Behandling med Vancomycin lastet kalsium sulfat og gjestfrihet bein i en forbedret kanin modell av benet infeksjon

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denne studien presenterer en forbedret kanin modell infisert med Staphylococcus aureus blokkerer samme mengde bakterier i benmargen. Vancomycin lastet kalsium sulfat og gjestfrihet bein brukes for antibiotika og bein reparasjon. Protokollen kan være nyttig for å studere benet infeksjon og gjenfødelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Benet infeksjon oppstår bakterielle invasjon, som er svært vanskelig å behandle i klinisk, ortopedisk og traumatisk kirurgi. Benet infeksjon kan føre vedvarende betennelse, osteomyelitt og eventuell bein ikke-unionen. Etablering av en mulig reproduserbar dyr modell er viktig å bein infeksjon forskning og antibiotikabehandling. Som en i vivo er kanin modellen mye brukt i benet infeksjon forskning. Men bein tidligere studier på kanin infeksjon modeller viste at statusen infeksjon var inkonsekvent, hvor bakterier var variabel. Denne studien presenterer en forbedret kirurgisk metode for å indusere benet infeksjon på en kanin, ved å blokkere bakterier i benmargen. Multi-level evalueringer kan deretter utføres kontrollere metoden modellering.

Generelt er debriding nekrotisk vev og implantering av vancomycin-lastet kalsium sulfat (VCS) dominerende i antibiotikabehandling. Selv om kalsium sulfat i VCS fordeler osteocyte gjennomgang og nye bein vekst, oppstår massive bein feilene etter debriding. Gjestfrihet bein (AB) er en tiltalende strategi å overvinne bein mangler for behandling av massiv bein feil etter debriding nekrose bein.

I denne studien brukte vi hale bein som en gjestfrihet bein implantert i bein feilen. Bein reparasjon ble målt ved hjelp av mikro-beregnet-tomografi (mikro-CT) og histologiske analyse etter dyr offer. Resultatet i gruppen VCS ble bein ikke-unionen konsekvent oppnådd. Derimot var bein defekt områdene i gruppen VCS-AB sunket betraktelig. Nåværende modelleringsmetoden beskrevet reproduserbare, stabil og mulig metode for å forberede en benet infeksjon modell. VCS-AB behandling resultert i lavere bein ikke-unionen priser etter antibiotikabehandling. Forbedret benet infeksjon modellen og Kombinasjonsbehandling av VCS og gjestfrihet bein kan være nyttig i å studere de underliggende mekanismene i benet infeksjon og bein regenerering relevant traumatology Ortopedisk programmer.

Introduction

Benet infeksjon er vanligvis resultatet av bakterier eller andre mikroorganismen invasjon etter traumer, beinbrudd eller andre bein sykdommer1. Benet infeksjon kan indusere høy betennelse og bein vev. I klinikken er Staphylococcus aureus (S. aureus) den dominerende utløsende agenten benet infeksjon2,3. Benet infeksjon er smertefulle, ødeleggende, og ofte tar en kronisk kurs som er svært vanskelig å behandle4. I dag er er rensing av nekrotisk vev og forankring av vancomycin-lastet kalsium (VCS) perler bekreftet som en effektiv strategi for å kontrollere lokale infeksjon5,6. Men opplevde 10% til 15% av pasientene en langvarig bein reparasjonsprosessen, forsinket union eller ikke-unionen etter anti-infeksjon behandling7. Den store segmentet bein kunden er vanskeligste for ortopediske kirurger. En autologous bone graft anses optimal bein utskifting i benet ikke-unionen behandling8,9.

Hittil, de fleste studiene på benet har infeksjon og autologous bone implantasjon vært gjennomført i ulike typer av dyr modeller, for eksempel rotter, kaniner, hundene, griser og sauer10,11. Kanin modeller brukes vanligvis for benet infeksjon studier, som første utført av Norden og Kennedy i 197012,13. I vår forrige undersøkelse, vi brukte kanin modeller følge Nordens metode, og vi fant at antallet S. aureus injisert i benmargen ikke kunne være kvantifisert nøyaktig, blod lekkasje av benmarg ledet til bakterier løsning overflow.

Denne artikkelen presenterer en forbedret kirurgisk metode for å indusere benet infeksjon på kaniner. På slutten på prosedyren, ble en blodprøve for biokjemi, en bakteriologiske undersøkelse og en histopathologic undersøkelse utført for å kontrollere benet infeksjon modellen. Deretter VCS var innoperere for å forhindre infeksjon og gjestfrihet bein ble implantert fremme bein foryngelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kaniner brukes studien ble behandlet i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr. Alle eksperimentelle prosedyrene ble fulgt av reglene av den bioetikk komiteen av Zhejiang Academy av tradisjonell kinesisk medisin.

1. forberedelse av bakteriell suspensjon

  1. Oppløse 0,5 mg av S. aureus Frysetørring pulver (ATCC 6538) med 0,3 mL av Luria-Bertani kultur medium. Bland suspensjon helt.
  2. Strek bakterier suspensjon på tryptic soya agar tallerkener og ruge bakteriell koloniene på 37 ° C 16 h.
  3. Velg en enkelt bakterie kolonien unit (CFU) og kultur i tryptic soya kjøttkraft rør for 24 h. utføre subkultur ca 24 h på 37 ° C, og få midt logaritmisk vekst fase bakterier etter 16 til 18 h, når optisk tetthet (OD) verdien 0,6 på 600 nm 14.
  4. Overføre 1 mL av bakterier suspensjon i en sentrifuge rør. Sentrifuge for 5 min på 825 x g og 4 ° C, og forkaste nedbryting. Resuspend og vaske bakterier med 100 µL fosfat bufret saltoppløsning (PBS); Gjenta dette trinnet 3 ganger. Til slutt, resuspend bakterier med 3 mL PBS.
  5. Anslå bakterier konsentrasjonen bruker Mcfarland's turbidimetry15.
    1. Overføre 100 til 500 µL av bakterier suspensjon slik kolorimetrisk før turbiditet tilsvarer en 0,5 McFarland standard.
    2. Vurdere turbiditet visuelle sammenligning til 0,5 McFarland, når innholdet av bakterier når ca 108 CFU/mL.
      Merk: Kontroller at volumet av bakterier suspensjon er tilstrekkelig for følgende protokoller. For hver kanin er volumet av bakterier suspensjon mindre enn 1 mL.
  6. Overføre 0,2 mL bakteriell suspensjon til en agar plate og anvende den jevnt. Inkuber platen ved 37 ° C i 16 h. antall bakterier koloniene for å kontrollere CFU bakterier hjuloppheng.

2. forberedelse av benet infeksjon modeller

  1. Holde mannlige New Zealand hvit kanin, alderen 3 måneder, i individuelle bur, under luft-kontrollerte forhold (20 ± 1 ° C) og 12 h/12 h lys-mørk lys sykluser. Tilby rutinemessig kosthold og trykk vann daglig.
  2. Kontroller at på tidspunktet for kirurgi at kaninen veier mer enn 3 kg.
  3. Anaesthetize kanin ved intraperitoneal injeksjon med pentobarbital natrium (3 mg per 100 g av kroppsvekt). Kontroller at kaniner er fullt anesthetized av svare på labben knipe. Fastsette kaniner i drifts tabellen under operation prosedyre.
    Merk: Kontroller at modellering prosedyre varigheten er mindre enn 1 time.
  4. Barbere proksimale tibia regionen med en elektrisk barbermaskin mot retning av hårvekst. Desinfiser huden ved å bruke en povidon-jod-løsning.
  5. Merk den øverste enden av tibia og bore hull posisjon for injeksjon med S. aureus (den øverste enden av tibia ligger 1,5 cm) med penn og hersker. Kontroller bore hull stillingene er i tibial platået vannrett (figur 1A).
  6. Skjær tibia huden med nei 11 skalpell og gjøre en 1 cm snitt i periosteum (figur 1B, C). Slå et 2 mm diameter hull i tibia bruker en elektrisk bein drill enhet (figur 1D).
  7. Trykk 2 mm diameter hull i tibial platået med en sylinder av bein voks 2 mm i diameter og 2 mm høyde (figur 1E). Fjerne ekstra bein voksen langs horisontalplanet av tibial platået (figur 1F). Kontroller at 2 mm hull er full av bein voks (figur 1G).
    Merk: Kontroller at hullene er full av bein voks ved å sjekke hullet med eller uten blod overflyt.
  8. Sy opp til periosteum og huden med absorberbare kirurgisk Sutur i en loddrett mattress Sutur å forhindre dyr fra chewing bildet (figur 1H).
  9. Injisere 1 x 108 CFU/mL av S. aureus løsninger (30 µL per 100 g kroppsvekt) med en 1 mL asepsis injektor (figur 1jeg). Kontroller nålene trenge bein voks og injisere S. aureus løsningen i benmargen sakte.
  10. Holde dyr i varm og ren forhold å unngå varmetap etter modellering. Overvåke respirasjonsfrekvens og hjertefrekvens. Etter waking opp, huset kaninene i individuelle bur med fri tilgang til mat og vann.

3. evaluering av benet infeksjon modell

  1. På dager 7, 14, 21 og 28 etter smitte, plassere kaniner i det kanin bestemt med hodet og øret utenfor bestemt.
  2. Trekke 2 mL blod fra auricular årer i en dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA-K2) antikoagulerende blod beholder. Trekke 1 mL blod fra en blodåre i en blod-beholder. Sentrifuge serum for 10 min med en hastighet på 651 x g ved romtemperatur.
    1. Bestemme antall hvite blodlegemer (WBC) fullblod bruker en blod biokjemiske analysator, og C - reaktivt protein (CRP) av et enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) metoden16.
  3. På dager 7, 14, 21 og 28 etter smitte, anaesthetize en modell kanin med pentobarbital natrium på dosering av 3 mg per 100 g kroppsvekt. Skjær tibia huden med nei 11 skalpell og gjøre en 2 cm snitt i periosteum (figur 2A).
  4. Rengjør Ben voks. Debride nekrose bein av punching to tilstøtende 4.8 mm diameter hull med en elektrisk bein drill enhet (figur 2B). Debride nekrose benmargen og korning tissue benytter en bein skje (figur 2C).
    Merk: Rengjør benvev under rensing å unngå benvev igjen i benmargen.
  5. Skrape og rense benvev mellom to hullene (figur 2D).
  6. Spre 1 mL av benmarg på sau blod agar plater. Inkuber plater overnatting på 37 ° C. Velg plater av 30-300 koloniene, og beregne antall kolonier.
  7. På slutten av dag 28 etter smitte, ekstra tibia prøver langs kantene på kne og ankel. Fix tibia eksemplarer i 4% paraformaldehyde for 24 h. Decalcify tibia prøver i 10% EDTA i 8 uker.
  8. Tørke tibia eksemplarer i en gradert rekke etanol fortynninger, og bygg deretter inn i parafin voks. Klipp 4 rad 5 µm deler fra koronale flyene. Stain seksjoner med en hematoxylin og eosin (H & E) flekker kit.
  9. Bruk et mikroskop til å vise de fargede delene og posten overføres lett bilder med programvare.

4. forberedelse av VCS perler

  1. Legge 1 g av vancomycin hydrochloride pulver til 9,5 g av medisinsk karakter kalsium sulfat, og deretter legge til 3 mL vanlig saltvann blandet makt. Bland dem godt med en slikkepott for 30 til 45 s.
  2. Plasser blandet produktet i fleksible silica gel mold (sylinder av 4.8 mm diameter og 4.8 mm høyde), og tørr ved romtemperatur for 15 min. fjerner VCS perlene bevegelse mold.

5. antibiotikabehandling og implantering av gjestfrihet bein

  1. Anaesthetize modell kaninene med pentobarbital natrium på dosering av 3 mg per 100 g kroppsvekt på 28th dag etter smitte. Barbere proksimale tibia regionen med en elektrisk barbermaskin. Desinfiser huden ved å bruke povidon-jod løsning.
    Merk: Kontroller at modellering prosedyren er mindre enn 1 time.
  2. Barbere hale regionen med en elektrisk barbermaskin og desinfisere halen ved å bruke povidon-jod løsning.
  3. Kutt ned halen med kirurgisk saks. Klipp halen huden med nei 11 skalpell og avsløre hale bein. Sy opp huden på halen regionen med absorberbare kirurgisk suturene i en loddrett mattress Sutur å forhindre dyr fra chewing bildet.
  4. Fjern alle muskler og myke vev periosteum. Løsne hale bein på hver felles og overføre bein fragmenter til en 100 mm plast tallerken med bakteriefri saline.
  5. Implantatet 4 stykker av VCS perler (sylinder av 4.8 mm diameter og 4.8 mm høyde, 1,25 mg vancomycin per stykke perle) inn i margtransplantasjon hulrommet med buet pinsett (figur 2E).
  6. Fylle bein feilen med 8 biter av gjestfrihet bein (sylinder av 2 mm diameter og 4 mm høyde per hver brikke) bruker buet pinsett (figur 2E).
  7. Sy opp til periosteum og huden med absorberbare kirurgisk suturer på mattress Sutur måte (figur 2F).
    Merk: Holde temperaturen ved 25 ° C under operasjonen.
  8. Holde dyr i varm og ren forhold å unngå varmetap etter operasjonen. Overvåke respirasjonsfrekvens og hjertefrekvens. Etter waking opp, huset kaninene i individuelle bur med fri tilgang til mat og vann.

6. vurderinger av antibiotika aktivitet

  1. Inn en kanin bestemt kaniner, og plasser hodet og øret utenfor bestemt på 2, 4, 6 og 8 uker etter behandlingen.
  2. Trekke blod fra auricular vener med EDTA-K2 antikoagulerende blod fartøy. Trekke 1 mL blod fra en blodåre i en blod-beholder. Sentrifuge serum for 10 min med en hastighet på 651 x g ved romtemperatur.
  3. Bestemme antall hvite blodlegemer (WBC) fullblod ved hjelp av blod biokjemiske analyzer og C - reaktivt protein (CRP) ved en ELISA metoden16.

7. vurderinger av bein gjenfødelse

  1. Euthanize kaniner ved å injisere med en over dosering av pentobarbital natrium, på slutten av 8 til 12 uker etter behandling.
  2. Ekstra tibia prøver, langs kantene på kne og ankel. Debride muskler og fascial lag.
  3. Analyser strukturen av tibia ved hjelp av mikro-beregnet tomografi (mikro-CT). Velg en oval området 4.8 mm diameter og 9.6 mm lenge regionen rundt (ROI). Rekonstruere 3D modell bilder bitmap data.
  4. Velg scorene til forholdet mellom bein volum/vev volum (BV/TV), trabekulært tykkelse (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) og trabekulært separasjon (Tb.Sp)from the3D modeller for å vurdere bein gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering av benet infeksjon modell
Etter infeksjon med S. aureusvar patologisk manifestasjoner av kaniner lik den representative symptomet på kronisk osteomyelitt i klinikken. I vår studie 30 kaniner var infisert, og utsatt som en modellgruppe og 10 kaniner ble utsatt som kontrollen dyr. Alle modell kaniner har infisert bihulene for tibia lokale området, med hvite og gule puss over flyt fra bihulene (Figur 3A). Resultatene av H & E flekker indikerer at bakteriell aggregater ligger rundt døde ben i modellgruppen, og vanlige osteocytes, kan ikke identifiseres. Nivået av CRP og WBC er høyere i modellgruppen enn i kontrollgruppen (Figur 3B). Lysates nekrose benmargen er stripete på agar plater, som resulterer i et økt antall koloniene for modellgruppen etter smitte (Figur 3C). På slutten av modellering var det 3 kaniner døde på grunn av alvorlig infeksjon. Gjenværende smittet kaniner ble identifisert som benet infeksjon modellen og ble delt i 3 grupper: modell gruppe, VCS gruppe og VCS-AB-gruppen.

Vurderinger av antibiotika aktivitet og bein gjenfødelse
2, 4, 6 og 8 uker etter behandling med VCS eller VCS-AB, nivået av CRP og WBC reduseres betydelig (Figur 4A). Etter 12 ukers implantering av VCS og Ben allograft syntes tibial defekter av VCS-AB fullt coalescent. Tibial platå er av VCS-AB flatere enn gruppen VCS. 2D rekonstruksjon bilder indikerer en progressiv økning i bein volum i løpet av 12 uker etter behandling med VCS-AB og VCS bentap er betydelig i modellgruppen (Figur 4B). Analysere bein gjenfødelse kvantitative indeksene, en oval området 4.8 mm diameter og 9,6 mm lang ble valgt som regionen rundt (ROI) (Figur 4C), og 3D-modellen bilder ble ombygget bruker data bitmap. Mikro-CT indeksene BV/TV i modellgruppen var betydelig lavere enn at i VCS og VCS-AB grupper. De Tb.N og Tb.Th scorene i gruppen VCS-AB var betydelig høyere enn i modellen og VCS-gruppen. Videre er Tb.Sp score i gruppen VCS-AB dårligere enn i modellgruppen og VCS gruppe (Figur 4D).

Disse resultatene tyder på at infeksjon med S. aureus årsaker øker WBC og CRP i modellgruppen som kan reduseres ved hjelp av Ventureselskaper. Implantering av VCS regnes som den optimale antibiotikabehandling. Men er bein feilen gruppen VCS. Ventureselskaper og gjestfrihet bein behandling øker trabeculae tykkelse og trabeculae nummer og redusere trabekulært separasjon. VCS-AB behandling viste evne til å fremme bein helbredelse.

Figure 1
Figur 1 . Kirurgisk utarbeidelsen av benet infeksjon modellen. (A) viser punching plasser på tibia. Avstanden mellom bore hull posisjon for injeksjon med S. aureus til øvre enden av tibia er 1,5 cm. (B) gjort snitt i huden å avsløre periosteum. (C) viser snitt gjort gjennom periosteum å avsløre tibia. (D) Punch 2 mm diameter hull i tibia. (E) Fyll 2 mm diameter hullet full av bein voks. (F) kuttet av ekstra bein voks. (G) viser bein voksen fylle bein feilen. (H) sy periosteum og hud. (jeg) injisere S. aureus løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Utarbeidelse av bein allograft og antibiotika behandling. (A) snitt gjort i huden å eksponere periosteum. (B) hull to tilstøtende 4.8 mm diameter. (C) Debride nekrose bein og provoserende benmarg. (D) skrape og rense benvev mellom de to hullene å gjøre en lang sirkel med 4.8 mm diameter og 9,6 mm lang. (E) fylle hullet med VCS og bein allograft. (F) sy periosteum og hud. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Evaluering av benet infeksjon modell. (A) utseende funksjoner av kanin bena infisert med S. aureusog typisk histopatologi bilder av kanin tibia i modellen og kontroll grupper. Blå pil: osteocyte; rosa pilen: bein trabeculae; gul pil: bakteriell aggregater; grønn pil: død bein. (B) WBC og CRP resulterer i kanin serum på tidspunkt av før modellering, 7, 14, 21 og 28 dager etter smitte. Kolonnene representerer den betyr ±SE, *p < 0,05 vs kontrollgruppen. (C) antall bakteriell koloniene i tibia margtransplantasjon telles etter overnatting inkubasjon. Kolonnene representerer den betyr ±SE, *p < 0,05 vs kolonien telle på dag 0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Vurderinger av antibiotika aktivitet og bein gjenfødelse. (A) resultatene WBC og CRP i kanin serum på tidspunkt 2, 4, 6 og 8 uker etter implantasjon av VCS og VCS-AB, punktene representerer den betyr ±SE, #p < 0,05 og *p < 0,05 sammenlignet med modellgruppen. (B) koronale delen bilder av tibia analysert av mikro-CT. (C) plassering av Avkastningen. (D) histogrammer showet benet volum/vev volum (BV/TV), trabekulært tykkelse (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) og trabekulært separasjon (Tb.Sp) scorene til avkastning fra fem kaniner per gruppe. Kolonnene representerer den betyr ±SE, *p < 0,05 vs kontrollgruppen eller modellgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Tidslinjen i alle prosedyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De tidligere studiene, ble ulike typer dyremodeller konstruert for å studere både akutte og kroniske benet infeksjon; imidlertid hardnakkethet Søk etter den ideelle modellen fremdeles17,18. I tillegg er ideelle benet infeksjon modellen ventet å simulere patologisk egenskapene til benet infeksjon i klinisk setting, mens modellering periodene, forbli lave kostnader og enkel å utføre. Så langt, er kanin bein infeksjon modellen den mest vanlige modellen i inflammatorisk bein sykdom forskning, som kaniner er tilgjengelig, gjennomførbare og billig. I vår forrige studie sammenlignet vi dødelighet og infeksjon rate av kanin med varierende kroppen vekter. Resultatene viste at kroppsvekten bør være mer enn 3 kg; ellers ville det være en høy dødelighet eller en høy forekomst av haematosepsis og en høyere dødelighet etter operasjonen.

I motsetning til tidligere studier er kanin bein infeksjon modeller og antibiotikabehandling i vår undersøkelse konsistent med patologisk karakteristikkene av menneskelig sykdom og kirurgisk behandling. I den tidligere studien, dyr injisert med natrium morrhuate og S. aureus ikke patologisk status mer enn 60 dager. Videre var dødeligheten mer enn 20%12,19. Overflyt S. aureus løsning bein mangler hadde blitt bevist for å indusere en lav infeksjon rate. Vi bein voks fylle 2 mm hull i tibia, for å blokkere S. aureus løsningen i beinmargen og sikret at hullene var full av bein voks ved å sjekke hullet med eller uten blod overflyt. Tykkelsen på en kanin tibia var 2 mm, vi presset en sylinder av 2 mm i diameter og 2 mm høyde bein voks hullene 2 mm diameter, noe som sikret bein voksen fylt hullet og ikke kunne infiltrere benmargen. Videre bein voksen var fleksibel og stabil, kunne det fylt hullene og ikke smelte eller reagere med benmarg. I vår studie på 28 dagen etter infeksjon, bein voksen var fortsatt komplett og fylte hullene fullt. Som vekten av kaniner var mer enn 3 kg og mindre enn 3,2 kg, ble volumet av bakterier suspensjon 900 µL til 960 µL. På grunn av treg hastighet på injeksjon og blokkerende funksjon av bein voks, kan dette volumet av bakterier suspensjon injiseres i benmargen uten høytrykk. Resultatene viste at denne protokollen sikrer antall S. aureus smittet i benmargen. 2 mm diameter hull slo i tibia slik at den øverste enden av tibia ligger 1,5 cm, som lokaliserer i hullet på tibial platået, sikrer tilstrekkelig plass til å debride og implantat VCS perler og gjestfrihet bein i følgende behandling. Under du modelleringsprosessen døde 3 kaniner på grunn av alvorlig infeksjon. Forble kaniner identifisert benet infeksjon kaniner, og infeksjon ofte i gjenværende kaniner var 100%. Sammenlignet med andre benet infeksjon protokoller som implantering av svamper dynket med S. aureus eller implantering av fremmedlegemer, våre protokoller tett simulere benet infeksjon i klinisk setting og har liten effekt på prosedyrer, slik debriding nekrose bein og antibiotikabehandling.

Diagnostisere benet infeksjon er en utfordring å kirurger. Laboratoriet testresultater, inkludert serum betennelse markør deteksjon, mikrobiologi analyse og histopatologi analyse ble brukt for å evaluere benet infeksjon i klinisk innstillinger20. Også diagnostic imaging, som ultralyd, røntgen, beregnede tomografi, magnetisk resonans imaging eller Raman spektroskopi ble brukt for å oppdage benet infeksjon21. Dessverre er diagnostisere osteomyelitt gjennom imaging metoder ofte forsinket fordi Ben nekrose difficult å oppdage ved vanlig røntgen til uke 3 av infeksjon. I vår studie brukte vi serum betennelse markør gjenkjenning og histopatologi analyse for å evaluere benet infeksjon modeller, som disse metodene var effektive, drift og indeksene var følsom. Følgende var de viktigste trinnene av kirurgiske prosedyren for å opprette en benet infeksjon modell i vår undersøkelse. Velg kaninene med passende kroppsvekt å utføre kirurgi og behandling. Opprettholde et sterilt miljø under skaffe og kirurgiske prosedyren, og sikre varme forhold etter kirurgisk prosedyre protokollen. Punch 2 mm diameter hull i tibia, og sikre den øvre enden av tibia ligger 1,5 cm. fylle hullet med bein voks, og sy periosteum og huden for å blokkere bakterier løsningen. De viktigste trinnene av antibiotika behandling er følgende. Sikre patologisk benet infeksjon av kaniner ved oppdage WBC i hele blod og CRP i serum. Debride nekrose bein helt, hull to tilstøtende 4.8 mm diameter og skrape og rense benvev mellom 2 hullene. Implantatet 4 stykker av VCS perler og 8 biter av gjestfrihet bein i benmargen og bein defekt.

Etter antibiotikabehandling observerte vi at kaninene i gruppen VCS-AB hadde et høyere osteogenic potensial enn i gruppen VCS. Dette kan skyldes at gjestfrihet benet inneholder aktivert osteocytes og bein formasjon vekstfaktorer, som produserer benmatriks hele graften overflaten, mens nedbrytning av VCS induserer knappe bein matrise på regionen defekt. Våre resultater indikerer at gjestfrihet benet har overlegen osteogenic evne. Selv om gjestfrihet bein høsting er begrenset i volum og innebærer sykelighet til donor-området, er viktigheten av gjestfrihet bein ikke ubetydelig22,23,24. I vår studie ble gjestfrihet bein kjøpt fra hale bein, som unngår systemisk skader, og reduserer dødeligheten sammenlignet få gjestfrihet bein fra iliaca bein. Autograft bein fra halen benet er kan være det foretrukne pode materialet i dyr studiet av benet infeksjon.

Avslutningsvis ble en forbedret kanin modell av benet infeksjon etablert i denne studien. Betennelse indekser og blod biokjemiske indekser ble brukt til å beregne benet infeksjon modellen. Også, etter antibiotikabehandling, multi-level analyser ble utført for å oppdage antibiotika aktivitet og bein gjenfødelse evne. Modellering, behandlingsprotokoller og evalueringsmetoder er gjennomførbart og pålitelig. Videre studier vil bli fokusert på å utnytte multi-modalitet visuelle enheter til å overvåke patologisk prosessen med benet infeksjon og bein reparasjonsprosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporten uten interessekonflikter i dette arbeidet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation av Kina (81803808, 81873062), Zhejiang provinsielle medisinske og helse vitenskap og Technology Fund (2017KY271) og vitenskap og teknologi prosjektet i Zhejiang-provinsen (2017C 37181).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
  2. Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
  3. Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
  4. Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
  5. Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
  6. Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
  7. Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
  8. Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
  9. Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
  10. Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
  11. de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
  12. Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
  13. Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
  14. Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
  15. Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
  16. Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
  17. Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
  18. Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
  19. Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
  20. Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
  21. Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
  22. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
  23. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
  24. Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics