고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Immunology and Infection

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Summary

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

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Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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Abstract

치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.

Introduction

폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.

AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.

AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.

면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.

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Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 세인트 조셉의 병원 및 의료 센터에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.

1. 절연 Murine Bronchoalveolar 게 (BAL) 액체에서 AMs의

  1. 케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.
  2. 복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 준비 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.
  3. 제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.
  4. 부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.
  5. 부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.
  6. 열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.
  7. 순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)를 삽입할. 흡수 성 목화 패드와 함께 혈액의 흐름을 흡수. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 게에 대 한 준비가 다음 blanched 표시 됩니다.
  8. 부드럽게 피부를 자르면 고 기도 폭로 목에 근육. 신중 하 게 소비 세는 인접 근육, 연골, 및 지방 조직 기관 손상 없이.
  9. 작은 절 개를 만들기 (< 2 m m) 후 두 후부 기관에. 이 절 기도 여전히 후 두에 연결 되어 있는 동안에 카 테 터 삽입에 충분 해야 합니다. 폐 쪽으로 기관지에 바늘 없이 1 인치 22 G 카 테 터를 삽입 합니다. 실크 꼰된 봉합으로 카 테 터를 확보 (4-0; 비 흡수) 광장 매듭.
    참고: 카 테 터는 마우스 크기에 따라 모든 트림을 하 게 해야 합니다. 매우 짧은 또는 긴 카는 누설 하 게 동안 기도 찢 어 경향이 있습니다. 카 테 터 길이 등을 해야 그 때 완전히 삽입 팁 남아 기도 내 고 주 기관지에 도달 하지.
  10. 카 테 터를 얼음 처럼 차가운 발 버퍼 (캘리포니아2 + , Mg2 + 무료 PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산, EDTA)으로 가득 1 mL 주사기를 연결 하 고 천천히 폐에 버퍼 되지 않도록. 이 폐를 부 풀 려 것입니다. 5 초에 대 한 카 테 터에 부착 된 주사기를 유지 하 고 게 액체 피스톤을 부드럽게 당겨서 발음. 이 폐 폐의 것입니다. 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 액체를 수집 합니다.
  11. 9 번에 대 한 단계 1.10을 반복 하 고 게 액체 수영장. 폐 용량을 초과 하 고 그것의 파열으로 이어질 수 있습니다 그 플러시, 당 1 mL 버퍼를 초과 하지 마십시오.
  12. IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.
  13. 10 분간 4 ° C에서 250 x g에 10 mL 발 유체 원심. 셀 펠 릿 발 셀을 포함합니다.
    주의: 펠 릿 매우 작을 수 있습니다, 그리고 그래서 주의 상쾌한 발음 하는 경우.
  14. 흐름/정렬 버퍼 (PBS 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1 mM EDTA + + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES))의 100 μ에 발 셀 resuspend
  15. Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.
  16. 항 체 형광에서 1 (FMO)을 뺀 함께 얼룩을 수행 하 고 단일-얼룩 컨트롤11,25. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 흐름 cytometry 분석 하 여 적절 한 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조) ( 재료의 표참조).
  17. AMs 격리 형광 활성화 된 세포에 의해 정렬 ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 정렬 AMs 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충 ( 재료의 표참조).

