Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

Neuroscience
 

Summary

Hier presenteren we een methode voor een menselijke in vitro model van stretch letsel in een 96-Wells-formaat op een tijdschaal die relevant zijn voor de invloed van trauma's. Het gaat hierbij om methoden voor het fabriceren van rekbare platen, kwantificeren van de mechanische belediging, kweken en verwonden van cellen, imaging en hoog inhoudsanalyse te kwantificeren van de schade.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijke klinische uitdaging met hoge morbiditeit en mortaliteit. Ondanks tientallen jaren van pre-klinisch onderzoek, zijn geen bewezen therapie voor TBI ontwikkeld. Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor preklinische neurotrauma onderzoek bedoeld als aanvulling op bestaande preklinische modellen. Het introduceert menselijke pathofysiologie door het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen (hiPSCNs). Het bereikt laden pulse duur gelijk aan de duur van het laden van klinische gesloten hoofd effect schade. Er werken een 96-Wells-indeling die vergemakkelijkt hoge doorvoer experimenten en maakt efficiënt gebruik van dure cellen en cultuur reagentia. Siliconen membranen worden eerst behandeld Schakel neurotoxische niet uitgehard polymeer en vervolgens gebonden aan commerciële 96-wells-plaat organen maken rekbare 96-wells-platen. Een op maat gemaakte apparaat wordt gebruikt voor het laten inspringen van sommige of alle van de goed bodems van onder, inducerende equibiaxial mechanische spanning die mechanisch cellen in cultuur in de putjes verwondt. De relatie tussen inspringing diepte en mechanische spanning wordt bepaald empirisch met hoge snelheid videografie van goed bodems tijdens de inspringing. Cellen, met inbegrip van hiPSCNs, kunnen worden gekweekt op deze silicone membranen met behulp van aangepaste versies van de protocollen van de cultuur van de conventionele cel. Fluorescerende microscopische beelden van celculturen worden verworven en geanalyseerd na blessure in een semi-geautomatiseerde wijze te kwantificeren van het niveau van het letsel in elk putje. Het model gepresenteerd is geoptimaliseerd voor hiPSCNs maar kan in theorie worden toegepast op andere celtypes.

Introduction

TBI is een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de Verenigde Staten, waardoor ongeveer 52.000 doden en 275.000 hospitalisaties elke jaar1. Meer dan 30 klinische proeven van kandidaat-therapeutics voor TBI zijn uitgevoerd zonder een enkele succes2. Deze uniforme mislukking suggereert dat processen van de mens-specifieke menselijke TBI van de pathofysiologie waargenomen in veelgebruikte preklinische knaagdier modellen scheiden.

De komst van hiPSCNs heeft een mogelijkheid om te studeren neurotrauma in een menselijke in vitro model gemaakt. Drug screening met hiPSCN-gebaseerde modellen kan leveren resultaten die zijn meer voorspellende van klinische succes dan modellen knaagdier cellen in dienst. Ook kunnen hiPSCNs genetisch worden gemanipuleerd om te isoleren en bestuderen van het effect van individuele menselijke genetische varianten op pathologie3.

De methode wordt beschreven in dit manuscript is ontworpen om de unieke voordelen van de hiPSCN gebaseerde ziekte modelleren naar neurotrauma. In vitro stretch letsel modellen van neurotrauma zijn gevestigde4,5,6 met primaire knaagdier cellen en cellijnen van menselijke neurale kanker. De meeste van deze modellen genereren stretch door pneumatisch laden een silicone-membraan. Deze aanpak is effectief in een goed formaat, maar moeilijk te schalen tot een multi goed formaat7heeft bewezen. Dientengevolge, is er nooit geweest een hoge doorvoersnelheid scherm voor agenten voor de behandeling van stretch gewonde neuronen.

In dit model, strekt het membraan zich als gevolg van inspringen ten opzichte van onder met een stijve indenter. Deze aanpak is herhaaldelijk aangetoond dat het genereren van klinisch relevante pathologie in vitro in één goed systemen8,9,10. Ons recente werk heeft aangetoond dat het gemakkelijk schalen omhoog naar een 96-Wells-indeling met behoud van impuls duur over de volgorde van tientallen milliseconden11, die nu domein van hoofd impact gebeurtenissen12,13 gesloten.

In het kort zijn de belangrijkste voordelen van dit letsel in vitro model de 96-Wells-indeling, het gebruik van hiPSCNs en het klinisch relevante tijdsdomein van de belediging.

Protocol

1. siliconen ontgifting

  1. Snijd 254 µm dik, 30.48 x 30.48 cm silicone membranen in 7,5 cm x 11 cm rechthoeken met een scheermesje en een acryl sjabloon. 10 rechthoekige membranen kunnen worden gemaakt met elk blad. Sparen het document dat wordt geleverd met de siliconen.
  2. Plaats de membranen in een bak vol gedeïoniseerd (DI) water met glaswerk zeep. Één tegelijk, schrobben de membranen krachtig met gehandschoende vingertoppen voor ten minste 20 s of totdat ingezeept.
  3. Spoel de membranen onder stromend DI water totdat de lathered zeep zichtbaar is verwijderd. Leg de membranen op het papier (uit hun verpakking) en de autoclaaf op een cyclus van de zwaartekracht.
  4. Geniet elke siliconen membraan in 250 mL 70% ethanol per membraan op een roteerschudapparaat op 60 rpm voor 24 h. gebruik een container gemaakt van een materiaal dat niet met ethanol, zoals polypropyleen reageert.
    1. Als meer dan één membraan is geplaatst in een enkele bin, of als de membranen vasthouden aan de onderkant van de bak, scheiden de membranen van hun omgeving met plastic pipet tips en Pipetteer tip rekken.
  5. De siliconen membranen met gehandschoende handen overbrengen in 250 mL DI water per membraan en geniet op de roteerschudapparaat voor 48u op 60 rpm.
  6. Leg de membranen terug op het papier en de plaats in een oven glaswerk 93 ° C gedurende 4 uur.
  7. Bewaar de membranen op het papier, in een schone en droge plaats, bedekt met een ander vel papier om hen te beschermen tegen stof.

2. plaat Fabrication

  1. Plasma behandelen een top 96-wells-plaat met een 200 W plasma reiniger (Zie Tabel of Materials) voor 60 s op hoog vermogen, plaatsen van het bottom-side-up binnen het plasma reiniger. Controleer voor een paarse gloed zichtbaar door het venster van de zaal, die aangeeft dat een effectieve plasma heeft gevormd. Deze hechting techniek is aangepast van Sunkara et al. 14
  2. Binnen 60 s, plaats de bovenkant van de plaat in 200 mL van 1,5% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) in DI water gedurende 20 min, bodem-side-down. Deze oplossing is instabiel: bereiden het niet meer dan 60 s vóór invoering van de plaat.
    Let op: Met APTES werken in een zuurkast.
  3. Plasma behandelen een uitgepakte siliconen membraan in het plasma reiniger voor 60 s op hoog vermogen. De plasma behandeling tijd zodanig dat deze niet meer dan 5 min voor het einde van de periode van de 20 min in stap 2.2 eindigt.
  4. Gebruik pincet om de positie van de behandeld plasmamembraan bovenop een 7,5 x 11 cm2 perkament papier rechthoek. Hiermee lijnt u een 7,5 cm x 11 cm x 0.5 cm aluminium plaat op het onderste gedeelte van de plaat fabricage klem. Hiermee lijnt u de silicone membraan en perkament papier op de aluminium plaat met pincet.
    Opmerking: Computer aided design (CAD)-bestanden voor dit apparaat vindt u in de aanvullende materialen als een aanvullende codebestand ' Press sterven - generieke 3D. STAP '. De bijbehorende stuklijst wordt geleverd in aanvullende tabel 1: aangepaste ingebouwde apparaten - BOM.xlsx.
  5. Verwijder de toppen van de plaat uit het APTES-bad en overtollige oplossing afschudden. Duik in een waterbad 200 mL DI voor 5 s en schud uit overtollig water. Duik in een waterbad verschillende 200 mL DI voor 5 s en schud uit overtollig water. Vervang het water in deze baden voordat een andere plaat bovenkant dompelen.
  6. Gebruik gecomprimeerde lucht volledig drogen de top plaat.
  7. Plaats de bovenkant van de plaat in het bovenste gedeelte van de plaat fabricage klem. Zachtjes sluiten de plaat fabricage klem om druk op de plaat boven- en siliconen samen. Klem voor ten minste 1 uur.
  8. Laat de plaat om te genezen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur vóór gebruik, beschermd tegen stof.

3. het uitrekken van een plaat

  1. Maak de indenters schoon.
    Opmerking: Zie aanvullende figuur 1.
    1. Bereiden een 60 W Bad-stijl ultrasoonapparaat met DI water op kamertemperatuur.
    2. Steun het indenter blok boven het ultrasoonapparaat bad, omgekeerd zodat alleen de toppen van de indenters zijn ondergedompeld tot een diepte van ten minste 1 mm. Bewerk ultrasone trillingen ten van de indenters voor 8 min op 42 kHz.
    3. Föhnen is de indenters met perslucht.
  2. Hiermee lijnt u het indenter blok.
    1. Plaats een camera met een live-feed boven het stretching apparaat zodat het kijkt neer op de indenter array. Focus op de toppen van de indenters.
      Opmerking: De beschreven in sectie 4, "Karakteriseren membraan Stretch," opstelling is één mogelijke camera setup voor deze taak.
    2. Beveiligen van een plaat op het podium van het schade-apparaat met behulp van de etappe klemmen (Figuur 1) en een licht koepel op het apparaat plaatst.
      Opmerking: Zie de Tabel van materialen voor de software van de controle van het instrument.
    3. Start de software van de controle van het instrument door te klikken op de software-pictogram op het bureaublad van de computer die het letsel-apparaat bestuurt. Voer het "in_vitro_neurotrauma.lvproj"-project door erop te klikken in het venster van de lancering. Van het project-venster, start de controle van de beweging en positie tracker virtuele instrumenten (VIs), die zijn naam 'motion_control.vi' en 'position_tracker.vi', respectievelijk door te dubbelklikken op hen.
    4. Sluit de kooi rond het letsel-apparaat. Druk op de '' pijlknop in de linker bovenhoek van de controle van de beweging VI te lopen van de VI en klik op 'In de buurt van Bottom' te verlagen van de etappe naar binnen 2 mm van contact met de indenters. Klik op de 'Stop' knop om te stoppen met de VI.
      Let op: Houd handen vrij van de brancard bij het bewerken van de camera in de kooi. De kooi moet voorzien zijn van een deur-switch die macht aan het stretching apparaat levert alleen wanneer de deur van de kooi is gesloten.
    5. In het project-venster, klik met de rechtermuisknop op 'As 1'. Klik op 'Interactieve Test Panel'. In het venster dat wordt geopend, die de stap-grootte tot 50 µm '500' eenheden invoeren in het veld 'De positie van het doel'.
    6. Klik op de groene 'Ga' knop aan de onderkant van het venster 'Interactieve Test Panel' herhaaldelijk tot de plaat eerst contact maakt met een indenters. Controleer contact op het live beeld weergegeven door de camera. Opmerking de verticale fase positie gerapporteerd in de linkerbovenhoek van het venster 'Interactieve Test Panel'; Dit is de eerste contact positie.
    7. Lager (zoals beschreven in stap 3.2.6) verder totdat elke goed heeft contact met de indenters. Indien nodig, beweeg de camera om te zien de hele plaat en omhoog verplaatsen in het werkgebied (het opgeven van een negatieve 'doelpositie') en naar beneden. Opmerking de verticale fase positie gerapporteerd in de linkerbovenhoek van het venster wanneer alle berichten in contact (dit is de volledige contact positie).
    8. Opmerking het verschil tussen het eerste contact en volledige contact posities. Sluit de 'interactieve Test Panel'. Uitvoeren van de 'motion control VI' (zie stap 3.2.4) en klik op 'Top' aan de orde stellen van het werkgebied. Stop de regeltechniek VI met de "Stop" knop.
    9. Zodra het podium aan de bovenkant van zijn reizen, open de deur is naar het apparaat deactiveren. Pas de stelschroeven op de hoeken van het indenter blok. Draai de stelschroef op de hoek die contact eerste, lager en draai de tegenovergestelde schroef te verhogen van de hoek die contact laatste.
    10. Herhaal het proces voor het verlagen van het werkgebied totdat de plaat contact op met het indenters, inspectie van de contact beelden voor tilt, het verhogen van het podium, en aan te passen (step, 3.2.9) de indenter blokkeren. Als de fase en blok worden uitgelijnd, zorgt voor alle indenters in één keer contact.
    11. Open de deur als u wilt uitschakelen van het apparaat. Steek de tie-down bouten in hun gaten op het indenter blok en draai ze. Controleer of het blok niveau met de schroeven van de stropdas-down in plaats (stappen 3.2.4-3.2.8). Neem nota van het standpunt van de etappe gerapporteerd door de 'interactieve Test Panel' wanneer de plaat maakt contact. Dit zal de nulpositie voor inspringing experimenten.
  3. Smeer de indenters.
    1. Als de indenter block net opgezet is en heeft nog niet gesmeerd, schoon een massief rubber pad (7,5 cm x 11 cm x 1.5 mm) en een zachte, gesloten-cel schuim-rubber pad (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) met een doekje ethanol doordrenkte lab. Laat ze in de lucht droog.
    2. Doordrenk een veeg lab in maïsolie en verspreid het over de massief rubber aanvullen tot een saai glans.
    3. Plaats de pad schuim op de massief rubber pad olie overzetten naar de pad van schuim. Plaats een 7,5 cm x 11 cm x 0.5 cm aluminium plaat op de top van het schuim stootkussen en laad het met een gewicht van de ballast van ongeveer 360 g (bijvoorbeeld6 conische buizen geladen met 45 mL water elke) om te zorgen voor consistente overdracht van olie van de massief rubber pad naar de pad van schuim. Toestaan van 10 s voor de olie overzetten naar de pad van schuimrubber.
    4. Verplaats de schuimrubber pad op de indenter array. Plaats de aluminium plaat en het gewicht van de ballast op de top van te zorgen voor consistente overdracht van de olie aan de toppen van de indenters. Toestaan van 10 s voor de olie over te dragen aan de indenters.
    5. Als geen plaat heeft zijn uitgerekt sinds het indenter blok opgericht en gesmeerd voor de eerste keer, een test-plaat rekken voordat u begint met het experiment.
      Opmerking: Dit zal verhinderen strijdigheid tussen de eerste stretch en latere stukken verstorende van het experiment. Herhaal voor latere stukken, alleen stappen 3.3.2-3.3.5 vóór elke stretch.
  4. Het rekken van een plaat.
    1. Smeer de indenters zoals beschreven in stap 3.3.
    2. Beveilig de plaat op het podium van het schade-apparaat met de etappe-klemmen. Als steriliteit vereist is, stelt u de positie van het deksel om de plaat zonder bloot van het oppervlak van de cultuur in de kamer lucht te veilig te stellen.
    3. Verlagen van de etappe naar de nul-positie met behulp van de '-regeltechniek VI' (Zie stappen 3.2.4-3.2.6); nul-positie wordt bepaald tijdens stap 3.2.
    4. Wijzigen van de naam van het bestand in het "bestandspad"-veld in de 'positie tracking VI' naar een unieke bestandsnaam, voert u het met de '' pijlknop in de linker bovenhoek van dat venster.
    5. De diepte en de duur van inspringing instellen (meestal 1-4 mm en 30 ms, respectievelijk, maximale diepte 5 mm, minimale duur 15 ms) in de 'Schade (mm)' en ' letsel (ms)' duurvelden in de 'beweging control panel VI' door op velden te klikken en te typen in de gewenste waarden.
    6. Start van de 'beweging control panel VI' en klik op 'Injure' laten inspringen van de plaat.
    7. Verplaats de etappe naar de top van zijn reizen door te klikken op 'Top'. Dan stoppen de VI met de 'Stop' knop en het letsel apparaat deactiveren door het openen van de deur.
    8. Controleer de geschiedenis van de verplaatsing van de etappe gepresenteerd in de 'positie tracker VI' om te bevestigen dat de opgegeven maximale waterverplaatsing werd toegepast. Klik met de rechtermuisknop op de grafiek en klik op 'Exporteer naar Excel'. Klik op ' bestand | Opslaan ' over het opslaan van de gegevens.

4. karakterisering van membraan Stretch

  1. Verf de uitsparing aan de bovenkant van elke indenter wit tot het bieden van een hoog contrast achtergrond voor hoge snelheid videografie.
    Let op: Verf niet de randen van de indenters waar ze maken contact met platen.
  2. 3D afdrukken met poly(lactic acid) (PLA), of anders fabriceren, een cilindrische stempel met een stip in elk putje maken. Controleer de cilinder 5,9 mm in diameter en 12.2 mm hoog, met een cilindrische uitsteeksel 1,5 mm diameter en 1,0 mm hoog gecentreerde bovenop.
    Opmerking: Een 3D-printbaar model ' stempel. STL' is beschikbaar als een aanvullende bestand.
  3. Plasma behandelen de plaat recht-side-up om te activeren het celoppervlak cultuur silicone in de putten voor 60 s, zoals vermeld in stap 2.1.
  4. Plaats de plaat op een pad van rubber of ander zacht oppervlak. De kleine uitstulping op de stamp Prime (zie stap 4.2) met inkt uit een permanente marker pen. De stempel in de put te beproeven invoegen en tik om te zorgen voor goede overdracht van inkt. Prime de stempel vóór elke goed.
  5. Uitlijnen van het indenter blok en smeer de indenters van het schade-apparaat (zie stap 3.2-3.3). De Klemplaat op het podium van het schade-apparaat. Plaats een diffuse axiale licht boven het letsel-apparaat.
  6. Opzetten van een high-speed camera op een boom staan over het letsel apparaat, recht naar beneden, geconfronteerd met de lens ingesteld op de kleinste genummerde f-stop, en zet hem aan. Start de camerasoftware op de computer aangesloten op de camera. In de frame rate waterdruppel waas spijskaart daling Selecteer 2.000 frames per seconde, en in de sluiter onderaan menu, selecteer de snelste belichtingstijd die hoog contrast beelden opbrengsten. Centrum over de gestippelde putten.
    1. Plaats de camera zodanig dat het gezichtsveld 12 putjes in een raster van 3 x 4 bevat.
      Opmerking: Deze gezichtsveld biedt een optimale compromis tussen de doorvoersnelheid en resolutie voor een afbeelding van 1280 × 1024.
  7. Verlagen van de plaat naar het nul-punt (Zie stappen 3.2.4-3.2.6). Één-klik op de record knop op de software van de camera, zodat er staat 'trigger in'. Starten de positie tracker VI (stap 3.4.4).
  8. Het licht diffuus axiale inschakelen. Streepje de plaat zoals beschreven in stap 3.4.6.
  9. Het licht diffuus axiale uitschakelen.
  10. Op de camera besturingscomputer, vind het 30-40 ms-venster van de opname waarin de inspringing plaatsvindt: Sleep van het begin en einde pijlen in de bar van de high-speed video af te spelen in de software van de camera. Klik op opslaan, instellen van de naam in het veld 'Bestandsnaam', selecteer 'TIFF' in het 'Formaat'-veld en klik op 'Opslaan'.
    1. Kijk door de. TIF-bestanden voor afbeeldingen van de minst uitgerekt (begin) en meest uitgerekt (piek inspringing) valt bestuurlijk.
    2. Gebruiken voor het meten van de hoogte en de breedte van de stippen in beide afbeeldingen, Fiji te openen de beelden van de minst en de piek stretch side-by-side. Met behulp van de standaard rechthoekige selectietool, klik en sleep een vak rond een stip in het ieder geval stretch afbeelding te tekenen. Meten van de hoogte en breedte met ' analyseren | Maatregel '.
    3. Herhaal deze stappen voor de stip in de zelfde put op de strekmetaal afbeelding van piek. Herhaal voor de rest van de putten.
  11. De Lagrangiaanse-stam in de x - en y -richtingen als volgt berekenen:
    Equation 1
    Equation 2
    Opmerking: Hier, Exx is de Lagrangiaan stam in de x -richting EJJ is de Lagrangiaan stam in de richting y , X is de breedte van de stip, Y is de hoogte van de stip, f duidt het uiteindelijke beeld (dat wil zeggen, het beeld van de manier van inspringen piek) en ik duidt het eerste beeld (dat wil zeggen, de pre inspringing beeld). De twee gemiddelden om te bepalen van de spanning in dat goed.

5. plating de gekweekte cellen

  1. Autoclaaf de opslaglocaties en ballast gewichten die wordt gebruikt voor sterilisatie.
  2. Plasma behandelen de silicone-bodem platen recht-side-up voor 60 s (zie stap 2.1). Onmiddellijk dompelen de platen in steriele opslaglocaties met 70% ethanol gedurende 15 minuten.
  3. De platen in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in aparte steriele opslaglocaties voor 30 min. onderdompelen.
  4. De PBS de putjes gecombineerd. Alleen droge één plaat op een moment om te verhinderen dat de putten de plasma behandeling te verliezen.
    Let op: Silicone bottomed platen bieden minder tactiele feedback geven dan de stijve platen wanneer pipetteren en hebben meer kans op het puntje van een pipet blokkeren.
  5. Voeg 100 µL van 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (PLO) per putje aan de gesteriliseerde platen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Spoel de putjes tweemaal met 100 µL steriele PBS, verlaten de tweede wash de putten tot de celsuspensie is klaar.
  7. Verwijder de flacon voor hiPSCNs van vloeibare stikstof opslag via veiligheidshandschoenen en plaats op droog ijs. Snel vervoer van de ampul naar een waterbad 37 ° C en ontdooien voor precies 3 min. Niet swirl de flacon.
  8. In een steriele kap, moet u de inhoud van de flacon zacht overbrengen in een conische tube van 50 mL, met behulp van een serologische pipet 1 mL.
  9. Spoel de lege cryogene flacon met 1 mL van kamertemperatuur compleet onderhoud medium (MediaBase + supplement).
  10. Breng de 1 mL van de media in de buis 50 mL drop-wise op ongeveer één druppel per seconde. Swirl zachtjes de buis tijdens het toevoegen. 8 mL van kamertemperatuur compleet onderhoud medium aan de tube 50 mL ongeveer 2 druppels/s toevoegen.
  11. Cap de buis en omkeren 2 - 3 keer. Telt de cellen met een hemocytometer. Berekenen van het volume van de extra media moeten de celsuspensie tot 225.000 cellen/mL verdund.
  12. Pipetteer zachtjes de hoeveelheid media (berekend boven) in de buis van met behulp van serologische Pipetteer 25 mL celsuspensie.
  13. Voeg 10 µL van 1 mg/mL laminin voorraad per 1 mL celsuspensie met een 1.000 µL micropipet tot 10 µg/mL van laminin in de celsuspensie. Gecombineerd eens omhoog en omlaag met de tip gebruikt voor laminin, dan de buis cap en één keer omkeren van de buis.
  14. De PBS van de platen, één plaat tegelijk gecombineerd. Gebruik een meerkanaalspipet 100 µL celsuspensie van de hiPSCN toevoegen aan elk putje. De putten hebben een deel van de cultuur van 0.33 cm2, dus de celdichtheid per gebied 67,500 cellen/cm2 is.
  15. De platen rusten bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten na het zaaien ter bevordering van de bijlage. Om te voorkomen dat trillingen van de ventilator van steriele cultuur kap, plaatst u de overdekte platen op de lab-Bank. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2culturen.
  16. Het uitvoeren van een volledige media-verandering op 24u, bijvullen van de putjes met 200 µL van compleet onderhoud media. Het uitvoeren van een half media van 100 µL per putje elke 2-3 dagen wijzigen.

6. het verwonden van culturen

  1. Aanpassing van het indenter blok en vinden de nulpositie zoals beschreven in stap 3.2. Smeer de indenters zoals beschreven in stap 3.3.
  2. De bestandsnaam voor de geschiedenis van de verplaatsing in de 'positie tracker VI' (stap 3.4.4) instellen Instellen van de parameters van de schade in de 'motion control VI' (stap 3.4.5).
  3. Neem de plaat uit de incubator worden verwond en klem op het podium. Pas de positie van het deksel om de plaat zonder bloot van de culturen in de kamer lucht te veilig te stellen.
  4. Het verlagen van de plaat naar het nul-punt (stappen 3.2.4-3.2.6) met behulp van de 'motion control VI'. Start van de 'positie tracker VI' (stap 3.4.4).
  5. Gebruik de controle van verplaatsingen VI laten inspringen van de plaat (zoals beschreven in stap 3.4.6). Voor sham trajecten, moet u alleen deze stap overslaan.
  6. Het werkgebied terug naar de bovenkant van het bereik van de beweging (zie stap 3.4.7). De plaat terugkomen in de incubator.
  7. Inspecteren en sla de verplaatsing trace (zoals in stap 3.4.8).

7. microscopie

  1. Een 10 x kleurstofoplossing met 2 µg/mL Hoechst 33342 en 5 µg Mn/mL calceïne AM in onderhoud media voor te bereiden.
  2. Vlekken van elk goed met een piek van 20 µL van 10 x de kleurstofoplossing.
  3. Incubeer gedurende 15 min met vlek bij 37 ° C.
  4. Breed veld fluorescerende beelden te verwerven. Gebruik conventionele FITC en DAPI filter sets om het imago van de calceïne AM en Hoechst 33342 signalen, respectievelijk. Als de multi goed imaging volgorde meer dan 10 min duurt, plaatst u de plaat in een incubator fase top om de gezondheid van de culturen te behouden.
    Opmerking: Een 10 X, 0,30 NB lens biedt voldoende detail voor bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen en morfologie. Aanpassen winsten om ervoor te zorgen voor goede visualisatie van de neurites, zelfs als dit zorgt ervoor dat sommige verzadiging van de veel helderder soma.
  5. Gesegmenteerde afbeeldingen van levende cellen in het groene kanaal calceïne AM om soma en neurites te identificeren. Nucleaire beelden in het blauwe kanaal van Hoechst 33342 gebruiken om te helpen bij de identificatie van het soma.

Representative Results

De brancard apparaat is geschikt voor het verplaatsen van het podium herhaalbaar met pulse duur zo kort 10-15 ms afhankelijk van de amplitude van de pols (figuur 2A). De pulse amplitudes zijn zeer herhaalbare, maar de impulstijd varieert van ongeveer 1 ms tussen herhalingen. De amplitude van de werkelijke pulse afwijkt van de voorgeschreven pulse amplitude wanneer een groot aantal putten worden geladen, en de voorgeschreven amplitude hoog is (Zie figuur 2B). Als de amplitude van de fase-verschuiving is toegenomen dan 3 mm, de werkelijke verplaatsing amplitude steeds achterblijft bij de voorgeschreven verplaatsing amplitude (Zie figuur 2B). Zorgvuldige afstemming van het post-blok elimineert elke tendens van de membraan-stam in rijen of kolommen (figuur 2C). Op de 3.5 mm voorgeschreven stadium verplaatsing amplitude (3,3 mm werkelijke verplaatsing amplitude) met 52 putten ingesprongen, de gemiddelde Lagrangiaan stam over alle goed locaties was 0.451 (standaarddeviatie van middelen voor alle locaties = 0.051, gemiddelde van standaarddeviaties voor alle locaties = 0,065, n = 5 metingen per putje). Deze resultaten zijn hier gepresenteerd voor de volledigheid, hoewel sommigen van hen zijn reeds gerapporteerde11.

Een optimale, ongedeerd cultuur zal hebben weinig of geen klontjes meer dan 5 cellen. Neurites zullen individuele, lange, slanke en gebogen met weinig of geen teken van spanning of beading (figuur 3A). Onder ideale omstandigheden, de levensvatbaarheid van de culturen moet nauw benaderen de levensvatbaarheid die is opgegeven in het veiligheidsinformatieblad van de fabrikant (doorgaans 60-70%) en culturen op siliconen moeten lijken op die op conventionele rigide cultuur substraten ( onderhouden Figuur 3B). Neurites al kan dan niet zichtbaar op een laag vermogen helder veld Microscoop. Laminin concentratie en celdichtheid beide invloed culturen op basislijn en na blessure. Verhoging van de celdichtheid steeg het aantal en de grootte van de bosjes die gevormd in cultuur. Verhoging van de concentratie van laminin vaak tegengewerkt dit effect (figuur 3A). Echter, verhoging van de laminin concentratie te veel afgerond de gevoeligheid van de culturen tot schade (Figuur 4). De concentratie van de optimale laminin voor ongedeerd culturen was 50 µg/mL laminin (Figuur 3), maar de optimale scheiding tussen de schijnvertoning en strekken zich uit benadeelde bevolking werd verkregen op 10 µg/mL laminin (Figuur 4). Hogere concentraties van de laminin verlaagd de gevoeligheid van de culturen schade op korte tijd punten (Figuur 4), maar ook de levensvatbaarheid van de cellen van verbeterde basislijn op langere tijd punten (bijvoorbeeld7 dagen). Kortom loont het om het optimaliseren van de concentratie van de laminin voor elk experimenteel scenario.

Membraan stam, na letsel imaging tijdstip laminin concentratie en celdichtheid alle uitgeoefend een zeer statistisch significant belangrijkste effect op de lengte van de neurite per cel (ANOVA, p < 0,001). Het effect van membraan stam op neurite lengte per cel had zeer statistisch significante interacties met na letsel imaging tijd punt en laminin concentratie (ANOVA, p < 0.001) en een statistisch significant interactie met cel dichtheid (ANOVA, p < 0,05). Ook de celdichtheid imaging tijdstip, membraan stam, na schade, en laminin concentratie alle oefende een zeer statistisch significant belangrijkste effect op de levensvatbaarheid van de cellen (ANOVA, p < 0,001). Het effect van de druk van de membraan op de levensvatbaarheid van de cellen hadden een zeer statistisch significant interactie met de na letsel imaging tijdstip (ANOVA, p < 0.001) en een statistisch significant interactie met de celdichtheid (ANOVA, p < 0,05). Deze resultaten bewijzen dat timing, celdichtheid en concentratie van de laminin een belangrijke invloed op de relatie tussen de toegepaste belediging en experimentele resultaten, uitoefenen zodat elk zorgvuldig moet worden geoptimaliseerd.

Levensvatbaarheid van de laag cellen en beaded neurites, samen met onvolgroeide neurite groei, geven aan giftige kweekomstandigheden die uit onjuist voortvloeien kunnen bereid siliconen. Overslaan of verkorting van het water weken of de oven droog kunt laten geabsorbeerd ethanol of water in het membraan van, respectievelijk, die u kunt verspreiden in de media en het benadrukken van de cellen. Goed gewonde culturen zullen verminderd hebben levensvatbaarheid van de cellen, verkorte of ontbrekende neurites, gerolde neurites en neurites die blik strak of gespannen. Letsel kan induceren samendoen in celculturen die goed verspreide pre letsel waren. Grote bosjes kunnen verwarren de morfologische analyse. Voor een morfologische analyse moet zodanig dat merkbare veranderingen optreden, maar cellen nog steeds aanwezig zijn met enkele neurites zijn worden afgestemd op het niveau waarop de schade.

Figure 1
Figuur 1 : A label schematische van het letsel apparaat. Bovenaanzicht (A), (B) isometrische weergave, Vooraanzicht (C), (D) rechts-zijaanzicht. De bar van de schaal is van toepassing op de orthografische weergaven (A, B en D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Kinematica van de mechanische belediging. (A) de fase-verschuiving geschiedenissen over 5 pulsen op een aantal voorgeschreven amplitudes (voorgeschreven amplitudes worden vermeld in de legenda) wanneer geen putjes worden geladen. (B) de fase-verschuiving geschiedenissen over 10 pulsen op een aantal voorgeschreven amplitudes (voorgeschreven amplitudes worden vermeld in de legenda) wanneer 52 putten worden geladen. (C) de gemiddelde spanning in elk putje met fase verplaatsing amplitude van 3,3 mm (n = 5 metingen per putje, gemiddelde standaardfout per putje = 0.029). Merk op dat C4-F4 en C9-F9 zonder rek-controleputjes. Dit cijfer is gewijzigd van Sherman et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Optimalisatie van cultuur voorwaarden op siliconen. (A) het effect van verschillende cel dichtheid en laminin concentratie op hiPSCN culturen op siliconen. Samendoen neemt toe met toenemende celdichtheid en afnemende laminin concentratie. Cel dichtheid en laminin concentratie moet worden geoptimaliseerd om mono verspreide culturen. Mono verspreide culturen zijn minder kwetsbaar voor artefacten tijdens kwantificering. Merk op dat het dynamisch bereik is aangepast voor het optimaliseren van de visualisatie van de neurites. Dientengevolge, de veel helderder soma zijn verzadigd. Deze presentatie verdient de voorkeur om het alternatief van het optimaliseren van het dynamisch bereik ten opzichte van het soma, waardoor het veel dimmer neurites bijna onzichtbaar. De voorwaarde gemarkeerd door het Rode plein werd geacht optimaal voor in vitro stretch letsel experimenten. (B) onder optimale omstandigheden, culturen op siliconen membranen lijken aan culturen op conventionele stijve substraten. Het linker paneel toont hiPSCNs gekweekt op 33,750 cellen/cm2 met 3.3 µg/mL laminin op een conventionele, stijve 96-wells-plaat (de cel cultuur substraat is een Weefselkweek behandeld cyclische olefine co-polymeer). Het rechterpaneel reproduceert het deelvenster geschetst in het rood van (A). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Het letsel fenotype en haar afhankelijkheid van laminin concentratie. (A) gezonde cultuur, met behulp van 10 µg/mL laminin en 67,500 cellen/cm2. Neurites zijn lang met geen kralen. Er zijn enkele dode kernen, en weinig klontjes. (B) cultuur met behulp van dezelfde cultuur voorwaarden gewond met 57% piek spanning en beeld na 4 h. Neurites worden ingekort of ontbreekt, en sommige hebben kralen (aangegeven door de pijlen). Er zijn minder calceïne AM-positieve cellen en meer calceïne AM-negatief (d.w.z., dode) kernen. Schade is toegenomen samendoen onder de overlevende cellen. (C) 4 h na blessure, neurite lengte per cel afneemt met toenemende spanning op een wijze die hangt af van de concentratie van de laminin. (D) 4 h na blessure, levensvatbaarheid van de cellen afneemt met toenemende spanning op een wijze die hangt af van de concentratie van de laminin. (E) 24u na blessure, neurite lengte per cel afneemt met toenemende spanning op een wijze die hangt af van de concentratie van de laminin. (F) 24u na blessure, levensvatbaarheid van de cellen afneemt met toenemende spanning op een wijze die hangt af van de concentratie van de laminin. (n = 4 per bar, foutbalken zijn ± 1 standaardafwijking, schaal bars = 100 µm). Stam waarden zijn afgeleid van fase verplaatsing met behulp van gegevens uit een voorafgaande bekendmaking door Sherman et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: technische tekening van de indenter. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.

Aanvullende tabel 1: aangepaste ingebouwde apparaten. Klik hier om te downloaden van deze tabel.

Aanvullende tabel 2:96 goed plaat-loader Pinout schakelschema. Klik hier om te downloaden van deze tabel.

Aanvullende Code bestand 1: Computer aided design tekeningen van het letsel apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code File 2: Computer aided design tekeningen van de plaat fabricage klem. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 3: 3D-weergave van de geometrie van de stempel, geschikt voor gebruik met een 3D-printer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 4: SubVI voor MuStLiMo_si_initialize.vi, die een SubVI voor motion_control.vi is. Zet items in dialoogvensters in parameters voor beweging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 5: SubVI voor meerdere rechte lijn Moves_simplified.vi, die een SubVI voor motion_control.vi is. Zet items in dialoogvensters in parameters voor beweging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 6: SubVI voor position_tracker.vi. Teller tracks verplaatsing input van lineaire encoder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende codebestand 7: LabVIEW Project baseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 8: Top niveau VI die het apparaat beweegt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 9: SubVI voor motion_control.vi. Hiermee voert u de snelle verplaatsing die zich uitstrekt van de plaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 10: SubVI voor motion_control.vi. Hiermee voert u de langzame verplaatsing die het werkgebied verplaatst. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 11: SubVI voor motion_control.vi. Percelen van een geschiedenis van de (meestal ondergesampelde) verplaatsing in het Configuratiescherm van de motion_control.vi. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 12: Top niveau VI die de geschiedenis van de verplaatsing houdt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 13: bevat variabele2, die tussen motion_control.vi en position_tracker.vi communiceert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 14: Schematische voor printplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Code bestand 15: lay-out voor printplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De sleutel tot het verkrijgen van een consistente, biofidelic fenotype in dit model is het toepassen van een consistente biofidelic mechanische belediging. Dit model kan pulse duur zo kort 10-15 ms, die overeenkomen met de duur van de pols voor menselijk hoofd effecten volgens dode foetussen experimenten12,13genereren. De consistentie van deze belediging, hangt af van de uitlijning van de plaat met de indenter block en consistente smering van de indenters. Wanneer het indenter blok is goed uitgelijnd, is er geen trend in de toegepaste spanning over rijen of kolommen (figuur 2C). Een dunne laag smeermiddel maakt meestal minder wrijving dan een dikke laag en viskeuze vetten zijn niet aanbevolen omdat ze het silicone fout en de passage van licht tijdens microscopie belemmeren. De werkelijke etappe verplaatsing amplitude kan achterblijven aanzienlijk de voorgeschreven verplaatsing amplitude bij veel indenters worden gebruikt, en de voorgeschreven stadium verplaatsing amplitude is groot (> 3 mm). Terwijl de werkelijke verplaatsing kleiner dan de voorgeschreven verplaatsing bij grote amplitudes is, blijft het echter herhaalbare (figuur 2B). Daarom kunnen groot, werkelijke verplaatsingen amplitudes op betrouwbare wijze worden verkregen door een voorgeschreven waarde meer dan de gewenste waarde in te voeren. Verplaatsing amplitude zaken alleen omdat het een gemakkelijk opgenomen proxy voor de piek membraan stam, die meet direct de mechanische belediging die pathologie induceert. Daarom is de procedure voor het bepalen van de membraan stam uit fase verplaatsing kritische. Dit proces moet worden herhaald als een belangrijke wijzigingen worden aangebracht in het systeem die invloed hebben op de interactie tussen de plaat en de indenters, bijvoorbeeld als verschillende diameter indenters, verschillende indenter materialen of coatings of verschillende soorten siliconen Bottomed plaat worden gebruikt. Het proces van de heroriëntering van het indenter blok en het bepalen van de nulpositie moet aan het begin van elk experiment te worden herhaald. Een schematische voorstelling van het stretching apparaat is afgebeeld in Figuur 1. CAD modellen moet reproduceren het apparaat worden geleverd als aanvullende materialen: ' letsel apparaat - volledige montage - algemene 3D. STAP "; de bijbehorende stuklijst geboden alsaanvullende tabel 1: aangepaste ingebouwde apparaten - BOM.xlsx. Zie ook aanvullende tabel 2 96 goed plaat _loader - Pinout bedrading Diagram.xlsx, die beschrijft de bekabeling verbindingen die diverse elementen van de systemen verbinden. 'Interconnector_circuit_board.dip' beschrijft een Printplaat die interconnects de kabels.

Als het apparaat is ingeschakeld met de etappe in de buurt van het midden van zijn reizen, zal het werkgebied verplaatsen nadat het is nettoevoer onderbroken omdat het Openspringende. Wanneer de stroomvoorziening is hersteld, detecteert de feedback lus een groot verschil tussen de laatste bekende voorgeschreven positie en de werkelijke positie. Hierdoor wordt de fase plotseling te verplaatsen naar de positie toen het apparaat werd uitgeschakeld. Deze plotselinge beweging kan fouten veroorzaken in de uitvoer van de encoder, dus zorg moet worden genomen om uit te schakelen het apparaat alleen wanneer het in haar niet geactiveerde positie aan de bovenkant van haar reizen rust.

De fabricage-klem is ontworpen om de plaat lichaam en siliconen bodem samenbrengen op een wijze waarmee optimale hechting. Te dien einde, er zijn drie belangrijke functies in het ontwerp gepresenteerd in het aanvullende bestand ' Press sterven - generieke 3D. STAP '. Ten eerste, de klem plaat lichaam houder is parallel aan de onderkant van de siliconen. Als dit goed is gebouwd, vergt het geen aanpassing na de eerste installatie. Ten tweede, de laag schuimrubber in de klem biedt een kleine hoeveelheid naleving onder de plaat, als een volledig Star systeem zou theoretisch een plotselinge toename van nul klemkracht aan oneindige klemkracht ervaring toen de klem werd gesloten. De positie van de dwarsbalk en stelschroef van de klem zijn verstelbaar, zodat de afstand tussen de twee zijden van de klem kan worden verfijnd.

Alles moet worden gesteld om te zorgen voor een heldere, witte achtergrond achter de stip op de goed bodem tijdens stam karakterisering experimenten. Hoe beter het contrast in deze foto's, hoe makkelijker het zal zijn voor het automatiseren van het proces voor het meten van de hoogte en de breedte van de stip, die kan worden vervelend voor een menselijke exploitant een groot experiment te analyseren. High-Speed videografie van de bodem van een put in een 96-wells-plaat presenteert uitdagingen omdat de wanden van de put de neiging te werpen schaduw. Het gebruik van een koepel licht of diffuus axiale licht die zonder het verduisteren van de afbeelding langs de lijn van het zicht van de camera kan verlichten elimineert schaduwen of spiegelende reflectie die zou ontstaan met een conventionele lichtbron. De helderste licht bron moet worden gebruikt omdat heldere verlichting beelden kunt aan te schaffen met een korte belichtingstijd. Korte belichtingstijden minimaliseren bewegingsonscherpte. Upgraden van de lichtemitterende diodes (LED's) in het diffuse axiale licht kunt kortere belichtingstijden tijdens snelle video acquisitie. De LED's kunnen worden bijgewerkt door het openen van het diffuse axiale licht, verwijderen van de voorraad LEDs, montage 4 hoogvermogen LED arrays naar het vorige deelvenster met behulp van LEDs houders, hen verbinden met een Constantstroom voeding en elkaar zetten van het diffuse axiale licht (Zie tabel van Materialen voor catalogus getallen). Het nadeel van een upgrade van de LED's is dat de passief gekoelde LEDs op kunnen worden genomen voor meer dan een paar seconden te wijten aan het risico van oververhitting. Een ander licht is dus, nodig voor de aanpassing van de post blok en camera aanpassing.

De onderhavige methode kwantificeren membraan stam door het meten van de dilatatie van een dot gestempeld op het membraan is relatief ruw, maar het kan schaal omhoog aan meerdere putjes in een robuuste manier. Het veld van de spanning over de goed bodem kan gekarakteriseerd worden in meer detail met behulp van digitale beeld correlatie. Deze techniek gaat spuiten een gespikkelde patroon op de basis van de put en vervolgens imaging op hoge snelheid tijdens vervorming. Commerciële software kan vervolgens worden gebruikt om het kwantificeren stam op elk punt in de afbeelding door het bijhouden van de evolutie van de gespikkelde patroon.

Dit protocol produceert een veelzijdige, klinisch relevante, stretch letsel fenotype in hiPSCNs. Celdood, neurite degeneratie en neurite beading zijn allemaal goed gedocumenteerde gevolgen van TBI in mens en dier15modellen. De sleutel tot succes in dit model is tot oprichting van en het handhaven van gezonde culturen. In het algemeen, is een cel cultuur protocol ontwikkeld met conventionele stijve platen een waardevol uitgangspunt voor rekbare plaat cultuur. De mogelijkheid dat de cellen in kwestie anders op siliconen reageert moet echter altijd worden beschouwd. Dit geldt met name voor hiPSCNs, die zeer gevoelig voor cultuuromstandigheden zijn. Enkele voorbeelden van het optimaliseren van de cel dichtheid en laminin concentratie worden geleverd in de sectie Vertegenwoordiger resultaten (Figuur 3, Figuur 4). Activering van het silicone met plasma behandeling is van vitaal belang. Silicone is hydrofoob en onreactieve; in zijn natuurlijke staat, zal het niet binden aan laminin of andere moleculen gebruikt ter bevordering van de bijlage van de cel. Plasma behandeling maakt het oppervlak hydrofiele en reactieve groepen blootstelt. Deze wijzigingen toestaan celadhesie-moleculen te binden aan het silicone en cel bijlage te bevorderen. Het is belangrijk op te merken dat het plasma behandeling effect binnen enkele minuten, verdwijnt tenzij de oppervlakte is ondergedompeld in een vloeistof, en dus procedures die betrekking hebben op het geactiveerde oppervlak drogen zo snel mogelijk moeten worden uitgevoerd. Een eenvoudige manier om te controleren als het effect van plasma behandeling heeft versleten uit is om een druppel water op het oppervlak. Op onbehandelde siliconen, zal de druppel bead omhoog terwijl op plasma behandeld silicone, het wordt verspreid. Met de hiPSCNs die we gebruikt (Zie Tabel of Materials), de fabrikant raadt u aan de laminin met de celsuspensie in plaats van pre coating. Dit protocol heeft deze aanpak met succes verwerkt. Terwijl de segmentatie kan, in theorie, worden bereikt met open-sourcesoftware of algemene programmeertalen, is een hoge mate van vaardigheid met deze tools vereist om goede resultaten te verkrijgen. Neurites zijn vaak moeilijk te onderscheiden van achtergrond signaal omdat ze zo slank. Daarom raden we het gebruik voor commerciële softwaretools gedistribueerd door hoge inhoud microscopie bedrijven met specifieke modules voor segmentatie en kwantificering van neuronen, als ze beschikbaar zijn. Zelfs met commerciële software is het verstandig om afbeeldingen van de segmentatie visueel juistheid te exporteren.

Er zijn enkele beperkingen die zijn gekoppeld aan het werken in rekbare platen in vergelijking met het werken met conventionele, stijve platen. Elastische platen kunnen worden beeld als normaal met lucht-doelstellingen. Beeldbewerking met onderdompeling doelstellingen is echter zeer moeilijk. Lens olie kan schade aan de siliconen. Bovendien, uitoefent het doel druk op de silicone membraan als het beweegt naar boven. Deze druk verdringt het membraan verticaal, waardoor het moeilijk is om het monster in focus. De siliconen membranen die momenteel worden gebruikt in het fabriceren van de platen zijn ongeveer 250 µm dik. Deze dikte is groter dan de brandpuntsafstand van vele hoog vermogen, onderdompeling doelstellingen. Speciale zorg moet men zich leggen van de membranen perfect vlak voordat de klemmen om de vlakheid vereist voor microscopie. Autofocus-systemen kunnen compenseren voor afwijkingen in de vlakheid van de afgewerkte plaat tot op zekere hoogte. Toekomstige versies van het protocol kunnen vooraf het membraan spanning voordat het is gebonden aan de bovenkant van de plaat om vlakheid. De lijm-gratis procedure voor het verlijmen van het membraan silicone op de plaat boven14 wordt beschouwd als een belangrijke kracht van het huidige protocol. Het elimineert het risico van neurotoxiciteit van de lijm, alsmede afwijkingen in vlakheid als gevolg van de niet-uniforme dikte van de kleeflaag.

Multi elektrode matrices worden vaak gebruikt in experimenten met hiPSCNs om hun rijpheid en functionaliteit te beoordelen. Helaas, deze systemen zijn niet compatibel met dit model omdat de cel cultuur substraat stijf is. Het is mogelijk om te maken een rekbare multi elektrodenserie, hoewel dit is tot nu toe alleen aangetoond in één goed opmaken16,17. Merk op dat indenters kan afzonderlijk worden verwijderd uit het indenter blok zodat sommige putten niet inspringen en als shams dienen kunnen. Het verwijderen van de indenter voorkomt inspringing maar doet niet volledig elimineren mechanische laden omdat er nog steeds inertial beweging van de vloeistof in de putten, terwijl het werkgebied beweegt. Het is de moeite waard deze putten putjes in de platen die nooit onderworpen aan fase motie werden voor het meten van een pathologische invloed van vloeiende bewegingen te vergelijken. De matrix van indenters in het blok moet ook bisymmetric (symmetrische van voren naar achteren en links naar rechts). Deze voorzorgsmaatregel zorgt ervoor dat de plaat gelijkmatig tijdens de manier van inspringen, wordt geladen, zodat de fase niet zijdelings kantelen en de staven veroorzaken te binden in hun lagers.

Een van de belangrijkste uitdagingen voor therapeutische innovatie in neurotrauma is de complexiteit en heterogeniteit van de aandoening. Trauma geldt multimodale stress gelijktijdig voor elk celtype in het centrale zenuwstelsel. Neuronen betrouwbaar hebben verkregen uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) en zijn nu algemeen beschikbaar zijn van commerciële leveranciers. Innovatie op dit gebied snel verloopt, en andere neurale celtypes zoals astrocyten18 en microglia19 zijn ook afgeleid worden van hiPSCs. Het kan binnenkort mogelijk te isoleren van de cel-autonome reacties van elk van deze celtypes aan trauma in vitro en daarna aan verschillende celtypes co cultuur te begrijpen hoe ze communiceren na trauma. Op deze manier het uiteindelijk mogelijk om de klinische uitdaging van de bodem omhoog opnieuw grondig om het te begrijpen in een menselijke systeem. Deze aanpak verschilt van de conventionele benadering van zich het baseren op knaagdieren modellen en heeft het potentieel voor het genereren van nieuwe inzichten die tot de eerste therapieën voor deze gemeenschappelijke, verwoestende en hardnekkige aandoening leiden.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk is deels gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R21NS098129). Wij zouden willen erkennen van uitstekende technische bijstand uit SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng en Feng Yuan Bu, die ontworpen en gebouwd van een structuur ter ondersteuning van de lichten gebruikt tijdens hoge snelheid imaging experimenten beschreven in dit manuscript .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. (2010).
  2. Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15, (1), 1216-1236 (2014).
  3. Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14, (6), 781-795 (2014).
  4. Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19, (11), 4263-4269 (1999).
  5. Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21, (6), 1923-1930 (2001).
  6. Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21, (1), 61-72 (2004).
  7. Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28, (11), 2203-2218 (2011).
  8. Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150, (2), 192-201 (2006).
  9. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101, (2), 434-447 (2007).
  10. Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14, (3), 561-575 (2015).
  11. Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
  12. Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
  13. Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
  14. Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11, (5), 962-965 (2011).
  15. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
  16. Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48, (10), 945-954 (2010).
  17. Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103, (1), 499-510 (2010).
  18. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9, (2), 600-614 (2017).
  19. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22, (11), 1358-1367 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics