분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

Developmental Biology

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Summary

이 프로토콜 선물 소설 체 외에서 구슬 시험을 더 적절 하 게 vivo에서 pericytes를 통합 하 여 신생을 돋 아의 프로세스 모델. 이 수정 구슬 분석 결과를 내 피 세포와 신생에 대 한 중요 한 벽화 셀 간의 heterotypic 세포 상호 작용을 더 충실 하 게 정리를 수 있습니다.

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Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

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Abstract

신생 기존의 맥 관 구조에서 새로운 혈관의 성장 이며, embryogenesis 및 개발, 상처 치유, 종양 성장 및 전이를 포함 하 여 많은 생물학 과정 그리고 눈 및 심장 혈관 질병의 중요 한 구성 요소입니다. 신생의 생물학을 정리 하는 효과적인 생체 외에서 모델 필요 적절 하 게이 과정을 공부 하 고 새로운 치료 전략에 대 한 궁극적으로 대상이 될 수 있는 규제의 메커니즘을 식별 합니다. 비드 신생 분석 결과 이전 입증 되었습니다 내 피 돋 아의 여러 단계를 정리 생체 외에서. 그러나,이 분석 결과의 한계는 부족의 내 피-벽화 세포 상호 작용, 내 피 세포의 분자 및 phenotypic 규정 하는 열쇠는 vivo에서작동. 여기에서 주어진 프로토콜 구슬 신생 분석 결과에 벽화 셀의 설립에 대 한 방법론을 제시 하 고 돋 아 시험관중 내 피 세포와 pericytes의 단단한 협회를 보여줍니다. 프로토콜은 또한 효과적인 기계 론 적인 연구에 대 한 내 피 세포에 siRNA를 사용 하 여 대상 유전자의 입을 위한 방법론을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜 시험관에서 분석 결과 신생, 돋 아에 관련 된 다양 한 셀 형식 보다 적절 하 고 치료 평가 및의 소설 발견 더 순수-관련 플랫폼을 제공을 제공 하는 모두, 신생 규제의 메커니즘입니다.

Introduction

신생 적절 한 embryogenesis 및 상처 치유에 필수적 이며, 그것은 또한 암 진행1 및 관상 동맥 질환을 포함 하 여 수많은 질병에 주요 역할을 재생 합니다. 2 , 3 신생 정상적인 개발 중 발생 하는 방법을 그리고 pathologic 컨텍스트에서 활성화 하는 방법의 더 나은 이해 하는 데이 소설, 효과적인 치료제의 개발에 대 한 중요 합니다. 중요 한 단계와 비보에 신생에 관련 된 셀 형식을 정리 충실 한 생체 외에서 모델 더 나은 신생을 운전 하는 분자 메커니즘을 특성화 하 고 소설 발견을 연구원 허용 하는 데 필요한 내 피 규칙.

휴즈와 나카쓰 돋 아 비드 분석 결과 그들은 신생을 돋 아의 많은 알려진된 단계를 겪 습 증명을 최적화 했습니다. 4 , 5 여기에 제시 된 방법의 목적은 돋 아 내 피 세포 벽 세포의 paracrine 및 juxtracrine 역할에 통합 될 수 있도록 분석 결과에 perictyes를 통합 하 여 나카쓰와 휴즈에 의해 최적화 된 분석 결과 따라 구축 소설 신생 학문입니다. Pericytes는 벽 세포 세포를 유지 하는 가까운 신체 접촉 때문에 혈관 지하실 멤브레인에 포함 되는 그들의 내 피 세포와 그들의 역할에 의해 정의 되는. 6 Pericytes 및 내 피 세포에에서 관여 신호 노치를 포함 한 경로 통해 복잡 한 잡담 신호, 중앙 Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, 및 많은 다른 사람. 7 , 8 마우스 모델 결핍이 신호 경로에 embryogenesis, 가난한 혈관 개장에 선도에서 맥 관 구조 및 기능 장애 맥 관 구조 개발의 가난한 pericyte 범위를 보여 줍니다. 7 또한, pathologic 신생에 pericytes의 역할은 중요 하지만 때로는 아래의 감사. 예를 들어 종양 맥 관 구조의 고유 기능은 혈관은 더 많은 새, 미 숙 하 고 가난한 pericyte 적용으로 인해 기능 장애입니다. 9 그것은 제안 되었습니다 pericytes의 유무 극적으로 종양 혈관의 표현 형에 영향 하는 항 혈관 신생을 antitumor 치료 응답의 중요 한 중재자. 9 따라서, 더 완전 하 게 내 피 규제의 중요 한 메커니즘을 캡처의 열쇠는 생체 외에서 분석 실험에서 pericytes의 역할을 포함 하 여.