2. 마우스 폐, 단일 세포 현 탁 액에서에서 AMs의 격리

  1. 케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.
  2. 복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.
  3. 제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.
  4. 부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.
  5. 부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.
  6. 열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.
  7. 순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 삽입할. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 수확에 대 한 준비가 blanched 표시 됩니다.
  8. 추위의 5 mL 15 mL 원뿔 튜브로 기관, 혈관, 인 대를 절단 하 여 폐 밖으로 해 부 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM). 다음 단계까지 얼음에 그것을 유지.
  9. IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.
  10. Perfused 폐 3 mL DMEM와 멸 균 및 pyrogen 무료 60 m m 문화 접시에 전송 합니다. 있는 경우 집게 해 부의 도움으로 기도와 다른 하드 비 폐 조직 소재, 애타게. 하 메스와 폐 조직 말하다 < 1 m m 크기.
  11. 300 µ g/mL Liberase TL과 5 U/mL을 추가 DNase I, pipetting으로 혼합 하 고 25 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 부드럽게 한 번 10 분 후 pipetting으로 혼합.
  12. 50 mL 원뿔 튜브에 설치 된 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 천연된 폐를 전달 합니다. 1 mL 주사기에서 플런저의 뒷면을 사용 하 여 필터에 세포 덩어리를 매 시. 20 mL 워시 버퍼 필터 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA).
  13. 4 ° C에서 500 x g에서 5 분간 원심. 삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿 20 mL 워시 버퍼에서 resuspend.
  14. 단계 반복 2.12 2.13 두 번 필터와 튜브 각 시간을 변경 합니다. 전 5 분 이상 워시 버퍼에 필터를 몸을 담글 오전 수확량을 증가 합니다. 100을 추가 하 여 단일 세포 현 탁 액을 준비 μ 흐름/정렬 셀 펠 릿에 버퍼.
  15. Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.
  16. 항 체 단일 얼룩 컨트롤11,25FMO와 얼룩을 수행 합니다. 평가 하는 폐 세포 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).
  17. 셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 1 mL 세포의 용 해 버퍼 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충으로 AMs를 정렬 합니다.

3. 인간의 발 액체에서 AMs의 격리

  1. 4 ° c.에 실험실을 병원에서 인간의 발 액체의 이동 정렬
  2. 10 분 동안 발 유체 (10-50 mL) 4 ° C에서 250 x g에서 원심. 셀 펠 릿 발 셀11포함 되어 있습니다.
  3. 20 mL 워시 버퍼와 펠 릿을 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA)와 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
  4. 발 셀 흐름/정렬 버퍼의 100 μ에는 resuspend (PBS + 2% 열 사 FBS 1 mM EDTA + 25mm HEPES).
  5. 인간의 Fc 블록 (클론 Fc1.3070, 25 μ g/mL)을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 배양 하 여 Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 차단.
  6. 항 체 단일 얼룩 컨트롤11,24FMO와 얼룩을 수행 합니다. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).
  7. 셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 인간의 오전 문화 매체 또는 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 보충 10 μ/mL β-Mercaptoethanol.

4. 문화 체 외에서 AMs에의

  1. 셀 정렬, 다음 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확.
  2. 1 mL 인간의 오전 문화 매체 [로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 보충 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF), 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 인간의 AMs resuspend 1mm 나트륨 pyruvate, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES), 및 (옵션) 1 x 페니실린/스]. 마찬가지로, 마우스 AMs 1 mL 마우스 오전 문화 매체 [DMEM 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 M-CSF, 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 1mm 나트륨 Pyruvate, 10 mM HEPES, 및 (선택 사항 1 x 페니실린/스 보충을 resuspend합니다 )].
  3. Trypan 블루 제외 가능한 셀 셀 카운터로 열거 하 고 1 x 106/mL에서 실행 가능한 세포 농도 조정 합니다.
    참고: 이상적으로, 최대 5 x 105 AMs 수 발 유체는 8 10 주 오래 된 C57BL/6 남성 마우스에서 수집 으로부터 격리. 마우스 폐 다이제스트에서 오전 항복 변수 이며 마우스 발 액체의 보다 약간 덜 수 있습니다. 인간의 발 액체에서 오전 항복 발 액, 게, 그리고 환자의 임상 상태에 사용 하는 염 분의 총 볼륨의 볼륨에 따라 달라 집니다.
  4. 수율과 실험 필요성에 따라, 챔버 슬라이드, 문화 요리 또는 문화 플라스 크에 세포 씨앗. 이상적으로, 1 x 105/mL T25 조직 배양 플라스 크에 10 mL 매체에 AMs 씨앗.
  5. 셀 5% CO2 분위기 37 ° C 습도 인큐베이터에 품 어.
    참고: AMs 부착 세포로 성장할 것입니다 그리고 매우 느린-성장 하는 (시간을 두 배로 > 7 일).
  6. 24 시간 후 시드, AMs 되어야 점착 및 문화 매체의 부드러운 변화에 의해 분리 되지 것입니다. 한쪽에서 포부에 의해 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 신선한 매체와 보충
    참고: 셀 이제 오전 생리학 또는 자극의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. AMs 성장 챔버 슬라이드에 적절 한 항 체와 편리 하 게 얼룩이 질 수 있다 고 현미경 시각화에 이상적입니다. 흐름 cytometric 평가, AMs 비 효소 셀 솔루션 해리 외피에 의해 수확.
  7. 문화 매체를 발음 하 고 문화 표면 (T25 플라스 크 당 약 2 mL)와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어 충분히 출신과 솔루션을 추가 합니다. 아니 된다고 해야 합니다, 그리고 세포를 기계적으로 긁어 권장 되지 않습니다. 부드럽게 양쪽, 1-2 mL 흐름/정렬 버퍼 추가 누르고 부드럽게 위아래로 분리 부착 세포의 대부분을 플라스틱.
  8. RNA 연구에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 문화 접시에 직접 세포를 lyse.

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Representative Results

흐름 cytometric 접근 마우스 AMs를 식별 하는 그림 1에 표시 됩니다. 이 표면 마커 다른 폐 상주 또는 폐에 침투 식 세포에서 AMs를 구별 하는 데 필요한 최소한의 분석을 포함 한다. 차동 분석은 긍정적으로 중간 세포, 수지상 세포, 호 중구, monocytes, 및 폐에서 발생 하는 monocyte 파생 된 폐 세포에서 AMs를 식별 해야 합니다. 표면 마커 다음 구성표 쉽게 구별이 세포 유형 서로 어디 AMs CD45는 채택 될 수 있다+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-A+ b, f 4/80-, CD11b- ; 중간 대 식 세포 는 CD45+, CD11b+-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + 수지상 세포 는 CD45+, CD11b+, CD11c+-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + 수지상 세포 는 CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+-Ab +, CD11b-; Plasmacytoid Dendritic 셀 은 CD45+, CD317+, Siglec-+, Ly-6 C+-Ab-, 호 중구 는 CD45+, Ly-6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab-, C 광-6-, 및 Monocytes 는 CD45+, CD64+, C 광-6+,-Ab-. 강조 표시 (CD11c안녕 및 Siglec-F안녕) 빨강과 청록 (CD11c안녕, Siglec-Fint), 각각, 오전 인구 기존의 AMs (주요 인구) 및 monocyte 파생 된 폐 세포 (대표 작은 인구) 치조 공간에서 발생 하는. CD45 정렬 흐름+, CD11c안녕하세요, Siglec-F안녕하세요 셀 수익률 순화 마우스 AMs. 그림 2 에서는 정확한 식별 및 인간의 AMs의 격리에 필요한 세포 표면 마커를 보여 줍니다. 인간의 AMs CD45 되 고 긍정적으로 확인은+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, 및 CD206+ 발 세포, 그리고 흐름 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정렬 될 수 있습니다.

Figure 1
그림 1 : 마우스 AMs의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (A) 마우스 폐 조직 단면도 (hematoxylin 및 오신)에 AMs의 해 부 위치. AMs는 화살표와 함께 표시 됩니다 그리고 눈금 막대 60 μ m. (B) 대표 cytometry 게이팅 마우스 발 셀에서 AMs를 식별 하는 전략. 샘플 셀 분석기에 의해 평가 했다 및 데이터 다운 샘플링 된 500 이벤트 비교 분석 소프트웨어. (CD11c안녕 및 Siglec-F안녕) 빨강과 청록 (CD11c안녕, Siglec-Fint), 각각, 기존의 AMs (주요 인구) 및 monocyte 파생 된 폐 세포 (작은 인구) 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 인간의 AMs의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (A) 게이팅 인간의 폐 이식 받는 사람에서 발 액체에서 인간 AMs를 식별 하는 전략. (B) 문화의 7 일에서 인간의 AMs의 밝은 분야 현미경 사진. 눈금 막대는 400 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24, 다른 만성 염증 및 거리 폐에 그들의 역할의 진행에 관여 하는 있기 때문에 질병 평가 될 필요가 있다. 역사적으로, AMs 혼란된 정체성 졌고 종종 오인 했다. 최근 채택된 phenotypic 마커25,28, 그는 지금 인간의 구별 하 고 (예를 들어, 중간 세포, 폐 수지상 세포, 및 monocyte 다른 폐 식 세포에서 AMs를 마우스를 가능한 폐 세포 파생). 여기에 설명 된 방법은 분리 하 고 마우스 및 인간의 AMs의 생체 외에서 문화에 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 프로토콜 다른 종에서 AMs에 대 한 광범위 하 게 채택 수 있습니다, 있지만 적절 한 phenotypic 결정 철저 한 특성에 대 한 표면 마커 "최소한 필요" 설정을 설정 하기 위해 실시 한다.

게 여 murine AMs의 격리, 킬레이트 화 대리인 (, EDTA)와 미리 발 버퍼를 재미의 포함 현재 연구에서 중요 한 것을 발견 했다. AMs 때문에 치경 벽에 부착, 혼자 PBS 사용 하 여 셀 dislodging에 효과가 아니 었 고 상당히 낮은 수확량을 생산. 기도에 카 테 터의 설치를 보안 하는 것은 또 다른 중요 한 단계입니다. 누출 방지 첨부 파일을 발 액체의 손실을 최소화 되도록 주의 해야 합니다. 추가 주의 필요 lavaging 젊은 마우스 동안 (< 6 주 이전), 기관지의 구조 진미 끊어지고 또는 누설에 게 동안 발생할 수 있습니다. 두 연속 겹치지 봉합을 자주 설치 테의 안전한 첨부 파일을 보장 하 고 누출을 방지. 비록 비 효소 분리 (., 보충 chelator 버퍼)는이 연구에서 오전 격리 수행에 그것이 가능 폐 게 동안 콜라와 효소 분리는 더 나은 오전 수율 생산할 수 있습니다.

인간의 오전 발 유체에서의 비중은 변수입니다. AMs 일상적인 후 폐 이식 후속 동안 노턴 가슴 연구소에서 인간의 폐 이식 받는 사람에서 수집 된 모든 발 세포의 약 10%를 구성 하며 총 오전 수율은 여러 변수에 의존 합니다. 이러한 변수에 환자의 임상 상태, 염 분에 게, 사용의 볼륨 및 오전 격리에 대 한 처리는 발 유체의 볼륨 포함 됩니다. 전 게 절차 (예: 바늘 생 검)을 microhemorrhage 발 세포; 세포 구성 변경 그럼에도 불구 하 고, 구현 phenotypic 감 적의 명백한 탐지 및 인간의 오전 수영장 (그림 2)의 수 있습니다.

L-929 컨디셔닝 매체 (M-CSF의 소스)를 사용 하 여 AMs의 체 외에 유지 보수를 위해 필요 했다. 그것은 우리의 믿음입니다 그 보충 정화 M-CSF의 문화;에서 AMs를 유지 하기 위해 충분 한 것 그러나, 최적화 된 농도 모두 인간을 위한 밖으로 일 수와 AMs를 마우스 필요가 있다. Endocytosis, 염증, 항 원 프레 젠 테이 션, 성숙/활성화 상태, 또는 한 시간 코스 분석11,24에 대 한 라이브 셀의 유지 보수를 필요로 하는 다른 분석 결과 대 한 연구에 사용 되는 경작된 한 세포 수 . 이 연구 과정에서 그것은 지속적으로 교양된 선 및 단기 터미널 연구 AMs를 유지 하려고 했다 (< 수확 이후 30 일) 수행 했다. 따라서,이 방법에는 분명 한 한계는 특히 세포의 안정성에 장기적인 문화 데이터의 부족 (즉, 여부 유한 또는 연속 AMs 성장할 수 있는 선, cryoprotectants 하 cryopreservation, AMs의 응답 및 및/또는 genotypic phenotypic 변화) 지속적인 문화 후. AMs는 긴 생활 세포 vivo에서 그리고 변이의 어느 정도 건강 한 폐와 호흡기 감염 또는 염증 성 면역 응답을 받은 그를 격리 하는 세포 사이 예정 이다.

전반적으로, 방법 제시 여기 문서 분리, 특성화, 인간을 유지 하 고 마우스 AMs는 간단한 접근 방법 셀 문화 시스템. 이 프로토콜은 개별 실험 필요에 따라 추가 최적화 수 있습니다, 하지만 그것은 호흡기 질환과 폐 의학에 AMs의 기능적 관련성을 해 부하는 초보자의 프로토콜 역할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

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References

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