万古霉素滴入硫酸钙和自体骨治疗兔骨感染的改进模型

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Summary

本研究通过阻断骨髓中相同数量的细菌, 提出了一种感染金黄色葡萄球菌的改良兔模型。万古霉素负载硫酸钙和自体骨用于抗生素和骨修复治疗。该方案可为骨感染和再生的研究提供参考。

Cite this Article

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Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

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Abstract

骨感染是由细菌入侵引起的, 在临床、整形外科和创伤性手术中, 细菌感染是极其困难的。骨感染可能导致持续炎症、骨髓炎和最终骨不愈合。建立可行、可重复的动物模型对骨感染研究和抗生素治疗具有重要意义。作为体内模型, 兔模型在骨感染研究中得到了广泛的应用。然而, 此前对兔骨感染模型的研究表明, 由于细菌数量是可变的, 感染状态不一致。本研究通过阻断骨髓中的细菌, 提出了一种诱导兔骨感染的改进手术方法。然后, 进行多层次的评价, 验证建模方法。

一般情况下, 脱骨坏死组织和植入香康辛负载硫酸钙 (vcs) 是抗生素治疗的主要优势。尽管 vcs 中的硫酸钙有利于骨细胞的爬行和新的骨生长, 但大量的骨缺损发生后, 脱骨。自体骨 (ab) 是一种治疗坏死骨后骨缺损的一种吸引人的方法。

在这项研究中, 我们使用尾骨作为自体骨植入骨缺损。采用显微断层扫描 (微 ct) 和动物牺牲后的组织学分析测量骨修复。因此, 在 vcs 组中, 持续获得骨不愈合。相比之下, vcs-ab 组的骨缺损区明显减少。目前的建模方法描述了一种可重复、可行、稳定的骨感染模型制备方法。vcs-ab 治疗导致抗生素治疗后骨不愈合率降低。改进的骨感染模型以及 vcs 和自体骨的联合治疗有助于研究与创伤骨科应用相关的骨感染和骨再生的潜在机制。

Introduction

骨感染通常是由创伤、骨折或其他骨骼疾病后的细菌或其他微生物入侵引起的。骨感染可能导致高水平的炎症和骨组织破坏。在临床上,金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 是骨感染主要病原体 2,3.骨感染是痛苦的, 使人虚弱的, 往往是慢性的, 是极难治疗4。目前, 清创坏死组织和植入万古霉素负载钙 (vcs) 珠已被证实为控制局部感染5,6的有效策略。然而, 10% 至15% 的患者经历了长期的骨修复过程, 延迟愈合, 或抗感染治疗后不愈合 7。骨缺损的大部分是整形外科医生最困难的问题。自体骨移植被认为是骨不结合治疗8,9的最佳骨置换方法。

到目前为止, 关于骨感染和自体骨植入的研究大多是在各种动物模型中进行的, 如老鼠、兔子、狗、猪和羊10、11.兔子模型最常用于骨感染研究, 这是诺登和肯尼迪在 1970年12,13首次进行的。在我们之前的研究中, 我们采用了 nnoren 方法的兔子模型, 我们发现注入骨髓的金黄色葡萄球菌的数量无法准确量化, 因为从骨髓中漏出的血液导致细菌溶液溢出。

本文提出了一种改良的家兔骨感染的手术方法。在手术结束时, 进行血液生化检查、细菌学检查和组织病理学检查, 以验证骨感染模型。然后, 植入 vcs 抑制感染, 自体骨植入, 促进骨再生。

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Protocol

本研究中使用的兔子按照《实验动物护理和使用指南》进行处理。所有的实验程序都遵循了浙江中医药研究院生物伦理委员会的规则。

1. 细菌悬浮液的制备

  1. 溶解0.5 毫克金黄色葡萄球菌冷冻干燥粉 (atcc 6538) 与0.3 毫升的卢里亚-伯塔尼培养基。将悬架完全混合。
  2. 将细菌悬浮液流到色氨酸大豆琼脂板上, 在37°c 孵育细菌菌落16小时。
  3. 选择单个菌落形成单元 (cfu) 并在色质豆瓣管中培养 24小时, 在37°c 下进行约24小时的亚培养, 在16至18小时后得到中对数生长相菌, 当时光学密度 (od) 值为0.6 纳米, 为600纳米14岁
  4. 将1毫升的细菌悬浮液转移到离心管中。在 825 x g和4°c 下离心 5分钟, 并丢弃上清液。用100μl 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对细菌进行再利用和清洗;重复此步骤3次。最后, 用3毫升的 pbs 重新悬浮细菌。
  5. 使用麦克法兰的浊度法估计细菌浓度15
    1. 将100至500μl 的细菌悬浮液转移到比色管中, 直到浊度相当于 0.5 mcfarland 标准。
    2. 当细菌含量达到约 10 8 chuml 时, 通过与0.5 麦克法兰的视觉比较来评估浊度。
      请注意:确保细菌悬浮液的体积足以满足以下方案。每只兔子的细菌悬浮量都小于1毫升。
  6. 将0.2 毫升的细菌悬浮液转移到琼脂板上, 均匀地应用。在37°c 下将板体在37°c 下培养 16小时, 数一数菌落, 以验证细菌悬浮液的 cfu。

2. 骨感染模型的制备

  1. 将3个月大的新西兰雄性白兔关在单独的笼子里, 在空气控制的条件下 (20±1°c) 和12小时的浅暗照明周期。每天提供日常饮食和自来水。
  2. 确保在手术时兔子的体重超过3公斤。
  3. 用戊巴比妥钠 (每100克体重3毫克) 腹腔注射对白兔进行麻醉。确保兔子因未能对爪子夹紧做出反应而完全麻醉。在手术过程中将兔子固定在手术台上。
    请注意:确保建模过程持续时间小于1小时。
  4. 用电动剃须刀对头发生长方向进行剃须胫骨近端区域。通过应用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
  5. 用笔和尺子标记胫骨的上端和注射的钻孔位置 (与胫骨上端的距离为1.5 厘米)。确保钻孔位置水平位于胫骨平台中间 (图 1a)。
  6. 用11号手术刀切割胫骨皮肤, 并在骨膜上做一个1厘米的切口 (图 1b, c)。用电骨钻装置在胫骨上打一个直径2毫米的洞 (图 1d)。
  7. 用直径为2毫米、高度为2毫米的骨蜡圆筒按胫骨平台上直径2毫米的孔 (图 1e)。沿胫骨平台的水平平面取出备用骨蜡 (图 1f)。检查2毫米孔是否充满了骨蜡 (图 1g)
    请注意:通过检查有或没有血液溢出的孔, 确保孔充满骨蜡。
  8. 用垂直床垫缝合线缝合骨膜和皮肤, 以防止动物咀嚼缝合线 (图 1h)。
  9. 用1毫升无菌注射器 (图1i) 注入 1 x 10 8 chun 溶液 (每100克体重 30μl)。确保针头穿透骨蜡, 慢慢地将金黄色葡萄球菌溶液注入骨髓。
  10. 在温暖和清洁的条件下保持动物, 以避免建模后的热损失。监测呼吸率和心率。醒来后, 把兔子关在单独的笼子里, 可以自由获得食物和水。

3. 骨感染模型的评价

  1. 在感染后的第7天、第14天、第21天和第28天, 将兔子放在兔子固定器中, 头部和耳朵在固定器外面。
  2. 将耳静脉中的2毫升血液放入乙二胺乙酸 (edta-k2) 抗凝血容器中。将血管中的1毫升血液放入血液容器中。在室温下离心血清 10分钟, 速度为 651 x 克.
    1. 用血液生化分析仪测定全血白细胞计数 (wbc), 用酶联免疫吸附法 (elisa) 方法16测定 c 反应蛋白 (crp)。
  3. 在感染后的第7天、第14天、第21天和第28天, 麻醉一种模型兔与戊巴比妥钠的剂量为每100克体重3毫克。用11号手术刀切割胫骨皮肤, 并在骨膜上做一个2厘米的切口 (图 2a)。
  4. 清洁骨蜡。用电动骨钻单元打两个直径4.8 毫米的相邻孔, 拆除坏死骨 (图 2b)。用骨胶勺脱下坏死的骨髓和肉芽组织 (图 2c)。
    请注意:在清创过程中清洁骨组织, 以避免骨髓中残留的骨组织。
  5. 刮擦和清洁两个孔之间的骨组织 (图 2d)。
  6. 将1毫升骨髓撒在羊血琼脂板上。在37°c 下连夜孵化板材。选择30-300 个菌落板, 并计算菌落数。
  7. 在感染后的第28天结束时, 沿膝关节和踝关节边缘提取胫骨标本。将胫骨标本测定4% 的甲醛 24小时, 用10% 的 edta 对胫骨标本进行解码, 为期8周。
  8. 在分级系列乙醇稀释中脱水胫骨标本, 然后嵌入石蜡中。从日冕平面上连续切割 4个5μm 部分。用血红素和 eosin (h & e) 染色试剂盒染色。
  9. 使用显微镜查看染色的部分, 并使用标准软件记录透射的光线图像。

4. vcs 珠子的制备

  1. 在9.5 克医用硫酸钙中加入1克盐酸万古霉素粉, 然后在混合动力中加入3毫升的生理盐水。用铲子将它们彻底混合30至45秒。
  2. 将混合产品放入柔性硅胶模具 (直径 4.8 mm、高度 4.8 mm 的圆柱体) 中, 在室温下干燥 15分钟. 通过弯曲模具取出 vcs 珠子。

5. 自体骨的抗生素治疗与植入

  1. 在感染后28天内, 以每100克体重3毫克的剂量对模型兔子进行麻醉。使用电动剃须刀剃须胫骨近端区域。应用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
    请注意:确保建模过程小于1小时。
  2. 使用电动剃须刀刮尾区域, 并应用 povidone-idi 溶液对尾巴进行消毒。
  3. 用手术剪刀把尾巴剪下来。用11号手术刀切割尾巴皮肤, 露出尾骨。用垂直床垫缝合线缝合尾部区域的皮肤, 防止动物咀嚼缝合线。
  4. 去除任何肌肉、软组织和骨膜。在每个关节处分离尾骨, 并将骨头碎片转移到含有无菌盐水的100毫米塑料盘中。
  5. 使用弯曲的推子将4块 vcs 微珠 (直径4.8 毫米、高度4.8 毫米的圆柱体、每颗珠子1.25 毫克万古霉素) 插入骨髓腔 (图 2e)。
  6. 用弯曲的推子填充骨头缺陷, 用8块自生骨 (每块直径为2毫米、每块4毫米高的圆筒) (图 2e)。
  7. 用可吸收的手术缝合线缝合骨膜和皮肤, 用床垫缝合方式缝合 (图 2f)。
    请注意:手术期间将温度保持在25°c。
  8. 保持动物在温暖和清洁的条件下, 以避免手术后的热损失。监测呼吸率和心率。醒来后, 把兔子关在单独的笼子里, 可以自由获得食物和水。

6. 抗生素活性评估

  1. 将兔子放入兔子固定器中, 并在治疗后2、4、6和8周将头部和耳朵放在固定器外面。
  2. 用 edta-k2 抗凝血血管从耳膜中抽血。将血管中的1毫升血液放入血液容器中。在室温下离心血清 10分钟, 速度为 651 x 克.
  3. 用血液生化分析仪测定全血白细胞计数 (wbc), 用 elisa 方法16测定 c 反应蛋白 (crp)。

7. 骨再生评估

  1. 在治疗后8或12周结束时, 注射过量的戊巴比妥钠, 使兔子安乐死。
  2. 提取胫骨标本, 沿着膝盖和脚踝关节的边缘。清除肌肉和筋膜层。
  3. 采用显微断层扫描 (mtt) 对胫骨结构进行分析。选择一个椭圆形区域4.8 毫米直径和9.6 毫米长的感兴趣的区域 (roi)。使用位图数据重建3d 模型图像。
  4. 从3d 模型中选择骨体积/组织体积 (bv/tv)、小梁厚度 (tb. th)、小梁数 (tb. n) 和小梁分离 (tb. sp) 的比例得分, 以评估骨再生。

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Representative Results

骨感染模型的评价
兔感染金黄色葡萄球菌后, 其病理表现与临床上慢性骨髓炎的典型症状相似。在我们的研究中, 30只家兔被感染, 并作为模型组进行了研究, 10只兔子被作为对照动物。所有模型兔都感染了胫骨局部部位的鼻窦, 从鼻窦流出白色和黄色脓液 (图 3a)。h & e 染色结果表明, 模型组细菌聚集物位于死骨周围, 正常骨细胞无法识别。模型组中 crp 和 wbc 的水平高于对照组 (图 3b)。坏死的骨髓裂解物在琼脂板上有条纹, 这导致模型组感染后菌落数量增加 (图 3c)。在模拟结束时, 有3只兔子因严重感染而死亡。其余感染家兔为骨感染模型, 分为模型组、vcs 组和 vcs-ab 组。

抗生素活性与骨再生的评估
在 vcs 或 vcs-ab 治疗后2周、4周、6周和8周内, crp 和 wbc 的水平显著降低 (图 4a)。经过12周的 vcs 植入和同种异体骨移植, vcs-ab 组的胫骨缺损似乎完全凝聚。vcs-ab 组的胫骨平台表面比 vcs 组的胫骨平台表面平坦。二维重建图像表明, 在 vcs-ab 和 vcs 治疗后的12周时间内, 骨体积逐渐增加, 而模型组的骨丢失显著 (图 4b)。为了分析骨再生的定量指标, 选择了一个椭圆形面积4.8 毫米直径和9.6 毫米长作为感兴趣的区域 (roi) (图 4c), 并利用位图数据重建三维模型图像。模型组 bv/tv 的微 ct 指标明显低于 vcs 组和 vcs-ab 组。vcs-ab 组的 tb. n 和 tb. th 得分明显高于模型组和 vcs 组。此外, vcs-ab 组的 tb. sp 分数明显低于模型组和 vcs 组 (图 4d)。

这些结果表明, 金黄色葡萄球菌感染导致模型组的 wbc 和 crp 增加, 使用 vcs 可以减少。vcs 的植入被认为是最佳的抗生素治疗方法。然而, 在 vcs 组中可以观察到骨缺损。vcs 和自体骨处理增加了小梁的厚度和小梁数, 减少了小梁的分离。vcs-ab 治疗显示了促进骨愈合的能力。

Figure 1
图 1.骨感染模型的手术准备.(a) 显示胫骨上的冲孔位置。用金黄色葡萄球菌注射的钻孔位置与胫骨上端之间的距离为1.5 厘米 (b) 在皮肤上进行的切口, 以暴露骨膜。(c) 显示通过骨膜进行的切口, 以暴露胫骨。(d) 在胫骨上打一个直径为2毫米的洞。(e) 填充直径为2毫米的充满骨蜡的孔。(f) 切断多余的骨蜡。(g) 显示骨蜡填充骨缺损。(h) 缝合骨膜和皮肤。(i) 用金黄色葡萄球菌溶液注入。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.同种异体骨移植的制备及抗生素治疗.(a) 在皮肤上进行的切口, 以暴露骨膜。(b) 打两个直径4.8 毫米的相邻孔。(c) 除血肉和炎性骨髓。(d) 刮擦和清洁两个孔之间的骨组织, 使长圆圈直径4.8 毫米, 长9.6 毫米。(e) 用 vcs 和同种异体骨移植填空。(f) 缝合骨膜和皮肤。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.骨感染模型的评价.(a) 兔腿感染金黄色葡萄球菌的外观特征, 以及模型和对照组中兔胫骨典型的组织病理学图像。蓝箭: 骨细胞;粉红色箭头: 骨小梁;黄色箭头: 细菌聚集体;绿色箭头: 死骨头。(b) 在感染后7、14、21和28天的时间点, wbc 和 crp 的结果是在兔血清中产生。这些列表示平均±se, *p < 0.05对照组的对比。(c) 在隔夜孵育后计算的骨髓中细菌菌落的数量。这些列表示平均± se、*p 和 lt;0.05 与第0天的菌落计数。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.抗生素活性和骨再生评估.(a) 在 vcs 和 vcs-ab 植入后2周、4周、6周和8周的时间点, 在兔血清中 wbc 和 crp 的结果, 与模型组相比, 均值为±se、 #p < 0.05 和 *p < 0.05。(b) 用显微 ct 分析胫骨冠状切片图像 (c) roi 的位置。(d) 直方图显示每组5只兔子的骨体积/组织体积 (bv/tv)、小梁厚度 (tb. th)、小梁号 (tb. n) 和小梁分离 (tb. sp) 分数。这些列表示平均±se, *p < 0.05对照组或模型组的对比。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5.所有过程的时间线.请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

在以往的研究中, 构建了各种动物模型, 研究急性和慢性骨感染;然而, 对理想模型的寻找仍然持续到17,18。此外, 理想的骨感染模型有望模拟临床环境下骨感染的病理特征, 而建模期间, 成本仍然较低, 易于实施。目前, 兔骨感染模型是炎症性骨病研究中最常见的模型, 因为兔子是可用的、可行的、廉价的。在我们之前的研究中, 我们比较了不同体重的兔子的死亡率和感染率。结果表明, 体重应大于3公斤;否则, 就会出现高死亡率或高死亡率, 手术后死亡率较高。

与早期的研究不同, 我们研究中的兔骨感染模型和抗生素治疗与人类疾病的病理特征和手术治疗是一致的。在先前的研究中, 注射莫氏钠和金黄色葡萄球菌的动物的病理状态不超过60天。此外, 死亡率超过 20% 1219.骨缺损的溢金黄色葡萄球菌溶液已被证明能诱发低感染率。我们用骨蜡填充胫骨上的2毫米孔, 以阻断骨髓中的金黄色葡萄球菌溶液, 并通过检查有或没有血液溢出的孔, 确保孔充满骨蜡。由于兔胫骨厚度为2毫米, 我们将直径为2毫米、高度为2毫米的圆筒压入直径为2毫米的孔, 确保了骨蜡充满了孔, 不能渗入骨髓。此外, 由于骨蜡是灵活和稳定的, 它填补了洞, 不能融化或反应与骨髓。在我们的研究中, 在感染后的第2 8天, 骨蜡仍然完整, 并完全填补了这些洞。由于家兔的重量大于3公斤, 小于3.2 千克, 细菌悬浮液的体积为900μl 至960μl。由于注射速度慢, 骨蜡阻滞功能强, 这种细菌悬浮液量可以在没有高压的情况下注入骨髓。结果表明, 该方案保证了骨髓中金黄色葡萄球菌的感染量。在胫骨上打了一个直径2毫米的洞, 以确保与胫骨上端的距离为1.5 厘米, 该孔位于胫骨平台, 确保有足够的空间在以下治疗中摘除和植入 vcs 珠和自体骨。在模拟过程中, 3只兔子死于严重感染。其余家兔被鉴定为骨感染家兔, 其余家兔感染率为100%。与其他骨感染方案相比, 如植入金黄色葡萄球菌的海绵或植入异物, 我们的方案在临床环境中非常模拟骨感染, 对手术的影响不大, 例如:作为脱骨坏死的骨头和抗生素治疗。

骨感染的诊断对外科医生来说是一个挑战。实验室检测结果, 包括血清炎症标志物检测、微生物学分析和组织病理学分析, 用于评估临床环境中的骨感染20。此外, 诊断成像, 如超声, 放射学, 计算机断层扫描, 磁共振成像或拉曼光谱被应用于骨感染 21。不幸的是, 通过成像方法诊断骨髓炎往往被推迟, 因为骨坏死很难通过普通影像学检测, 直到感染的第3周。在我们的研究中, 我们使用血清炎症标志物检测和组织病理学分析来评估骨感染模型, 因为这些方法是有效的, 可操作的, 指标是敏感的。以下是在我们的研究中创建骨感染模型的外科手术中最重要的步骤。选择体重适当的兔子进行手术和治疗。在提高和手术过程中保持无菌环境, 并确保按照手术程序的程序提供温暖的条件。在胫骨上打一个直径2毫米的洞, 并确保与胫骨上端的距离为1.5 厘米, 用骨蜡填充孔, 并缝合骨膜和皮肤, 以阻断细菌溶液。抗生素治疗最重要的步骤如下。通过检测全血 wbc 和血清 crp, 确保家兔的病理骨感染。彻底除牙坏死骨, 打两个直径4.8 毫米的相邻孔, 刮擦和清洁2个孔之间的骨组织。将4块 vcs 珠子和8块自体骨植入骨髓和骨缺损中。

抗生素治疗后, 我们观察到 vcs-ab 组的家兔比 vcs 组的家兔有更高的成骨潜能。这可能是因为自体骨含有激活的骨细胞和骨形成生长因子, 这些因子在整个移植表面产生骨基质, 而 vcs 的降解会导致缺陷区域的骨基质稀缺。结果表明, 自体骨具有优越的成骨能力。虽然自体骨采集的数量有限, 并导致发病率的供体部位, 自体骨的重要性是不可忽视的 22,23,24。在我们的研究中, 自体骨是从尾骨获得的, 避免了全身损伤, 并降低了死亡率相比, 获得自体骨从胫骨。自体自体骨骨移植可能是动物骨感染研究中首选的移植材料。

最后, 建立了一种改进的兔骨感染模型。采用炎症指标和血液生化指标对骨感染模型进行了评价。此外, 抗生素治疗后, 进行了多层次的分析, 以检测抗生素活性和骨再生能力。该建模、处理方案和评价方法是可行和可靠的。进一步的研究将集中在利用多模视觉装置来监测骨感染的病理过程和骨修复过程上。

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Disclosures

作者报告说, 这项工作没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金 (81803808, 81803808)、浙江省医疗卫生科学技术基金 (2017ky271) 和浙江省科技项目 (2017KY271) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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