비록 많은 시험관 전 비보 분석 현재 신생 공부를 고용, 각각에 고려해 야 할 결점 있다. 일부 내 피 확산 등 내 피 마이그레이션 분석 실험, 지나치게 단순화 하 고 초점 조직 문화 플라스틱에 격리 된 환경에서 한 내 피 기능에. 10 다른 분석와 같은 Matrigel 관 형성 분석 결과,10 만이 분석 실험은 여전히 간소화 마이그레이션할 드 노 보 혈관 형성 내 피 세포의 기능에 더 많은 초점 더 많은 3 차원 (3D) 설정, 발생 기존의 맥 관 구조에서 돋 아와 반대로 구조. 또한,이 분석 실험의 벽 세포 유형 통합. Ex vivo 모델 링 대동맥 분석 결과 pericytes 호스트 기관에 통합 수행 하는 있지만 이러한 모델의 유전자 조작의 녹아웃 또는 유전자 변형 마우스 모델 생성의 필요성 때문에 훨씬 더 도전적인는 관심 경로 분석 결과 돋 아 비드 모델 내 피 돋 아, 확산, 마이그레이션, 그리고 3 차원 매트릭스에도 문 합 및 루멘 형성 하기 때문에 이상적 이다. 4 분석 결과 충실 하 게 돋 아, 내 피 세포 또는 더 많은 제어 설정에서 pericytes의 직접적인 유전 수정에 대 한 허용 하면서의 많은 다른 단계 기계적 평가 대 한 수 있습니다. 돋 아 구슬 포함 된 섬유 소 혈전 쉽게 고정, 스테인드, 고 수 돋 아;의 여러 단계에서 몇 군데 이 새싹이 돋 아의 실시간 이미지를 수행 하는 라이브 영상 실에 배치할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법론 공부 깊이 형질에 통해 신생의 기본 메커니즘 및 신생 중 활성화 통로의 철저 한 분석에 이상적입니다.

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Protocol

제 1 일:

1. 과도 Transfection 내 피 세포의

  1. 원하는 경우, 일시적인 transfection의 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 유전자 규제 oligonucleotides (예: 마이크로 RNAs 또는 작은 간섭 RNA (siRNA))에 따라 적절 한 lipofectamine 시 약을 사용 하 여 수행 제조 업체의 지침입니다.
    참고:이 프로토콜 역 transfections 사용자 지정 siRNA 시퀀스와 상업 transfection 시 약 (자료 표 참조)를 수행 하는 큰 성공을 했다. 저자는 다른 transfection 프로토콜 및 시 약이 분석이 결과 함께 테스트 하지. 나열 된 시 약을 사용 하 여 역방향 transfection에 대 한 단계는 다음과 같습니다.
  2. 동결 건조 된 reconstitute siRNAs 또는 microRNAs nuclease 무료 물에서 20 µ M의 농도에서.
  3. 다음 비율로 transfection 솔루션 확인: siRNA의 예측에 관한 9 µ L와 어떤 혈 청 자유로운 미디어의 1 mL.
  4. 솔루션을 선동 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어에 있습니다.
  5. Transfection 시 약의 18 µ L을 솔루션에 추가 하 고 선동.
  6. 하는 외피의 기간에 대 한 모든 10 ~ 15 분 해결책을 교 반 20-40 분 동안 실내 온도에 품 어 솔루션을 수 있습니다.
  7. Transfection 솔루션 잠복기 동안 HUVEC 세포 분리 솔루션 (예:Accutase)를 사용 하 여 분리 합니다. T175 플라스 크에 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 플라스 크를 씻고 세포 분리 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어.
  8. T175 플라스 크를 완전 한 미디어의 5 mL을 추가, 플라스 크와 3 분 1200 rpm에서 원심 분리기에서 세포 현 탁 액을 제거.
  9. 진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 EGM2에 mL 당 1 X 106 세포의 밀도에 셀 펠 릿 resuspend.
    참고:이 프로토콜 표준 성장 인자 총알 키트 추가 10% 포함 된 내 피 세포 성장 매체 (EGM2)를 사용 하 여 큰 성공을 왔다 FBS.
  10. Transfection 솔루션 잠복기 완료 되 면, 접시는 10 cm 접시 솔루션의 1 mL 고 위에 HUVEC 서 스 펜 션의 1 mL를 추가 합니다.
  11. 9 mL에 10 cm 접시에 최종 볼륨을가지고 완전 한 미디어의 추가 7 mL를 추가 합니다.
  12. 분석 결과에서 나중 단계에 사용할 수 있는 충분 한 세포는 되도록 각 transfection 조건에 대 한 셀의 가치가 두 개 이상의 10 cm 번호판을 확인 합니다.
    참고: 이러한 조건 20의 유전자 규정 oligonucleotide의 최종 작업 농도 귀 착될 nM. 저자는 60-80% 최저 관심의 그들의 목표에 대 한 유전자 발현의 결과를이 조건을 발견 했다. 다른 연구원은 그들의 실험적인 요구 transfection 조건 최적화 할 수 있습니다.
  13. SiRNA 단지 신선한 완전 한 미디어의 미디어 4-6 h 게시물 추가 교환 합니다.
    참고:이 프로토콜 통로 사용 하 여 개발 되었다 1 2 HUVEC.

주 2

2. 내 피 세포와 Microcarrier 구슬의 코팅

  1. PBS와 압력솥에 60000 구슬/mL의 농도에서 microcarrier 구슬 (예를 들어, Cytodex 3)을 다시 구성.
    참고: microcarrier 구슬 그램 당 약 3 x 106 구슬의 농도에 올. 약 60000 구슬/mL의 비드 밀도를 PBS의 mL 당 구슬의 20 밀리 그램의 비율로 구슬 reconstitute
  2. 약 수 원하는 번호의 라운드 바닥 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 완전 한 미디어의 1 mL 튜브합니다.
  3. 각 관 (구슬 솔루션 pipetting 이전 resuspended 잘 되도록 돌)으로 20 µ L microcarrier 구슬 서 스 펜 션의 플라스틱.
    참고: 있을 것입니다 가능성이 극적인 변화 주어진된 microcarrier 구슬 정지에 구슬의 최종 작업 농도에. 구슬 쉽게 크게 솔루션에 구슬 농도 변경할 수 있는 플라스틱 및 유리 컨테이너의 측면을 준수 수 있습니다. 비드 솔루션 microcarrier 비드 현 탁 액의 각 일괄 처리에 대 한 FACS 튜브에 추가의 가장 적합 한 볼륨 탐정에 의해 실험적으로 결정 해야 합니다. 여기에 제시 된 숫자 봉사 시작 지점으로 더 의미가 있다. 이상적으로, 조건 10-20 구슬 분석 결과의 끝에 24 잘 접시에 잘 당 섬유 소 젤에 포함 되므로 최적화 되어야 합니다. 분석 결과 대 한 구슬 숫자의 최적화에 관한 아래 토론 섹션에서 추가 논의 참조 하십시오.
  4. 분리 transfected HUVEC 24 h 게시물 transfection 세포 분리 솔루션을 사용 하 여 다음과 같습니다.
    1. 셀의 5 mL PBS의 각 10 cm 접시를 씻고 셀 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
    2. 완전 한 미디어에 1 X 106 셀/mL의 농도에서 세포 resuspend
  5. 구슬 포함 된 각 FACS 튜브에 세포 현 탁 액 ( 1 X 106 HUVEC)의 1 mL를 추가 합니다.
  6. 부드럽게 교 반 하십시오 FACS 튜브 마다 20 분 동안 37 ° C (해당 되는 경우 3.4 단계로 진행) 또는 2.5 ~ 3 h h 4의 (해당 되는 경우 3.2 단계로 진행).
    참고:이 기간 및 동요의 주파수는 경험적으로 의해 결정 되었습니다 이전 연구자의 분석 결과 돋 아 기본 비드 최적화. 4 동요의 다른 주파수와 구슬 코팅 단계 기간 하지 저자에 의해 테스트 되었습니다.

3. 순차적 코팅 HUVEC 코팅 Microcarrier 구슬에 Pericytes의

  1. 10T1/2 셀 (pericytes) 셀 분리 솔루션 (trypsin)를 사용 하 여 다음과 같이 분리 시작:
    1. PBS의 10 mL와 함께 T175 플라스 크를 씻고 trypsin의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 완전 한 미디어에서 2 X 105 셀/0.5 mL의 농도에서 10T1/2 resuspend.
      참고: 셀 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 구매 되었다.
      참고: 문화 10T1/2 셀 최소 필수 매체 (MEM)에 보충 10 %FBS 1% 페니실린 스.
  2. Agitating 구슬 + HUVEC 솔루션의 2.5 ~ 3 h, 후 구슬과 부동성 HUVEC 튜브의 하단에 정착 수 있도록 5 분 기다립니다.
  3. P1000 피 펫을 사용 하 여 각 튜브에서 완전 한 미디어의 0.5 mL을 제거 하 고 각 FACs 튜브를 0.5 mL의 볼륨에서 완전 한 미디어에서 2 x 105 10T1/2 추가. 셀 및 구슬은 솔루션을 선동 하 고 37 ° c.에 품 어 계속 구슬 4 h의 총 동요 되는 때까지 매 20 분을 선동을 계속 합니다.
    참고: 5 HUVEC의 비율: 구슬에 1 pericyte 혈관의 적절 한 pericyte 범위를 유지 하기 위해 필수적 이다.
    참고: 다음 대체 단계 프로토콜에서이 시점에서 대신 다음 수 있습니다.
  4. 4 h에만 구슬 및 HUVEC을 교 반 하십시오.
  5. Microcarrier 구슬의 HUVEC 코팅의 4 h 완료 되 면 선동 튜브 마지막으로 한 번, 30-60 s를 기다려 다음 FACS 튜브에서 솔루션의 1.5-1.75 mL를 즉시 제거.
    참고:이 미디어에서 많은 부동성 HUVEC 제거 될 것 이다 동안 정착 구슬의 대부분에 대 한 충분 한 시간을 허용 해야 합니다.
    1. 완전 한 미디어에서 2 X 105 10T1/2를 추가 하 고는 FACS의 볼륨을가지고 최대 2 mL 튜브.
    2. 부드럽게 FACS 튜브 마다 20 분 추가 시간에 대 한 교 반 하십시오.
  6. 교 반 완료 되 면, 부드럽게 선동 튜브 마지막으로 한 번 즉시 제거 전체 솔루션 (2 mL), 그리고 6 cm 접시에 그것을 추가. 각 접시에 완전 한 미디어의 추가 3 mL를 추가 하 고 판 37 ° C 배양 기에서 밤새 껏 두기 위하여.

3 일

4입니다. 섬유 소 젤 솔루션의 준비

  1. PBS에서 1 mg/mL의 농도에 aprotinin 및 50 단위/mL에서 트 롬 빈의 작업 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 이러한 솔루션의 큰 주식 만든 고 적어도 1 년에 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
  2. 2 mg/mL의 농도에서 fibrinogen의 신선한 솔루션을 확인 합니다. 동요 FACS 튜브 당 솔루션의 2.5 mL를가지고 충분 한 솔루션을 확인 합니다.
    1. 솔루션에 들어가려고 fibrinogen의 모든 있도록 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻한.
    2. Fibrinogen 솔루션의 1 mL 당 aprotinin 솔루션의 37.5 µ L를 추가 합니다.
    3. 멸 균 필터 솔루션 고 실 온에서 설정 옆으로.

5. 구슬 젤 이식 준비

  1. 모든 구슬 충분히 내 피 세포에 의해 코팅 되는 되도록 20 X 목표를 사용 하 여 현미경 microcarrier 코팅 구슬 포함 된 요리를 검사 합니다.
  2. 적극적으로 플라스틱 셀 6 cm 접시에서 그들을 분리 하 고 솔루션 튜브 도금된 솔루션. 세척 접시 2 X 추가 시간 완전 한 미디어와 모든 잔여 구슬 플레이트에 부착 될 수 있습니다 수집 하는 튜브를 전송.
    1. 소개 하는 기포 방지 하 고 p1000 피 펫을 사용 하 여 내 피 세포 코팅 구슬에 전단 응력을 최소화.
    2. 내 피 세포에 siRNA 때 려 눕 힘 효율성 평가 필요 하다 면, 2 단계에서 HUVEC 전용 코팅된 구슬의 접시를가지고 해야 합니다. 다음이 단계 (5.2), 구슬 분리 하 고 HUVEC RNA 분리 및 정량 분석에 대 한 플레이트에 연결 된 잔여 수집 키를 누릅니다.
  3. 튜브의 하단에 정착 솔루션에 구슬 수 있도록 3 분을 기다립니다.
  4. P1000 피 펫 팁을 사용 하 여 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 최대한 많은 상쾌한 제거 (진공 흡 인기 사용 안 함).
  5. 각 튜브를 완전 한 미디어의 1 mL을 추가 하 고 resuspend 구슬.
  6. 30-60 s는 바닥에 정착을 구슬 수 있도록 기다립니다. 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 P1000 피 펫을 사용 하 여 가능한으로 상쾌한의 제거. 비드 펠 렛을 실수로 제거의 가능성은 크게 증가 진공 흡 인기를 사용 하지 마십시오.
  7. 5.5 및 5.6 두 추가 번 단계를 반복 합니다. 목표 하지 부동성 세포 보다 더 빨리 FACS 튜브에 정착 한다 너무 많은 HUVEC 코팅 구슬, 제거 하는 동안, 6 cm 접시에서 분리 되어 수 부동성 HUVEC의 제거 하는 것입니다.
  8. 구슬에 완전 한 미디어의 1 mL를 추가 합니다.

6. 포함 코팅 섬유 소 젤에 구슬

  1. P1000 피 펫을 사용 하 여 각 FACS 튜브에 비드 펠 렛을 방해 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 합니다.
  2. 2.5 ml fibrinogen 솔루션의 구슬 resuspend.
  3. 트 롬 빈 솔루션의 13 µ L 24-잘 유리 바닥 접시의 원하는 각 플라스틱. 도금 유리 바닥 접시에 콩나물의 최적의 이미지 사용에 대 한 필수적입니다.
    참고: 다음 단계 전에 5-10 분 이상 잘에 앉아 하는 트 롬 빈을 두지 마십시오.
  4. 각 우물에 구슬/fibrinogen 솔루션의 0.5 mL를 추가 합니다.
    1. 잘 때마다 솔루션 pipetting 이전 구슬 솔루션 resuspend를 해야 합니다.
    2. 신중 하 게 우물에 이미 있는 트 롬 빈에 직접 플라스틱을 주의. 천천히 플라스틱 아래로 2-3 시간을 철저 하 게 혼합 솔루션, 복용 주의 어떤 공기 방울을 소개 하지.
    3. 웰 스 사이 피 펫 팁을 변경 해야 합니다.
    4. 주의 키를 눌러 이동 또는 어떤 운동 든 지 젤 형성 중단 될 수 있습니다 대로 응고, 초기 섬유 소 중 어느 시점에서 접시를 방해.
  5. 실 온에서 30 분 동안 후드에 앉아 접시를 남겨 주세요.
  6. 조심 스럽게 완전히 응고를 젤 수 있도록 추가 1.5-2 h 37 ° C 배양 기에 접시를 전송

7. 도금 섬유 소 젤 위에 섬유 아 세포

  1. 젤 응고의 마지막 30 분 동안 보통 인간의 폐 섬유 아 세포 (NHLF)를 다음과 같이 분리:
    1. PBS, 10 mL로 세포의 T175 플라스 크를 씻고 세포 분리 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 완전 한 미디어에 20000 셀/mL의 농도에서 NHLF를 resuspend.
      참고: NHLF 세포와 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 10 %FBS 1% 보충 양식 수 페니실린 스.
  2. 각 잘 젤에 NHLF 세포 현 탁 액의 1 mL 접시 하 고 인큐베이터에 다시.
  3. 완전 한 미디어 분석 결과의 동안 매일 변경 합니다.

8. 섬유 소 젤에 구슬 이식 다음 2-7 일에 걸쳐 돋 아 관찰. 돋 아에 필요한 시간의 길이 HUVEC의 통로 많은 수에 따라 달라 집니다.

9입니다. 분석 결과 돋 아의 고정

  1. 일단 충분 한 돋 아 치료 그룹의 phenotypic 차이 결정, 모든 우물 2 mL PBS의와 함께 한 번 씻어 수 발생 했습니다.
  2. 각 잘 하 세포 분리 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
  3. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 접시의 측면을 누릅니다.
    참고:이 단계의 목적에서 젤으로 젤의 이미징에 항 체 침투를 촉진 하기 위하여 가능한 섬유 소 젤 위에 성장 하는 NHLF 세포의 만큼 제거 하는. 셀 분리 솔루션 총 보육 시간 NHLF 제거를 최적화 하도록 조정 해야 합니다. 연구는 하지와 세포 분리 솔루션 수 있습니다 젤에 침투 내 내 피 구조를 방해 시작 시간의 과도 한 동안 젤을 품 어를 경고 했다.
  4. NHLF 세포의 충분 한 양의 제거 되 면 완전 한 미디어의 1 mL로 세포 분리 솔루션을 끄다.
  5. 분리 된 NHLF 및 진공 흡 인기를 사용 하 여 미디어를 aspirate 하 고 우물 1 mL의 PBS로 한 번 씻어.
  6. 각 우물에 PBS에서 2 %paraformaldehyde 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
  7. 2 %paraformaldehyde 솔루션을 제거 하 고 실 온에서 각각 잘 3 시간 3 분 1 mL의 PBS로 세척.
    참고: 2 %paraformaldehyde 솔루션 환경 보건 및 안전 (EHS) 지침에 따라 적절 하 게 폐기 하시기 바랍니다.
    1. 각 잘 얼룩 또는 콩나물 이미지 준비가 될 때까지 4 ° C에서 저장 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다.

10. 분석 결과 돋 아의 얼룩

  1. 0.5% 각 PBS에 트리톤 X 100 잘 하 고 실 온에서 30 ~ 45 분 동안 품 어의 300 µ L를 추가 합니다.
  2. 진공 흡 인기 사용 하 여, 트리톤 X100을 제거 하 고 5 분 동안 PBS에서 3 회 세척.
  3. 차단 솔루션 각 젤을 500 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
    참고: 차단 솔루션은는 다음과 같은 구성 요소로 이루어져: 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 5 %FBS, 0.1% 트윈-20, 그리고 1% 원으로 (를 사용 하 여 당신의 이차 항 체는 파생 된 동일한 종) PBS에.
  4. 각 우물에서 차단 솔루션을 제거 하 고 각 음에 1 차적인 항 체를 포함 하는 얼룩 솔루션의 300 µ L를 추가 합니다.
    참고: 얼룩 솔루션은 같은 원으로 존재 하지 않고 차단 솔루션으로. 저자는 1:400에 1: 200의 희석에서 1 차 항 체와 함께 배양 성공을 했다.
  5. 4 ° c.에 24 h에 대 한 솔루션 얼룩에 1 차 항 체를 품 어
  6. 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 부드러운 락으로 실 온에서 20 분 각 0.5% 트윈와 TBS에서 3 회 세척. 3 세척 후 신선한 워시 버퍼 다시, 대체 하 고 하룻밤 4 ° C에서 저장 합니다.
  7. 실 온에서 2 h에 대 한 솔루션 얼룩에 형광 이차 항 체 희석 1:1000와 함께 품 어.
  8. 이차 항 체 얼룩 솔루션을 제거 하 고 부드러운 락으로 실 온에서 0.5% 트윈이 포함 된 TBS와 20 분에 대 한 5 번 세척.
  9. PBS에서 핵 얼룩을 희석 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
    참고:이 프로토콜 PBS에 희석 Hoechst 1:10000와 함께 큰 성공을 했다.
    참고: 영상 전에 핵 얼룩 솔루션을 제거할 필요가 있다.
  10. 이미지 완료 최적의 형광 신호를 잡으려고 얼룩의 몇 일 이내.

11. 분석 결과 정량화를 돋 아

  1. 콩나물 몇 군데 되어 있다, 후 ImageJ로 이미지 파일을 가져올 하 고 콩나물, 개수를 카운트 도구 또는 새싹 길이 측정 하는 선 도구를 사용 하 여.
    참고: 콩나물 내 피 돌출 그들은 돋 아 있는 구슬의 직경 보다 크거나 길이가 정의 됩니다. 11 새싹 길이는 새싹 새싹의 끝에 구슬에서 돌기 시작 하는 지점에서 거리로 측정할 수 있습니다. 평균 새싹 비드 당 고 비드 당 콩나물의 평균 수는 신생 돋 아에서 유전자 침묵의 phenotypic 효과 평가 하기 위해 유용한 통계. 치료 그룹 당 적어도 1 개의 새싹을 포함 하는 구슬의 평균 수 돋 아의 견고성을 평가 하기 위해 통계로 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

이 프로토콜을 사용 하는 두 셀 형식 생체 외에서 의 단단한 협회를 위한 그리고 존재는 pericytes의 보완 돋 아 (그림 1A, B)의 발생. 프로토콜도 사용 하면 효과적인 입을 (예를 들어 RNA 간섭을 통해) 관심 (VEGFA 특히 내 피 세포에서에서) 또는 pericytes에서 PDGFRβ 등7,12 의 셀 형식에 관심사의 유전자의 분석 결과,이 분석 결과에서 돋 아 형의 저해를 번역할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용 하는 연구원은 혈관 기능에 pericytes의 독특한 기여를 더 철저 하 게 조사 pericyte 코팅 돋 아 분석 결과를 병렬로 표준 내 피 세포만 돋 아 시험을 수행 하는 것이 좋습니다. 그리고 고기 공부 되 고입니다.

이 프로토콜에서 설명 된 조건은 충분히 코팅 구슬 (그림 2A, B) 섬유 소 젤에 강력한 돋을 수 있을 것입니다 얻으려면 준수 해야 합니다. 저자에서에서 발견 했습니다 그 (예: pericytes 1 HUVEC 1 10T1/2의 비율로 코팅) pericytes 결과의 초과를 pericyte 자라 난 뚜렷한 혈관 구조는 잘 분별을 전체 잘 및 후속 무 능력의.

Figure 1
그림 1입니다. Pericytes 밀접 하 게 연관 분석 결과 돋 아 비드에 내 피 혈관. (A) 표준 돋 아 분석 결과 HUVEC만 입히는 구슬. 분석 결과 돋 아 pericyte의 (B) 공초점 현미경 이미지 pericytes 돋 아 분석 결과에서 내 피 혈관 주위 포장 하지만 그들의 돋 아 방해 하지 않습니다 보여줍니다. 파란색은 Hoechst (핵 얼룩); 빨간색은 CD31 (내 피 얼룩), 그리고 녹색은 Desmin (pericyte 얼룩). 모든 확장 바, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 코팅된 구슬 모양 처럼 거친, 골프공을 있다. 적절 하 게 입히는 구슬 섬유 소 젤 주입 (B)에 대 한 준비, 골프 공 같은 모습에는 알몸 microcarrier 구슬 (A) 완전 하 게 매끄러운 표면을. 눈금 막대, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜 특성화 복잡 한 단계와 철저 한 기계적 조사에 유전과 이미징 접근을 연구 함으로써 신생을 돋 아의 heterotypic 세포 상호 작용을 위한 메서드를 제공 합니다. 분석 결과 수행할 때 그 구슬의 효율적인 내 피 코팅 동안에 일어난 구슬 동요 단계 필수적 이다. 불 쌍 한 내 피 코팅은 구슬 골프 공 처럼 거친 표면 젤 이식 전에 다음날 아침 고 대신 완전히 부드러운 표시 나타나지 않는 경우에, 분명 하 게 만들어질 것 이다. 구슬 구슬 표면 내 피 세포의 최대 노출 수 있도록 튜브를 적극적으로 교 반에 의해 각 동요 단계 충분히 resuspended는 되도록 처리 하지만 하지 너무 적극적으로 그것이 이미 내 피 세포를 발생 구슬에서 분리 되 연결할.

분석 결과에 pericytes을 추가 하는 때 1 pericyte 5 내 피 세포의 비율이 유지 됩니다 필수적 이다. Pericytes의 과잉 발생 자라 다, 분석 결과 중 내 피 세포 인구를 추월 하 고 pericytes에 부족 하면 혈관의 가난한 보험. 적절 한 셀 밀도 유지 하지만 혈관의 가난한 pericyte 범위 여전히 관찰, pericytes와 교 반 시간 수정 해야 합니다. 핸드폰 번호 변경 되는 것이 바람직하지 않습니다. 다른 접근 수 있습니다 4 h만을 위한 내 피 세포와 비즈 코트 수 비드 resuspending에 의해 미디어에서 내 피 세포를 제거 그리고 세포 솔루션 및 일단 구슬 정착 하지만 셀 전에 미디어를 제거 정착 다음 pericytes에 추가 하 고 모든 20 분 추가 시간에 대 한 교 반.

글자만 코팅된 구슬에 섬유 소 혈전, 응고 형성 동안 접시를 방해 하 여 젤의 무결성을 방해 하지 않는 것이 필수적 이기도 합니다. 매트릭스 형성의 장애 정도 벗어난 돋 아 발생할 수 있습니다. 또한 적절 한 비드 밀도 젤에 유지 되도록 필수적 이다. 구슬의 인구 너무 조밀한 경우에, 서로 게 가까운 근접에서 구슬 구슬 이웃의 돋 아에 영향을 미칠 것 이다와 서로 향해 anastomose에 시작 됩니다. 연구원 및 특성화 선박-선박 상호 작용에 대 한 관심의 궁극적인 목표에 따라 비드 밀도 수정 해야 합니다. 그러나, 고립 된 구슬 및 젤 내에서 서로 게 가까운 근접에서 구슬의 이종 인구 크게 변수 돋 아 고기를 줄 수 있습니다. 비드 밀도 비드 솔루션 FACS 튜브에는 프로토콜의 동요 단계 동안 추가의 볼륨을 변경 하 여 또는 젤 이식 전에 구슬 resuspend 하는 데 사용 하는 섬유 소 솔루션의 볼륨을 변경 하 여 조정할 수 있습니다.

또한 건강 한 NHLFs mL 당 20000 셀의 밀도 각 섬유 소 병 위에 도금 필수적 이다. 적극적으로 나누어 NHLFs에서 제공 하는 성장 요인의 지속적인 공급은 강력한 분석 결과 중 돋 아 필요 note 하시기 바랍니다. NHLF 조절 EGM2 충분 한 대안이 아니다. 13 가난한 돋 아 분석 결과 중 나타나지는, 완전 한 미디어의 신선한 병 및 NHLF 세포의 새로운, 건강 한 통로 사용 됩니다 것이 좋습니다.

이 분석 결과 더 큰 해상도에서 신생의 셀룰러 및 phenotypic 복잡성을 해결 하기 위해 시작, 비록 그것은 여전히 사실, vivo에서 컨텍스트를 기준으로 간소화 시스템을 나타냅니다. 또한,이 분석 결과에서 발생 하는 돋 아 신생은 종양 혈관 신생 등 pathologic 컨텍스트 반대로 건강 하 고, 생리 적 컨텍스트 더 비슷합니다. 이 방법의 미래 응용 프로그램 추가 셀 유형 (신생 응답을 조절 하는 면역 세포 인구)의 소개를 포함 될 수 있습니다 추가 heterotypic 세포 상호 작용을 정리를이 복잡 한 과정에 참여. -섬유 소 젤-pathologic 신생에 생체 외에서 시뮬레이션에 돋 아 선박에 가까운 근접에 종양 같은 외부 스트레스의 도입의 더 철저 한, 기계적 특성을 허용 하도록 또한 사용할 수 있습니다는 병 적인 상황에서 활성화 하는 분자 경로. 이러한 진보는 궁극적으로 발견 및 대상에 대 한 새로운 치료 경로의 더 심층적인 특성화를 활성화 더 많은 제어 설정에 신생의 복잡 한 단계를 공부 하는 연구자의 능력 향상을 위한 중요 한 것 pathologic 신생입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 유용한 토론에 대 한 박사 빅토리아 Bautch와 조슈아 바우처를 감사 하 고 표준 비드 최적화에 대 한 조언을 시험 조건 및 얼룩 프로토콜 분석 결과 돋 아 돋 아. S.H.A. 국립 과학 연구소에서의 일반 의료에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 5T32 GM007092 수상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

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References

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Comments

1 Comment

  1. Very nice

    Reply
    Posted by: huihui a.
    June 5, 2019 - 4:58 AM

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