Integratie van Pericytes in een parel van de Endothelial cel kiemen Assay

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol presenteert een kraal roman in vitro assay dat meer modellen op de juiste wijze het proces van in vivo angiogenese kiemen door pericytes op te nemen. Deze wijziging maakt het mogelijk de bepaling van de kraal te recapituleren meer getrouw de heterotypic cellulaire interacties tussen endotheliale cellen en muurschildering cellen die essentieel zijn voor angiogenese.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenese is de groei van nieuwe schepen uit reeds bestaande therapieën en is een belangrijk onderdeel van vele biologische processen, met inbegrip van de embryogenese en ontwikkeling, wondgenezing, tumorgroei en uitzaaiing, en oculaire en cardiovasculaire ziekten. Effectief in vitro modellen die de biologie van angiogenese recapituleren zijn nodig om op de juiste manier studeren dit proces en identificeren van mechanismen voor regelgeving die uiteindelijk kan worden gericht voor nieuwe therapeutische strategieën. De bepaling van de angiogenese kraal is eerder aangetoond de meerdere fasen van het endotheel kiemen recapituleren in vitro. Een beperking van deze bepaling is echter het ontbreken van endotheel-muurschildering cel interacties,, die zijn de sleutel tot de moleculaire en fenotypische verordening van endothelial cel functie in vivo. Het protocol hier gegeven presenteert een methodologie voor de opneming van de muurschildering cellen in de bepaling van de angiogenese kraal en toont een strakke vereniging van endotheliale cellen en pericytes tijdens de kiemen in vitro. Het protocol gegevens ook een methodologie voor effectieve silencing van doelgenen met behulp van siRNA in endotheliale cellen voor mechanistische studies. Over het geheel genomen voorziet dit protocol in een in vitro assay die doelmatiger modellen van de diverse celtypes die betrokken zijn bij het kiemen van de angiogenese, en biedt een fysiologisch-relevanter platform voor therapeutische beoordeling en nieuwe ontdekking van mechanismen van angiogenese verordening.

Introduction

Angiogenese is essentieel voor passende embryogenese en wondgenezing en het speelt ook spelen een belangrijke rol in talrijke ziekten waaronder kanker progressie1 en coronaire ziekte. 2 , 3 hebben een beter begrip van hoe angiogenese optreedt tijdens normale ontwikkeling, en hoe het wordt geactiveerd in de pathologische contexten, is cruciaal voor de ontwikkeling van de roman, effectieve therapeutics. Trouw in vitro modellen die de mijlpalen en celtypes die betrokken zijn bij de angiogenese in vivo recapituleren zijn nodig om onderzoekers beter karakteriseren de moleculaire mechanismen rijden angiogenese en nieuwe ontdekkingen in de verordening van het endotheel.

Nakatsu en Hughes hebben een gekiemde kraal-test die zij aangetoond de vele bekende stadia dat hebben van kiemen angiogenese ondergaat geoptimaliseerd. 4 , 5 het doel van de methode die hier gepresenteerd is voort te bouwen op de assay geoptimaliseerd door Nakatsu en Hughes door de integratie van perictyes in de assay, zodat de paracrine en juxtracrine functies van muurschildering cellen in endothelial cel kiemen kunnen worden opgenomen in Roman angiogenese studies. Pericytes zijn muurschildering cellen die zijn gedefinieerd door hun rol als cellen die handhaven sluiten fysiek contact met endotheliale cellen als gevolg van hun wordt ingebed in het vasculaire membraan van de kelder. 6 Pericytes en endotheliale cellen zich bezighouden met complexe kruis-talk via trajecten met inbegrip van Inkeping signalering signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ en vele anderen. 7 , 8 Muismodellen tekort aan deze signaalroutes tonen arme pericyte dekking therapieën in embryogenese, wat leidt tot slechte vasculaire remodeling en disfunctionele therapieën te ontwikkelen. 7 bovendien de rol van pericytes in het pathologische angiogenese is belangrijk, maar vaak onder-gewaardeerd. Een uniek kenmerk van tumor therapieën is bijvoorbeeld dat de vaartuigen meer onrijpe, lekkende en disfunctionele als gevolg van slechte pericyte dekking zijn. 9 er is voorgesteld dat de aanwezigheid of afwezigheid van pericytes drastisch invloed op het fenotype van tumor-bloedvaten en een belangrijke bemiddelaar van reacties op antiangiogenic en antitumorale therapieën is. 9 zo, met inbegrip van de rol van pericytes in in vitro testen is sleutel tot de belangrijke mechanismen van endothelial verordening meer volledig te vangen.

Hoewel er veel in vitro en ex vivo tests momenteel werkzaam te bestuderen van de angiogenese, zijn er tekortkomingen in elk te overwegen. Sommige, zoals endotheel proliferatie en endotheel migratie vitrotests, zijn overdreven vereenvoudigd en concentreren op één endothelial functie in een geïsoleerde omgeving op weefselkweek plastic. 10 andere testen optreden in een meer 3 dimensionale (3D) omgeving, zoals de Matrigel bepaling voor de vorming van de buis,10 maar deze testen nog oppervlakkig zijn en zich meer richten op het vermogen van migreren en vormen van DOVO vasculaire endotheliale cellen structuren, in tegenstelling tot de kiemen van reeds bestaande therapieën. Bovendien nemen geen van deze tests muurschildering celtypes. Er zijn ex vivo modellen zoals de bepaling van de aorta ring die pericytes aanwezig in de host-orgel nemen, maar genetische manipulatie van deze modellen is veel moeilijker als gevolg van de noodzaak van het genereren van de afvalrace of transgene muismodellen van de trajecten van belang. De parel kiemen assay is ideaal omdat het endotheel kiemen, proliferatie, migratie en zelfs anastomose en lumen vorming in een 3D matrix modellen. 4 de assay getrouw voorziet mechanistische beoordeling van de vele verschillende stadia van het kiemen, terwijl nog steeds voor directe genetische modificatie van de endotheliale cellen of pericytes in een meer gecontroleerde omgeving. Het fibrine stolsels bevattende de gekiemde bolletjes kunnen worden gemakkelijk vast, gekleurd en beeld in verschillende stadia van kiemen; Deze kiemen kunnen ook worden geplaatst in een levende imaging kamer uit te voeren real-time beeldvorming van kiemen. De hier voorgestelde methodologie is ideaal voor het bestuderen van de basismechanismen van angiogenese via diepte fenotypering en grondige analyse van de trajecten geactiveerd tijdens angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dag 1:

1. voorbijgaande transfectie van endotheliale cellen

  1. Desgewenst voeren een voorbijgaande transfectie van menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC) met behulp van gen-regulerende oligonucleotides (bijvoorbeeld micro-RNAs of Klein Mengend RNA (siRNA)) en de juiste lipofectamine-reagens volgens instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Dit protocol heeft groot succes uitvoeren van omgekeerde transfections met aangepaste siRNA sequenties en een commerciële transfectiereagens (Zie materialen tabel). De auteurs hebben niet getest andere protocollen van de transfectie en reagentia met deze test. De stappen voor het omgekeerde transfectie met behulp van de reagentia die vermeld zijn als volgt:
  2. Reconstrueren gelyofiliseerd siRNAs of microRNAs bij een concentratie van 20 µM in nuclease gratis water.
  3. Maken van transfectie oplossingen op de volgende verhouding: 1 mL van elk serum vrije media met 9 µL van siRNA en microRNA.
  4. Doorroeren van de oplossing en laat het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  5. 18 µL van het transfectiereagens aan de oplossing toevoegen en doorroeren.
  6. Laat de oplossing voor het broeden bij kamertemperatuur gedurende 20-40 minuten, schudden de oplossing elke 10 tot 15 min voor de duur van de incubatietijd.
  7. Terwijl de transfectie oplossing is aan het broeden, los HUVEC met behulp van een cel detachement oplossing (bijvoorbeeldAccutase). Voor een T175 kolf, wassen van de kolf met 10 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 5 mL cell detachement oplossing en Incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
  8. Voeg 5 mL van de volledige media aan op de maatkolf T175, verwijderen van de celsuspensie van de kolf en centrifuge op 1200 toeren per minuut gedurende 3 minuten.
  9. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een vacuüm aspirator en resuspendeer de pellet cel bij een dichtheid van 1 X 106 cellen per mL in EGM2.
    Opmerking: Dit protocol heeft groot succes met behulp van Endothelial cel groeimedium (EGM2) met de standaard groeifactor opsommingsteken kit alsmede een extra 10% FBS.
  10. Zodra de transfectie oplossing heeft gebeëindigd het broeden, 1 mL van de oplossing in een 10-cm plaat plaat, en voeg 1 mL HUVEC schorsing bovenop.
  11. Voeg een extra 7 mL volledige media toe zodat het eindvolume in de 10-cm plaat 9 mL.
  12. Make-up van ten minste twee 10 cm platen waard van cellen voor elke transfectie voorwaarde om ervoor te zorgen dat er voldoende cellen beschikbaar voor latere stappen in de analyse zijn.
    Opmerking: Deze omstandigheden leiden tot een eindconcentratie van de werken van de regelgevende oligonucleotide gen van 20 nM. De auteurs hebben gevonden deze voorwaarden leiden tot een knockdown 60-80% van de genexpressie voor hun doelstellingen van belang. Andere onderzoekers wellicht transfectie voorwaarden volgens hun experimentele behoeften te optimaliseren.
  13. De media 4-6 h post toevoeging van siRNA complexen met verse volledige media uit te wisselen.
    Opmerking: Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van passage 1-2 HUVEC.

Dag 2

2. coating van Microcarrier kralen met endotheliale cellen

  1. Microcarrier kralen (bvCytodex 3) met een concentratie van 60.000 kralen/mL in PBS en autoclaaf reconstrueren.
    Opmerking: microcarrier kralen komen bij een concentratie van ongeveer 3 x 106 kralen per gram. Reconstrueren de parels met een verhouding van 20 mg kralen per mL PBS om de dichtheid van een kraal van ongeveer 60.000 kralen/mL.
  2. Aliquot 1 mL van de volledige media in het gewenste aantal Rondbodemkolf fluorescentie geactiveerd Cell Sorting (FACS) buizen.
  3. Pipetteer 20 µL van microcarrier kraal schorsing in elke buis (zorg om ervoor te zorgen dat de kraal oplossing is goed geresuspendeerde voorafgaand aan pipetteren).
    Opmerking: Er zal wellicht dramatische variabiliteit in de eindconcentratie van de werken van parels aanwezig zijn in een bepaalde microcarrier kraal schorsing. Kralen kunnen gemakkelijk voldoen aan de zijkanten van de containers voor plastic en glas die kraal concentratie in de oplossing sterk kunnen veranderen. De meest geschikte hoeveelheid kraal oplossing toegevoegd aan de FACS buis voor elke partij microcarrier kraal schorsing moet empirisch bepaald worden door de onderzoeker. De hier gepresenteerde cijfers zijn bedoeld om te dienen meer als uitgangspunt. Voorwaarden moeten idealiter worden geoptimaliseerd zodat er 10-20 kralen ingebed binnen de fibrine gel per putje in de 24 goed plaat aan het einde van de test zijn. Zie verdere discussie in de discussie hieronder over optimalisatie van kralen nummers voor de bepaling.
  4. Ontkoppel transfected HUVEC 24 h post transfectie met behulp van de mobiele-detachement oplossing als volgt:
    1. Wassen van elke 10-cm plaat van cellen met 5 mL PBS, voeg toe 2 mL van de mobiele-detachement oplossing en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 X 106 cellen/mL in volledige media.
  5. Voeg 1 mL celsuspensie (d.w.z. 1 X 106 HUVEC) aan elke FACS buis met kralen.
  6. Zachtjes doorroeren de FACS buizen elke 20 min voor de duur van 4 h bij 37 ° C (als u stap 3.4) of 2,5 tot 3 h (als u stap 3.2).
    Opmerking: Deze duur en frequentie van agitatie is empirisch bepaald door eerdere onderzoekers die de fundamentele parel assay kiemen hebben geoptimaliseerd. 4 Andere frequenties van agitatie en duur van de kraal coating stap zijn niet getest door de auteurs.

