एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन न्यूरॉन्स की उच्च गति खिंचाव चोट के लिए विधि

Neuroscience
 

Summary

यहां हम एक ९६ में खिंचाव चोट के विट्रो मॉडल में एक मानव के लिए एक विधि वर्तमान एक टाइमस्केल पर अच्छी तरह से प्रारूप आघात प्रभाव के लिए प्रासंगिक । इस खिंचाव प्लेटों के निर्माण के लिए तरीके शामिल हैं, यांत्रिक अपमान, संवर्धन और घायल कोशिकाओं, इमेजिंग, और उच्च सामग्री विश्लेषण चोट यों तो बढ़ाता है ।

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Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

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Abstract

दर्दनाक मस्तिष्क चोट (TBI) उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ एक प्रमुख नैदानिक चुनौती है । पूर्व के दशकों के बावजूद नैदानिक अनुसंधान, TBI के लिए कोई सिद्ध चिकित्सा विकसित किया गया है । यह कागज पूर्व नैदानिक neurotrauma मौजूदा पूर्व नैदानिक मॉडल के पूरक के लिए इरादा अनुसंधान के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत करता है । यह मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिका व्युत्पंन न्यूरॉन्स (hiPSCNs) के उपयोग के माध्यम से मानव pathophysiology का परिचय । यह लोड हो रहा है नाड़ी अवधि नैदानिक बंद सिर प्रभाव चोट की लोडिंग अवधि के समान । यह एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप है कि उच्च प्रवाह प्रयोगों की सुविधा और महंगी कोशिकाओं और संस्कृति रिएजेंट के कुशल उपयोग करता है रोजगार । सिलिकॉन झिल्ली पहले neurotoxic खरीद बहुलक को हटाने और फिर वाणिज्यिक ९६ के लिए बंधुआ-अच्छी तरह से प्लेट निकायों को बढ़ाकर ९६-अच्छी तरह से प्लेटें बनाने के लिए इलाज कर रहे हैं । एक कस्टम-निर्मित डिवाइस के नीचे से कुछ या सभी अच्छी तरह से नीचे से इंडेंट के लिए प्रयोग किया जाता है, equibiaxial यांत्रिक तनाव उत्प्रेरण कि यांत्रिक कुओं में संस्कृति में कोशिकाओं को घायल कर । इंडेंटेशन गहराई और यांत्रिक तनाव के बीच संबंध इंडेंट के दौरान अच्छी तरह से नीचे की उच्च गति वीडियोग्राफी का उपयोग empirically निर्धारित होता है । hiPSCNs सहित कोशिकाओं, पारंपरिक कोशिका संस्कृति प्रोटोकॉल के संशोधित संस्करण का उपयोग कर इन सिलिकॉन झिल्ली पर प्रसंस्कृत किया जा सकता है. सेल संस्कृतियों के फ्लोरोसेंट सूक्ष्म छवियों का अधिग्रहण कर रहे है और एक अर्द्ध स्वचालित फैशन में चोट के बाद विश्लेषण के लिए एक अच्छी तरह से चोट के स्तर को बढ़ाता है । प्रस्तुत मॉडल hiPSCNs के लिए अनुकूलित है, लेकिन सकता है सिद्धांत में अंय प्रकार के सेल के लिए लागू किया जाएगा ।

Introduction

TBI मृत्यु और संयुक्त राज्य अमेरिका में रुग्णता का एक प्रमुख कारण है, के आसपास के कारण ५२,००० मौतें और २७५,००० अस्पताल में हर साल1। TBI के लिए उंमीदवार चिकित्सीय चिकित्सा के 30 से अधिक नैदानिक परीक्षणों को एकल सफलता2के बिना आयोजित किया गया है । इस वर्दी विफलता पता चलता है कि मानव विशिष्ट प्रक्रियाओं आमतौर पर इस्तेमाल पूर्व नैदानिक कुतर मॉडल में मनाया pathophysiology से मानव TBI अलग ।

hiPSCNs के आगमन में एक मानव में neurotrauma अध्ययन करने का अवसर बनाया गया है इन विट्रो मॉडल । hiPSCN आधारित मॉडल के साथ दवा स्क्रीनिंग परिणाम है कि अधिक नैदानिक सफलता के मॉडल से कुतर कोशिकाओं को रोजगार की भविष्यवाणी कर रहे है उद्धार कर सकते हैं । इसके अलावा, hiPSCNs आनुवंशिक रूप से अलग और पैथोलॉजी3पर व्यक्तिगत मानव आनुवंशिक वेरिएंट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है ।

इस पांडुलिपि में वर्णित विधि hiPSCN आधारित रोग मॉडलिंग के अनूठे फायदों को neurotrauma में लाने के लिए बनाया गया है. इन विट्रो में खिंचाव चोट neurotrauma के मॉडल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं4,5,6 प्राथमिक के साथ कुतर कोशिकाओं और मानव तंत्रिका कैंसर सेल लाइनों. इन मॉडलों के अधिकांश सांस एक सिलिकॉन झिल्ली लदान द्वारा खिंचाव उत्पंन करते हैं । इस दृष्टिकोण एक भी अच्छी तरह से प्रारूप में प्रभावी है, लेकिन मुश्किल साबित कर दिया है एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप7तक पैमाने पर । नतीजतन, वहां कभी नहीं किया गया है एक उच्च प्रवाह स्क्रीन एजेंटों के लिए खिंचाव घायल ंयूरॉंस के इलाज के लिए ।

इस मॉडल में, झिल्ली एक कठोर फ्रॉम के साथ नीचे से इंडेंट के कारण फैला. इस प्रकिया बार में एकल अच्छी तरह से सिस्टम8,9,10में इन विट्रो में नैदानिक रूप से प्रासंगिक विकृति उत्पंन करने के लिए दिखाया गया है । हमारे हाल के काम से पता चला है कि यह आसानी से एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप को तराजू जबकि मिलीसेकंड11, जो बंद सिर प्रभाव घटनाओं12,13के समय डोमेन है के दसियों के आदेश पर पल्स अवधि को बनाए रखने ।

संक्षेप में, इस में इन विट्रो चोट मॉडल के प्रमुख लाभ ९६-well प्रारूप, hiPSCNs का उपयोग कर रहे हैं, और अपमान के नैदानिक प्रासंगिक समय डोमेन ।

Protocol

1. सिलिकॉन Detoxification

  1. कट २५४ µm मोटी, ३०.४८ सेमी x ३०.४८ सेमी सिलिकॉन झिल्ली में ७.५ सेमी x 11 सेमी एक उस्तरा ब्लेड और एक ऐक्रेलिक टेंपलेट का उपयोग कर आयतों । 10 आयताकार झिल्ली प्रत्येक पत्रक के साथ बनाया जा सकता है । कागज है कि सिलिकॉन के साथ आता है बचाओ ।
  2. झिल्ली के एक टब में रखें (DI) पानी के कांच के बनने के एक समय में एक, झिल्ली साफ़ करने के लिए दस्ताने उंगलियों के साथ सख्ती से कम से 20 एस या जब तक lathered ।
  3. lathered साबुन को हटा दिया जाता है जब तक DI पानी चल रहा है के तहत झिल्ली कुल्ला । (उनकी पैकेजिंग से) कागज पर झिल्ली रखना और गुरुत्वाकर्षण चक्र पर आटोक्लेव ।
  4. एक कक्षीय शेखर पर ७०% इथेनॉल के २५० मिलीलीटर में प्रत्येक सिलिकॉन झिल्ली भिगोने के लिए ६० rpm पर 24 घंटे के लिए एक सामग्री है कि इथेनॉल के साथ, इस तरह के के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता से बना कंटेनर का प्रयोग करें ।
    1. यदि एक से अधिक झिल्ली को एक ही बिन में रखा जाता है, या यदि झिल्ली बिन के नीचे चिपकी रहती है, तो अपने पर्यावरण से झिल्ली को प्लास्टिक पिपेट सुझावों और पिपेट टिप रैक के साथ अलग करें ।
  5. दस्ताने हाथों के साथ सिलिकॉन झिल्ली स्थानांतरण झिल्ली प्रति DI पानी की २५० मिलीलीटर और ४८ एच के लिए ६० rpm पर कक्षीय शेखर पर लेना ।
  6. झिल्ली के कागज पर वापस रखना और एक ९३ डिग्री के कांच के नीचे के लिए 4 एच
  7. कागज पर झिल्ली की दुकान, एक साफ और शुष्क जगह में, कागज के एक अंय पत्रक के साथ कवर करने के लिए उंहें धूल से बचाने के लिए ।

2. प्लेट निर्माण

  1. प्लाज्मा का इलाज एक ९६-अच्छी तरह से एक २०० डब्ल्यू प्लाज्मा क्लीनर के साथ प्लेट शीर्ष ( सामग्री की तालिकादेखें) ६० एस के लिए उच्च शक्ति पर, यह नीचे साइड-अप प्लाज्मा क्लीनर के अंदर रखकर । एक प्रभावी प्लाज्मा का गठन किया गया है जो इंगित करता है कि चैंबर की खिड़की के माध्यम से दिखाई एक बैंगनी चमक के लिए जाँच करें । यह बांडिंग तकनीक Sunkara एट अल से अनुकूलित है । 14
  2. ६० एस के भीतर, 20 मिनट के लिए DI पानी में १.५% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) के २०० मिलीलीटर में प्लेट शीर्ष प्लेस, नीचे की ओर नीचे । यह समाधान अस्थिर है: यह थाली शुरू करने से पहले कोई ६० से अधिक तैयार करें ।
    चेतावनी: एक धुएं डाकू में APTES के साथ काम करते हैं ।
  3. प्लाज्मा उच्च शक्ति पर ६० एस के लिए प्लाज्मा क्लीनर में एक निकाली सिलिकॉन झिल्ली का इलाज । समय प्लाज्मा उपचार है कि यह कोई अधिक से अधिक 5 मिनट २.२ कदम में 20 मिनट की अवधि के अंत से पहले खत्म होता है ।
  4. एक ७.५ x 11 सेमी2 चर्मपत्र कागज आयत के शीर्ष पर प्लाज्मा इलाज झिल्ली की स्थिति के लिए संदंश का प्रयोग करें । एक ७.५ cm x 11 सेमी x ०.५ सेमी एल्यूमीनियम स्लैब प्लेट निर्माण क्लैंप के निचले हिस्से पर संरेखित करें । संदंश का उपयोग कर एल्यूमीनियम स्लैब पर सिलिकॉन झिल्ली और चर्मपत्र कागज संरेखित करें ।
    नोट: इस डिवाइस के लिए कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) फ़ाइलें पूरक सामग्री में प्रदान की जाती हैं एक अनुपूरक कोड फ़ाइल ' प्रेस मरो-जेनेरिक 3 डी के रूप में. कदम ' । सामग्री के संबद्ध बिल में आपूर्ति की जाती है अनुपूरक तालिका 1: कस्टम निर्मित उपकरणों-BOM. xlsx
  5. APTES स्नान से प्लेट में सबसे ऊपर निकालें और बंद अतिरिक्त समाधान शेक । 5 एस के लिए एक २०० मिलीलीटर DI जल स्नान में डुबकी और बंद अतिरिक्त पानी हिला । 5 एस के लिए एक अलग २०० मिलीलीटर DI पानी स्नान में डुबकी और बंद अतिरिक्त पानी हिला । एक और प्लेट शीर्ष सूई से पहले इन स्नान में पानी की जगह ।
  6. पूरी तरह से प्लेट शीर्ष सूखी करने के लिए संपीड़ित हवा का उपयोग करें ।
  7. प्लेट निर्माण क्लैंप के ऊपरी हिस्से में प्लेट शीर्ष प्लेस । धीरे थाली निर्माण दबाना बंद करने के लिए प्लेट शीर्ष और सिलिकॉन एक साथ प्रेस । के लिए क्लैंप 1 ज ।
  8. प्लेट का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए इलाज के लिए अनुमति दें, धूल से सुरक्षित ।

3. एक प्लेट टूटती

  1. फ्रॉम क्लीन करा.
    नोट: अनुपूरक आंकड़ा 1देखें ।
    1. कमरे के तापमान पर DI पानी के साथ एक ६० डब्ल्यू स्नान शैली sonicator तैयार करें ।
    2. sonicator स्नान के ऊपर फ्रॉम ब्लॉक का समर्थन करें, उल्टे इतना है कि केवल सबसे ऊपर फ्रॉम के एक गहराई तक जलमग्न कर रहे हैं कम से कम 1 मिमी. Sonicate 8 मिनट के लिए ४२ kHz पर फ्रॉम.
    3. ब्लो ड्राई फ्रॉम संपीड़ित हवा के साथ ।
  2. इंडेंटर ब्लॉक संरेखित करें ।
    1. एक कैमरा खींच डिवाइस के ऊपर एक जीवित फ़ीड के साथ स्थिति है कि यह नीचे इंडेंट सरणी पर देख रहा है । फ्रॉम द टॉप पर फोकस करें ।
      नोट: सेटअप खंड 4, "निस्र्पक झिल्ली खिंचाव," में वर्णित इस कार्य के लिए एक संभव कैमरा सेटअप है ।
    2. स्टेज clamps (चित्रा 1) का उपयोग कर चोट डिवाइस के मंच पर एक थाली सुरक्षित और डिवाइस पर एक गुंबद प्रकाश जगह है ।
      नोट: साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें.
    3. कंप्यूटर के डेस्कटॉप पर सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करके इंस्ट्रूमेंट कंट्रोल सॉफ्टवेयर लॉन्च करें जो इंजरी डिवाइस को नियंत्रित कर रहा है । लॉंच विंडो में उस पर क्लिक करके "in_vitro_neurotrauma. lvproj" प्रोजेक्ट चलाएं । परियोजना खिड़की से, गति नियंत्रण और स्थिति ट्रैकर आभासी उपकरणों (विज़), जो क्रमशः उन पर डबल क्लिक करके ' motion_control. vi ' और ' position_tracker. vi ' नाम हैं, शुरू करते हैं ।
    4. चोट डिवाइस आसपास के पिंजरे बंद करो । छठी चलाने के लिए गति नियंत्रण छठी के शीर्ष बाएँ कोने में ' तीर ' बटन दबाएँ और इंडेंटर्स से संपर्क करने के 2 मिमी के भीतर करने के लिए मंच को कम करने के लिए ' निकट नीचे ' पर क्लिक करें. VI रोकने के लिए ' stop ' बटन पर क्लिक करें ।
      सावधानी: पिंजरे में कैमरे से छेड़छाड़ करने पर स्ट्रेचर का हाथ साफ रखें । पिंजरे एक दरवाजा स्विच के साथ सज्जित किया जाना चाहिए कि खींच डिवाइस के लिए बिजली उद्धार केवल जब पिंजरे का दरवाजा बंद कर दिया है ।
    5. प्रोजेक्ट विंडो में, ' अक्ष 1 ' पर दायां क्लिक करें । ' इंटरएक्टिव टेस्ट पैनल ' पर क्लिक करें । खुलने वाली विंडो में, चरण आकार को ' लक्ष्य स्थिति ' फ़ील्ड में ' ५०० ' इकाइयों में प्रवेश करके ५० µm पर सेट करें.
    6. ' इंटरएक्टिव टेस्ट पैनल ' विंडो के तल पर ' ग्रीन जाओ ' बटन पर क्लिक करें बार जब तक प्लेट पहले किसी भी इंडेंटर्स के साथ संपर्क बनाता है । कैमरे द्वारा प्रदर्शित लाइव छवि पर संपर्क के लिए जांचें । नोट अनुलंब चरण स्थिति ' इंटरैक्टिव परीक्षण पैनल ' विंडो के ऊपरी बाएँ में रिपोर्ट; यह पहली संपर्क स्थिति है ।
    7. आगे लोअर (के रूप में चरण 3.2.6 में वर्णित) जब तक हर अच्छी तरह से फ्रॉम के साथ संपर्क किया है । यदि आवश्यक हो, तो पूरी थाली को देखने के लिए कैमरा ले जाएं और चरण को ऊपर ले जाएं (एक नकारात्मक ' लक्ष्य स्थिति ' निर्दिष्ट करके) और नीचे । नोट जब सभी पोस्ट संपर्क में हों (यह पूर्ण संपर्क स्थिति है) अनुलंब अवस्था स्थिति विंडो के ऊपरी बाएं भाग में रिपोर्ट की गई है ।
    8. पहले संपर्क और पूर्ण संपर्क स्थितियों के बीच अंतर नोट करें । ' इंटरएक्टिव टेस्ट पैनल ' बंद करें । रन ' गति नियंत्रण VI ' (चरण 3.2.4 देखें) और मंच बढ़ाने के लिए ' शीर्ष ' पर क्लिक करें । ' बंद करो ' बटन के साथ गति नियंत्रण छठी बंद करो ।
    9. एक बार मंच अपनी यात्रा के शीर्ष पर है, उपकरण को निष्क्रिय करने के लिए दरवाजा खोलो । इंडेंटर ब्लॉक के कोनों पर सेट शिकंजा समायोजित करें । कोने पर सेट पेंच ढीला है कि पहले संपर्क किया, इसे कम करने के लिए और कोने है कि पिछले संपर्क बनाया बढ़ाने के लिए विपरीत पेंच कस ।
    10. चरण को कम करने की प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक प्लेट इंडेंटर्स, झुकाव के लिए संपर्क छवियों का निरीक्षण, चरण बढ़ाने, और समायोजन (step 3.2.9) फ्रॉम ब्लॉक को नहीं करती । जब चरण और ब्लॉक संरेखित होते हैं, तो सभी इंडेंटर एक बार में संपर्क कर लेंगे ।
    11. डिवाइस को निष्क्रिय करने के लिए दरवाजा खोलें । इंडेंटर ब्लॉक पर उनके छेद में टाई-डाउन शिकंजा डालें और उन्हें कस लें । पुष्टि करें कि ब्लॉक टाई नीचे शिकंजा जगह में (कदम 3.2.4-3.2.8) के साथ स्तर है । मंच स्थिति का ध्यान रखें ' इंटरएक्टिव परीक्षण पैनल ' द्वारा रिपोर्ट जब प्लेट संपर्क करता है । यह इंडेंटेशन प्रयोगों के लिए शून्य स्थिति होगी.
  3. चिकनाई फ्रॉम द.
    1. अगर फ्रॉम ब्लॉक अभी सेट किया गया है और अभी तक चिकनाई नहीं आई है, तो एक ठोस रबर पैड साफ (७.५ cm x 11 cm x १.५ mm) और एक नरम, बंद सेल फोम रबड़ पैड (७.५ सेमी x 11 cm x 3 mm) एक इथेनॉल से लथपथ प्रयोगशाला पोंछ के साथ । उंहें शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. मक्का के तेल में एक प्रयोगशाला पोंछ लेना और यह एक सुस्त चमक के लिए ठोस रबर पैड पर फैल गया ।
    3. फोम पैड के लिए तेल हस्तांतरण करने के लिए ठोस रबर पैड पर फोम पैड प्लेस । फोम पैड के शीर्ष पर एक ७.५ cm x 11 cm x ०.५ cm एल्यूमीनियम स्लैब प्लेस और यह लगभग ३६० ग्राम के एक गिट्टी वजन के साथ लोड (उदा, 6 शंकु ट्यूबों पानी की ४५ मिलीलीटर के साथ लोड प्रत्येक) फोम पैड करने के लिए ठोस रबर पैड से तेल के लगातार हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए । तेल के लिए 10 एस की अनुमति के लिए फोम रबड़ पैड को हस्तांतरण ।
    4. फोम रबड़ पैड पर इंडेंट सरणी ले जाएँ । इसके शीर्ष पर एल्यूमीनियम स्लैब और गिट्टी वजन प्लेस फ्रॉम के सुझावों के लिए तेल के लगातार हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए । तेल के लिए 10 एस को इंडेंटकों को ट्रांसफर करने की अनुमति दें ।
    5. यदि कोई प्लेट इंडेंट ब्लॉक स्थापित किया गया था और पहली बार के लिए चिकनाई के बाद से बढ़ाया गया है, प्रयोग शुरू करने से पहले एक परीक्षण प्लेट खिंचाव ।
      नोट: यह प्रयोग को प्राप्त करने से पहले खिंचाव और बाद में फैला के बीच किसी भी विसंगति को रोक देगा । क्रमिक हिस्सों के लिए, प्रत्येक खिंचाव से पहले केवल 3.3.2-3.3.5 चरण दोहराएँ.
  4. एक थाली खींचो ।
    1. ३.३ चरण में वर्णित के रूप में इंडेंटेशन को चिकना ।
    2. स्टेज clamps के साथ चोट डिवाइस के मंच पर प्लेट सुरक्षित । यदि बांझपन की आवश्यकता है, कमरे में हवा के लिए संस्कृति की सतह को उजागर किए बिना थाली सुरक्षित करने के लिए ढक्कन की स्थिति को समायोजित करें ।
    3. 'गति नियंत्रण VI ' (चरण 3.2.4-3.2.6 देखें) का उपयोग करके शून्य स्थिति के लिए चरण को कम करें; शून्य-स्थिति चरण ३.२ के दौरान निर्धारित होता है ।
    4. एक अद्वितीय फ़ाइल नाम के लिए ' स्थिति ट्रैकिंग VI ' में "फ़ाइल पथ" फ़ील्ड में फ़ाइल का नाम बदलें, फिर उसे उस विंडो के ऊपरी बाएँ कोने में ' तीर ' बटन के साथ चलाएँ.
    5. गहराई और इंडेंट की अवधि सेट करें (सामांयतया 1-4 mm और 30 ms, क्रमशः, अधिकतम गहराई 5 मिमी, न्यूनतम अवधि 15 ms) ' चोट (मिमी) ' और ' चोट की अवधि (ms) ' फ़ील्ड में ' आंदोलन नियंत्रण कक्ष छठी ' में फ़ील्ड और टाइपिंग पर क्लिक करके वांछित मान.
    6. ' मूवमेंट कंट्रोल पैनल छठी ' चलाएं और प्लेट को इंडेंट करने के लिए ' घायल ' पर क्लिक करें ।
    7. ' ऊपर ' पर क्लिक करके अपनी यात्रा के शीर्ष पर मंच हटो । फिर ' स्टॉप ' बटन के साथ छठी बंद करो और दरवाजा खोलने के द्वारा चोट डिवाइस निष्क्रिय ।
    8. निर्दिष्ट अधिकतम विस्थापन लागू किया गया था कि पुष्टि करने के लिए ' स्थिति ट्रैकर छठी ' में प्रस्तुत मंच के विस्थापन इतिहास का निरीक्षण । ग्राफ पर राइट क्लिक करें और ' एक्सेल में निर्यात ' पर क्लिक करें । ' पर क्लिक करें फ़ाइल । सहेजें ' के रूप में डेटा को बचाने के लिए ।

4. निस्र्पक झिल्ली खिंचाव

  1. उच्च गति वीडियोग्राफी के लिए एक उच्च कंट्रास्ट पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए प्रत्येक इंडेंटर सफेद के शीर्ष पर अवकाश पेंट करें ।
    सावधानी: रिम्स के उन फ्रॉम यूज को पेंट न करें जहां से वे प्लेटों से संपर्क बनाते हैं ।
  2. पाली (लैक्टिक एसिड) के साथ 3 डी प्रिंट (पीएलए), या अंयथा बनाना, एक बेलनाकार स्टांप जिसके साथ एक अच्छी तरह से एक डॉट बनाने के लिए । सिलेंडर ५.९ मिमी व्यास में और १२.२ मिमी उच्च, एक बेलनाकार दखल १.५ मिमी व्यास और १.० मिमी उच्च शीर्ष पर केंद्रित के साथ बनाओ ।
    नोट: एक 3 डी मुद्रण योग्य ' मॉडल स्टांप । STL ' एक अनुपूरक फाइल के रूप में उपलब्ध है ।
  3. प्लाज्मा इलाज प्लेट दाईं ओर-६० एस के लिए कुओं में सिलिकॉन सेल संस्कृति की सतह को सक्रिय करने के लिए, जैसा कि चरण २.१ में उल्लेख किया ।
  4. एक रबर पैड या अंय नरम सतह पर प्लेट रखें । प्रधानमंत्री स्टांप पर छोटी दखलंदाजी (४.२ कदम देखें) एक स्थाई मार्कर कलम से स्याही के साथ । अच्छी तरह से परीक्षण किया जा करने के लिए और स्याही का अच्छा हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए नल में स्टांप डालें । प्रधानमन्त्री हर कुआं से पहले स्टाम्प लगाए ।
  5. इंडेंटर ब्लॉक संरेखित करें और चोट डिवाइस के इंडेंटर्स को चिकनाई (चरण 3.2-3.3 देखें) । चोट डिवाइस के मंच पर प्लेट दबाना । चोट डिवाइस के ऊपर एक चमकदार फैलाना अक्षीय प्रकाश की स्थिति ।
  6. एक उच्च गति कैमरा सेट अप पर एक बूम खड़े हो जाओ पर चोट डिवाइस, सीधे नीचे का सामना करना पड़ लेंस के साथ छोटे गिने f-स्टॉप, और इसे चालू करें । कैमरे से जुड़े कंप्यूटर पर कैमरा सॉफ्टवेयर लॉन्च करें । फ्रेम दर ड्रॉप डाउन मेनू में, २,००० फ्रेम प्रति सेकंड का चयन करें, और शटर ड्रॉप डाउन मेनू में, सबसे तेजी से जोखिम समय है जो उच्च कंट्रास्ट छवियों पैदावार का चयन करें । बिंदीदार कुओं पर केंद्र ।
    1. कैमरा स्थिति इतना है कि देखने के क्षेत्र में एक 3 एक्स 4 ग्रिड में 12 कुओं शामिल हैं ।
      ध्यान दें: देखने के इस क्षेत्र के प्रवाह और संकल्प के बीच एक १,२८० × १,०२४ छवि के लिए एक इष्टतम समझौता प्रदान करता है ।
  7. शूंय-बिंदु (चरण 3.2.4-3.2.6) को देखने के लिए थाली को कम करें । एक-क्लिक कैमरा सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्ड बटन ताकि यह में ' ट्रिगर' पढ़ता है । स्थिति ट्रैकर छठी (चरण 3.4.4) शुरू करो ।
  8. चमकीले फैलाना अक्षीय प्रकाश को चालू करें । चरण 3.4.6 में वर्णित के रूप में प्लेट इंडेंट ।
  9. चमकीले फैलाना अक्षीय प्रकाश को बंद कर दें ।
  10. कैमरा नियंत्रण कंप्यूटर पर, जिसमें इंडेंटेशन होती है रिकॉर्डिंग की 30-40 ms विंडो ढूँढें: कैमरा सॉफ़्टवेयर में उच्च-गति वीडियो प्ले बार में शुरुआत और अंत तीरों को खींचें. सहेजेंक्लिक करें, ' फ़ाइल का नाम ' फ़ील्ड में नाम सेट, ' ' स्वरूप ' फ़ील्ड में ' TIFF ' का चयन करें, और ' सहेजें ' पर क्लिक करे ।
    1. के माध्यम से देखो । TIF-कम (शुरुआत) और सबसे बढ़ाकर (पीक इंडेंट) राज्यों की छवियों के लिए फ़ाइलें ।
    2. दोनों छवियों में डॉट्स की ऊंचाई और चौड़ाई को मापने के लिए, फिजी का उपयोग करने के लिए सबसे कम और पीक खिंचाव के साथ-साथ की छवियों को खोलने के लिए । डिफ़ॉल्ट आयताकार चयन उपकरण का उपयोग करना, क्लिक करें और खींचें के लिए एक बॉक्स के आसपास एक डॉट कम खिंचाव छवि में आकर्षित । माप ऊंचाई और चौड़ाई के साथ ' विश्लेषण । उपाय '.
    3. शिखर खिंचाव छवि पर ही अच्छी तरह से डॉट के लिए दोहराएँ. कुओं के आराम के लिए दोहराएं ।
  11. इस रूप में x और y दिशाओं में Lagrangian तनाव की गणना करें:
    Equation 1
    Equation 2
    नोट: यहां, exx x दिशा में Lagrangian तनाव है, eवव में y दिशा में Lagrangian तनाव है, x की चौड़ाई बिंदी है, y का कद बिंदी है, f अंतिम छवि (यानी, पीक इंडेंट छवि) को नोट करें, और मैं आरंभिक छवि (यानी, पूर्व-इंडेंट छवि) को अर्थपूर्ण बना पाता है. औसत दो मूल्यों में है कि अच्छी तरह से तनाव का निर्धारण ।

5. प्रसंस्कृत कोशिकाओं चढ़ाना

  1. आटोक्लेव के डिब्बे व गिट्टी तौल कर उसका उपयोग नसबंदी के लिए किया जाएगा ।
  2. प्लाज्मा इलाज सिलिकॉन तली हुई प्लेट्स दाईं ओर-६० s के लिए (चरण २.१ देखें) । तत्काल 15 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल युक्त बाँझ डिब्बे में प्लेटें जलमग्न ।
  3. 30 मिनट के लिए अलग बाँझ डिब्बे में बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में प्लेटें जलमग्न.
  4. पंजाबियों को कुएं से महाप्राण । कुएं को प्लाज्मा ट्रीटमेंट खोने से रोकने के लिए एक बार में ही सूखी एक प्लेट ।
    चेतावनी: सिलिकॉन तली प्लेट कठोर प्लेटों से कम स्पर्श प्रतिक्रिया जब pipetting और अधिक एक पिपेट की नोक ब्लॉक होने की संभावना है प्रदान करते हैं ।
  5. ०.१ मिलीग्राम/एमएल पाली-एल-ornithine (पीएलओ) के प्रति अच्छी तरह से निष्फल प्लेटों के लिए १०० µ एल जोड़ें । 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  6. १०० µ l बाँझ पंजाबियों के साथ दो बार कुओं कुल्ला, सेल निलंबन के लिए तैयार है जब तक कुओं पर दूसरा धो छोड़ ।
  7. सूखी बर्फ पर सुरक्षा दस्ताने और जगह का उपयोग तरल नाइट्रोजन भंडारण से hiPSCNs की शीशी निकालें । जल्दी से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और गल के लिए ठीक 3 मिनट के लिए शीशी परिवहन । शीशी में न घूमता हो ।
  8. एक बाँझ डाकू में, धीरे से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब एक 1 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करने के लिए शीशी की सामग्री को हस्तांतरण ।
  9. कमरे के तापमान पूरा रखरखाव माध्यम (मीडिया बेस + अनुपूरक) के 1 मिलीलीटर के साथ खाली क्रायोजेनिक शीशी कुल्ला ।
  10. के बारे में एक बूंद प्रति सेकंड में ५०-एमएल ट्यूब ड्रॉप वार में मीडिया के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । धीरे जबकि जोड़ने ट्यूब घूमता । कमरे के तापमान के 8 मिलीलीटर पूरा रखरखाव मध्यम ५० मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें के बारे में 2 बूंदें/
  11. टोपी ट्यूब और 2-3 बार पलटना । किसी hemocytometer के साथ कक्षों की गणना करना. २२५,००० कक्षों/एमएल के लिए सेल निलंबन को पतला करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त मीडिया की मात्रा की गणना ।
  12. धीरे मीडिया की राशि पिपेट (ऊपर की गणना) एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर सेल निलंबन की ट्यूब में ।
  13. सेल सस्पेंशन के 1 मिलीग्राम/एमएल laminin स्टॉक के 10 µ एल जोड़ें १,००० µ l micropipette के साथ सेल निलंबन में µ के 10 laminin g/एमएल प्राप्त करने के लिए । महाप्राण ऊपर और नीचे एक बार laminin के लिए इस्तेमाल टिप के साथ, तो ट्यूब टोपी और एक बार ट्यूब पलटना ।
  14. पंजाबियों को प्लेटों से महाप्राण, एक बार में एक थाली । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से hiPSCN सेल निलंबन के १०० µ एल जोड़ने के लिए । कुओं ०.३३ cm2के एक संस्कृति क्षेत्र है, तो क्षेत्र के प्रति सेल घनत्व ६७,५०० कोशिकाओं/
  15. अनुलग्नक को बढ़ावा देने के लिए बोने के बाद 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें आराम करें । बाँझ संस्कृति हूड के प्रशंसक कंपन से बचने के लिए, लैब बेंच पर कवर प्लेटों जगह. 5% CO2के साथ ३७ ° c पर संस्कृतियों की मशीन ।
  16. पूरा रखरखाव मीडिया के २०० µ एल के साथ कुओं को फिर से भरना 24 घंटे में एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन करते हैं । १०० µ l/हर 2-3 दिन का एक आधा मीडिया परिवर्तन निष्पादित करें ।

6. घायल संस्कृतियों

  1. इंडेंटर ब्लॉक संरेखित करें और चरण ३.२ में वर्णित के रूप में शून्य स्थिति ढूँढें । ३.३ चरण में वर्णित के रूप में इंडेंटेशन को चिकना ।
  2. ' पोजिशन ट्रैकर VI ' (step 3.4.4) में विस्थापन इतिहास के लिए फ़ाइल नाम सेट करें । ' गति नियंत्रण VI ' (step 3.4.5) में चोट के मापदंडों को निर्धारित करें ।
  3. थाली लेने के लिए बाहर मशीन से घायल हो और यह मंच पर दबाना । ढक्कन की स्थिति को समायोजित करने के लिए कमरे में संस्कृतियों को उजागर बिना थाली सुरक्षित करने के लिए हवा ।
  4. ' गति नियंत्रण VI ' का उपयोग करके प्लेट को जीरो-पॉइंट (steps 3.2.4-3.2.6) तक कम करें । ' पोजिशन ट्रैकर VI ' (step 3.4.4) शुरू करें ।
  5. प्लेट को इंडेंट करने के लिए मूवमेंट कंट्रोल VI का उपयोग करें (जैसा चरण 3.4.6 में वर्णित है). अन्तर्वासना स्ट्रेच के लिए, केवल इस चरण को छोड़ें ।
  6. चरण को गति की अपनी सीमा के शीर्ष पर लौटें (चरण 3.4.7 देखें) । मशीन के लिए थाली लौटें ।
  7. निरीक्षण और विस्थापन ट्रेस सहेजें (के रूप में चरण 3.4.8 में) ।

7. माइक्रोस्कोपी

  1. 2 µ g/ml Hoechst ३३३४२ और 5 µ g/ml Calcein के साथ एक 10x धुंधला समाधान तैयार रखरखाव मीडिया में हूं ।
  2. 10x धुंधला समाधान के एक 20 µ एल कील के साथ एक अच्छी तरह से दाग ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर दाग के साथ 15 मिनट के लिए मशीन ।
  4. व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त । Calcein AM और Hoechst ३३३४२ संकेतों, क्रमशः छवि के लिए पारंपरिक FITC और DAPI फ़िल्टर सेट का उपयोग करें । यदि बहु अच्छी तरह से इमेजिंग अनुक्रम 10 मिनट से अधिक ले जाएगा, एक मंच शीर्ष मशीन में थाली बंद करना संस्कृतियों के स्वास्थ्य को बनाए रखने के ।
    नोट: एक 10x, ०.३० NA लेंस सेल व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान के निर्धारण के लिए पर्याप्त विस्तार प्रदान करता है । neurites का अच्छा दृश्य सुनिश्चित करने के लिए लाभ समायोजित करें, भले ही यह बहुत उज्जवल सोमा के कुछ संतृप्ति का कारण बनता है ।
  5. खंड लाइव सेल छवियों में ग्रीन Calcein हूं सोमा और neurites की पहचान करने के लिए चैनल । सोमा की पहचान के साथ सहायता करने के लिए ब्लू Hoechst ३३३४२ चैनल में परमाणु छवियों का उपयोग करें.

Representative Results

स्ट्रेचर डिवाइस के रूप में कम के रूप में पल्स अवधि के साथ दोहराया मंच चलती में सक्षम है 10-15 एमएस पल्स के आयाम पर निर्भर करता है (चित्रा 2a). पल्स आयाम अत्यधिक दोहराया जा रहा है, लेकिन पल्स अवधि पुनरावृत्तियों के बीच लगभग 1 ms द्वारा बदलता रहता है. कुओं की एक बड़ी संख्या लोड कर रहे हैं जब वास्तविक पल्स आयाम निर्धारित पल्स आयाम से हट जाता है, और निर्धारित आयाम उच्च है ( चित्र bदेखें) । मंच विस्थापन के आयाम 3 मिमी से परे बढ़ जाता है के रूप में, वास्तविक विस्थापन आयाम तेजी से निर्धारित विस्थापन आयाम की कमी हो जाता है ( चित्रा 2 बीदेखें). पोस्ट ब्लॉक के सावधान संरेखण पंक्ति या स्तंभों में झिल्ली तनाव में किसी भी प्रवृत्ति को समाप्त (चित्र 2c) । ३.५ मिमी निर्धारित चरण विस्थापन आयाम (३.३ mm वास्तविक विस्थापन आयाम) के साथ ५२ कुओं दांतेदार बना, सभी अच्छी तरह से स्थानों के पार मतलब Lagrangian तनाव ०.४५१ था (सभी स्थानों के लिए साधन के मानक विचलन = ०.०५१, मानक कुटिलता का मतलब सभी स्थानों के लिए = ०.०६५, n = 5 प्रति अच्छी तरह से माप). ये परिणाम पूर्णता के लिए यहां प्रस्तुत कर रहे है हालांकि उनमें से कुछ पहले से ही11सूचना दी गई है ।

एक इष्टतम, घायल संस्कृति से अधिक 5 कोशिकाओं के किसी भी झुरमुट अगर कुछ होगा । Neurites व्यक्ति, लंबे, पतला होगा, और कम या कोई तनाव या मनका (चित्र 3) के संकेत के साथ घुमावदार । आदर्श शर्तों के तहत, संस्कृतियों की व्यवहार्यता बारीकी से निर्माता के डाटा शीट में निर्दिष्ट व्यवहार्यता दृष्टिकोण चाहिए (आमतौर पर 60-70%) और सिलिकॉन पर संस्कृतियों पारंपरिक कठोर संस्कृति सब्सट्रेट पर बनाए रखा उन जैसा दिखना चाहिए ( चित्र बी) । Neurites या एक कम बिजली उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर दिखाई नहीं हो सकता है । Laminin एकाग्रता और कोशिका घनत्व दोनों प्रभाव संस्कृतियों बेसलाइन पर और चोट के बाद । कोशिका घनत्व में वृद्धि होने से संस्कृति में गठित होने वाले झुरमुट की संख्या और आकार में वृद्धि हुई. laminin एकाग्रता में वृद्धि अक्सर इस प्रभाव (चित्र 3ए) प्रतिक्रिया । हालांकि, laminin एकाग्रता में वृद्धि बहुत ज्यादा चोट करने के लिए संस्कृतियों की संवेदनशीलता कुंद (चित्रा 4) । घायल संस्कृतियों के लिए इष्टतम laminin एकाग्रता ५० µ g/laminin के एमएल (चित्रा 3) था, लेकिन शम और खिंचाव घायल आबादी के बीच इष्टतम जुदाई 10 µ जी/laminin के एमएल (चित्रा 4) में प्राप्त किया गया था । उच्च laminin सांद्रता कम समय अंक (चित्रा 4) पर चोट करने के लिए संस्कृतियों की संवेदनशीलता कम है, लेकिन यह भी लंबे समय अंक (जैसे, 7 दिन) में आधारभूत कोशिका व्यवहार्यता में सुधार । संक्षेप में, यह प्रत्येक प्रयोगात्मक परिदृश्य के लिए laminin एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए सार्थक है ।

झिल्ली तनाव, बाद चोट इमेजिंग समय बिंदु, laminin एकाग्रता, और कोशिका घनत्व सभी सेल प्रति neurite लंबाई (ANOVA, p < 0.001) पर एक उच्च सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव डालती । कोशिका प्रति neurite लंबाई पर झिल्ली तनाव के प्रभाव के बाद चोट इमेजिंग समय बिंदु और laminin एकाग्रता (ANOVA, p < 0.001) और सेल के साथ एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बातचीत के साथ अत्यधिक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बातचीत की थी घनत्व (ANOVA, p < 0.05) । इसी प्रकार, झिल्ली तनाव, बाद चोट इमेजिंग समय बिंदु, कोशिका घनत्व, और laminin एकाग्रता सभी सेल व्यवहार्यता पर एक उच्च सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मुख्य प्रभाव डालती (ANOVA, p < 0.001) । कोशिका व्यवहार्यता पर झिल्ली तनाव के प्रभाव के बाद चोट इमेजिंग समय बिंदु (ANOVA, पी < 0.001) और सेल घनत्व के साथ एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बातचीत के साथ एक उच्च सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बातचीत थी (ANOVA, पी < 0.05) । इन परिणामों को साबित करते है कि समय, कोशिका घनत्व, और laminin एकाग्रता लागू अपमान और प्रयोगात्मक परिणामों के बीच संबंधों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव डालती है, तो प्रत्येक सावधानी से अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

कम सेल व्यवहार्यता और मनके neurites, अवरुद्ध neurite वृद्धि के साथ, विषाक्त संस्कृति की स्थिति है कि अनुचित तरीके से तैयार सिलिकॉन से पैदा कर सकते है संकेत मिलता है । लंघन या छोटा पानी सोख या ओवन सूखी झिल्ली में अवशोषित इथेनॉल या पानी छोड़ सकते हैं, क्रमशः, जो मीडिया में फैलाना और कोशिकाओं तनाव कर सकते हैं । अच्छी तरह से घायल संस्कृतियों सेल व्यवहार्यता कम हो जाएगा, छोटा या लापता neurites, मनके neurites, और neurites कि तना हुआ या तनाव देखो । चोट कोशिका संस्कृतियों है कि अच्छी तरह से पूर्व चोट फैलाया गया में झुरमुट पैदा कर सकता है । बड़े झुरमुट रूपात्मक विश्लेषण को प्राप्त कर सकते हैं । रूपात्मक विश्लेषण के लिए, चोट के स्तर को देखते होना चाहिए कि इस तरह ध्यान देने योग्य परिवर्तन होते हैं, लेकिन कुछ neurites के साथ कोशिकाओं को अभी भी मौजूद हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : चोट डिवाइस के एक लेबल योजनाबद्ध. (A) शीर्ष दृश्य, (B) isometric दृश्य, (C) फ्रंट व्यू, (D) दाईं ओर दृश्य. स्केल बार लिखने का दृश्य (A, B और D) पर लागू होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : यांत्रिक अपमान का कीनेमेटीक्स । () कोई कुओं भरी हुई है जब निर्धारित आयाम (निर्धारित आयाम की एक श्रेणी में 5 से अधिक दालों पर मंच विस्थापन इतिहास) । ५२ कुओं लोड कर रहे हैं (निर्धारित आयाम) निर्धारित आयाम की एक श्रेणी में 10 से अधिक दालों पर मंच विस्थापन इतिहास (). () ३.३ mm के चरण विस्थापन आयाम के साथ एक अच्छी तरह से औसत तनाव (n = 5 अच्छी तरह से माप, औसत मानक त्रुटि प्रति अच्छी तरह = ०.०२९) । ध्यान दें कि C4-F4 और C9-F9 unतनी नियंत्रण कुओं हैं । यह आंकड़ा शर्मन एट अल से संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : सिलिकॉन पर संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन । () सिलिकॉन पर hiPSCN संस्कृतियों पर बदलती कोशिका घनत्व और laminin एकाग्रता का प्रभाव. बढ़ती कोशिका घनत्व और घटते laminin एकाग्रता के साथ झुरमुट बढ़ता है । सेल घनत्व और laminin एकाग्रता मोनो फैलाई संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. मोनो फैलाने वाली संस्कृतियों ठहराव के दौरान कलाकृतियों को कम कमजोर कर रहे हैं । ध्यान दें कि डायनेमिक रेंज neurites के दृश्य ऑप्टिमाइज़ करने के लिए समायोजित किया गया है । एक परिणाम के रूप में, बहुत उज्जवल सोमा संतृप्त हैं । इस प्रस्तुति सोमा, जो बहुत dimmer neurites लगभग अदृश्य renders के संबंध में गतिशील रेंज के अनुकूलन के विकल्प के लिए पसंद है । लाल चौक से प्रकाश डाला शर्त के लिए इष्टतम माना जाता था इन विट्रो खिंचाव चोट प्रयोगों । () इष्टतम स्थितियों के तहत, सिलिकॉन झिल्ली पर संस्कृतियों पारंपरिक कठोर सब्सट्रेट पर संस्कृतियों के समान दिखाई देते हैं । बाएं पैनल से पता चलता है hiPSCNs ३३,७५० कोशिकाओं/cm2 पर ३.३ µ g/laminin के साथ एक पारंपरिक, कठोर ९६ प्लेट पर (सेल संस्कृति सब्सट्रेट एक ऊतक संस्कृति चक्रीय olefin सह बहुलक का इलाज किया है) । सही पैनल (ए) से लाल रंग में उल्लिखित पैनल reproduces । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : चोट phenotype और laminin एकाग्रता पर अपनी निर्भरता । () स्वस्थ संस्कृति, 10 µ जी/एमएल laminin और ६७,५०० कोशिकाओं का उपयोग कर2सेमी/ Neurites नहीं मोतियों के साथ लंबे होते हैं । कुछ मृत नाभिक, और कुछ झुरमुट हैं । () संस्कृति एक ही संस्कृति की स्थिति का उपयोग कर, ५७% पीक तनाव के साथ घायल हो गए और 4 घंटे के बाद imaged Neurites छोटा या लापता हैं, और कुछ मोती है (तीर से संकेत) । वहां कम Calcein हूं-सकारात्मक कोशिकाओं और अधिक Calcein हूं-नकारात्मक (यानी, मृत) नाभिक । चोट से बचे हुए कोशिकाओं के बीच का झुरमुट बढ़ गया है. () चोट के बाद 4 ज, सेल प्रति neurite लंबाई एक तरह से है कि laminin एकाग्रता पर निर्भर करता है में बढ़ती तनाव के साथ गिरावट आती है । () चोट के बाद 4 ज, कोशिका व्यवहार्यता एक तरह से है कि laminin एकाग्रता पर निर्भर करता है में बढ़ती तनाव के साथ गिरावट आती है । (E) 24 ज चोट के बाद, सेल प्रति neurite लंबाई एक तरीके से बढ़ती तनाव के साथ गिरावट आती है जो laminin एकाग्रता पर निर्भर करता है । () 24 एच चोट के बाद, कोशिका व्यवहार्यता एक तरह से है कि laminin एकाग्रता पर निर्भर करता है में बढ़ती तनाव के साथ गिरावट आती है । (n = 4 प्रति पट्टी, त्रुटि पट्टियां है ± 1 मानक विचलन, स्केल बार्स = १०० µm) । तनाव मूल्यों शर्मन एट अल द्वारा एक पूर्व प्रकाशन से डेटा का उपयोग कर चरण विस्थापन से मुजे रहे हैं । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक चित्रा 1: इंडेंटर की तकनीकी ड्राइंग. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: कस्टम निर्मित उपकरणों. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2:96 अच्छी तरह से प्लेट-लोडर Pinout तारों आरेखइस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 1: चोट डिवाइस के कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन चित्र. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 2: प्लेट निर्माण क्लैंप के कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन चित्र. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 3: स्टांप ज्यामिति के 3 डी प्रतिनिधित्व, एक 3 डी प्रिंटर के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 4: MuStLiMo_si_initialize. vi के लिए SubVI, जो motion_control. vi के लिए एक SubVI है. संवाद बक्सों में प्रविष्टियों को गति के लिए पैरामीटर्स में कनवर्ट करता है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फ़ाइल 5: SubVI के लिए एकाधिक सीधी रेखा Moves_simplified. vi, जो motion_control. vi के लिए एक SubVI है । संवाद बक्सों में प्रविष्टियों को गति के लिए पैरामीटर्स में कनवर्ट करता है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फ़ाइल 6: position_tracker. vi के लिए SubVI । काउंटर रैखिक एनकोडर से विस्थापन इनपुट पटरियों । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फ़ाइल 7: आधार LabVIEW प्रोजेक्ट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 8: शीर्ष स्तर VI जो डिवाइस ले जाता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फाइल 9: motion_control. vi के लिए SubVI । तेजी से विस्थापन कि थाली फैला निष्पादित करता है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फाइल 10: SubVI for motion_control. vi. धीमी गति से विस्थापन है कि मंच चालें कार्यांवित । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फाइल 11: motion_control. vi के लिए SubVI । भूखंड एक (आमतौर पर नमूना) motion_control. vi नियंत्रण कक्ष में विस्थापन इतिहास । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फ़ाइल 12: शीर्ष स्तर छठी है कि विस्थापन इतिहास रिकॉर्ड. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 13: शामिल Variable2, जो motion_control. vi और position_tracker. vi के बीच संचार करता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 14: मुद्रित सर्किट बोर्ड के लिए योजनाबद्ध । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक कोड फ़ाइल 15: मुद्रित सर्किट बोर्ड के लिए लेआउट. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

इस मॉडल में एक सुसंगत, biofidelic phenotype प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण एक सुसंगत biofidelic यांत्रिक अपमान लागू है । यह मॉडल पल्स अवधि के रूप में कम के रूप में 10-15 ms, जो मानव सिर प्रभावों के लिए पल्स अवधि के लिए समान है cadaveric प्रयोगों12,13के अनुसार उत्पन्न कर सकते हैं. इस अपमान की निरंतरता इंडेंटर ब्लॉक और इंडेंटर्स के अनुरूप स्नेहन के साथ प्लेट के संरेखण पर निर्भर करता है । जब इंडेंटर ब्लॉक अच्छी तरह संरेखित होता है, तो पंक्तियों या स्तंभों में लागू किए गए दबाव में कोई रुझान नहीं होता है (चित्र 2c) । स्नेहक की एक पतली परत आमतौर पर एक मोटी परत की तुलना में कम घर्षण बनाता है, और चिपचिपा तेल की सिफारिश नहीं कर रहे है क्योंकि वे और सिलिकॉन बेईमानी माइक्रोस्कोपी के दौरान प्रकाश के पारित होने बाधा । वास्तविक अवस्था विस्थापन आयाम निर्धारित विस्थापन आयाम के काफी कम गिर सकता है जब कई इंडेंटर का उपयोग किया जाता है, और निर्धारित चरण विस्थापन आयाम बड़ा (> 3 मिमी) है । हालांकि, जबकि वास्तविक विस्थापन बड़े आयाम पर निर्धारित विस्थापन से कम है, यह दोहराई (आंकड़ा बी b) रहता है । इसलिए, बड़े, वास्तविक विस्थापन आयाम मज़बूती से वांछित मूल्य से अधिक में एक निर्धारित मूल्य दर्ज करके प्राप्त किया जा सकता है । विस्थापन आयाम मामलों केवल क्योंकि यह पीक झिल्ली तनाव है, जो सीधे यांत्रिक अपमान है कि विकृति लाती उपाय के लिए एक आसानी से दर्ज प्रॉक्सी है । इसलिए, चरण विस्थापन से झिल्ली तनाव निर्धारित करने के लिए वर्णित प्रक्रिया महत्वपूर्ण है । इस प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए अगर कोई बड़ा परिवर्तन प्रणाली है कि प्लेट और फ्रॉम के बीच बातचीत को प्रभावित करने के लिए किया जाता है, उदाहरण के लिए अगर अलग व्यास फ्रॉम, विभिन्न फ्रॉम सामग्री या कोटिंग्स, या सिलिकॉन के विभिन्न प्रकार तली प्लेट इस्तेमाल कर रहे हैं । इंडेंटर ब्लॉक करने और शून्य स्थिति निर्धारित करने की प्रक्रिया को प्रत्येक प्रयोग के प्रारंभ में दोहराया जाना चाहिए. खींच डिवाइस के एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है. उपकरण को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक सीएडी मॉडल पूरक सामग्री के रूप में प्रदान की जाती हैं-' चोट डिवाइस-पूर्ण विधानसभा-जेनेरिक 3d. कदम '; ' के रूप में प्रदान की सामग्री के संबद्ध बिलअनुपूरक तालिका 1: कस्टम निर्मित उपकरणों-BOM. xlsx। इसके अलावा अनुपूरक तालिका २ ९६ खैर प्लेट _loader- Pinout तारों आरेख.xlsx, जो सिस्टम के विभिन्न घटकों से कनेक्ट केबलिंग कनेक्शन का वर्णन करता है देखें । ' Interconnector_circuit_board. डुबकी ' एक सर्किट बोर्ड का वर्णन करता है जो केबलों को जोड़ता है ।

यदि डिवाइस को अपनी यात्रा के बीच के चरण के साथ निष्क्रिय कर दिया जाता है, तो चरण बिजली कट जाने के बाद आगे बढ़ जाएगा क्योंकि यह स्प्रिंग-लोडेड है । पावर पुनर्स्थापित किया जाता है, जब प्रतिक्रिया लूप अंतिम ज्ञात निर्धारित स्थिति और वास्तविक स्थिति के बीच एक बड़ा अंतर का पता लगाने जाएगा । इस चरण के लिए अचानक स्थिति यह जब उपकरण निष्क्रिय था में था स्थानांतरित करने के लिए कारण होगा । इस अचानक गति encoders के उत्पादन में त्रुटियों के कारण कर सकते हैं, तो देखभाल के लिए डिवाइस निष्क्रिय करने के लिए लिया जाना चाहिए केवल जब वह अपनी यात्रा के शीर्ष पर अपनी शक्तिहीन आराम की स्थिति में है ।

निर्माण क्लैंप थाली शरीर और सिलिकॉन नीचे एक तरह से एक साथ है कि इष्टतम संबंध की अनुमति देता है लाने के लिए बनाया गया है । इस अंत करने के लिए, वहां तीन पूरक फ़ाइल ' प्रेस मरो-जेनेरिक 3d में प्रस्तुत डिजाइन में प्रमुख विशेषताएं हैं । कदम ' । सबसे पहले, क्लैंप प्लेट शरीर धारक सिलिकॉन नीचे करने के लिए समानांतर है । यदि यह ठीक से बनाया गया है, यह प्रारंभिक सेटअप के बाद कोई समायोजन की आवश्यकता होगी । दूसरा, दबाना में फोम रबड़ की परत प्लेट के तहत अनुपालन की एक छोटी राशि प्रदान करता है, एक पूरी तरह से कठोर प्रणाली के रूप में सैद्धांतिक रूप से अनंत clamping बल को जब दबाना बंद कर दिया गया था शक्ति को दबाना शूंय से अचानक वृद्धि का अनुभव होगा । crossbar की स्थिति और दबाना के पेंच सेट समायोज्य रहे है ताकि क्लैंप के दोनों पक्षों के बीच की दूरी ठीक-देखते हो सकता है ।

हर प्रयास तनाव लक्षण वर्णन प्रयोगों के दौरान अच्छी तरह से नीचे डॉट के पीछे एक उज्ज्वल, सफेद पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए किया जाना चाहिए । इन छवियों में बेहतर इसके विपरीत, आसान यह ऊंचाई और चौड़ाई को मापने की प्रक्रिया को स्वचालित होगा, जो एक मानव एक बड़े प्रयोग का विश्लेषण ऑपरेटर के लिए थकाऊ हो सकता है । एक अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी थाली में एक कुआं के नीचे की उच्च गति वीडियोग्राफी चुनौतियों प्रस्तुत करता है क्योंकि अच्छी तरह से दीवारों को छाया डाली जाती हैं । एक गुंबद प्रकाश या फैलाना अक्षीय प्रकाश है कि छवि अस्पष्ट बिना कैमरे की दृष्टि की रेखा के साथ रोशन कर सकते है का उपयोग छाया या specular प्रतिबिंब है कि एक पारंपरिक प्रकाश स्रोत के साथ पैदा होता है समाप्त । प्रतिभाशाली उपलब्ध प्रकाश स्रोत का इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्योंकि उज्ज्वल रोशनी छवियों एक कम जोखिम समय के साथ प्राप्त करने की अनुमति देता है । लघु जोखिम बार गति कलंक को कम । फैलाना अक्षीय प्रकाश में प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) उन्नयन उच्च गति वीडियो अधिग्रहण के दौरान कम जोखिम बार की अनुमति देता है. एल ई डी को फैलाना अक्षीय प्रकाश खोलने के द्वारा उंनत किया जा सकता है, शेयर एल ई डी हटाने, बढ़ते 4 उच्च शक्ति वापस फलक एल ई डी धारकों का उपयोग करने के लिए arrays एलईडी, उंहें एक निरंतर मौजूदा बिजली की आपूर्ति के लिए जोड़ने, और फैलाना अक्षीय प्रकाश reकोडांतरण ( तालिका देखें सूची संख्या के लिए सामग्री) । एल ई डी उंनयन के नुकसान यह है कि निष्क्रिय ठंडा एल ई डी पर अधिक से अधिक overheating के जोखिम के कारण कुछ सेकंड के लिए नहीं रखा जा सकता है । इसलिए, पोस्ट-ब्लॉक और कैमरा समायोजन के संरेखण के लिए एक अलग प्रकाश की आवश्यकता है ।

एक झिल्ली पर मुद्रांकित डॉट के फैलाव को मापने के द्वारा झिल्ली तनाव को बढ़ाता के प्रस्तुत विधि अपेक्षाकृत कच्चे तेल है, लेकिन यह एक मजबूत तरीके से कई कुओं के लिए पैमाने पर कर सकते हैं । अच्छी तरह से नीचे तनाव क्षेत्र डिजिटल छवि सहसंबंध का उपयोग अधिक विस्तार में विशेषता हो सकती है । इस तकनीक को अच्छी तरह के आधार पर एक धब्बेदार पैटर्न छिड़काव शामिल है और फिर यह विकृति के दौरान उच्च गति पर इमेजिंग । वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर तो धब्बेदार पैटर्न के विकास पर नज़र रखने से छवि में हर बिंदु पर तनाव यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल hiPSCNs में एक बहुआयामी, नैदानिक प्रासंगिक, खिंचाव चोट phenotype पैदा करता है । कोशिका मृत्यु, neurite अध कि, और neurite मनके सभी अच्छी तरह से प्रलेखित sequelae है मानव और पशु मॉडल में TBI के15। इस मॉडल में सफलता की कुंजी स्थापित करने और स्वस्थ संस्कृतियों को बनाए रखने है । सामांयतया, एक सेल संस्कृति पारंपरिक कठोर प्लेटों के साथ विकसित प्रोटोकॉल स्केलेबल थाली संस्कृति के लिए एक सार्थक प्रारंभिक बिंदु है । हालांकि, संभावना है कि सवाल में कोशिकाओं सिलिकॉन पर अलग ढंग से प्रतिक्रिया कर सकते है हमेशा विचार किया जाना चाहिए । यह विशेष रूप से hiPSCNs के सच है, जो बहुत संस्कृति की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं । सेल घनत्व और laminin एकाग्रता के अनुकूलन के कुछ उदाहरण प्रतिनिधि परिणाम खंड (चित्रा 3, चित्रा 4) में आपूर्ति कर रहे हैं । प्लाज्मा उपचार के साथ सिलिकॉन के सक्रियकरण महत्वपूर्ण है । सिलिकॉन hydrophobic और प्रतिक्रियात्मक है; अपने प्राकृतिक राज्य में, यह laminin या अंय अणुओं को सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल नहीं बांध जाएगा । प्लाज्मा उपचार हाइड्रोफिलिक सतह प्रदान करता है और सक्रिय समूहों को उजागर करता है । ये परिवर्तन आसंजन अणुओं सिलिकॉन से बाइंड और सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए अनुमति देते हैं । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्लाज्मा उपचार प्रभाव एक मिनट के भीतर फैलने जब तक सतह तरल में जलमग्न है, और इतनी प्रक्रियाओं है कि सक्रिय सतह सुखाने शामिल के रूप में जल्दी संभव के रूप में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । एक सरल तरीका है अगर प्लाज्मा उपचार के प्रभाव से पहना है की जांच करने के लिए सतह पर पानी की एक छोटी बूंद जगह है । अनुपचारित सिलिकॉन पर, छोटी बूंद को मनका जबकि प्लाज्मा इलाज सिलिकॉन पर होगा, यह बाहर फैल जाएगा । hiPSCNs है कि हम इस्तेमाल के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता की सिफारिश की बजाय पूर्व कोटिंग सेल निलंबन के साथ laminin जोड़ने । इस प्रोटोकॉल ने इस approach को सफलतापूर्वक शामिल किया है । जबकि विभाजन, सिद्धांत रूप में, खुले स्रोत सॉफ्टवेयर या सामांय प्रयोजन प्रोग्रामिंग भाषाओं, इन उपकरणों के साथ प्रवीणता के एक उच्च डिग्री के साथ पूरा किया जा सकता है अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । Neurites अक्सर पृष्ठभूमि संकेत से अंतर करने के लिए मुश्किल है क्योंकि वे इतना पतला कर रहे हैं । इसलिए, हम वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर विभाजन और न्यूरॉन्स के ठहराव के लिए समर्पित मॉड्यूल के साथ उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी कंपनियों द्वारा वितरित के उपयोग की सिफारिश, अगर वे उपलब्ध हैं. यहां तक कि वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ, यह विभाजन की छवियों का निर्यात करने के लिए नेत्रहीन सटीकता की पुष्टि बुद्धिमान है ।

पारंपरिक, कठोर प्लेट के साथ काम करने के लिए तुलना में खिंचाव प्लेटों में काम करने के साथ जुड़े कुछ सीमाएं हैं । स्केलेबल प्लेट हवा उद्देश्यों के साथ सामान्य रूप में imaged किया जा सकता है । हालांकि, विसर्जन उद्देश्यों के साथ इमेजिंग बहुत मुश्किल है । लेंस तेल सिलिकॉन नुकसान हो सकता है । इसके अतिरिक्त, उद्देश्य सिलिकॉन झिल्ली पर दबाव डालती है क्योंकि यह ऊपर की ओर घूमती है । यह दबाव झिल्ली को लंबवत विस्थापित कर देता है, जिससे नमूना को ध्यान में लाना कठिन हो जाता है. सिलिकॉन झिल्ली वर्तमान में प्लेटें गढ़े में इस्तेमाल लगभग २५० µm मोटी हैं । यह मोटाई कई उच्च शक्ति, विसर्जन उद्देश्यों की फोकल दूरी से अधिक है । विशेष देखभाल के लिए माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक संकुचन को प्राप्त करने के लिए clamping से पहले पूरी तरह से फ्लैट झिल्ली बिछाने के लिए लिया जाना चाहिए । फोकस सिस्टम कुछ हद तक समाप्त थाली के संकुचन में विचलन के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं । प्रोटोकॉल के भविष्य के संस्करणों पूर्व तनाव झिल्ली हो सकता है पहले यह थाली शीर्ष करने के लिए बंधुआ है सपाटता सुनिश्चित करते हैं । चिपकने वाला मुक्त प्रक्रिया के लिए सिलिकॉन झिल्ली बांड शीर्ष14 के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण ताकत माना जाता है । यह चिपकने वाला से neurotoxicity के जोखिम के रूप में अच्छी तरह से चिपकने वाली परत की गैर-समान मोटाई के कारण संकुचन में किसी भी विचलन से समाप्त होता है ।

मल्टी इलेक्ट्रोड arrays सामांयतः hiPSCNs के साथ प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए उनकी परिपक्वता और कार्यक्षमता का आकलन कर रहे हैं । क्योंकि सेल संस्कृति सब्सट्रेट कठोर है दुर्भाग्य से, इन पद्धतियों इस मॉडल के साथ असंगत हैं । यह एक स्केलेबल बहु इलेक्ट्रोड सरणी बनाने के लिए संभव है, हालांकि यह अब तक केवल एक अच्छी तरह से प्रारूप16,17में प्रदर्शन किया गया है । ध्यान दें कि इंडेंटर को इंडेंटर ब्लॉक से व्यक्तिगत रूप से निकाला जा सकता है ताकि कुछ कुओं को इंडेंट न किया जा सके और शम्स के रूप में कार्य कर सकें. इंडेंटेशन निकालने से इंडेंटेशन रोकता है लेकिन यांत्रिक लोडिंग को पूरी तरह से समाप्त नहीं करता है क्योंकि अवस्था के चलते ही कुएं में द्रव का अभी भी inertial गति होता है । यह प्लेटों में कुओं के लिए इन कुओं की तुलना करने लायक है कि कभी भी द्रव गति के किसी रोग के प्रभाव को मापने के लिए मंच गति के अधीन थे । इसके अलावा, ब्लॉक में इंडेंटर्स की सरणी bisymmetric होना चाहिए (सामने से पीठ और पक्ष की ओर सममित) । इस एहतियात यह सुनिश्चित करता है कि थाली इंडेंट के दौरान समान रूप से भरी हुई है, ताकि चरण बग़ल में झुका नहीं और छड़ को उनके बीयरिंगों में बांधने में परेशानी न हो ।

neurotrauma में चिकित्सकीय नवाचार के लिए प्राथमिक चुनौतियों में से एक जटिलता और हालत की विविधता है । आघात केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में हर कोशिका प्रकार के लिए बहु-मोडल तनाव एक साथ लागू होता है । न्यूरॉन्स मज़बूती से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) से उत्पन्न किया गया है और अब व्यापक रूप से वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं. नवाचार जल्दी इस क्षेत्र में आगे बढ़ रहा है, और अंय astrocytes18 और microglia19 के रूप में तंत्रिका कोशिका प्रकार भी hiPSCs से प्राप्त किया जा रहा है । यह जल्द ही सेल को अलग करने के लिए संभव हो सकता है इन विट्रो में आघात करने के लिए इन सेल प्रकार के प्रत्येक के स्वायत्त प्रतिक्रियाओं और फिर सह संस्कृति अलग सेल प्रकार समझने के लिए कि कैसे वे आघात के बाद संवाद. इस तरह, यह अंततः एक मानव प्रणाली में अच्छी तरह से इसे समझने के लिए नीचे से नैदानिक चुनौती बहलाना संभव हो सकता है । यह दृष्टिकोण पारंपरिक मूषक मॉडल पर निर्भर दृष्टिकोण से अलग है और उपंयास अंतर्दृष्टि उत्पंन करने की क्षमता है कि इस आम, विनाशकारी, और असभ्य हालत के लिए पहले चिकित्सा के लिए सीसा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21NS098129) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित है । हम SueSan चेन, जोनाथन टैन, कोर्टनी Cavanaugh, शि काई एनजी और फेंग युआन बु, जो डिजाइन और एक संरचना के लिए इस पांडुलिपि में वर्णित उच्च गति इमेजिंग प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया रोशनी का समर्थन करने के लिए बनाया से उत्कृष्ट तकनीकी सहायता स्वीकार करना चाहते है .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

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References

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