से खोलो । आदर्श रूप में, रिब पिंजरे पक्ष की ओर से एक्साइज किया जा सकता है । वक्ष गुहा खोलते समय फेफड़ों के फुफ्फुस को घायल न करने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए ।
  6. अवर वेना कावा का पता लगाने और एक चीरा करने के लिए माउस भरो । रक्त सोख करने के लिए शोषक सूती पैड का प्रयोग करें ।
  7. सही निलय (10 मिलीलीटर सिरिंज और 25G सुई) में घूम रक्त कोशिकाओं फ्लश करने के लिए का उपयोग कर 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) सुई । शोषक सूती पैड के साथ रक्त के प्रवाह को अवशोषित । एक बार पूरी तरह से perfused, फेफड़ों में आधे उबले हुए दिखाई देंगे और फिर लेवेज के लिए तैयार हैं ।
  8. धीरे त्वचा और गर्दन में मांसपेशियों को खोलने के लिए airway बेनकाब काट । ध्यान से श्वासनली को नुकसान पहुंचाए बिना अगल-बगल की मांसपेशियों, उपास्थि, और वसा ऊतकों को एक्साइज करें ।
  9. गला करने के लिए श्वासनली पीछे पर एक छोटा सा चीरा (< 2 mm) बनाओ । श्वासनली अभी भी गला से जुड़ा हुआ है, जबकि यह चीरा बस में एक कैथेटर डालने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । फेफड़ों की ओर श्वासनली में एक सुई के बिना एक 1 इंच 22G कैथेटर डालें । एक वर्ग गांठ के साथ एक रेशम लट टांका (4-0; गैर अवशोषित) के साथ कैथेटर सुरक्षित ।
    नोट: कैथेटर माउस आकार के आधार पर छंटनी की जरूरत है । बहुत कम या लंबे कैथेटर्स रिसाव और/या लेवेज के दौरान airway आंसू करते हैं । कैथेटर लंबाई ऐसी है कि जब पूरी तरह से टिप डाला श्वासनली के भीतर अच्छी तरह से रहता है और प्राथमिक ब्रांकाई तक पहुंच नहीं होना चाहिए ।
  10. एक 1-एमएल बर्फ ठंडा बाल बफर (Ca2 + और मिलीग्राम2 + मुक्त पंजाबियों + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic एसिड, EDTA) कैथेटर से भरा सिरिंज और धीरे फेफड़ों में बफर टपकाना । इससे फेफड़ों में संकुचन होगा । पांच सेकंड के लिए कैथेटर से जुड़ी सिरिंज रखें और फिर धीरे पिस्टन खींच द्वारा लेवेज द्रव महाप्राण । यह फेफड़ों खंडन करना होगा । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब बर्फ पर रखा में तरल पदार्थ ले लीजिए ।
  11. नौ अधिक बार और पूल लेवेज द्रव के लिए १.१० कदम दोहराएं । प्रति फ्लश 1 मिलीलीटर बफर से अधिक नहीं है, के रूप में है कि फेफड़ों की क्षमता से अधिक हो सकता है और इसके टूटना के लिए सीसा ।
  12. Euthanize2 के साथ माउस को IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल द्वारा ।
  13. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर १० मिलीलीटर बाल द्रव केंद्रापसारक । सेल गोली बाल कोशिकाओं शामिल हैं ।
    सावधानी: गोली बहुत छोटी हो सकती है, इसलिए supernatant को aspirating करते समय सावधानी बरतें ।
  14. प्रवाह के १०० μL में बाल कोशिकाओं reसस्पेंड/(पंजाबियों + 2% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + 1 मिमी EDTA + 25 मिमी एन-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic एसिड (HEPES)) ।
  15. ब्लॉक विशिष्ट एंटीबॉडी एफसी रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी माउस एफसी ब्लॉक (क्लोन 2.4 g2, 10 μg/एमएल) और बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन से जोड़कर ।
  16. एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) और एक दाग11,25नियंत्रण के साथ साथ धुंधला प्रदर्शन । एक सेल विश्लेषक द्वारा बाल कोशिकाओं का मूल्यांकन ( सामग्री की तालिकादेखें) उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा एकल सेल प्रवाह cytometry विश्लेषण के बाद ( सामग्री की तालिकादेखें).
  17. एम्स को अलग कर एक प्रतिदीप्ति-एक्टिवेट सेल सॉर्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) में सीधे 1 मिलीलीटर माउस AM संस्कृति माध्यम जब एंस के लिए इन विट्रो संस्कृति या vivo सेल स्थानांतरण में करना है । वैकल्पिक रूप से, एंस में 1 मिलीलीटर Lysis बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) 10 μL/एमएल β-Mercaptoethanol निष्कर्षण के लिए के साथ पूरक.

2. माउस लंग, सिंगल सेल सस्पेंशन से एम्स का अलगाव

  1. Anaesthetize एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से एक आठ सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस के साथ ketamine (८७.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और xylazine (१२.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) कॉकटेल । आगे बढ़ना है जब माउस सजगता और मांसपेशियों की छूट के नुकसान के साथ सर्जिकल संज्ञाहरण प्राप्त है ।
  2. ventral ओर का सामना करना पड़ के साथ एक विच्छेदन सतह पर माउस रखें । निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र पशु चिकित्सक मरहम लागू करें और संक्रमित करने के लिए ७०% isopropanol के साथ संतृप्त बाँझ शराब पैड के साथ माउस के पूरे ventral सतह पोंछ ।
  3. सभी चार पैर रोका के साथ माउस माउंट ।
  4. धीरे सूक्ष्म विच्छेदन उपकरण के साथ उदर गुहा खोलो । देखभाल किसी भी आंत अंगों को नुकसान पहुंचाने या हैंगिंग ऊतक बनाने के बिना संभव के रूप में ज्यादा क्षेत्र के रूप में खोलने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  5. धीरे मध्यावकाश के माध्यम से रिब पिंजरे incising द्वारा वक्ष गुहा को धीरे से खोलो । आदर्श रूप में, रिब पिंजरे पक्ष की ओर से एक्साइज किया जा सकता है । वक्ष गुहा खोलते समय फेफड़ों के फुफ्फुस को घायल न करने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए ।
  6. अवर वेना कावा का पता लगाने और एक चीरा करने के लिए माउस भरो । रक्त सोख करने के लिए शोषक सूती पैड का प्रयोग करें ।
  7. सही निलय (10 मिलीलीटर सिरिंज और 25G सुई का उपयोग) में परिचालित रक्त कोशिकाओं फ्लश करने के लिए 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाबियों सुई । एक बार पूरी तरह से perfused, फेफड़ों में उबला हुआ दिखाई देगा और फसल के लिए तैयार हैं ।
  8. श्वासनली, रक्त वाहिकाओं और काटना को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में तोड़कर फेफड़ों से बाहर निकालकर 5 मिलीलीटर ठंड Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) के साथ । यह अगले कदम तक बर्फ पर बनाए रखें ।
  9. Euthanize2 के साथ माउस को IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल द्वारा ।
  10. perfused फेफड़ों को बाँझ और पायरोजेन-फ्री ६० mm कल्चर डिश में 3 मिलीलीटर DMEM के साथ स्थानांतरित करें । के साथ विदारक संदंश की मदद से बाहर एयरवेज और अंय हार्ड गैर फेफड़ों ऊतक सामग्री, अगर मौजूद है । एक स्केलपेल के साथ फेफड़ों के ऊतकों को < 1 mm आकार में कीमा करें ।
  11. जोड़ें ३०० µ जी/एमएल Liberase TL और 5 यू/एमएल DNase मैं, pipetting द्वारा मिश्रण और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 25 मिनट के लिए । धीरे से एक बार pipetting 10 मिनट के बाद मिश्रण ।
  12. एक १०० µm सेल छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर स्थापित असंबद्ध फेफड़ों दर्रा । 1 मिलीलीटर सिरिंज से एक गोताख़ोर के पीछे का उपयोग करने के लिए फिल्टर पर सेल का झुरमुट मैश । 20 मिलीलीटर धोने बफर के साथ फिल्टर धो (पंजाबियों + 2% गर्मी निष्क्रिय FBS + 2 मिमी EDTA) ।
  13. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और 20 मिलीलीटर धोने बफर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  14. दोहराएं चरण २.१२ और २.१३ दो बार, फ़िल्टर और ट्यूब हर बार बदल रहा है । पहले से अधिक पांच मिनट के लिए धोने बफर में फिल्टर भिगोने AM उपज बढ़ जाती है । सेल गोली करने के लिए १०० μL प्रवाह/छंटाई बफर जोड़कर एकल सेल निलंबन तैयार करें ।
  15. माउस एफसी ब्लॉक (क्लोन 2.4 g2, 10 μg/एमएल) और बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन जोड़ने के द्वारा एफसी रिसेप्टर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी बंधन ब्लॉक ।
  16. प्रदर्शन एंटीबॉडी FMO और एक दाग के साथ साथ दाग11,25नियंत्रण । विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा एकल-कक्ष प्रवाह cytometry विश्लेषण के बाद एक कक्ष विश्लेषक द्वारा फेफड़ों के कक्षों का मूल्यांकन करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  17. एम्स को एक सेल सॉर्टर द्वारा क्रमबद्ध करें ( सामग्री की तालिकादेखें) सीधे 1 मिलीलीटर माउस AM संस्कृति माध्यम जब एंस के लिए इन विट्रो संस्कृति या vivo सेल स्थानांतरण में करना है । वैकल्पिक रूप से, 10 μL/एमएल β-Mercaptoethanol आरएनए निष्कर्षण के लिए के साथ पूरक 1 मिलीलीटर Lysis बफर में एम्स को क्रमबद्ध करें ।

3. मानव बाल द्रव से एम्स का अलगाव

  1. मानव बाल द्रव के स्थानांतरण की व्यवस्था क्लिनिक से 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला में ।
  2. बाल द्रव (10-50 मिलीलीटर) में २५० x g पर 4 ° c 10 मिनट के लिए । सेल गोली बाल कोशिकाओं11शामिल हैं ।
  3. 20 मिलीलीटर धोने बफर के साथ गोली धो (पंजाबियों + 2% गर्मी निष्क्रिय FBS + 2 मिमी EDTA) और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
  4. बाल कोशिकाओं reसस्पेंड प्रवाह के १०० μL में है/(पंजाबियों + 2% हीट निष्क्रिय FBS + 1 मिमी EDTA + 25 मिमी HEPES) ।
  5. मानव एफसी ब्लॉक (क्लोन एफसी 1.3070, 25 μg/एमएल) और बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन जोड़कर एफसी रिसेप्टर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी बंधन ब्लॉक ।
  6. FMO और एकल दाग11,24नियंत्रण के साथ साथ धुंधला एंटीबॉडी प्रदर्शन । एक सेल विश्लेषक द्वारा बाल कोशिकाओं का मूल्यांकन ( सामग्री की तालिकादेखें) विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा एकल सेल फ्लो cytometry विश्लेषण के बाद.
  7. एक सेल सॉर्टर द्वारा क्रमबद्ध करें एंस (देखें सामग्री की तालिका) सीधे में 1 मिलीलीटर मानव हूं संस्कृति मध्यम या 1 मिलीलीटर Lysis बफर 10 μL/एमएल β-Mercaptoethanol के साथ पूरक ।

4. इन विट्रो में एम्स की संस्कृति

  1. कक्ष छँटाई के बाद, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २५० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल ।
  2. 1 मिलीलीटर मानव हूं संस्कृति मध्यम [रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (RPMI) १६४० 10% FBS, 20% एल-९२९ संस्कृति supernatant (मैक्रोफेज कॉलोनी के एक स्रोत के रूप में उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ), १०० U/एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक में मानव एम्स reसस्पेंड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी एन-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic एसिड (HEPES), और 1x पेनिसिलिन/streptomycin (वैकल्पिक)]. इसी तरह, 1 मिलीलीटर में माउस एंस reसस्पेंड माउस AM संस्कृति मध्यम [DMEM 10% FBS के साथ पूरक, 20% एल-९२९ संस्कृति supernatant (एम के एक स्रोत के रूप में-सीएसएफ, १०० U/एमएल अंतिम एकाग्रता), 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 10 मिमी HEPES, और 1x पेनिसिलिन/streptomycin (वैकल्पिक )].
  3. गणना trypan ब्लू-एक सेल काउंटर द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं को छोड़कर और 1 x 106/mL. पर व्यवहार्य कोशिका एकाग्रता को समायोजित
    नोट: आदर्श रूप में, 5 x 105 एंस के बाल द्रव से पृथक किया जा सकता है एक 8-10 सप्ताह पुराने C57BL/ माउस फेफड़े डाइजेस्ट से AM उपज चर रहा है और माउस बाल द्रव की तुलना में थोड़ा कम हो सकता है । AM मानव बाल द्रव से उपज बाल द्रव की मात्रा पर निर्भर करता है, लेवेज में इस्तेमाल खारा की कुल मात्रा, और रोगी की नैदानिक हालत.
  4. उपज और प्रयोगात्मक आवश्यकता के आधार पर, चैंबर स्लाइड में कोशिकाओं बीज, संस्कृति व्यंजन या संस्कृति कुप्पी । आदर्श रूप में, एक T25 ऊतक संस्कृति कुप्पी में 10 मिलीलीटर मध्यम के साथ 1 x 105/mL पर एंस के बीज ।
  5. 5% CO2 वातावरण के साथ एक ३७ ° c humidified मशीन में कोशिकाओं को मशीन ।
    नोट: एंस के अनुयाई कोशिकाओं के रूप में विकसित होगा और बेहद धीमी गति से बढ़ रहे है (दोहरीकरण समय > 7 दिन) ।
  6. 24 घंटे में सीडिंग के बाद एम्स अनुयाई होना चाहिए और संस्कृति माध्यम के सौम्य परिवर्तन से अलग नहीं किया जाएगा । एक छोर से आकांक्षा द्वारा माध्यम निकालें और ३७ ° c करने के लिए ताजा मध्यम पूर्व गर्म के साथ भरपाई ।
    नोट: कोशिकाओं अब फिजियोलॉजी या उत्तेजनाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चैंबर में उगाया गया एम्स स्लाइड आसानी से उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ दाग हो सकता है और सूक्ष्म दृश्य के लिए आदर्श होते हैं । प्रवाह cytometric मूल्यांकन के लिए, एंस के गैर एंजाइमी सेल dissociating समाधान के साथ मशीन द्वारा काटा जाता है ।
  7. संस्कृति माध्यम महाप्राण और पर्याप्त संस्कृति की सतह को कवर करने के लिए dissociating समाधान जोड़ें (T25 कुप्पी प्रति लगभग 2 मिलीलीटर) और 5-10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । कोई परिमार्जन आवश्यक हो जाएगा, और यह कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से परिमार्जन करने के लिए अनुशंसित नहीं है । धीरे पक्षों ठोकर, जोड़ें 1-2 मिलीलीटर प्रवाह/छंटाई बफर और धीरे पिपेट ऊपर और नीचे अनुयाई कोशिकाओं के बहुमत अलग करने के लिए ।
  8. आरएनए अध्ययन के लिए, लाइसे Lysis बफर जोड़कर सीधे संस्कृति पकवान पर कोशिकाओं को ।

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Representative Results

माउस एंस की पहचान करने के लिए प्रवाह cytometric दृष्टिकोण चित्रा 1में दिखाया गया है । यह अंय फेफड़े निवासी या फेफड़ों में घुसपैठ फ़ैगोसाइट से अलग एम्स में आवश्यक सतह मार्करों का एक ंयूनतम सेट का विश्लेषण भी शामिल है । विभेदक विश्लेषण को सकारात्मक रूप से मध्य मैक्रोफेज, वृक्ष कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, monocytes, और monocyte-व्युत्पंन फुफ्फुसीय मैक्रोफेज कि फेफड़ों में होने से एम्स की पहचान करने के लिए आवश्यक है । सतह मार्करों की निम्नलिखित योजना को आसानी से एक दूसरे से जहां एम्स CD45 कर रहे हैं इन सेल प्रकार को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है+, CD11c+, Siglec-च+, CD64+, I-Ab +/, F4/80-, CD11b- ; मध्यवर्ती मैक्रोफेज CD45+, CD11b+, I-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + वृक्ष कोशिका एं CD45+, CD11b+, CD11c+, I-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + वृक्ष कोशिका एं CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+, I-Ab +, CD11b-; Plasmacytoid वृक्ष कोशिका एं CD45+हैं, CD317+, Siglec-ज+, त-6C+, I-Ab-, न्यूट्रोफिल CD45+, 6G +, CD11b- , i-ab-, 6C-, और Monocytes हैं CD45+, CD64+/-, 6C+/, i-ab-। AM की आबादी लाल रंग में प्रकाश डाला (CD11cहाय और Siglec-एफहाय) और चैती (CD11cहाय, Siglec-एफint), क्रमशः, पारंपरिक एंस (प्रमुख जनसंख्या) और monocyte व्युत्पंन फुफ्फुसीय मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व ( छोटी जनसंख्या) जो वायुकोशीय अंतरिक्ष में घटित होती है । CD45 की छंटाई प्रवाह+, CD11cहाय, Siglec-Fहाय कोशिकाओं को शुद्ध माउस एंस पैदावार । चित्रा 2 एक सटीक पहचान और मानव एंस के अलगाव के लिए आवश्यक सेल सतह मार्करों को दर्शाता है । मानव एंस सकारात्मक CD45 जा रहा है+, CD11b+, एचएलए-डॉ+, CD163+, CD169+, और CD206+ बाल कोशिकाओं, और बहाव अनुप्रयोगों के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है के लिए पहचाने जाते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि प्रवाह माउस एंस के cytometric विश्लेषण । (क) एक चूहे फेफड़े के ऊतक खंड (hematoxylin और eosin) में एंस के शारीरिक स्थान । एंस के तीर के साथ संकेत दिया है और पैमाने पर बार ६० माइक्रोन है । (ख) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry गेटिंग बाल कोशिकाओं में चूहे की पहचान एम्स की रणनीति. नमूने एक सेल विश्लेषक द्वारा मूल्यांकन किया गया और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा तुलना के लिए ५०० घटनाओं के लिए नीचे नमूने थे । लाल (CD11chi और Siglec-fhi) और चैती (CD11chi, Siglec-fint), क्रमशः, पारंपरिक एंस (प्रमुख जनसंख्या) और monocyte-व्युत्पंन फुफ्फुसीय मैक्रोफेज (छोटी जनसंख्या) हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मानव एंस के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण । (क) गेटिंग रणनीति मानव फेफड़े प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता से बाल द्रव से मानव एंस की पहचान करने के लिए । (ख) संस्कृति के सात दिनों में मानव एंस के उज्जवल क्षेत्र micrograph । स्केल बार ४०० माइक्रोन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एंस के लंबे समय से रह रहे है फेफड़े के निवासी मैक्रोफेज है कि जंम के समय फेफड़ों आबाद और पूरे जीवन पर स्थाई26अवधि । फुफ्फुसीय फिजियोलॉजी7 और पैथोलॉजी12 में उनकी भूमिकाओं और फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा24 की भविष्यवाणी करने के लिए उनकी क्षमता को मांयता दी गई है । क्योंकि एंस के फेफड़े11,27 में एक दीर्घकालिक उपस्थिति है और क्योंकि वे सक्रियकरण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं11,24की प्रगति में शामिल हैं, उनकी भूमिका (ओं) अंय पुरानी भड़काऊ और fibrotic फेफड़ों में बीमारियों का मूल्यांकन करने की जरूरत है । ऐतिहासिक दृष्टि से एम्स में उलझन की पहचान थी और अक्सर उसकी पहचान होती थी । हाल ही में अपनाया phenotypic मार्करों के साथ25,28, अब यह अन्य फेफड़े के फ़ैगोसाइट से मानव और माउस एम्स भेद करने के लिए संभव है (जैसे, मध्यवर्ती मैक्रोफेज, फेफड़े के वृक्ष कोशिकाओं, और monocyte व्युत्पंन फुफ्फुसीय मैक्रोफेज) । यहां वर्णित तरीके अलगाव के लिए अनुकूलित किया गया है और के लिए इन विट्रो संस्कृति माउस और मानव एंस के । हालांकि इन प्रोटोकॉल को मोटे तौर पर अंय प्रजातियों से एम्स के लिए अपनाया जा सकता है, उपयुक्त phenotypic दृढ़ संकल्प का एक सेट की स्थापना के लिए आयोजित किया जाना चाहिए "ंयूनतम आवश्यक" पूरी तरह से लक्षण वर्णन के लिए सतह मार्करों ।

लेवेज द्वारा murine एंस के अलगाव के लिए, chelating एजेंट (यानी, EDTA) और पूर्व द्रुतशीतन बाल बफर के शामिल किए जाने के मौजूदा अध्ययन में महत्वपूर्ण पाया गया । क्योंकि एंस वायुकोशीय दीवार के लिए अनुयाई हैं, अकेले पंजाबियों के उपयोग की कोशिकाओं को विकरने में अप्रभावी था और एक काफी कम उपज का उत्पादन किया । श्वासनली के लिए कैथेटर की स्थापना की सुरक्षा एक और महत्वपूर्ण कदम है । देखभाल के लिए एक लीक प्रूफ लगाव है कि बाल तरल पदार्थ की हानि को कम करता है सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए । अतिरिक्त सावधानी की जरूरत है, जबकि एक छोटा माउस lavaging (< 6 सप्ताह पुरानी), श्वासनली के संरचनात्मक विनंरता के रूप में लेवेज के दौरान फाड़ या रिसाव में परिणाम हो सकता है । लगातार दो गैर अतिव्यापी टांके स्थापित करने से अक्सर कैथेटर का एक सुरक्षित लगाव सुनिश्चित करता है और लीक से बचाता है । हालांकि गैर एंजाइमी पृथक्करण (यानी, एक chelator पूरक बफर के साथ) केवल am अलगाव के लिए किया गया था इस अध्ययन में, यह संभव है कि एंजाइमी पृथक्करण के दौरान collagenase के साथ फेफड़ों लेवेज एक बेहतर कर रहा हूँ उपज हो सकता है.

बाल द्रव से मानव की उपज चर रही है । एंस के सभी बाल Norton वक्ष संस्थान में मानव फेफड़े प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से एकत्र नियमित बाद फेफड़ों प्रत्यारोपण अनुवर्ती के दौरान कोशिकाओं के लगभग 10% का गठन, और कुल हूं उपज कई चर पर निर्भर है । इस तरह के चर रोगी की नैदानिक स्थिति, लेवेज में इस्तेमाल खारा की मात्रा, और बाल द्रव AM अलगाव के लिए संसाधित की मात्रा शामिल हैं । पूर्व लेवेज प्रक्रियाओं (जैसे, सुई बायोप्सी) कि microhemorrhage में परिणाम बाल कोशिकाओं की सेलुलर रचना बदल; फिर भी, phenotypic मार्करों के कार्यांवयन के एक अस्पष्ट का पता लगाने और मानव हूं पूल (चित्रा 2) के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है ।

एल-९२९ कंडीशनिंग मध्यम (एम-सीएसएफ का एक स्रोत) का उपयोग एम्स के इन विट्रो मेंटेनेंस के लिए जरूरी था । यह हमारा विश्वास है कि शुद्ध एम-सीएसएफ की अनुपूरक संस्कृति में एम्स को बनाए रखने के लिए पर्याप्त होगा; हालांकि, एक अनुकूलित एकाग्रता के लिए बाहर दोनों मानव और माउस एंस के लिए काम किया जाना चाहिए । प्रसंस्कृत कोशिकाओं endocytosis पर अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर सकते हैं, सूजन के लिए प्रतिक्रिया, प्रतिजन प्रस्तुति, परिपक्वता/सक्रियण स्थिति, या किसी भी अंय परख है कि एक समय के लिए लाइव कोशिकाओं के रखरखाव आवश्यक-पाठ्यक्रम विश्लेषण11,24 . इस अध्ययन के पाठ्यक्रम में एम्स को लगातार कल्चरल लाइन के रूप में बनाए रखने का प्रयास नहीं किया गया और केवल अल्पकालिक टर्मिनल स्टडीज (हार्वेस्ट के बाद से < 30 दिन) का प्रदर्शन किया गया । इसलिए, इस विधि के लिए एक स्पष्ट सीमा एक दीर्घकालिक संस्कृति डेटा की कमी है, विशेष रूप से कोशिकाओं की स्थिरता पर (यानी, चाहे एम्स एक परिमित या सतत लाइन के रूप में विकसित कर सकते हैं, cryoprotectants और cryopreservation के लिए एम्स की प्रतिक्रिया, और phenotypic और/या genotypic बहाव) के बाद चल रही संस्कृति । एम्स vivo में लंबे समय से जीवित कोशिकाओं रहे हैं, और भिन्नता के कुछ डिग्री स्वस्थ फेफड़ों से अलग कोशिकाओं और श्वसन संक्रमण या भड़काऊ/स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं से गुजर उन लोगों के बीच की उम्मीद है.

कुल मिलाकर, विधि यहां प्रस्तुत अलग, निस्र्पक, और एक सेल संस्कृति प्रणाली में मानव और माउस एंस को बनाए रखने के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण दस्तावेजों । हालांकि इस प्रोटोकॉल और व्यक्तिगत प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, यह एक शुरुआत है श्वसन रोगों और फुफ्फुसीय चिकित्सा में एम्स के कार्यात्मक प्रासंगिकता काटना प्रोटोकॉल के रूप में काम कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि संपादन के साथ सहायता के लिए क्लेयर Prendergast धन्यवाद । DKN Flinn फाउंडेशन से एक अनुसंधान अनुदान (#2095) द्वारा समर्थित है और TM स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01HL056643 और R01HL092514) से अनुदान द्वारा समर्थित है । DKN विकसित तरीकों, अध्ययन डिजाइन और पांडुलिपि लिखा था; ओम पशु अध्ययन और नैदानिक नमूना खरीद के साथ सहायता प्रदान की; SB प्रवाह cytometric विश्लेषण और सेल छँटाई के साथ सहायता प्रदान की; टीएम ने पढ़ाई की निगरानी की और पांडुलिपि की समीक्षा की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

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References

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