3. sequentiële Coating van Pericytes op HUVEC-gecoate Microcarrier kralen

  1. Begin loskoppelen 10T1/2 cellen (pericytes) met behulp van de mobiele-detachement oplossing (trypsine) als volgt:
    1. Wassen van een T175 kolf met 10 mL PBS, dan Voeg 5 mL trypsine en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Resuspendeer 10T1/2 bij een concentratie van 2 X 105 cellen/0,5 mL in volledige media.
      Opmerking: Cellen werden aangekocht van het Amerikaanse Type cultuur collectie (ATCC).
      Opmerking: Cultuur 10T1/2 cellen in Minimum essentiële Medium (MEM) aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine.
  2. Na 2,5 tot 3 uur voor het schudden van de kraal + HUVEC solution, wacht u 5 min zodat de kralen en vrij zwevende HUVEC om af te wikkelen naar de onderkant van de buis.
  3. Verwijderen van 0,5 mL van volledige media uit elke buis met behulp van een precisiepipet P1000 en 2 x 105 10T1/2 in volledige media in een volume van 0,5 mL toevoegen aan elke FACs buis. De cel en parel oplossing doorroeren en vervolgens blijven Incubeer bij 37 ° C. Blijven elke 20 minuten doorroeren totdat de kralen hebben is geschud voor een totaal van 4 h.
    Opmerking: De verhouding van 5 HUVEC: 1 pericyte op de parels is van essentieel belang om passende pericyte dekking van de vaartuigen.
    Opmerking: De volgende alternatieve stappen kunnen worden gevolgd in plaats daarvan op dit punt in het protocol:
  4. Agitate kralen en HUVEC alleen voor 4 uur.
  5. Zodra de 4 uur van HUVEC coating van de parels van de microcarrier voltooid is, doorroeren van de buizen een laatste keer, wachten 30-60-s, dan 1,5-1,75 mL van oplossing onmiddellijk te verwijderen uit de buis FACS.
    Opmerking: Moet hierdoor voldoende tijd voor de meeste van de kralen te regelen terwijl vele vrij zwevende HUVEC in de media zal worden verwijderd.
    1. Voeg van 2 X 105 10T1/2 in volledige media en breng het volume van de FACS maximaal 2 mL tube.
    2. Zachtjes doorroeren de FACS buizen elke 20 min voor een extra uur.
  6. Zodra het schudden voltooid is, zachtjes doorroeren van de buizen een laatste keer onmiddellijk verwijderen van de gehele oplossing (2 mL) en toe te voegen aan een plaat van 6 cm. Voeg een extra 3 mL van volledige media toe aan elke plaat en plaats de platen in de incubator 37 ° C's nachts.

Dag 3

4. voorbereiding van fibrine Gel oplossingen

  1. Werkoplossingen van aprotinin met een concentratie van 1 mg/mL in PBS en trombine bij 50 eenheden/mL voor te bereiden.
    Opmerking: Een ruime voorraad van elk van deze oplossingen kan worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C voor ten minste een jaar.
  2. Maak een nieuwe oplossing van fibrinogeen bij een concentratie van 2 mg/mL. Maakt genoeg oplossing dat 2,5 mL van oplossing per opgewonden FACS buis.
    1. Verwarm de oplossing in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten zodat alle de fibrinogeen om in oplossing te gaan.
    2. Voeg 37,5 µL van aprotinin oplossing per 1 mL van fibrinogeen oplossing.
    3. Steriel-filter de oplossing en braaklegging bij kamertemperatuur.

5. voorbereiding kralen voor Gel implantatie

  1. De gerechten met de microcarrier-gecoate kralen onder de microscoop met behulp van de 20 X doelstelling om ervoor te zorgen dat alle kralen voldoende hebben is bekleed door endotheliale cellen onderzoeken.
  2. Krachtig Pipetteer de vergulde oplossing van cellen aan hen loskoppelen van de 6-cm-plaat en breng de oplossing in een buis. Wassen van de plaat 2 X extra keer met volledige media en overdracht aan de buis te verzamelen van alle resterende kralen dat de plaat kunnen worden nageleefd.
    1. Vermijd invoering van luchtbellen en gebruik een pipet p1000 om te minimaliseren van shear stress op de endothelial cel beklede parels.
    2. Desgewenst beoordeling van siRNA vechtpartij efficiëntie in de endotheliale cellen is in stap 2, moet u een plaat van dit is een alleen-HUVEC gecoate parels. Tijdens deze stap (5.2), loskoppelen van de kralen en verzamelen van de resterende die HUVEC gekoppeld aan de plaat voor RNA isolatie en qPCR analyse.
  3. Wacht 3 min zodat de kralen in de oplossing om af te wikkelen naar de onderkant van de buis.
  4. Verwijder zo veel van het supernatans dat mogelijk zonder verstoring van de kraal pellet met behulp van een p1000 Pipetteer tip (gebruik geen een vacuüm aspirator).
  5. 1 mL van de volledige media toevoegen aan elke buis en resuspendeer de kralen.
  6. Wacht 30-60 s zodat de kralen om af te wikkelen naar de bodem. Verwijder zo veel van de bovendrijvende substantie als mogelijk met behulp van een precisiepipet P1000 zonder verstoring van de kraal-pellet. Gebruik een vacuüm aspirator niet zoals de waarschijnlijkheid van het per ongeluk verwijderen van de kraal pellet is sterk toegenomen.
  7. Herhaal stap 5.5 en 5.6 extra tweemaal. Het doel is om zoveel mogelijk van de vrij zwevende HUVEC dat kan hebben is losgekoppeld van de 6-cm plaat mogelijk, terwijl het niet verwijderen van teveel HUVEC beklede parels, die in de buis FACS sneller dan vrij zwevende cellen moeten regelen.
  8. 1 mL van de volledige media toevoegen aan de kralen.

6. insluiten gecoat kralen in een fibrine-Gel

  1. Verwijder zo veel media mogelijk zonder verstoring van de kraal pellet in elke FACS buis met behulp van een precisiepipet P1000.
  2. Resuspendeer de kralen in 2.5 mL fibrinogeen oplossing.
  3. Pipetteer 13 µL van trombine oplossing in elk gewenst goed van een 24-well glassbottom plaat. Beplating in een glazen bodem plaat is essentieel voor het inschakelen van optimale beeldvorming van de spruiten.
    Opmerking: Laat geen trombine zit in een goed voor meer dan 5-10 min voor de volgende stap.
  4. Voeg 0,5 mL parel/fibrinogeen oplossing aan elk putje.
    1. Zorg ervoor dat de oplossing van de kraal goed vóór de oplossing elke keer pipetteren resuspendeer.
    2. Nemen voorzichtigheid aan zorgvuldig Pipetteer rechtstreeks in de trombine al aanwezig in de put. Pipetteer langzaam op en neer 2 - 3 keer te grondig Meng de oplossing, nemen voorzichtigheid niet om eventuele luchtbellen.
    3. Zorg ervoor dat het uiteinde van de pipet tussen putten wijzigen.
    4. Nemen voorzichtigheid niet verplaatsen of verstoren van de plaat op elk gewenst moment tijdens eerste fibrine stolling, zoals elke beweging kan het verstoren van de vorming van de gel.
  5. Laat de plaat zit in de kap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. De plaat zorgvuldig overbrengen in een 37 ° C incubator voor een extra 1.5-2 h om de gel te stollen volledig

7. plating fibroblasten bovenop de fibrine-Gel

  1. Tijdens de laatste 30 min van de gel stollen, ontkoppel normale menselijke longen fibroblasten (NHLF) als volgt:
    1. Wassen van een T175 kolf van cellen met 10 mL PBS, dan Voeg 5 mL van cel detachement oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Resuspendeer NHLF bij een concentratie van 20.000 cellen/mL in volledige media.
      Opmerking: NHLF cellen kunnen worden gekweekt met Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine.
  2. 1 mL van de celsuspensie van de NHLF op de gel van elk putje plaat en plaats terug in de incubator.
  3. Wijzigen van volledige media om de andere dag voor de duur van de test.

8. acht kiemen in de loop van 2-7 dagen na kraal inplanting in de gel van fibrine. De lengte van de tijd die nodig is voor het kiemen zal afhangen van de passage en veel aantal HUVEC.

9. fixatie van kiemen Assay

  1. Zodra voldoende kiemen zijn opgetreden om te kunnen bepalen van een fenotypische verschil tussen behandelgroepen, wassen alle putjes één keer met 2 mL PBS.
  2. Voeg 0,5 mL cell detachement oplossing aan elk putje en plaats van de plaat in een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten.
  3. De plaat uit de incubator verwijderen en tik op de zijkanten van de plaat.
    Opmerking: Het doel van deze stap is om zo veel van de cellen van de NHLF groeiende bovenop de fibrine gel mogelijk te vergemakkelijken van antilichaam penetratie in de gel, evenals de beeldvorming van de gel. De totale incubatietijd met cell detachement oplossing wellicht worden aangepast om het optimaliseren van NHLF verwijdering. Onderzoekers zijn gewaarschuwd te niet broeden de gel voor buitensporige perioden als de cel detachement oplossing kan in de gel doordringen en beginnen met het verstoren van het endotheel structuren binnen.
  4. Zodra een voldoende aantal NHLF cellen zijn verwijderd, doven de cel detachement oplossing met 1 mL van volledige media.
  5. De vrijstaande NHLF en media, met behulp van een vacuüm aspirator gecombineerd, en was de putjes goed eenmaal met 1 mL PBS.
  6. 300 µL van 2% paraformaldehyde-oplossing in PBS toevoegen aan elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  7. Verwijder de 2% paraformaldehyde-oplossing en wassen elk goed 3 keer met 1 mL PBS gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Gelieve te vervreemden van 2% paraformaldehyde-oplossing op de juiste wijze overeenkomstig de richtsnoeren van de milieu-gerelateerde gezondheid en veiligheid (EHS).
    1. Voeg 1 mL PBS elk goed en bewaren bij 4 ° C tot klaar om vlekken of afbeelding de spruiten.

10. kleuring van kiemen Assay

  1. Voeg 300 µL van 0,5% Triton-X 100 in PBS aan elk goed en incubeer gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Met behulp van een vacuüm aspirator, Triton-X100 verwijderen en wassen van 3 keer in PBS voor elke 5 min.
  3. Voeg 500 µL van het blokkeren van de oplossing voor elke gel en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    Opmerking: De blokkerende oplossing is opgebouwd uit de volgende onderdelen: 1% bovien serumalbumine (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 en 1% antiserum (gebruik dezelfde soort waaruit uw secundaire antilichamen zijn verkregen) in PBS.
  4. Verwijder blokkerende oplossing uit elk putje en voeg 300 µL van kleurstofoplossing met primair antilichaam aan elk putje.
    Opmerking: De kleurstofoplossing is hetzelfde als de blokkerende oplossing, maar zonder het antiserum aanwezig. De auteurs hebben succes met primaire antilichamen in verdunningen van 1:200 naar 1:400 aan het broeden.
  5. Incubeer primaire antilichamen in kleurstofoplossing gedurende 24 uur bij 4 ° C.
  6. Primair antilichaam oplossing gecombineerd en wassen van 3 keer in TBS met 0,5% tween gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met zachte schommelen. Na de derde wash, vervangen door verse was buffer weer en bewaren bij 4 ° C's nachts.
  7. Met fluorescerende secundair antilichaam verdund 1:1000 in de kleurstofoplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  8. Verwijderen van secundair antilichaam kleurstofoplossing en 5 keer voor elke 20 minuten wassen met TBS met 0,5% tween bij kamertemperatuur met zachte rockende.
  9. Verdun nucleaire vlek in PBS en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    Opmerking: Dit protocol heeft groot succes met Hoechst verdund 1:10000 in PBS.
    Opmerking: Er behoeft niet verwijderen van nucleaire kleurstofoplossing voorafgaand aan de beeldvorming.
  10. Afbeelding binnen een paar dagen van de voltooiing van de kleuring te vangen optimale fluorescent signaal.

11. kiemen Assay kwantificering

  1. Nadat de spruiten hebben Image is gemaakt, de afbeeldingsbestanden importeren ImageJ en gebruik het gereedschap tellen om het aantal spruiten te tellen, of het hulpmiddel lijn voor het meten van de lengtes van de stronk.
    Opmerking: Spruiten worden gedefinieerd als endothelial uitsteeksels met een lengte groter dan of gelijk aan de diameter van de kraal waaruit ze zijn kiemen. 11 sprout lengte kan worden gemeten als de afstand vanaf het punt waarop de stronk begint uitsteekt off van de kraal naar het uiteinde van de stronk. Gemiddelde lengte per kraal ontkiemen en gemiddelde aantal spruiten per kraal zijn nuttige statistieken fenotypische effecten gene monddood maken in de kiemen van angiogenese. Het gemiddelde aantal kralen met ten minste één sprout per behandeling groep kan ook gebruikt worden als een maatstaf om te beoordelen van de robuustheid van de kiemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol zorgt voor een strakke vereniging van de cel van de twee typen in vitro en de aanwezigheid van de pericytes vormt een aanvulling op het vóórkomen van gekiemde (figuur 1A, B). Het protocol maakt het ook mogelijk effectieve silencing (bijvoorbeeld via de interferentie van RNA) van een gen van belang in een celtype van belang zoals (VEGFA specifiek in de endotheliale cellen) of PDGFRβ in pericytes7,12 tijdens de test, die kan vertalen naar de remming van gekiemde fenotype in de test. Onderzoekers in dienst van dit protocol worden aangemoedigd om het uitvoeren van een standaard endothelial cel-alleen gekiemde assay parallel aan de pericyte-gecoate gekiemde assay grondiger onderzoeken de unieke bijdragen van pericytes in de vasculaire functies en fenotypen bestudeerd.

De voorwaarden beschreven in dit protocol zijn belangrijk voor voldoen aan met het oog op voldoende beklede kralen (figuur 2A, B) dat zal zitten kundig voor ondergaan robuuste kiemen in de gel van fibrine. De auteurs hebben gevonden dat een overmaat van pericytes (zoals pericytes bekleed bij een verhouding van 1 10T1/2 tot 1 HUVEC) resultaat in pericyte overmatige groei van de hele goed en de daaropvolgende onvermogen om te onderscheiden van de verschillende vasculaire structuren binnen de put.

Figure 1
Figuur 1. Pericytes strak associëren met endothelial vaartuigen in de kraal kiemen assay. (A) standaard gekiemde assay met HUVEC enige gecoate kralen. (B) confocale microscopie beelden van de pericyte kiemen assay aantonen dat pericytes wikkel rond endothelial vaartuigen in de gekiemde assay, maar geen belemmering voor hun kiemen vormen. Blauw is Hoechst (nucleaire vlek); rood is CD31 (endothelial vlek), en groen is Desmin (pericyte vlek). Alle schalen bars, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Gecoate kralen hebben een ruwe, golf-bal als uiterlijk. Naakte microcarrier kralen (A) hebben een volkomen glad oppervlak, terwijl op de juiste manier beklede kralen klaar voor fibrine gel implantatie (B) een ruwe, golf bal-achtige uitstraling hebben. Schaal bar, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol biedt een methode voor het karakteriseren van de complexe stadia en heterotypic cellulaire interacties van kiemen angiogenese doordat de onderzoeker om genetische en imaging benaderingen grondige mechanistisch onderzoek te verrichten in dienst. Als u de test uitvoert, is het essentieel dat efficiënte endothelial coating van de kralen tijdens de kraal agitatie stappen plaatsvindt. Arme endothelial coating zal duidelijk zijn, als de kralen niet lijken te hebben een ruw oppervlak van golf bal-achtige de volgende ochtend gel vóór en in plaats daarvan verschijnen volledig glad worden gemaakt. Zorg om ervoor te zorgen dat de kralen zijn voldoende geresuspendeerde tijdens elke stap van de agitatie door krachtig schudden van de buizen zodat maximale blootstelling van het oppervlak van de parel aan de endotheliale cellen, maar niet zo agressief is dat het veroorzaakt de endotheliale cellen al gehecht aan het worden losgemaakt van de kralen.

Wanneer het toevoegen van pericytes in de test, is het essentieel dat de verhouding van 1 pericyte 5 endotheliale cellen wordt gehandhaafd. Een overmaat van pericytes veroorzaakt te overwoekeren en inhalen de endothelial cel bevolking tijdens de test, en een tekort aan pericytes veroorzaakt slechte dekking van de vaartuigen. Als de juiste celdichtheid wordt gehandhaafd, maar slechte pericyte dekking van de schepen wordt nog steeds waargenomen, moet agitatie tijd met pericytes worden gewijzigd. Het is niet raadzaam dat de mobiele nummers worden gewijzigd. Een alternatieve benadering kan zijn jas de kralen met endotheliale cellen alleen voor 4 uur, dan verwijderen van de endotheliale cellen van de media door het resuspending van de parel en cell oplossing en de media te verwijderen zodra de kralen hebben geregeld, maar vóór de cellen hebben geregeld , vervolgens toe te voegen in pericytes en schudden van iedere 20 min voor een extra uur.

Bij het insluiten van de gecoate kralen in de fibrine clot, is het ook essentieel voor de integriteit van de gel niet te storen door het verstoren van de plaat tijdens clot vorming. Verstoring van de vorming van de matrix kan leiden tot afwijkende kiemen. Het is ook essentieel om ervoor te zorgen dat de juiste kraal dichtheid wordt gehandhaafd in de gel. Als de bevolking van kralen te dicht is, dan kralen dicht bij elkaar zal van invloed zijn op het kiemen van naburige kralen en zal beginnen te ontkiemen jegens elkander en anastomose. Afhankelijk van het uiteindelijke doel van de onderzoeker en de rente in het karakteriseren van schip-schip interacties, kan de kraal dichtheid moet worden aangepast. Een heterogene populatie van geïsoleerde kralen en kralen dicht bij elkaar in de gel kan echter grotendeels variabele gekiemde fenotypen geven. Kraal dichtheid kan worden aangepast door het volume van de oplossing van de kraal toegevoegd aan de buizen FACS tijdens de stap van de opwinding van het protocol te wijzigen, of door een wijziging van het volume van de oplossing van fibrine gewend resuspendeer de kralen gel vóór.

Het is ook essentieel dat gezonde NHLFs bij een dichtheid van 20.000 cellen per mL op de top van elke fibrine clot zijn verguld. Houd er rekening mee dat de continue aanvoer van groeifactoren, geleverd door het actief scheidslijn NHLFs noodzakelijk zijn voor robuuste kiemen tijdens de test. EGM2 NHLF-geconditioneerd is geen voldoende alternatief. 13 als slechte kiemen wordt waargenomen tijdens de test, is het raadzaam dat er een nieuwe fles van volledige media en een nieuwe, gezonde passage van NHLF cellen worden gebruikt.

Hoewel deze test begint met het inspelen op de complexiteit van het cellulaire en fenotypische van angiogenese op een grotere resolutie, vormt het nog steeds een ongenuanceerd systeem ten opzichte van de context voor waar, in vivo . De gekiemde angiogenese die zich voordoen in deze test is bovendien meer analoog aan een gezonde, fysiologische context in tegenstelling tot een pathologische context zoals tumor angiogenese. Toekomstige toepassingen van deze methode kunnen de invoering van extra celtypes (zoals immuun cel populaties die moduleren van angiogenic reacties) omvatten de heterotypic cellulaire interacties verder te recapituleren betrokken in dit complexe proces. De invoering van externe stressoren - zoals een tumor ingebed in de nabijheid van de gekiemde vaartuigen in het fibrine-gel - te simuleren pathologische angiogenese in vitro kan ook worden gebruikt om grondiger, mechanistische karakterisering van de moleculaire pathways geactiveerd in pathologische contexten. Deze vooruitgang is belangrijk voor de verbetering van het vermogen van onderzoekers te bestuderen van de complexe stadia van angiogenese in een meer gecontroleerde omgeving, waardoor uiteindelijk ontdekking en meer diepgaande karakterisering van nieuwe therapeutische opleidingstrajecten voor targeting pathologische angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Drs. Victoria Bautch en Joshua Boucher voor nuttige discussies en advies voor het optimaliseren van standaard kraal gekiemde assay voorwaarden en een gekiemde assay kleuring protocol. S.H.A. was deels gesteund door een subsidie van de National Institute of General Medical Sciences onder toekenning van 5T32 GM007092.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86, (3), 353-364 (1996).
  2. Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
  3. Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8, (5), 491-500 (2009).
  4. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
  5. Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, (3), 311-322 (1995).
  6. Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18, (2), 153-174 (1986).
  7. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21, (2), 193-215 (2011).
  8. Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19, (2), 201-215 (2016).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, (5706), 58-62 (2005).
  10. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  11. Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (5), 1011-1019 (2014).
  12. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, (7070), 937-945 (2005).
  13. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22, (20), 3791-3800 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Very nice

    Reply
    Posted by: huihui a.
    June 5, 2019 - 4:58 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics