離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Immunology and Infection

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Summary

この通信は、人間から肺胞大食細胞の分離と培養の方法論や実験用マウスのモデルについて説明します。

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Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

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Abstract

肺胞マクロファージは、肺居住者、最終分化マクロファージ出生前原産です。肺胞マクロファージは、寿命が長く、肺開発機能とその肺局所応答感染症や炎症に重要な役割でユニークです。日には、識別、分離、および人間およびマウスから肺胞マクロファージの処理の統一的手法は存在しません。このようなメソッドは、さまざまな実験的設定のこれらの重要な自然免疫系の細胞に関する研究に必要です。あらゆる研究室で簡単に採用できる、ここで説明する方法は、気管支肺胞洗浄液や肺組織から肺胞マクロファージを採取し、体外を維持する簡素化されたアプローチです。肺胞マクロファージは、肺胞に付着性のセルとして主に発生する、ためこのメソッドの焦点は収穫と同定する前にそれらを外れです。肺は高度に血管の臓器、骨髄性とリンパ性の起源の様々 な細胞タイプに生息する、対話、および肺微小環境によって影響を受けています。ここで説明されている表面のマーカーのセットを使用して、研究者はことができます簡単かつ明確に他の白血球から肺胞マクロファージを区別し、下位アプリケーションにそれらを浄化します。ここを開発した培養法両方の人間をサポートするマウスの体外発育の肺胞マクロファージと分子・細胞の研究と互換性が。

Introduction

肺微小環境は精巧な空気の導管と血管を一意に複雑な生態系です。吸入空気は、血液-空気ガス交換が発生する、肺胞に達する前に気管と気管支、細気管支の多数の枝を通してを移動します。大気と直接相互作用は、呼吸の表面は浮遊粒子状物質や汚染物質の可能性のある有害な効果から保護を必要とします。物理的、化学的、免疫学的障壁の数は、肺を保護します。特に、食細胞呼吸面での展開は、重要な最初の行の防衛システムを提供しています。肺胞マクロファージ (AMs) 肺居住者食細胞の一種であるし、彼らは肺マクロファージ プールの大半を構成します。その名の通り、AMs は主に肺胞腔に局在しているし、常に周囲の雰囲気をサンプルし、歯槽の上皮1通信付着細胞として発生します。肺胞腔内の食細胞の 95% 以上は、定常状態の肺、AMs2、その組成は、炎症、感染症、または汚染物質への慢性露出により変わる可能性があります。

AMs は、全身の重要性のおよび/または肺に対してローカルにすることができる機能の広い範囲に参加します。例えば、AMs は肺の最適な機能と開発に不可欠です。免疫の監視;侵入する病原体と吸入粒子3,4,5,6,7細胞の残骸のクリアランス。AMs の対象の枯渇は、呼吸器系ウイルスや細菌4,8のクリアランスを阻害する知られています。食細胞と肺の恒常性の最初の行の擁護者としての役割のほか AMs 知られている T を引き出すことで抗原提示細胞細胞免疫9、として機能する鼻腔内ワクチン10の効果を増強し、肺移植11,12後肺制限自己免疫に影響を与えます。午前の機能の欠乏は、遺伝子の突然変異、悪性腫瘍や肺界面活性剤13,14のクリアランスを損なう感染から生じる条件 (PAP)、肺胞蛋白症にリンクされています。AMs の移植は今 PAP 15,16の治療のための治療法として検討されています。

AMs は、胚形成の間に由来して循環白血球2,17に置き換えることがなく一生肺に固執するに知られています。午前売り上げ高のさまざまなレベルがインフルエンザ ウイルス4、破壊的照射18、内毒素への暴露によって感染を含む特定の臨床状況で報告されている午前売り上げ高は恒常性の肺に、19、そして高齢者20。AMs は、自己を介して悪性増殖17,21, 更新すると考えられているが、いくつかの最近の研究は、単球が血管肺マクロファージ22,23の下の人口に上昇を与えることができることを主張これらの新たに変えられた肺のマクロファージの機能がの実験条件はまだ肺疾患定義しなければなりません。肺炎症シグナルと免疫制御機械間の平衡を維持しようとすると、潜在的に興味深い地域がさらに午前活性化のコンテキストで刺激の閾値を理解することです。

免疫制御の損失をもたらす生理学的または病理学的変化は、さまざまな臨床設定 (例えば、呼吸器感染症、炎症性肺疾患、肺線維化疾患) の評価に重要です。それにもかかわらず、AMs はますますインジケーターまたは肺健康11,24のも決定要因として認識されます。収穫、特性評価、および人間および前臨床マウスモデルから維持する AMs 統一プロトコルは現在、ありません。午前前駆体と表現型のコンセンサスの欠如と詳細な方法の不在は、肺の健康および病気の午前の解読の役割の主要な障害をされていた。次のプロトコルでは、決定的な識別、分離、および体外で文化大きく午前動作の理解を進めるし、AM 向けの診断および治療の調査を促進する戦略を提供しています。

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Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) セントジョセフ病院と医療センター制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。

1. マウスの気管支肺胞洗浄 (BAL) 液から AMs の分離

  1. ケタミン (87.5 mg/kg 体重) とキシラジン (12.5 mg/kg 体重) 腹腔内注射を介してカクテル 8 週齢 c57bl/6 マウスを anaesthetize します。マウスに達する反射の損失や筋肉の弛緩で外科麻酔を進みます。
  2. 郭清の面に腹側を上にマウスを配置します。脱水症状を防ぐために、滅菌アルコール準備を 70% イソプロパノール消毒すると飽和するパッドとマウスの腹側表面全体を拭く目に獣医眼科用軟膏を適用します。
  3. 拘束された 4 本の脚を持つマウスをマウントします。
  4. 優しく顕微解剖ツールで腹腔内を開きます。すべての内臓の損傷や張り出した組織を作成しなくてもできるだけ同様に多くの領域を開くには注意が必要があります。
  5. 優しくゆっくりと縦隔から胸郭を切開して胸腔内を開きます。理想的には、肋骨は側に側から摘出することができます。胸腔内を開くときの肺の胸膜を傷つけないように十分な注意が必要があります。
  6. 下大静脈を探し、マウスを出血する切開をおきます。血液を吸収する吸収性綿パッドを使用します。
  7. 循環血液細胞をフラッシュする (25 G 針、10 mL の注射器を使用して) 右心室に 10 mL の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を挿入します。吸収性綿パッドとは、血液の流れを吸収します。完全に灌流、肺湯通し表示され、洗浄の準備ができているし。
  8. 優しく皮膚を開いてカットし、気道を公開する首の筋肉します。慎重に気管を損傷することがなく隣接する筋肉、軟骨、脂肪組織を切除します。
  9. 小さな切開 (< 2 mm) 気管喉頭の後方に。この切開は気管、喉頭にまだ接続されている間にカテーテルを挿入するだけで十分なはずです。針なし 1 インチ 22 G カテーテルを肺に向かって気管に挿入します。シルク編み縫合糸でカテーテルを固定 (4-0; 非吸収性) 正方形の結び目を持つ。
    注: カテーテルが整う必要がマウスのサイズに基づいて。 ある非常に短期または長期のカテーテルは、リークおよび/または洗浄中に気道を引き裂く傾向があります。カテーテルの長さはこのようなする必要があるときに完全に挿入される先端まま気管内も、主気管支に到達します。
  10. 冷たいバル バッファー (Ca2 +と Mg2 +無料 PBS + 1 mM EDTA エチレンジアミン四酢酸) カテーテルでいっぱい 1 mL 注射器を接続し、ゆっくりと肺の中にバッファーを植え付けます。これは肺を膨らませます。5 秒間、カテーテルに接続されている注射器を維持し、軽くピストンを引いて、洗浄液を吸引します。これは肺に空気を抜きます。氷上に置いた 15 mL の円錐管に流体を収集します。
  11. さらに 9 回のステップは 1.10 を繰り返し、洗浄液をプールします。肺の容量を超えるし、その破裂につながる可能性がありますので、フラッシュあたり 1 mL のバッファーを超えないようにします。
  12. IACUC 承認プロトコルによって CO2の過剰摂取とマウスを安楽死させます。
  13. 10 分の 4 ° C で 250 x g で 10 mL BAL 液を遠心分離機します。細胞ペレットには、バルのセルが含まれています。
    注意:ペレットは非常に小さく、上清を吸引するときので注意します。
  14. 流れ/並べ替えバッファー (PBS + 2% 不活化熱牛胎児血清 (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES)) の 100 μ L の BAL 細胞を再懸濁します。
  15. マウス Fc ブロックの追加により、Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロック (2.4G2、10 μ g/mL のクローン) 氷の上 20 分間インキュベートし、。
  16. 抗体と一緒にマイナス 1 (FMO) 蛍光染色を実行し、単一染色コントロール11,25。BAL を評価セル アナライザーによって細胞が適切な分析ソフトウェア単一セル フローサイトメトリー分析による続く (材料の表を参照してください) (材料の表を参照してください)。
  17. AMs を分離蛍光活性化セルによる選別機 (材料の表を参照してください) 直接 1 mL マウスに時に培地培養または生体内でAMs は、携帯転送。また、1 mL の溶解バッファーに並べ替え AMs は 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール RNA の抽出で補完 (材料の表を参照してください)。

2. AMs マウス肺、単一細胞懸濁液からの分離

  1. ケタミン (87.5 mg/kg 体重) とキシラジン (12.5 mg/kg 体重) 腹腔内注射を介してカクテル 8 週齢 c57bl/6 マウスを anaesthetize します。マウスに達する反射の損失や筋肉の弛緩で外科麻酔を進みます。
  2. 郭清の面に腹側を上にマウスを配置します。脱水症状を防ぐために、70% イソプロパノール消毒すると飽和滅菌アルコール パッドとマウスの腹側表面全体を拭く目に獣医眼科用軟膏を適用します。
  3. 拘束された 4 本の脚を持つマウスをマウントします。
  4. 優しく顕微解剖ツールで腹腔内を開きます。すべての内臓の損傷や張り出した組織を作成しなくてもできるだけ同様に多くの領域を開くには注意が必要があります。
  5. 優しくゆっくりと縦隔から胸郭を切開して胸腔内を開きます。理想的には、肋骨は側に側から摘出することができます。胸腔内を開くときの肺の胸膜を傷つけないように十分な注意が必要があります。
  6. 下大静脈を探し、マウスを出血する切開をおきます。血液を吸収する吸収性綿パッドを使用します。
  7. 循環血液細胞をフラッシュする (25 G 針、10 mL の注射器を使用して) 右心室に 10 mL の氷冷 PBS を挿入します。完全に灌流、肺湯通し表示され、収穫の準備ができています。
  8. 風邪の 5 mL と 15 mL の円錐管に気管、血管、靭帯を切断して肺を解剖ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)。次のステップまで氷の上それを維持します。
  9. IACUC 承認プロトコルによって CO2の過剰摂取とマウスを安楽死させます。
  10. 3 ml DMEM 無菌、パイロジェン フリーの 60 mm ディッシュに灌流の肺を転送します。鉗子を解剖の助けを借りて、航空および他のハードの非肺組織材料をいじめる存在する場合。肺組織にメスをミンチ < 1 mm サイズ。
  11. 300 μ g/mL Liberase TL と 5 U/mL 追加 DNase I、ピペッティングで混ぜるし、インキュベーターの 37 ° C で 25 分間インキュベートします。軽く 10 分後ピペッティングにより一度混ぜます。
  12. 50 mL コニカル チューブにインストールされている 100 μ m セル ストレーナーを解離肺を通過します。1 mL 注射器からプランジャーの後ろを使用すると、フィルターの細胞塊をマッシュ アップします。20 mL 洗浄バッファーが付いているフィルターを洗う (PBS + 2% 熱不活化の FBS + 2 ミリメートルの EDTA)。
  13. 4 ° C で 500 × g で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、20 mL 洗浄バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。
  14. 手順 2.12 と二度、2.13 たびにフィルターとチューブを変更するを繰り返します。5 分以上の洗浄バッファーのフィルターを予浸午前収量が増加します。単一細胞懸濁液を準備するには、追加し 100 μ L 細胞ペレットにバッファーの流れ/並べ替え。
  15. マウス Fc ブロックの追加により、Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロック (2.4G2、10 μ g/mL のクローン) 氷の上 20 分間インキュベートし、。
  16. FMO と単一染色コントロール11,25染色抗体を実行します。肺を評価セル アナライザーによる細胞単一セル フローサイトメトリーによる解析ソフトウェア後 (材料の表を参照してください)。
  17. セルの並べ替えで並べ替え AMs (材料の表を参照してください) 直接 1 mL マウスに時に培養培地培養または生体内でAMs は、携帯転送。また、1 mL の 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール RNA 抽出のための補足の換散バッファーに AMs を並べ替えます。

3. 人間の BAL 液から AMs の分離

  1. 4 ° C で研究室に診療所から人間の BAL 液の送迎を手配します。
  2. BAL 液 (10-50 mL) を 4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心します。細胞ペレットには、BAL 細胞11が含まれています。
  3. 20 mL 洗浄バッファーの餌を洗浄 (PBS + 2% 熱不活化の FBS + 2 ミリメートルの EDTA)、4 ° C で 250 x g で 10 分間遠心します。
  4. フロー/並べ替えバッファーの 100 μ L、BAL 細胞を再懸濁します (PBS + 2% 熱不活化 FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES)。
  5. 人間の Fc ブロック (クローン Fc1.3070、25 μ g/mL) を追加し、氷で 20 分間インキュベート Fc 受容体に非特異的な抗体の結合をブロックします。
  6. FMO と単一染色コントロール11,24を汚す抗体を実行します。BAL を評価セル アナライザーによる細胞単一セル フローサイトメトリーによる解析ソフトウェア後 (材料の表を参照してください)。
  7. セルソーターによる並べ替え AMs (材料の表を参照してください) 直接培地 1 mL 人間午前に 1 mL の溶解バッファーを添加した 10 μ L/mL β-メルカプトエタノール。

4. 文化体外AMs の

  1. 次のセルの並べ替え、4 ° C 10 分で 250 × g で遠心分離によってセルを収穫します。
  2. 1 mL人間午前培[ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 10% を添加した 1640 FBS、20 %l-929 文化 (マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)、100 U/mL 最終濃度ソース) として上清で人間の AMs を再懸濁します1 mM ピルビン酸ナトリウム、N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 酸 (HEPES) 10 mM、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (省略可能)]。同様に、1 mLマウス午前培[10 %fbs、20 %l-929 培養上清 (100 U/mL 最終濃度 M CSF ソース) として 1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPES、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (オプションと DMEM で AMs マウスを再懸濁します)].
  3. 細胞カウンターによって生菌トリパン ブルーを除くを列挙し、1 x 106/mL で実行可能な細胞濃度を調整します。
    注: 理想的を 5 × 105 AMs から分離でき、8-10 週古い C57BL/6 の雄マウスから収集した BAL 液。マウス肺ダイジェストから午前の収穫は可変してマウス BAL 液のそれよりもやや少ない可能性があります。人間の BAL 液から午前の収穫は、BAL 液、洗浄、および患者の臨床状態で使用されている生理食塩水の総容積の量によって異なります。
  4. チャンバー スライド、培養皿または培養フラスコ内のセルの種子収量と実験の必要性に基づき。理想的には、T25 培養フラスコに 10 mL の培地で 1 × 105/mL で AMs をシードします。
  5. セル 5% CO2雰囲気の 37 ° C の加湿インキュベーターで孵化させなさい。
    注: AMs 付着性のセルとして成長し、非常にゆっくりと成長 (倍加時間 > 7 日間)。
  6. 播種後 24 時間で AMs すべき付着と培地の穏やかな変化ではデタッチされません。端から端まで吸引してメディアを削除し、37 ° C に加温新鮮な培地で補充します。
    注: セルは、午前生理学または刺激の効果を評価するために今すぐ使用できます。AMs チャンバー スライドで成長に適切な抗体便利に汚すことができるし、可視化に最適です。流れフローサイトメトリー評価、AMs はソリューションを解離非酵素的セル孵化によって収穫されています。
  7. 培養液を吸引し、文化面 (T25 フラスコあたり約 2 mL) をカバーし、37 ° C で 5 ~ 10 分間インキュベートする十分な分離液を追加します。削りが不要になると機械的に細胞をこすり取る際に勧めはしませんが。側面を軽く 1-2 mL の流れ/並べ替えバッファーを追加して、優しく上下に付着性のセルの大部分をデタッチするピペットします。
  8. RNA 研究の換散バッファーを追加して培養皿に直接細胞を溶解します。

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Representative Results

マウス AMs を識別するためにフローのフローサイトメトリーによるアプローチは、図 1に示すです。これは、表面マーカー他肺居住者又は肺に浸潤食から AMs を区別するに必要な最小セットの分析が含まれています。差分解析は、間質性マクロファージ、樹状細胞、好中球、単球、肺に発生する単球由来の肺マクロファージから AMs を識別するために必要です。表面のマーカーの次のスキームは、 AMsが CD45 互いから容易にこれらの細胞型を区別するために用いることができる+CD11c+、シグ F+、CD64+- A+ bF4/80-、CD11b-;間質性マクロファージCD45+、CD11b+- Ab +、CD64+、CD24-;CD11b+樹状細胞は CD45+、CD11b+CD11c+- Ab +、CD24+CD64-;CD103+樹状細胞は CD45+CD11c+、CD24+、CD103+- Ab +CD11b-;形質細胞様樹状細胞は CD45+CD317+、シグ H+、Ly-6 C+- Ab -好中球は CD45+Ly-6 G+、CD11b+CD11c-、- Ab -Ly-6 C-、および単球CD45+CD64+/-Ly-6 C+/-、- Ab -。それぞれ、赤 (CD11cこんにちはとシグ Fこんにちは) とティール (CD11cこんにちはシグ Fint) で強調表示されます午前集団を表す従来 AMs (主要な人口) と肺マクロファージ (人口のマイナーな) 肺胞腔内に発生します。CD45 の並べ替えの流れ+CD11cこんにちはシグ Fこんにちは細胞収率精製マウス AMs。図 2は、正確な同定と人間の AMs の分離に必要な細胞表面マーカーを示しています。人間の AMs は CD45 の識別+、CD11b+、HLA+、CD163+CD169+と CD206+バル細胞、およびフローを下位アプリケーションに並べ替えをすることができます。

Figure 1
図 1: マウス AMs の代表フローサイトメトリー解析します(A)マウス肺ティッシュ セクション (ヘマトキシリンとエオシン) で AMs の解剖学的位置。AMs は矢印で示された、スケール バーが 60 μ m。(B)代表的なフローサイトメトリー マウス bal の AMs を識別するための戦略をゲートします。試料をセル アナライザーによって評価し、データ ダウン サンプリングされた比較のための 500 のイベント分析ソフトウェアで。赤 (CD11cこんにちはとシグ Fこんにちは) ティール (CD11cこんにちはシグ Fint)、それぞれ、従来の AMs (主要な人口) と単球由来肺マクロファージ (マイナーな人口)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 人間の AMs の代表フローサイトメトリー解析します(A)は、人間の肺移植レシピエントから BAL 液から人間の AMs を識別するために戦略をゲートします。(B)文化の 7 日間で人間の AMs の明視野光学顕微鏡像。スケール バーは、400 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

AMs は、肺に生じる出生時と26全体の寿命を永続的な作成時間の長いリビング肺居住者マクロファージです。肺生理学7と病理12とその潜在的な肺の免疫24の予測における役割を認識しています。AMs 肺11,27で長期的な存在感があるので、活性化と免疫11,24、その他の慢性的な炎症と線維化肺内に、ロールの進行に関与しているので病気は、評価する必要があります。歴史的に、AMs は混乱のアイデンティティを持っていたし、された誤認しやすい。最近採用された表現型マーカー25,28, 人間を区別し、他の肺の食細胞 (例えば、間質性マクロファージ、肺樹状細胞、単球から AMs をマウスに可能なそれは今肺マクロファージを派生した)。ここで説明する方法は、マウスとヒトの体外培養、分離のために最適化されています。これらのプロトコルは、他の種から AMs の広く採用されることができます、ただし、徹底した特性評価のための表面のマーカーの「必要最小限」のセットを確立する適切な表現型定量を実施しなければなりません。

洗浄によってマウスの AMs の分離、キレート剤 (すなわちEDTA) と予備冷蔵バル バッファーを含めることは現在の研究で重要であると発見されました。AMs は、肺胞の壁に付着、PBS の単独での使用セルを外れに効果的ではなかったと有意に低収量を生産します。気管カテーテルのインストールを確保は、別の重要なステップです。BAL 液の損失を最小限に抑える防漏添付ファイルを確保するため注意が必要があります。余分な注意が必要と lavaging 若いマウス中 (< 6 週齢)、洗浄中に涙や漏れで気管の構造の繊細さがあります。多くの場合 2 つの連続した重複縫合をインストールにより、カテーテルのセキュリティで保護された添付ファイル、漏れを防ぎます。非酵素的分解 (すなわち。、キレート剤を添加したバッファーと) だっただけで、本研究における絶縁に午前実行こそ肺洗浄中にコラゲナーゼ酵素分離が良い午前収量を生成可能性があります。

BAL 液から人間の午前の収量は、変数です。AMs は、ルーチンの後の肺移植の経過観察中にノートン胸所ひと肺移植から収集したすべての BAL 細胞の約 10% を構成して午前収量はいくつかの変数に依存します。このような変数には、患者の臨床症状、生理食塩水で洗浄、使用量および AM 分離処理 BAL 液の量が含まれます。Microhemorrhage は、前洗浄プロシージャ (例えば、針生検) BAL 細胞の細胞構成を変更します。それにもかかわらず、表現型マーカーの実装明確な検出や人間の午前のプール (図 2) の評価ができます。

L-929 エアコン媒体 (M-CSF のソース) の使用 AMs の生体外でメンテナンスの必要があります。それは私たちの信念精製 M-CSF の補充は文化の AMs を維持するのに十分だろうただし、最適化された濃度は両方とも、人間作り出される、マウスの AMs 必要があります。エンドサイトーシス、炎症、抗原提示、成熟/活性化状態、または経時的解析11,24 の生きた細胞のメンテナンスを要する他の試金への応答に関する研究用培養細胞が.この要領では、それは継続的に培養線とのみ短期ターミナル研究 AMs を維持するために試行されませんでした (< 収穫から 30 日間) を行った。したがって、このメソッドに明白な制限はセルの安定性に特に、長期的なカルチャ データの欠如 (すなわちAMs は有限または連続を育てることができるかどうかの行、凍結し、凍結、AMs の応答と表現型および遺伝子型ドリフト) 継続的な文化の後。AMs は長い生きている生体内で細胞は、健康な肺と呼吸器感染症や炎症性/自己免疫反応を受けているそれらから分離された細胞間変異の程度を予想します。

全体的にみて、メソッドここで紹介文書を分離する、特性評価、および人間の維持とマウス AMs 簡易アプローチ細胞培養系で。このプロトコルは、実験の個々 のニーズに基づいてさらに最適化することができます、ただし、呼吸器疾患、呼吸器に AMs の機能的関連性を分析する初心者のためのプロトコルとして役立つかもしれない。

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Disclosures

著者の利害の衝突を宣言するあります。

Acknowledgments

原稿を編集の支援ありがとうクレア プレンダーガスト。DKN はサポートされて研究でフリン財団から (#2095) を付与し、TM は国立衛生研究所 (R01HL056643 と R01HL092514) からの補助金によってサポートされています。DKN 手法を開発、研究をデザイン、そして書いた原稿;動物実験と臨床サンプル調達支援 OMSB 支援フローサイトメトリー解析・細胞のソーティング。TM は研究を監督し、原稿の見直し。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

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