أسلوب لإصابة الإنسان تمتد عالية السرعة التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية في شكل جيد 96

Neuroscience
 

Summary

هنا نقدم طريقة لنموذج بشرية في المختبر للإصابة تمتد في شكل 96-جيدا في مقياس الوقت ذات صلة بتأثير الصدمة. وهذا يشمل أساليب لاختلاق ألواح المط، التحديد الكمي إهانة الميكانيكية واستزراع وإصابة الخلايا وتصوير وتحليل محتوى عالية تحديد حجم الإصابة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إصابات الدماغ الرضية (تبي) تحد سريرية رئيسية مع ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات. على الرغم من البحوث السريرية قبل عقود، وقد وضعت لا العلاجات المجربة تبي. وتعرض هذه الورقة طريقة جديدة للبحوث نيوروتروما قبل الإكلينيكية تهدف إلى استكمال نماذج ما قبل السريرية الحالية. فهو يقدم الفيزيولوجيا المرضية البشرية عن طريق استخدام العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكنس). أنه يحقق نبض تحميل مغلقة مدة مماثلة لمدد التحميل السريرية الإصابة أثر الرأس. ويعمل شكل 96-جيدا أن ييسر تجارب إنتاجية عالية ويجعل كفاءة استخدام الخلايا مكلفة والكاشفات الثقافة. أول علاج لإزالة السمية العصبية البوليمر أونكوريد أغشية سيليكون والرهينة ثم إلى الهيئات التجارية 96-كذلك لوحة لإنشاء لوحات 96-جيدا المط. يتم استخدام جهاز المواصفات وضع مسافة بادئة لبعض أو كل من قيعان جيدا من أسفل، حمل سلالة اكويبياكسيال الميكانيكية ميكانيكيا يجرح الخلايا في الثقافة في الآبار. يتم تحديد العلاقة بين عمق المسافة البادئة والضغط الميكانيكي تجريبيا باستخدام الفيديو عالية السرعة من قيعان جيدا خلال المسافة البادئة. يمكن استزراع الخلايا، بما في ذلك هيبسكنس، على هذه الأغشية السيليكون باستخدام الإصدارات المعدلة من بروتوكولات الثقافة التقليدية الخلية. الصور المجهرية الفلورسنت الثقافات الخلية المكتسبة وتحليلها بعد الإصابة بطريقة شبه الآلي لتحديد مستوى الإصابة في كل بئر. النموذج الذي قدم هو الأمثل هيبسكنس ولكن يمكن من الناحية النظرية أن تطبق على أنواع الخلايا الأخرى.

Introduction

تبي سبب رئيسي للوفيات والإصابة بالأمراض في الولايات المتحدة، مما تسبب في وفاة حوالي 52,000 والمستشفيات 275,000 كل سنة1. وأجريت التجارب السريرية أكثر من 30 من المداواة المرشح تبي دون نجاح واحد2. هذا الفشل موحدة تشير إلى أن العمليات الخاصة بالإنسان فصل تبي البشرية عن الفيزيولوجيا المرضية لوحظت في نماذج القوارض قبل الإكلينيكية شيوعاً.

ظهور هيبسكنس أوجد فرصة لدراسة نيوروتروما في نموذج بشرية في المختبر . يجوز تسليم المخدرات الفرز مع النماذج المستندة إلى هيبسكن النتائج التي أكثر تنبؤية لنجاح السريرية من النماذج التي تستخدم الخلايا القوارض. أيضا، يمكن التلاعب هيبسكنس وراثيا لعزل ودراسة أثر المتغيرات الجينية البشرية الفردية على علم الأمراض3.

الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة يهدف إلى تحقيق مزايا فريدة من نوعها للمرض على أساس هيبسكن والنمذجة نيوروتروما. في المختبر نماذج الإصابة تمتد من نيوروتروما هي راسخة4،،من56 مع الخلايا الأولية القوارض وخطوط الخلايا البشرية سرطان العصبية. إنشاء معظم هذه النماذج تمتد من برج تحميل غشاء سيليكون. هذا النهج الفعال في شكل جيد واحد ولكن ثبتت صعوبة بحجم يصل إلى تنسيق متعدد جيدا وهو7. كنتيجة لذلك، لم يكن هناك شاشة عالية إنتاجية لوكلاء لعلاج الخلايا العصبية المصابين تمتد.

في هذا النموذج، يمتد الغشاء بسبب المسافة البادئة من أسفل مع indenter جامدة. لقد ثبت مرارا وتكرارا هذا النهج لتوليد الأمراض ذات الصلة سريرياً في المختبر في نظم جيدا واحدة8،،من910. أعمالنا الأخيرة قد أظهرت أن بسهولة المقاييس إلى تنسيق 96-جيدا مع المحافظة على المدد نبض يقارب عشرات ميلي ثانية11، وهو وقت إغلاق المجال للرأس أثر أحداث12،13.

وباختصار، هي من المزايا الرئيسية لهذا النموذج الإصابة في المختبر شكل 96-جيدا واستخدام هيبسكنس، والمجال الزمنية ذات الصلة سريرياً للإهانة.

Protocol

1-سيليكون إزالة السموم

  1. قص أغشية سيليكون 30.48 سم × 30.48 سم ميكرومتر سميكة، 254 إلى مستطيلات 7.5 سم × 11 سم باستخدام شفرة حلاقة وقالب إلكتروني اكريليك. ويمكن إجراء 10 الأغشية مستطيلة مع كل ورقة. حفظ الورقة التي تأتي مع السيليكون.
  2. ضع الأغشية في حوض من المياه (DI) مع صابون الأواني الزجاجية. واحد في كل مرة، فرك الأغشية بقوة بمتناول القفاز لمالا يقل عن 20 ق أو حتى لاثيريد.
  3. شطف في الأغشية تحت الماء دي الجاري حتى تتم إزالة الصابون لاثيريد واضح. تكمن في الأغشية على الورق (من غلافها) والاوتوكلاف على دورة جاذبية.
  4. نقع كل غشاء السيليكون في 250 مل إيثانول 70% كل غشاء على شاكر مداري 60 لفة في الدقيقة ل 24 h. استخدام حاوية مصنوعة من مادة لا تتفاعل مع الإيثانول، مثل بولي بروبلين.
    1. إذا تم وضع غشاء واحد أو أكثر في سلة واحدة، أو إذا الأغشية التي تتمسك بالجزء السفلي من السلة، فصل الأغشية عن بيئتهم مع نصائح الماصة البلاستيكية و "الماصة؛" رفوف تلميح.
  5. نقل الأغشية سيليكون مع الأيدي القفاز إلى 250 مل مياه دي كل الغشاء ونقع على شاكر المداري ح 48 60 لفة في الدقيقة.
  6. تكمن في الأغشية مرة أخرى على الورق ومكانه في فرن الأواني زجاجية 93 درجة مئوية ح 4.
  7. تخزين الأغشية على الورق، في مكان نظيف وجاف، مغطاة بورقة أخرى لحمايتهم من الغبار.

2-لوحة تلفيق

  1. علاج البلازما أعلى لوحة 96-جيدا مع بلازما ث 200 النظيف (انظر الجدول للمواد) 60 s على طاقة عالية، وضعه الجانب-ينطلق داخل البلازما أنظف. تحقق من وجود توهج أرجواني مرئية من خلال نافذة الغرفة، مما يشير إلى أن شكلت بلازما فعال. هذا الأسلوب الربط مقتبس من سانكارا et al. 14
  2. خلال 60 ثانية، مكان أعلى لوحة في 200 مل من 1.5% (3-أمينوبروبيل) تريثوكسيسيلاني (أبتيس) في المياه دي لمدة 20 دقيقة، أسفل الجانب-لأسفل. هذا الحل غير مستقرة: إعداد أنه ليس أكثر من 60 ثانية قبل عرض اللوحة.
    تنبيه: العمل مع أبتيس في غطاء دخان.
  3. علاج البلازما غشاء سيليكون المستخرجة في البلازما أنظف 60 ثانية على طاقة عالية. وقت المعاملة البلازما أن ينتهي لا يزيد عن 5 دقائق قبل نهاية فترة 20 دقيقة في الخطوة 2، 2.
  4. استخدم الملقط لوضع غشاء البلازما تعامل على رأس مستطيل2 سم 7.5 × 11 ورقة شهادة جامعية. محاذاة 7.5 سم × 11 سم × 0.5 سم الألومنيوم البلاطة في الجزء السفلي من لوحة المشبك تلفيق. قم بمحاذاة الورقة سيليكون الغشاء وشهادة جامعية في لوح الألومنيوم استخدام الملقط.
    ملاحظة: يتم توفير ملفات التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لهذا الجهاز في المواد التكميلية كملف التعليمات برمجية إضافية '"الصحافة يموت"-3D عامة. الخطوة '. شجرة المواد المرتبطة بها يتم توفيرها في التكميلية الجدول 1: "مخصص بنيت الأجهزة"--BOM.xlsx.
  5. إزالة قمم لوحة من حمام أبتيس والتخلص من فائض الحل. تراجع في حمام مائي 200 مل دي 5 s ويهز قبالة المياه الزائدة. تراجع في حمام مائي دي مختلفة 200 مل 5 s ويهز قبالة المياه الزائدة. استبدال الماء في هذه الحمامات قبل غمس أعلى لوحة أخرى.
  6. استخدام الهواء المضغوط لتجف تماما في أعلى اللوحة.
  7. مكان أعلى لوحة في الجزء العلوي من لوحة المشبك تلفيق. برفق أغلق المشبك تصنيع لوحة الضغط أعلى اللوحة وسيليكون معا. المشبك ح 1 على الأقل.
  8. تسمح اللوحة علاج 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها، حمايتها من الغبار.

3-تمتد لوحة

  1. تنظيف في إيندينتيرس.
    ملاحظة: انظر التكميلية الرقم 1.
    1. إعداد ث 60 حمام طراز سونيكاتور مع دي الماء في درجة حرارة الغرفة.
    2. دعم كتلة indenter أعلاه حمام سونيكاتور، مقلوب حيث أن فقط قمم إيندينتيرس مغمورة بعمق لمالا يقل عن 1 مم. Sonicate إيندينتيرس لمدة 8 دقائق في 42 كيلو هرتز.
    3. ضربة الجاف إيندينتيرس مع الهواء المضغوط.
  2. قم بمحاذاة الكتلة indenter.
    1. وضع كاميرا مع تغذية حية فوق الجهاز تمتد بحيث أنها تتطلع إلى أسفل في الصفيف indenter. وتركز على قمم إيندينتيرس.
      ملاحظة: الإعداد المذكورة في القسم 4، "امتداد الغشاء الذي يتسم به،" واحد من إعداد الكاميرا ممكن لهذه المهمة.
    2. تأمين لوحة المرحلة من إصابة الجهاز باستخدام المشابك المرحلة (الشكل 1) ومكان قبة ضوء على الجهاز.
      ملاحظة: انظر الجدول للمواد اللازمة لبرامج التحكم الصك.
    3. إطلاق البرنامج أداة التحكم عن طريق النقر على رمز البرنامج على سطح المكتب الخاص بالكمبيوتر الذي يتم التحكم في الجهاز إصابة. قم بتشغيل المشروع "in_vitro_neurotrauma.lvproj" بالنقر فوقه في إطار إطلاق. من إطار project، الشروع في مراقبة الحركة ووضع الصكوك الظاهري المقتفي (VIs)، التي تسمى 'motion_control.vi' و 'position_tracker.vi'، على التوالي، بالنقر المزدوج عليها.
    4. إغلاق القفص المحيطة بالجهاز الضرر. اضغط على زر 'السهم' في الزاوية اليسرى العليا لعنصر التحكم الحركة السادس لتشغيل في السادس وانقر فوق '"قرب القاعدة"' إلى انخفاض المرحلة إلى حدود 2 ملم للاتصال إيندينتيرس. انقر فوق الزر 'إيقاف' لإيقاف في السادس.
      تنبيه: الحفاظ على أيدي واضحة من نقالة عند التعامل مع الكاميرا في القفص. وينبغي أن تكون مزودة القفص مفتاح باب الذي يسلم السلطة إلى جهاز تمتد فقط عندما يتم إغلاق باب القفص.
    5. في إطار المشروع، حق انقر على 'المحور 1'. انقر فوق 'لوحة الاختبار التفاعلي'. في النافذة التي تفتح، تعيين حجم الخطوة إلى 50 ميكرون بإدخال وحدات '500' في الحقل '"الموضع المستهدف"'.
    6. انقر فوق الزر 'اذهب' الأخضر في الجزء السفلي من النافذة '"لوحة الاختبار التفاعلي"' مرارا وتكرارا حتى اللوحة أولاً يجعل الاتصال مع أي إيندينتيرس. التحقق من وجود اتصال بشأن الصورة الحية المعروضة بواسطة الكاميرا. ملاحظة موقف المرحلة الرأسية عنها في الأعلى يسار نافذة '"لوحة الاختبار التفاعلي"'؛ وهذا هو الموقف الاتصال الأولى.
    7. كذلك أقل (كما هو موضح في الخطوة 3.2.6) حتى جعلت كل بئر الاتصال مع إيندينتيرس. إذا لزم الأمر، تتحرك الكاميرا لرؤية اللوحة كاملة ونقل المرحلة أعلى (عن طريق تحديد '"وضع الهدف"' السلبية) وإلى أسفل. ملاحظة موقف المرحلة الرأسية عنها في الأعلى يسار النافذة عندما تكون جميع الوظائف في الاتصال (هذا هو موقف الاتصال الكاملة).
    8. ملاحظة الفرق بين أول اتصال ومواقع الاتصال الكاملة. قم بإغلاق 'لوحة الاختبار التفاعلي'. تشغيل 'الحركة السيطرة السادس' (راجع الخطوة 3.2.4) وانقر على 'الأعلى' لرفع المرحلة. إيقاف عنصر التحكم الحركة السادس مع الزر 'إيقاف'.
    9. مجرد المرحلة في الجزء العلوي من السفر، فتح الباب أمام تنشيط الجهاز. ضبط مجموعة مسامير في زوايا كتلة indenter. تخفيف مجموعة المسمار على الزاوية التي جعلت الاتصال أولاً، خفض وتشديد المسمار المعاكس لرفع الزاوية التي جعلت الاتصال الأخير.
    10. كرر العملية لخفض المرحلة حتى اللوحة الاتصال إيندينتيرس، تفقد الصور الاتصال لإمالة، رفع مستوى المرحلة، وضبط (الخطوة 3.2.9) indenter كتلة. عند محاذاة المرحلة وكتلة إيندينتيرس جميع سيجعل الاتصال في وقت واحد.
    11. فتح الباب أمام تنشيط الجهاز. إدراج هذه الثقوب على كتلة indenter مسامير التعادل لأسفل وتشديد لهم. التأكد من أن الكتلة المستوى مع مسامير التعادل لأسفل في مكان (الخطوات 3.2.4-3.2.8). يحيط علما بموقف المرحلة عنها '"لوحة الاختبار التفاعلي"' عندما يجعل اللوحة الاتصال. وهذا سيكون موضع صفر لتجارب المسافة البادئة.
  3. تليين في إيندينتيرس.
    1. إذا كان فقط تم تشكيل كتلة indenter ولم مشحم بعد، تنظيف وسادة مطاطية صلبة (7.5 سم × 11 سم × 1.5 مم) ومنصة مطاط الرغوة الناعمة، خلية مغلقة (7.5 سم × 11 سم × 3 مم) مع مسح مختبر غارقة في الإيثانول. السماح لهم بالهواء الجاف.
    2. نقع مسح مختبر في زيت الذرة وانتشر على لوح المطاط الصلب إلى تألق مملة.
    3. ضع وسادة رغوة على لوح المطاط الصلب لنقل النفط إلى لوحة الرغوة. ضع 7.5 سم × 11 سم × 0.5 سم الألومنيوم البلاطة فوق وسادة رغوة وتحميله مع وزن صابورة من حوالي 360 g (مثلاً، أنابيب مخروطية الشكل 6 محملة 45 مل مياه كل) ضمان نقل منتظمة للنفط من لوح المطاط الصلب إلى منصة الرغوة. تسمح 10 s للنفط لنقل إلى لوح المطاط الرغوي.
    4. نقل لوحة رغوة المطاط على الصفيف indenter. ضع لوح الألومنيوم والوزن الصابورة على أعلى من ذلك ضمان نقل منتظمة من النفط إلى النصائح من إيندينتيرس. تسمح 10 s للنفط لنقل إلى إيندينتيرس.
    5. إذا كان قد تم تمديد لا لوحة منذ أنشئت كتلة indenter ومشحم للمرة الأولى، تمتد صفيحة اختبار قبل البدء بالتجربة.
      ملاحظة: هذا سوف يمنع أي تضارب بين الأولى وتمتد وتمتد اللاحقة من التباس التجربة. بالنسبة للامتدادات اللاحقة، كرر فقط الخطوات في 3.3.2-3.3.5 قبل كل امتداد.
  4. تمتد لوحة.
    1. تليين إيندينتيرس كما هو موضح في الخطوة 3، 3.
    2. تأمين اللوحة في مرحلة الإصابة الجهاز مع المشابك المرحلة. إذا كان مطلوباً العقم، ضبط موضع غطاء تأمين اللوحة دون تعريض سطح الثقافة لهواء الغرفة.
    3. انخفاض المرحلة باستخدام عنصر تحكم الحركة 'السادس الصفر-الموقف' (انظر الخطوات 3.2.4-3.2.6)؛ صفر-الموقف يتحدد خلال الخطوة 3، 2.
    4. قم بتغيير اسم الملف في الحقل "مسار ملف" في 'سادسا تتبع موقف' إلى اسم ملف فريد، ثم تشغيله باستخدام الزر 'السهم' في الركن الأيمن العلوي من هذا الإطار.
    5. تعيين عمق ومدة للمسافة البادئة (عادة من 1-4 مم و 30 مللي ثانية، على التوالي، الحد الأقصى لعمق 5 مم، والحد الأدنى لمدة 15 مللي ثانية) في 'الإصابة (مم)' وحقول '"مدة الإصابة"(ms)' في 'حركة لوحة التحكم السادس' عن طريق النقر فوق الحقول وكتابة في المطلوب القيم.
    6. تشغيل 'حركة لوحة التحكم السادس' ثم انقر فوق 'جرح' وضع مسافة بادئة اللوحة.
    7. نقل المرحلة التي تصل إلى الجزء العلوي من السفر عن طريق النقر على 'رأس'. ثم وقف السادس مع الزر 'إيقاف' وتنشيط الجهاز الإصابة عن طريق فتح الباب.
    8. فحص تاريخ التشرد من المرحلة التي عرضت في تعقب السادس 'موقف' للتأكد من أنه تم تطبيق تشريد الحد الأقصى المحدد. انقر على الحق في الرسم البياني، وانقر فوق "تصدير إلى Excel". انقر فوق ' الملف | حفظ ' فيما يتعلق بحفظ البيانات.

4-تميز امتداد الغشاء

  1. الطلاء العطلة في الجزء العلوي من كل الأبيض indenter لتوفير خلفية تباين العالي للفيديو عالية السرعة.
    تنبيه: لا طلاء دواليب إيندينتيرس حيث أنها تجعل الاتصال مع اللوحات.
  2. 3D الطباعة باستخدام poly(lactic acid) (جيش التحرير الشعبي)، أو اختﻻق خلاف ذلك، ختم أسطواني مع الذي جعل نقطة في كل بئر. جعل الاسطوانة 5.9 ملم في القطر وعالية، مع بروز أسطواني قطرها 1.5 مم و 1.0 مم ارتفاع 12.2 مم تركزت في الأعلى.
    ملاحظة: نموذج ثلاثي الأبعاد لطباعة ' الطابع. STL ' متوفرة كملف تكميلي.
  3. علاج البلازما لوحة الحق الجانب الهاتفي لتنشيط سطح الثقافة خلية سيليكون في الآبار 60 ثانية، كما هو مذكور في الخطوة 2، 1.
  4. وضع اللوحة على وسادة مطاطية أو غيرها من سطح ناعمة. رئيس الوزراء نتوء صغير على الطابع (راجع الخطوة 4، 2) مع الحبر من قلم علامة دائمة. إدراج الطابع في البئر لفحصها والاستفادة لضمان نقل جيدة من الحبر. رئيس الوزراء الختم قبل كل بئر.
  5. محاذاة الكتلة indenter وتليين إيندينتيرس الجهاز الضرر (انظر الخطوات 3.2-3.3). المشبك لوحة على خشبة المسرح لإصابة الجهاز. ضع ضوء ساطع منتشر محوري أعلاه إصابة الجهاز.
  6. إعداد كاميرا عالية السرعة على ازدهار الوقوف على مدى إصابة الجهاز، التي تواجه مباشرة إلى الأسفل، مع العدسة تعيين إلى أصغر وتوقف مرقمة، وقم بتشغيله. إطلاق برنامج الكاميرا على جهاز الكمبيوتر متصلاً بالكاميرا. في انخفاض معدل الإطار أسفل القائمة، المنسدلة حدد إطارات 2,000 في الثانية، وفي المصراع القائمة، حدد أسرع وقت التعرض التي تعطي الصور عالية التباين. مركز عبر الآبار منقط.
    1. ضع الكاميرا حيث يحتوي حقل الرؤية 12 بئرا في شبكة 3 × 4.
      ملاحظة: هذا الحقل لعرض يقدم حلاً وسطا أمثل بين الإنتاجية والقرار لصورة 1,280 × 1,024.
  7. انخفاض اللوحة إلى نقطة الصفر (انظر الخطوات 3.2.4-3.2.6). الزر السجل بنقرة واحدة على برنامج الكاميرا حتى أن يقرأ 'المشغل في'. بدء تعقب الموضع السادس (الخطوة 3.4.4).
  8. قم بتشغيل الضوء الساطع المحوري منتشر. إضافة مسافة بادئة اللوحة كما هو موضح في الخطوة 3.4.6.
  9. إيقاف الضوء الساطع المحوري منتشر.
  10. على جهاز الكمبيوتر كاميرا مراقبة، إيجاد الإطار 30-40 مللي ثانية للتسجيل التي يحدث فيها المسافة البادئة: اسحب الأسهم بداية ونهاية في شريط تشغيل الفيديو عالية السرعة في برنامج الكاميرا. انقر فوق حفظ تعيين الاسم في حقل '"اسم الملف"'، وحدد 'TIFF' في الحقل 'تنسيق' وانقر فوق 'حفظ'.
    1. ننظر من خلال. ملفات TIF للصور أقل امتدت (بداية) وامتدت إلى معظم الدول (ذروة المسافة البادئة).
    2. لقياس الطول والعرض للنقاط في كلا الصورتين، استخدام تمتد فيجي لفتح الصور أقل وذروة جنبا بجنب. باستخدام أداة التحديد المستطيل الافتراضي، انقر واسحب لرسم مربع حول نقطة في الصورة تمتد على الأقل. قياس الارتفاع والعرض مع ' تحليل | قياس '.
    3. كرر هذه العملية لدوت في البئر ذاتها في ذروة تمدد الصورة. تكرار لبقية الآبار.
  11. حساب الضغط لاغرانج في الاتجاهين x و y كما يلي:
    Equation 1
    Equation 2
    ملاحظة: هنا، هxx هو سلالة لاغرانج في اتجاه x ، هyy هي سلالة لاغرانج في اتجاه y , X هو عرض النقطة، Y هو ارتفاع النقطة، و يدل على الصورة النهائية (أي، في ذروة المسافة البادئة صورة)، و أنا يدل على الصورة الأولى (أي، الصورة قبل المسافة البادئة). متوسط القيم لتحديد السلالة في ذلك جيدا.

5-طلاء الخلايا المستزرعة

  1. اﻷوتوكﻻف سلال والأوزان الصابورة التي سيتم استخدامها للتعقيم.
  2. علاج البلازما ألواح السيليكون القاع الحق الجانب-حتى 60 ثانية (راجع الخطوة 2، 1). فورا تغرق اللوحات في سلال العقيمة التي تحتوي على الإيثانول 70% لمدة 15 دقيقة.
  3. غمر اللوحات في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في صناديق معقمة منفصلة لمدة 30 دقيقة.
  4. نضح برنامج تلفزيوني من الآبار. فقط الجافة لوحة واحدة في وقت واحد للحيلولة دون فقدان المعاملة البلازما الآبار.
    تنبيه: سيليكون لوحات أدنى توفير التغذية المرتدة عن طريق اللمس أقل من لوحات جامدة عند بيبيتينج ومن المرجح أن كتلة غيض من ماصة.
  5. إضافة 100 ميليلتر من 0.1 مغ/مل بولي-L-أورنيثيني (منظمة التحرير الفلسطينية) لكل بئر على لوحات معقمة. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  6. شطف الآبار مرتين مع 100 ميليلتر PBS العقيمة، ترك الغسيل الثاني على الآبار حتى تعليق خلية جاهز.
  7. إزالة قنينة هيبسكنس من تخزين النيتروجين السائل باستخدام قفازات السلامة ووضع على الثلج الجاف. سرعة النقل القنينة إلى حمام مائي 37 درجة مئوية وذوبان الجليد لمدة 3 دقائق بالضبط. دوامة لا القنينة.
  8. في غطاء عقيمة، بلطف نقل محتويات القنينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام ماصة مصلية 1 مل.
  9. شطف القنينة المبردة فارغة مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة المتوسطة صيانة كاملة (قاعدة الوسائط + الملحق).
  10. نقل مل 1 من وسائط الإعلام في أنبوب 50 مل دروبويسي في حوالي قطره واحدة في الثانية الواحدة. بلطف دوامة الأنبوب أثناء إضافة. إضافة 8 مل من درجة حرارة الغرفة صيانة كاملة المتوسطة إلى أنبوب 50 مل في حوالي 2 قطرات/s.
  11. كاب الأنبوب وعكس 2-3 مرات. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير. حساب حجم الوسائط الإضافية المطلوبة لتمييع تعليق خلية إلى خلايا/مل 225,000.
  12. بلطف "الماصة؛" كمية وسائل الإعلام (المحسوبة أعلاه) في أنبوب تعليق خلية باستخدام ماصة مصلية 25 مل.
  13. إضافة 10 ميليلتر من 1 ملغ/مل laminin الأسهم كل 1 مل تعليق خلية مع ميكروبيبيتي ميليلتر 1,000 لتحقيق 10 ميكروغرام/مل من لامينين في تعليق خلية. نضح أعلى وأسفل مرة واحدة مع طرف المستخدمة لامينين، ثم كاب الأنبوب وعكس الأنبوب مرة واحدة.
  14. نضح برنامج تلفزيوني من اللوحات، ولوح واحد في وقت واحد. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية هيبسكن لكل بئر. الآبار من منطقة ثقافة من 0.33 سم2، حيث كثافة الخلية الواحدة والمنطقة هو 67,500 الخلايا/سم2.
  15. بقية اللوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة بعد البذر لتعزيز مرفق. لتجنب الاهتزازات مروحة هود الثقافة العقيمة، وضع لوحات مغطاة على مقاعد البدلاء المختبر. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  16. القيام بتغيير كامل وسائل الإعلام في 24 ساعة، إعادة الملء الآبار مع 200 ميليلتر من الوسائط صيانة كاملة. أداء نصف تغيير الوسائط من 100 ميليلتر/كذلك كل 2-3 أيام.

6-إصابة الثقافات

  1. قم بمحاذاة الكتلة indenter والعثور على الموضع صفر كما هو موضح في الخطوة 3، 2. تليين إيندينتيرس كما هو موضح في الخطوة 3، 3.
  2. تعيين اسم الملف لتاريخ التشرد في 'تعقب الموضع السادس' (الخطوة 3.4.4). تعيين معلمات الإصابة في 'الحركة السيطرة السادس' (الخطوة 3.4.5).
  3. تأخذ اللوحة إصابة خارج الحاضنة والمشبك على خشبة المسرح. ضبط موضع غطاء تأمين اللوحة دون تعريض الثقافات لهواء الغرفة.
  4. أقل لوحة إلى نقطة الصفر (الخطوات 3.2.4-3.2.6) باستخدام 'السيطرة الاقتراح السادس'. بدء تشغيل 'تعقب الموضع السادس' (الخطوة 3.4.4).
  5. استخدام عنصر التحكم حركة السادس للمسافة البادئة في اللوحة (كما هو موضح في الخطوة 3.4.6). للشام وتمتد، تخطي هذه الخطوة فقط.
  6. العودة المرحلة إلى الجزء العلوي من نطاق الحركة (راجع الخطوة رقم 3.4.7). العودة اللوحة للحاضنة.
  7. فحص وحفظ التتبع التشرد (كما هو الحال في الخطوة 3.4.8).

7-الفحص المجهري

  1. إعداد 10 × تلطيخ الحل مع 2 ميكروغرام/مل هويشت 33342 و 5 ميكروغرام/مل كالسين صباحا في الحفاظ على وسائل الإعلام.
  2. وصمة عار كل جيدا مع ارتفاع 20 ميليلتر من 10 × تلطيخ الحل.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة مع وصمة عار في 37 درجة مئوية.
  4. الحصول على الصور الفلورية واسعة المجال. استخدام فيتك التقليدية و DAPI تصفية مجموعات الصورة كالسين صباحا وإشارات هويشت 33342، على التوالي. إذا كان تسلسل التصوير متعدد جيدا سوف يستغرق أكثر من 10 دقائق، ضع اللوحة في حاضنة مرحلة أعلى الحفاظ على صحة الثقافات.
    ملاحظة: 10 X، 0.30 غ عدسة يوفر تفاصيل كافية للبت في صلاحية خلية ومورفولوجيا. ضبط المكاسب لضمان حسن التصور نيوريتيس، حتى لو كان هذا يسبب بعض التشبع كثير سوما أكثر إشراقا.
  5. الجزء الصور خلية حية في قناة كالسين الساعة الخضراء لتحديد سوما ونيوريتيس. استخدام الصور النووية في قناة هويشت 33342 الأزرق للمساعدة في التعرف سوما.

Representative Results

يعد هذا الجهاز نقالة قادرة على نقل المرحلة ريبيتابلي مع نبض مدد قصيرة بقدر 10-15 مللي ثانية حسب السعة للنبض (الشكل 2A). ستريك النبض عاليا للتكرار، ولكن مدة نبض يختلف حسب ما يقرب من 1 مللي ثانية بين التكرار. السعة الفعلية نبض يحيد من السعة المقررة النبض عندما يتم تحميل عدد كبير من الآبار، وعالية السعة المقررة (انظر الشكل 2). كما يتم زيادة السعة لمرحلة التشرد خارج 3 مم، السعة الفعلية تشريد متزايد يقصر عن السعة التشرد المنصوص عليها (انظر الشكل 2). المحاذاة حذراً من كتلة وظيفة يلغي أي اتجاه في سلالة غشاء عبر الصفوف أو الأعمدة (الشكل 2). في 3.5 مم المنصوص عليها مرحلة التشرد السعة (السعة الفعلية تشريد 3.3 مم) مع 52 بئرا بادئة، كان يعني سلالة لاغرانج عبر جميع المواقع جيدا 0.451 (الانحراف المعياري للوسائل لجميع المواقع = 0.051، يعني انحرافات المعيارية لجميع المواقع = 0.065، n = 5 قياسات كل بئر). يتم عرض هذه النتائج هنا للتأكد من اكتمالها على الرغم من أن البعض منهم قد تم بالفعل المبلغ عنها11.

وسيكون ثقافة الأمثل، يصب كتل قليلة إذا كانت أي من الخلايا أكثر من 5. وسوف تكون نيوريتيس الفردية وطويلة ونحيله ومنحني مع القليل أو لا علامة التوتر أو الديكور (الشكل 3A). في ظروف مثالية، استمرارية الثقافات ينبغي عن كثب نهج صلاحية المحدد في ورقة بيانات الشركة المصنعة (عادة 60-70 في المائة) والثقافات في سيليكون يجب أن يشابه أولئك الحفاظ على الثقافة التقليدية الجامدة ركائز ( الشكل 3B). نيوريتيس قد أو قد لا تكون مرئية في مجهر حقل مشرق طاقة منخفضة. Laminin تركيز وكثافة الخلية تأثير الثقافات في الأساس وبعد الإصابة. زيادة كثافة الخلية زيادة في عدد وحجم كتل التي تشكلت في الثقافة. زيادة تركيز لامينين غالباً مواجهتها هذا التأثير (الشكل 3A). ومع ذلك، زيادة في لامينين تركيز الكثير حدث حساسية الثقافات للإصابة (الشكل 4). وكان تركيز لامينين الأمثل للثقافات يصب 50 ميكروغرام/مل من لامينين (الشكل 3)، ولكن تم الحصول على فصل الأمثل بين السكان المصابين الشام وتمتد على 10 ميكروغرام/مل من لامينين (الشكل 4). خفض تركيزات laminin أعلى حساسية للثقافات للإصابة في وقت قصير النقاط (الشكل 4)، ولكن أيضا بقاء الخلية الأساسية في نقاط زمنية أطول (مثلاً، 7 أيام). وخلاصة القول، أنها جديرة بالاهتمام لتحسين تركيز لامينين لكل سيناريو التجريبية.

سلالة غشاء الإصابة بعد انتهاء التصوير وقت نقطة، تركيز laminin وكثافة الخلية جميع تمارس أثرا رئيسية ذات دلالة إحصائية عالية على طول نورت كل خلية (ANOVA، ف < 0.001). أثر غشاء ضغطاً على طول نورت كل خلية كانت التفاعلات عالية إحصائيا مع laminin ونقطة تركيز وقت الإصابة بعد انتهاء التصوير (ANOVA، ف < 0.001) وتفاعل يعتد به إحصائيا مع الخلية الكثافة (ANOVA، ف < 0.05). وبالمثل، التصوير وقت نقطة، الخلية غشاء السلالة، بعد إصابة الكثافة، وتبذل laminin تركيز جميع تأثير الرئيسي عاليا إحصائيا على بقاء الخلية (ANOVA، ف < 0.001). تأثير الضغط غشاء على بقاء الخلية قد تفاعل بشدة إحصائيا مع نقطة الإصابة بعد انتهاء وقت التصوير (ANOVA، ف < 0.001) وتفاعل يعتد به إحصائيا مع كثافة الخلية (ANOVA، ف < 0.05). وتثبت هذه النتائج أن توقيت وكثافة الخلية وتركيز laminin ممارسة تأثير هام على العلاقة بين إهانة التطبيقية والنتائج التجريبية، حيث كل واحد ينبغي أن يكون الأمثل بعناية.

بقاء الخلية منخفضة ونيوريتيس مطرز، جنبا إلى جنب مع نورت توقف النمو، تشير إلى ظروف الثقافة السمية التي يمكن أن تنشأ غير صحيح إعداد السيليكون. تخطي أو تقليص امتصاص الماء أو الفرن الجاف يمكن ترك الإيثانول يمتص أو المياه في الغشاء، على التوالي، التي يمكن نشرها في وسائل الإعلام ونشدد على الخلايا. ستكون قد خفضت الثقافات جيدا المصابين نيوريتيس التي تبدو مشدود أو المتأزم ونيوريتيس مطرز، بقاء الخلية ونيوريتيس تقصير أو مفقودة. قد تؤدي الإصابة التثاقل في الثقافات الخلية التي كانت مشتتة جيدا قبل الإصابة. كتل كبيرة يمكن الخلط بين تحليل الخصائص المورفولوجية. لتحليل الخصائص المورفولوجية، ينبغي ضبطها على مستوى الإصابة تحدث تغييرات ملحوظة، ولكن الخلايا لا تزال موجودة مع بعض نيوريتيس.

Figure 1
الشكل 1 : A المسمى التخطيطي لإصابة الجهاز- عرض أعلى (A)، عرض متساوي القياس (ب)، (ج) منظر أمامي، عرض الجانب الأيمن (د). شريط مقياس ينطبق على آراء الهجائي (ألف، باء ودال). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : علم الحركة لإهانة الميكانيكية- (أ) مرحلة التشرد وتاريخها على مدى 5 البقول في طائفة من الاتساع المنصوص عليها (يتم سرد ستريك المنصوص عليها في وسيلة الإيضاح) عندما يتم تحميل لا الآبار. (ب) مرحلة التشرد وتاريخها على مدى 10 نبضات في طائفة من الاتساع المنصوص عليها (يتم سرد ستريك المنصوص عليها في وسيلة الإيضاح) عندما يتم تحميل 52 بئرا. (ج) متوسط الضغط في كل بئر مع مرحلة التشرد السعة 3.3 مم (n = 5 قياسات كل بئر، متوسط الخطأ القياسي للبئر الواحد = 0.029). لاحظ أن C4-F4 و C9-F9 آبار مراقبة أونستريتشيد. وقد تم تعديل هذا الرقم من شيرمان et al. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الظروف الأمثل للثقافة في سيليكون. (أ) أثر اختلاف تركيز خلية laminin وكثافة في الثقافات هيبسكن في سيليكون. التثاقل يزداد مع زيادة كثافة الخلايا وتقليل تركيز لامينين. يجب أن يكون الأمثل الخلية laminin وكثافة تركيز لتحقيق الثقافات فرقت مونو. فرقت مونو الثقافات أقل عرضه للقطع الأثرية أثناء القياس الكمي. علما أنه تم تعديل النطاق الديناميكي لتحسين التصور من نيوريتيس. نتيجة لذلك، المشبعة كثير سوما أكثر إشراقا. هذا العرض المفضل للبديل الأمثل النطاق الديناميكي فيما يخص سوما، مما يجعل كثير نيوريتيس باهتة يكاد يكون غير مرئي. الشرط أبرزها الساحة الحمراء يعتبر الأمثل بالنسبة لتجارب تمتد الإصابة في المختبر . (ب) الظروف المثالية، تظهر الثقافات في أغشية سيليكون مشابهة للثقافات على ركائز الجامدة التقليدية. اللوحة اليسرى يظهر هيبسكنس مثقف في 33,750 الخلايا/سم2 مع 3.3 ميكروغرام/مل من لامينين على لوحة 96-البئر التقليدية، جامدة (الركيزة ثقافة الخلية هو زراعة الأنسجة تعامل اوليفينيه دوري بوليمر المشارك). اللوحة اليسرى يستنسخ لوحة المبينة باللون الأحمر من (أ). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : النمط الظاهري الإصابة واعتمادها على تركيز لامينين. ثقافة صحية (A)، باستخدام 10 ميكروغرام/مل laminin والخلايا 67,500/سم2. نيوريتيس طويلة مع لا الخرز. وهناك قليل نوى قتلى، وعدد قليل من كتل. الثقافة (ب) باستخدام نفس الشروط الثقافة، أصيب بسلالة ذروة 57% وتصويرها بعد 4 h. نيوريتيس يتم تقصير أو في عداد المفقودين، وبعضها يكون الخرز (المشار إليها بواسطة الأسهم). وهناك خلايا أقل كالسين صباحا-إيجابية وسلبية صباحا كالسين أكثر النوى (أيالميت). وزادت إصابة التثاقل بين الخلايا الباقين على قيد الحياة. (ج) ح 4 بعد الإصابة، طول نورت كل خلية ينخفض مع زيادة الضغط بطريقة تعتمد على تركيز لامينين. (د) ح 4 بعد الإصابة، بقاء الخلية ينخفض مع زيادة الضغط بطريقة تعتمد على تركيز لامينين. () 24 ساعة بعد الإصابة، طول نورت كل خلية ينخفض مع زيادة الضغط بطريقة تعتمد على تركيز لامينين. (و) 24 ساعة بعد الإصابة، بقاء الخلية ينخفض مع زيادة الضغط بطريقة تعتمد على تركيز لامينين. (n = 4 كل بار، هي مجالات الخطأ ± 1 الانحراف المعياري، أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر). قيم الضغط يتم استخلاصه من مرحلة التشرد باستخدام بيانات من منشور مسبق قبل شيرمان et al. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم 1: تقنية الرسم indenter. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

التكميلية الجدول 1: مخصص بنيت الأجهزة. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

التكميلية الجدول 2:96 لوحة جيدا-محمل Pinout الأسلاك الرسم التخطيطي. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

التكميلية 1 ملف التعليمات البرمجية: رسومات التصميم بمساعدة الكمبيوتر الجهاز الإصابة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 2 ملف التعليمات البرمجية: رسومات التصميم بمساعدة الكمبيوتر من لوحة المشبك تلفيق. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 3 ملف التعليمات البرمجية: تمثيل ثلاثي الأبعاد للهندسة الطوابع، مناسبة للاستخدام مع طابعة 3D- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 4 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي ل MuStLiMo_si_initialize.vi، وهو سوبفي ل motion_control.vi. تحويل إدخالات في مربعات الحوار إلى معلمات للحركة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 5 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي لعدة Moves_simplified.vi خط مستقيم، وهو سوبفي ل motion_control.vi. تحويل إدخالات في مربعات الحوار إلى معلمات للحركة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 6 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي ل position_tracker.vi. مكافحة التشرد المسارات الإدخال من التشفير الخطي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف التعليمات البرمجية التكميلية 7: قاعدة المشروع LabVIEW. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 8 ملف التعليمات البرمجية: أعلى المستوى السادس الذي يحرك الجهاز. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 9 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي ل motion_control.vi. ينفذ التشرد السريع الذي يمتد اللوحة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 10 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي ل motion_control.vi. ينفذ تشريد بطيئة أن ينتقل المرحلة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 11 ملف التعليمات البرمجية: سوبفي ل motion_control.vi. يرسم تاريخ تشرد (عادة خفيفا) في لوحة التحكم motion_control.vi. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 12 ملف التعليمات البرمجية: أعلى المستوى السادس الذي يسجل تاريخ التشرد. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 13 ملف التعليمات البرمجية: يحتوي على Variable2، والتواصل بين motion_control.vi و position_tracker.vi- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 14 ملف التعليمات البرمجية: التخطيطي للدوائر المطبوعة المجلس. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية 15 ملف التعليمات البرمجية: تخطيط للوحة الدوائر المطبوعة- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

المفتاح للحصول على متناسقة، النمط الظاهري بيوفيديليك في هذا النموذج هو تطبيق إهانة ميكانيكية بيوفيديليك متسقة. هذا النموذج يمكن أن تولد نبض مدد قصيرة بقدر 10-15 مللي ثانية، ومماثلة لمدد نبض للتأثيرات البشرية الرأس وفقا للتجارب المأخوذة12،13. اتساق هذه الإهانة يعتمد على محاذاة اللوحة مع كتلة indenter وتزييت متسقة إيندينتيرس. عند محاذاة الكتلة indenter جيدا، هناك لا اتجاه في سلالة التطبيقية عبر الصفوف أو الأعمدة (الشكل 2). طبقة رقيقة من مواد التشحيم يخلق عادة الاحتكاك أقل من طبقة سميكة، ولا ينصح الشحوم اللزجة لأنها كريهة السيليكون وعرقلة مرور الضوء خلال الفحص المجهري. السعة التشرد المرحلة الفعلية يمكن أن تقل إلى حد كبير السعة التشرد المنصوص عليها عندما تستخدم العديد من إيندينتيرس، والسعة التشرد المنصوص عليها المرحلة الكبيرة (> 3 مم). ومع ذلك، بينما تشرد الفعلي أقل من التشرد المنصوص عليها في الاتساع الكبير، يبقى التكرار (الشكل 2). ولذلك، يمكن الحصول ستريك نزوح كبيرة، الفعلية موثوق بواسطة إدخال قيمة محددة تتجاوز القيمة المطلوبة. السعة التشرد مسائل فقط لأنها وكيل مسجل بسهولة لسلالة غشاء الذروة، الذي يقيس مباشرة إهانة الميكانيكية التي يدفع علم الأمراض. ولذلك، الإجراء الموضح لتحديد سلالة غشاء من مرحلة التشرد أمر بالغ الأهمية. يجب تكرار هذه العملية إذا الرئيسية أي تغييرات النظام التي تؤثر على التفاعل بين اللوحة وإيندينتيرس، على سبيل المثال، إذا كان مختلفاً إيندينتيرس القطر، ومواد مختلفة indenter أو الطلاء، أو أنواع مختلفة من السيليكون وتستخدم لوحة أدنى. يجب تكرار عملية إعادة تنظيم كتلة indenter وتحديد موضع صفر في بداية كل تجربة. ويرد في الشكل 1تخطيطي للجهاز وتمتد. توفر نماذج كندي المطلوبة لإعادة إنتاج الجهاز كمواد تكميلية: '"إصابة الجهاز"-الجمعية كامل-3D عامة. الخطوة '؛ شجرة المواد المقدمة المقترنة اسمالتكميلية الجدول 1: "مخصص بنيت الأجهزة"--BOM.xlsx. راجع أيضا 2 جدول التكميلي 96 أيضا لوحة _loader Diagram.xlsx Pinout الأسلاك، التي تصف اتصالات الكابلات التي تربط مختلف مكونات النظم. ويصف 'Interconnector_circuit_board.dip' لوحة دائرة اتصال وصلتي الكابلات.

إذا كان يتم إلغاء تنشيط الجهاز مع مرحلة قرب منتصف السفر، سيتم نقل المرحلة بعد السلطة هو قطع لأنها محملة بنابض. عند استعادة الطاقة، سيتم الكشف عن حلقة مفرغة فرق كبير بين الموقف الأخير المعروف المنصوص عليها والوضع الفعلي. سيتسبب هذا في مرحلة الانتقال فجأة إلى الموقف كان عليها عندما تم إلغاء تنشيط الجهاز. هذا الاقتراح المفاجئ يمكن أن يسبب أخطاء في إخراج التشفير، حيث ينبغي الحرص على تنشيط الجهاز فقط عند في دون محرك يستريح الموقف في الجزء العلوي من السفر.

المشبك اختﻻق يهدف إلى الجمع بين أسفل اللوحة الهيئة وسيليكون بطريقة تسمح بالربط الأمثل. وتحقيقا لهذه الغاية، وهناك ثلاث سمات رئيسية في تصميم المقدمة في ملف إضافي '"الصحافة يموت"-3D عامة. الخطوة '. أولاً، صاحب الجسم لوحة المشبك موازية لأسفل سيليكون. إذا تم بناء هذا بشكل صحيح، وسوف يتطلب أي تعديل بعد الإعداد الأولى. ثانيا، يوفر طبقة المطاط الرغوي في المشبك كمية صغيرة من الامتثال تحت صفيحة، وجود نظام صارم تماما نظرياً أن تجربة زيادة مفاجئة من الصفر لقط القوة لانهائي لقط القوة عندما أغلق المشبك. موقف العارضة ومجموعة المسمار المشبك قابلة للتعديل حيث أن المسافة بين الجانبين من المشبك يمكن ضبطها بدقة.

وينبغي بذل كل جهد تقديم خلفية بيضاء مشرقة، وخلف النقطة في الجزء السفلي جيدا أثناء تجارب توصيف سلالة. على النقيض من ذلك أفضل في هذه الصور، سيكون من الأسهل لأتمتة العملية لقياس الطول والعرض للنقطة، التي يمكن أن تصبح مملة لمشغل بشرية تحليل تجربة كبيرة. بالفيديو عالية السرعة من الجزء السفلي من بئر في صفيحة 96-كذلك تحديات لجدران البئر تميل إلى أن يلقي الظلال. يلغي استخدام قبة الضوء أو ضوء منتشر المحورية التي يمكن أن تضيء على طول خط البصر الكاميرا دون تعتيم الصورة الظلال أو انعكاسات براق التي ستنشأ مع مصدر ضوء تقليدية. ينبغي أن تستخدم ألمع مصدر الضوء المتاحة للإضاءة الساطعة يسمح الصور يتم الحصول عليها مع وقت تعرض قصير. تقليل أوقات التعرض القصير الضبابية. رفع مستوى الضوء التي تنبعث منها الثنائيات (LEDs) في ضوء محورية منتشر يسمح أقصر التعرض مرات خلال اقتناء الفيديو عالية السرعة. يمكن ترقية المصابيح بفتح على ضوء محورية منتشر، إزالة الأسهم المصابيح، وتركيب 4 الطاقة العالية LED صفائف إلى الجزء الخلفي استخدام أصحاب المصابيح وتوصيلها إلى إمدادات طاقة الحالية ثابتة وتجميع على ضوء محورية منتشر (انظر الجدول من مواد لإعداد النشرة المصورة). الحرمان من الترقية المصابيح لا يمكن إبقاء المصابيح تبريد سلبية لأكثر من بضع ثوان بسبب خطر الانهاك. ولذلك، مطلوب ضوء مختلف لمحاذاة الكاميرا وكتلة ما بعد التسوية.

طريقة عرض التحديد الكمي لسلالة الغشاء بقياس تمدد نقطة مختومة إلى الغشاء بدائية نسبيا، ولكن يمكن الارتقاء إلى الآبار متعددة بطريقة قوية. ويمكن وصف الحقل السلالة عبر أسفل جيدا بمزيد من التفصيل باستخدام ارتباط الصورة الرقمية. هذا الأسلوب ينطوي على رش نقش منقط على قاعدة البئر، وثم التصوير في السرعة أثناء التشوه. ثم يمكن استخدام البرمجيات التجارية لتحديد مقدار الضغط عند كل نقطة في الصورة بتتبع تطور نمط الأرقط.

وينتج هذا البروتوكول النمط الظاهري إصابات متعددة الأوجه، وذات الصلة سريرياً، وتمتد في هيبسكنس. موت الخلية، وانحطاط نورت، والديكور نورت عقابيل كلها موثقة توثيقاً جيدا من تبي في البشر والحيوان نماذج15. أن مفتاح النجاح في هذا النموذج هو إنشاء والحفاظ على ثقافات صحية. وبصفة عامة، بروتوكول ثقافة خلية المتقدمة مع لوحات جامدة التقليدية نقطة انطلاق جديرة بالاهتمام للثقافة لوحة المط. ومع ذلك، يجب دائماً النظر في إمكانية أن الخلايا المعنية قد يستجيب بطريقة مختلفة عن السيليكون. وهذا صحيح بصفة خاصة من هيبسكنس، وحساسة للغاية لشروط الثقافة. يتم توفير بعض الأمثلة للاستفادة المثلى من الخلية لامينين وكثافة التركز في قسم النتائج الممثل (الشكل 3، الرقم 4). تنشيط السيليكون مع البلازما في المعاملة أمر حيوي. سيليكون مسعور وأونرياكتيفي؛ في حالته الطبيعية، فإنه سيتم ربط لا laminin أو جزيئات أخرى تستخدم لتعزيز مرفق خلية. يجعل السطح ماء البلازما والعلاج والكشف عن الجماعات المتفاعلة. تسمح هذه التغييرات جزيئات الالتصاق الربط بالسيليكون وتعزيز مرفق خلية. من المهم أن نلاحظ أن تأثير العلاج البلازما تبدد في غضون دقائق ما لم يكن السطح هي مغمورة في سائل، ولذلك يجب أن يتم تنفيذ الإجراءات التي تنطوي على تجفيف السطح المنشط بأقصى سرعة ممكنة. طريقة بسيطة للتحقق إذا كان تأثير المعالجة بالبلازما قد بليت وضع قطرات الماء على السطح. على سيليكون غير المعالجة، سوف حبة الحبرية حتى حين في البلازما تعامل السيليكون، سوف تنتشر. مع هيبسكنس التي استخدمناها (انظر الجدول للمواد)، وتوصي الشركة المصنعة إضافة laminin مع تعليق خلية بدلاً من الطلاء قبل. وقد أدرجت هذا البروتوكول هذا النهج بنجاح. بينما تجزئة يمكن، نظرياً، أن يتحقق مع برمجيات المصدر المفتوح أو لغات البرمجة ذات الأغراض العامة، مطلوب بدرجة عالية من الكفاءة باستخدام هذه الأدوات للحصول على نتائج جيدة. نيوريتيس غالباً يكون من الصعب التمييز بين الإشارات الخلفية لأنها نحيلة جداً. ولذلك، نوصي باستخدام أدوات البرمجيات التجارية التي توزعها شركات الفحص المجهري المحتوى عالية مع وحدات مخصصة لتجزئة والتقدير الكمي للخلايا العصبية، إذا كانت متوفرة. وحتى مع البرمجيات التجارية، أنه من الحكمة لتصدير صور تجزئة بصريا التحقق من دقتها.

وهناك بعض القيود المرتبطة بالعامل في لوحات المط مقارنة بالعمل مع لوحات التقليدية، جامدة. لوحات المط يمكن تصويرها كالمعتاد مع الأهداف الجوية. ومع ذلك، تصوير مع أهداف الغمر من الصعب جداً. قد تتلف عدسة زيت السيليكون. بالإضافة إلى ذلك، الهدف يمارس ضغطاً على غشاء السيليكون وهو يتحرك صعودا. هذا الضغط يزيح الغشاء عمودياً، مما يجعل من الصعب على إحضار العينة إلى التركيز. هي أغشية سيليكون المستخدمة حاليا في اختﻻق اللوحات سميكة حوالي 250 ميكرون. ويتجاوز هذا السمك البعد البؤري كثيرة عالية القدرة، أهداف الغمر. يجب إيلاء عناية خاصة لوضع الأغشية تماما شقة قبل لقط لتحقيق التسوية اللازمة للفحص المجهري. نظم ضبط تلقائي يمكن أن تعوض عن الانحرافات في التسطيح لصفيحة الانتهاء إلى حد ما. الإصدارات المستقبلية من البروتوكول قد قبل التوتر الغشاء قبل هو الرهينة إلى أعلى لوحة لضمان التسطيح. ويعتبر الإجراء خالية من مادة لاصقة للترابط غشاء السيليكون إلى أعلى لوحة14 قوة هامة للبروتوكول الحالي. فإنه يزيل خطر السمية العصبية من اللاصق، فضلا عن أي انحرافات في التسطيح بسبب سمك طبقة لاصقة غير موحدة.

صفائف متعدد القطب تستخدم عادة في التجارب مع هيبسكنس لتقييم النضج والأداء الوظيفي. لسوء الحظ، هذه النظم تتنافى مع هذا الطراز للركيزة ثقافة الخلية جامدة. فمن الممكن لإنشاء صفيف متعدد قطب المط، وعلى الرغم من أن هذا حتى الآن فقط ثبت في واحدة أيضا تنسيق16،17. لاحظ أن إيندينتيرس يمكن إزالتها على حدة من كتلة indenter حتى أن بعض الآبار لا وبدءها بمسافة بادئة، ويمكن أن تكون بمثابة شمس. إزالة indenter يمنع المسافة البادئة ولكن لا تزيل تماما تحميل الميكانيكية نظراً لوجود الحركة لا تزال تعمل بالقصور الذاتي للسائل في الآبار بينما تتحرك المرحلة. وتجدر مقارنة هذه الآبار إلى آبار في لوحات أن تخضع ابدأ للحركة المرحلة لقياس أي تأثير المرضية لحركة السوائل. أيضا، ينبغي أن تكون مجموعة إيندينتيرس في الكتلة بيسيميتريك (متناظرة من الأمام إلى الخلف وجنبا إلى جنب). ويضمن هذا الحذر أن اللوحة تم تحميلها بالتساوي خلال المسافة البادئة، حيث أن المرحلة عدم إمالة جانبية ويسبب قضبان الربط في تلك المحامل.

واحدة من التحديات الرئيسية للابتكار العلاجي في نيوروتروما هو التعقيد والتباين في الشرط. الصدمة يطبق الإجهاد المتعدد الوسائط لكل نوع من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي في أن واحد. تم إنشاؤها بشكل موثوق من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) من الخلايا العصبية وهي الآن متاحة على نطاق واسع من الموردين التجاريين. الابتكار ويسير بسرعة في هذا المجال، وأنواع الخلايا العصبية الأخرى مثل أستروسيتيس18 و microglia19 مستمدة أيضا من هيبسكس. قد يكون من الممكن عزل الردود خلية مستقلة لكل نوع من أنواع هذه الخلية للصدمات في المختبر ، ومن ثم إلى أنواع الخلايا المختلفة الثقافة المشتركة لفهم كيف يتواصلون بعد الصدمة قريبا. وبهذه الطريقة، قد يكون من الممكن لإعادة التحدي السريرية من أسفل إلى أعلى لفهم ذلك تماما في نظام بشري في نهاية المطاف. وهذا النهج يختلف عن النهج التقليدي الاعتماد على نماذج القوارض ولديه القدرة على توليد رؤى جديدة تؤدي إلى العلاج الأولى لهذه الحالة الشائعة والمدمرة، ومستعصية على الحل.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل جزئيا منحة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R21NS098129). ونود أن نعترف بالمساعدة التقنية ممتازة من تشن سوزان، جوناثان تان، كافانو كورتني، شي كاي نغ وفنغ يوان بو، الذي صمم وبني هيكل دعم الأضواء المستخدمة أثناء تجارب التصوير عالية السرعة الموصوفة في هذه المخطوطة .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15, (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14, (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19, (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21, (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21, (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28, (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150, (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101, (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14, (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11, (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48, (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103, (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9, (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22, (11), 1358-1367 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics