Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenez önceden varolan damarlara yeni gemileri büyüme ve oküler ve kardiyovasküler hastalıklar ve embriyo ve geliştirme, yara iyileşmesi, tümör büyüme ve metastaz, gibi birçok biyolojik süreçleri önemli bir bileşenidir. Biyoloji angiogenez özetlemek etkili vitro modelleri uygun şekilde bu işlem çalışma ve sonuçta hedeflenebilir düzenleme mekanizmaları için yeni tedavi stratejileri belirlemek için gereklidir. Boncuk angiogenez tahlil daha önce birden fazla aşamalarında endotel çimlenme özetlemek için göstermiş olduğu tüp bebek. Ancak, bu testin bir sınırlama bir olmaması, endotel – duvar hücre etkileşimleri, endotel hücre moleküler ve fenotipik Yönetmeliği anahtarıdır vivoişlev. Burada verilen protokol duvar hücreleri birleşme boncuk angiogenez tahlil içine bir metodoloji sunar ve sıkı Derneği endotel hücreleri ve perisitlerden çimlenme içinde vitrosırasında gösterir. Protokol Ayrıca siRNA endotel hücrelerinde mekanik çalışmaları için kullanarak hedef genlerin etkili susturulması için bir metodoloji ayrıntıları. Özet olarak, bu iletişim kuralı daha uygun farklı hücre tipleri angiogenez çimlenme dahil modelleri ve terapötik değerlendirme ve roman keşfi için daha fizyolojik-alakalı bir platform sağlayan bir vitro tahlil sağlar angiogenez düzenleme mekanizmaları.

Introduction

Angiogenez uygun embriyo ve yara iyileşmesi için hayati önem taşımaktadır ve bu da kanser ilerleme1 ve koroner arter hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda hastalıklarda kilit rolü oynar. 2 , 3 daha iyi anlamak nasıl angiogenez normal gelişim sırasında oluşur ve nasıl patolojik bağlamlarda yeniden sahip roman, etkili tedavi gelişimi için önemlidir. Önemli aşamaları ve hücre tipleri angiogenez vivo içinde içinde yer alan özetlemek sadık vitro modelleri araştırmacılar daha iyi angiogenez sürüş moleküler mekanizmaları karakterize ve yeni keşifler yapmak için izin vermek için gerekir endotel yönetmelikte.

Nakatsu ve Hughes angiogenez çimlenme, çok bilinen aşamaları uğrar göstermiştir filizlenen bir boncuk tahlil optimize. 4 , 5 burada sunulan yöntemin amacı parakrin ve juxtracrine rollerinin çimlenme endotel hücre duvar hücrelerinin içinde dahil edilebilir Nakatsu ve Hughes tarafından perictyes tahlil içine dahil ederek optimize tahlil üzerine inşa etmektir roman angiogenez çalışmalar. Perisitlerden kendi içinde damar membran gömülü nedeniyle endotel hücreleri ile fiziksel temas korumak hücreleri kapatmak gibi onların rol tarafından tanımlanan duvar hücrelerdir. 6 perisitlerden ve endotel hücreleri karmaşık çapraz-hadis yollar çentik dahil olmak üzere sinyal aracılığıyla sinyal, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ ve diğer pek çok meşgul. 7 , 8 fare modelleri bu sinyal yollar eksik embriyogenez, zavallı vasküler remodeling için önde gelen damarlara ve işlevsel olmayan damarlara geliştirme zavallı pericyte kapsama göstermektedir. 7 Ayrıca, önemli ama oftentimes altında takdir perisitlerden patolojik angiogenez rolü vardır. Örneğin, bir benzersiz tümör damarlara damarları daha olgunlaşmamış, sızan ve zavallı pericyte kapsamı nedeniyle işlevsiz özelliğidir. 9 perisitlerden olup önemli ölçüde tümör kan damarlarının fenotip etkileri ve yanıt anjiogenik ve antitümör tedaviler önemli bir arabulucu olduğunu önerilmiştir. 9 böylece, vitro deneyleri perisitlerden rolü dahil olmak üzere daha eksiksiz endotel Yönetmeliğin önemli mekanizmalar yakalamak için anahtardır.

Şu anda angiogenez çalışmaya istihdam birçok vitro ve ex vivo deneyleri olmakla birlikte, her göz önünde bulundurulacak eksiklikler bulunmaktadır. Endotel proliferasyon ve endotel geçiş deneyleri, gibi bazı aşırı Basitleştirilmiş ve odak üzerinde doku kültürü plastik yalıtılmış bir ortamda bir endotel fonksiyonları üzerine. 10 Matrigel tüp oluşumu tahlil,10 ama bu deneyleri hala oversimplified ve daha fazla göç ve de novo vasküler endotel hücreleri yeteneği üzerinde odaklanmak gibi diğer deneyleri bir daha fazla 3 boyutlu (3D) ayarı, ortaya yapıları, önceden varolan damarlara çimlenme aksine. Ayrıca, bu deneyleri hiçbiri duvar hücre tipleri dahil. Perisitlerden ana organ mevcut dahil ex vivo modeli yüzük aort tahlil gibi ama bu modellerin genetik manipülasyon olduğunu çok daha nakavt veya transgenik fare modelleri üreten gerekliliği nedeniyle zor yollar ilgi. Endotel çimlenme, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve 3D matris bile anastomoz ve Lümen oluşumunda modelleri çünkü tahlil çimlenme boncuk idealdir. 4 tahlil Sadakatle çimlenme, hala doğrudan genetik değişiklik endotel hücreleri veya daha kontrollü bir ortamda perisitlerden için izin verirken birçok farklı aşamalarında mekanik değerlendirmesini sağlar. Çimlenme boncuk içeren fibrin pıhtısı kolayca sabit, lekeli ve çimlenme farklı aşamalarında görüntüsü; Bu lahanası da çimlenme, gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştirmek için canlı bir görüntüleme odasında yerleştirilebilir. Burada sunulan metodoloji angiogenez derinlik fenotipleme ile temel mekanizmaları ve anjiogenezi sırasında aktif yollar ayrıntılı analizi eğitimi için idealdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. gün:

1. geçici Transfection endotel hücrelerinin

  1. İstenirse, geçici transfection, insan göbek damar endotel hücreleri (gen düzenleyici oligonucleotides (örneğin mikro RNA'lar veya küçük müdahale RNA (siRNA)) ve uygun lipofectamine reaktif göre kullanarak HUVEC) gerçekleştirmek prosedürü yerine getirin.
    Not: Bu protokol özel siRNA dizileri ve ticari transfection reaktifi (bkz: malzemeler tablo) ile ters transfections gerçekleştirme büyük başarı elde etti. Yazarlar diğer transfection protokolleri ve Kimyasalları bu tahlil ile test etmedim. Listelenen reaktifler kullanarak geriye doğru transfection için adımlar şunlardır:
  2. Liyofilize çift veya mikroRNA'lar nükleaz boş su 20 µM bir konsantrasyon, yeniden oluşturma.
  3. Transfection çözümleri aşağıdaki oranında olun: siRNA veya mikroRNA 9 µL ile 1 mL serum Ücretsiz medya.
  4. Çözüm tahrik ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya sağlar.
  5. Transfection reaktif 18 µL ekleyin ve kışkırtmak.
  6. 20-40 dk, çözüm kışkırtmaktan için oda sıcaklığında her 10-15 dk kuluçka süresi için kuluçkaya çözüm izin verin.
  7. Transfection çözüm kuluçka iken, bir hücre dekolmanı çözümü (örneğin, Accutase) kullanarak HUVEC bağlantısını kesin. Bir T175 şişesi için 10 mL, fosfat tamponlu tuz (PBS), ile şişeye yıka ve hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve şişeye 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  8. Komple medya 5 mL T175 şişeye ekleyin, hücre süspansiyon şişesi ve 3 dak için 1200 rpm'de santrifüj kaldırın.
  9. Bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet EGM2 mL başına 1 X 106 hücre yoğunluğu, resuspend.
    Not: Bu protokol endotel hücre büyüme standart büyüme faktörü kurşun kiti yanı sıra ek bir % 10 içeren orta (EGM2) kullanarak büyük bir başarı olmuştur FBS.
  10. Transfection çözüm kuluçka tamamladığında, 1 mL çözeltisi 10 cm plaka plaka ve HUVEC süspansiyon 1 mL üstüne ekleyin.
  11. Son hacim için 9 mL 10 cm tabak içinde getirmek için tam ortam bir ek 7 mL ekleyin.
  12. Hücre yeterince hücre tahlil'sonraki adımlarında için kullanılabilir olduğundan emin olmak her transfection koşul için en az iki 10 cm tabak oluşturur.
    Not: Bu koşullar gen düzenleyici Oligonükleotid 20 son çalışma konsantrasyon içinde yol nM. Yazarlar bu koşullar % 60-80'i nakavt hedeflerine ilgi için gen ifadesinin neden bulduk. Diğer araştırmacılar transfection koşulları deneysel onların ihtiyaçlarına göre en iyi duruma getirmek gerekir.
  13. SiRNA kompleksleri ile taze komple medya medya 4-6 h mesaj ilavesi değişimi.
    Not: Bu protokol geçişi kullanarak geliştirilmiştir 1-2 HUVEC.

2. gün

2. Microcarrier boncuk endotel hücreleri ile kaplanması

  1. Microcarrier boncuk (örneğin, Cytodex 3) 60.000 boncuk/mL PBS ve basınçlı kap bir konsantrasyon, yeniden oluşturma.
    Not: microcarrier boncuk bir konsantrasyon yaklaşık 3 x 106 boncuk gram başına gelir. Sulandırmak boncuk boncuk boncuk yoğunluğu yaklaşık 60.000 boncuk/mL ile almak için PBS mL başına 20 mg oranında.
  2. Yuvarlak popolu Floresans aktif hücre sıralama (FACS) tüpler için istediğiniz sayıyı tam medya aliquot 1 mL.
  3. Microcarrier boncuk süspansiyon, 20 µL pipet (Boncuk çözüm de pipetting önce resuspended emin olmak için göz kulak) her tüpün içine.
    Not: Büyük olasılıkla olacak dramatik değişkenlik son çalışma konsantrasyon boncuk bir verilen microcarrier boncuk süspansiyon mevcut. Boncuk boncuk konsantrasyon çözüm büyük ölçüde değiştirebilir plastik ve cam kapları kenarlarına kolayca uygun. FACS tüp microcarrier boncuk süspansiyon, her toplu iş için eklenen boncuk çözüm en uygun hacmi ampirik olarak araştırmacı tarafından belirlenecektir gerekir. Burada gösterilen sayilar daha bir başlangıç noktası olarak hizmet etmek içindir. İdeal olarak, 10-20 boncuk 24 iyi plaka tahlil sonunda iyi başına fibrin jel içinde gömülü böylece koşulları optimize edilmelidir. Tahlil için boncuk numaraları duruma getirilmesi ile ilgili olarak aşağıda tartışma bölümünde daha fazla tartışma bakın.
  4. Transfected HUVEC 24 s yazı transfection hücre dekolmanı çözümü aşağıdaki gibi kullanarak bağlantısını kesin:
    1. Hücreleri PBS, 5 mL ile her 10 cm tabak yıkama ve hücre dekolmanı çözümü 2 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    2. 1 X 106 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon hücreleri resuspend.
  5. Hücre süspansiyon (Yani 1 X 106 HUVEC) 1 mL boncuk içeren her FACS tüp ekleyin.
  6. Yavaşça FACS tüpler her 20 dk boyunca 4 37 ° C (3,4 adıma devam değilse) veya 2.5-3 h h (3.2 adıma devam eğer) tahrik.
    Not: Bu süre ve sıklıkta ajitasyon ampirik olarak belirledi tahlil çimlenme temel boncuk optimize önceki araştırmacılar tarafından. 4 Ajitasyon diğer frekansları ve boncuk kaplama adım sürelerini yazarlar tarafından sınanmamıştır.

3. perisitlerden HUVEC kaplı Microcarrier boncuk üzerinde sıralı kaplama

  1. Hücre dekolmanı çözümü (tripsin) aşağıdaki gibi kullanarak 10T1/2 hücreleri (perisitlerden) ayırma başlar:
    1. PBS, 10 mL ile T175 şişeye yıka o zaman tripsin 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. 2 X 105 hücreleri/0.5 mL tam medyada bir konsantrasyon, 10T1/2 resuspend.
      Not: Hücreler Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) üzerinden satın alındı.
      Not: Kültür 10T1/2 hücre içinde en az gerekli orta (MEM) penisilin streptomisin %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiştir.
  2. Tantanacı boncuk + HUVEC çözüm, 2.5-3 h sonra boncuk ve serbest yüzer HUVEC tüp altına yerleşmek izin vermek için 5 dakika bekleyin.
  3. 0.5 mL tam medya P1000 pipet kullanarak her tüpünden kaldırın ve 2 x 105 10T1/2 0.5 mL hacminde tam medyada her FACs tüp ekleyin. Hücre ve boncuk çözüm tahrik ve 37 ° C'de kuluçkaya devam Boncuk 4 h toplam için heyecanlı kadar her 20 dk kışkırtmak devam edin.
    Not: 5 HUVEC oranı: boncuk üzerinde 1 pericyte uygun pericyte kapsama damarlarının korumak için önemlidir.
    Not: Aşağıdaki alternatif adımlar yerine protokol bu noktada izlenebilir:
  4. Boncuk ve HUVEC sadece 4 h için tahrik.
  5. HUVEC kaplama microcarrier boncuk 4 h tamamlandıktan sonra son kez tüpler kışkırtmak, 30-60 s bekleyin sonra derhal 1,5-1,75 mL çözeltisi FACS tüpünden kaldırın.
    Not: Bu çoğu medya birçok serbest yüzer HUVEC kaldırılacak iken yerleşmek için boncuk için yeterli zaman izin vermelidir.
    1. 2 X 105 10T1/2 tam medya ekleyin ve FACS hacmi getirmek 2 mL tüp.
    2. Yavaşça FACS tüpler her 20 dakikada bir ek saat için tahrik.
  6. Tantanacı tamamlandıktan sonra yavaşça tüpler son kez kışkırtmak ve hemen tüm çözüm (2 mL) kaldırın ve 6 cm plakasına ekleyin. Komple medya bir ek 3 mL her plakasına eklemek ve tabakları da 37 ° C kuluçka makinesine gecede yerleştirin.

3. gün

4. Fibrin jel çözümleri hazırlanması

  1. Çalışma çözümleri konsantrasyonu 1 mg/mL PBS, aprotinin ve Trombin 50 adet/mL, hazır olun.
    Not: Bu çözümlerin her biri büyük bir hisse senedi yapılan ve en az bir yıl için 4 ° C'de depolanan.
  2. Fibrinojen taze bir çözüm 2 mg/mL konsantrasyonu olun. Çözüm heyecanlı FACS tüp başına 2.5 mL için yeterli bir çözüm yapmak.
    1. Çözüm çözüm gitmek fibrinojen izin vermek üzere 10 dk 37 ° C su banyosunda ısıtın.
    2. 37,5 µL aprotinin çözüm başına 1 mL fibrinojen çözeltisi ekleyin.
    3. Steril-filtre çözümü ve oda sıcaklığında kenara.

5. boncuk jel implantasyon için hazırlanması

  1. Tüm boncuk endotel hücreleri tarafından yeterince kaplı olduğunu emin olmak için 20 X objektif kullanma mikroskop altında microcarrier kaplı boncuk içeren yemekler inceleyin.
  2. Şiddetle onları 6 cm plaka ayırmak ve çözüm bir tüpün içine yerleştirmek için hücre kaplama çözüm pipette. Plaka 2 X ek kez komple medya ve plaka şeklinde olması gereken tüm kalıntı boncuk toplamak için tüp transferi ile yıkayın.
    1. Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek ve p1000 pipet endotel hücre kaplı boncuk kesme stresi en aza indirmek için kullanın.
    2. SiRNA devirme verimliliği endotel hücrelerinde değerlendirirken, adım 2, gerektiğinde salt HUVEC kaplı boncuk bir plaka var emin olun. O zaman bu adımda (5.2), boncuk bağlantısını kesin ve HUVEC plaka RNA izolasyon ve qPCR çözümleme bağlı kalan toplamak.
  3. Boncuk çözüm tüp altına yerleşmek için izin vermek için 3 dakika bekleyin.
  4. P1000 pipet ucu kullanarak boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın (vakum aspiratör kullanmayın).
  5. Her tüpün tam medya 1 mL ekleyin ve boncuk resuspend.
  6. Boncuk altına yerleşmek izin vermek için 30-60 s bekle. Sonra büyük bir kısmını mümkün P1000 pipet boncuk Pelet bozmadan kullanmakla süpernatant kaldırın. Yanlışlıkla boncuk Pelet kaldırma olasılığı büyük ölçüde artırılır bir vakum aspiratör kullanmayın.
  7. 5.5 veya 5.6 iki ek kez arasındaki adımları yineleyin. Daha fazla 6 cm plaka mümkün olduğunca çok fazla HUVEC kaplı boncuk FACS tüpünde yüzen hücreleri daha hızlı bir şekilde yerleşmek kaldırılırken değil ayırdıktan serbest yüzer HUVEC kaldırmak için hedeftir.
  8. 1 mL tam medya için boncuk ekleyin.

6. katıştırma Fibrin jel boncuklar kaplı

  1. P1000 pipet kullanarak her FACS tüp boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın.
  2. Boncuk 2.5 mL fibrinojen çözüm resuspend.
  3. Her şey bir 24-şey cam popolu tabak istenen içine Trombin çözüm 13 µL pipet. Kaplama cam popolu bir tabak içinde filizi en uygun görüntüleme etkinleştirmek için gereklidir.
    Not: birden fazla 5-10 dk önce bir sonraki adım için iyi oturan Trombin bırakmayın.
  4. Her şey için 0.5 mL boncuk/fibrinojen çözeltisi ekleyin.
    1. Her zaman çözüm pipetting önce de boncuk çözüm resuspend emin olun.
    2. Dikkatle doğrudan kuyuda zaten mevcut Trombin pipet için dikkatli. Yavaş yavaş aşağı yukarı 2 - 3 kez için pipet herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici çözüm, iyice karıştırın.
    3. Pipet ucu kuyular arasında değiştirdiğinizden emin olun.
    4. Taşımak ya da herhangi bir hareket jel oluşumu engel olabilecek gibi pıhtılaşma, ilk fibrin sırasında herhangi bir noktada plaka rahatsız değil dikkatli.
  5. Mahalle için oda sıcaklığında 30 dk içinde oturan plaka bırakın.
  6. Dikkatle plaka 37 ° C kuluçka jel tamamen kuvvetlendirmek izin vermek ek bir 1,5-2 h için transfer

7. fibroblastlar Fibrin jel üstüne kaplama

  1. Son 30 jel güçlendirilerek, min sırasında Normal insan akciğer fibroblastlar (NHLF) aşağıdaki şekilde bağlantısını kesin:
    1. Hücreleri bir T175 şişesi PBS, 10 mL ile yıkayın sonra hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. 20.000 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon, NHLF resuspend.
      Not: NHLF hücreleri ile Dulbecco modifiye kartal orta (%10 FBS ve % 1 ile DMEM) kültürlü penisilin streptomisin.
  2. NHLF hücre Süspansiyon Jel her şey üzerine 1 mL plaka ve kuluçka makinesine koyun.
  3. Komple medya tahlil süresince her gün değiştirin.

8. fibrin jel boncuk implantasyon 2-7 gün boyunca çimlenme izleyin. Çimlenme için gereken sürenin uzunluğu HUVEC geçit ve çok sayısına bağlı olacaktır.

9. fiksasyon tahlil çimlenme

  1. Bir kez yeterli çimlenme tedavi grupları arasındaki fenotipik farkı belirlemek, Bütün wells PBS 2 mL ile bir kez yıkamak için oluştu.
  2. Her şey için hücre dekolmanı çözümü 0.5 mL ekleyin ve 5 min için 37 ° C kuluçka plaka yerleştirin.
  3. Plaka da kuluçka kaldır ve plaka tarafında dokunun.
    Not: Bu adımın amacı olabildiğince fazla fibrin jel antikor penetrasyon jel gibi görüntüleme jel içine kolaylaştırmak mümkün olduğunca üst üste büyüyen NHLF hücrelerinin kaldırmaktır. Hücre dekolmanı çözümü toplam kuluçka zamanla NHLF kaldırma optimize etmek için ayarlanması gerekebilir. Araştırmacılar hücre dekolmanı çözümü jel nüfuz ve endotel yapıları içinde engellemeden başlar gibi jel aşırı süreler için kuluçkaya değil için uyardı.
  4. Bir kez NHLF hücreleri yeterli miktarda çıkarmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL tam medya ile gidermek.
  5. Müstakil NHLF ve bir vakum aspiratör kullanarak medya Aspire edin ve wells bir kez PBS 1 mL ile yıkayın.
  6. Her şey için PBS içinde 300 µL % 2 paraformaldehyde çözüm ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  7. % 2 paraformaldehyde çözümü kaldırmak ve her biri de 3 kez PBS 1 mL 3 dakika oda sıcaklığında yıkayın.
    Not: Lütfen % 2 paraformaldehyde çözüm çevre sağlığı ve güvenliği (EHS) yönergeleri doğrultusunda uygun şekilde atın.
    1. Her şey ve 4 ° C'de hazır kadar leke veya lahanası resim depolamak için PBS 1 mL ekleyin.

10. tahlil çimlenme boyama

  1. Triton-X 100 her PBS'iyi ve 30-45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya % 0,5 300 µL ekleyin.
  2. Bir vakum aspiratör kullanarak, Triton-X100 kaldırın ve 3 kez her 5 min için PBS içinde yıkayın.
  3. Her jel çözüm engelleme 500 µL ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    Not: Engelleme çözüm aşağıdaki bileşenlerden oluşur: %1 sığır serum albumin (BSA), %5 FBS, % 0,1 ara-20 ve % 1 Anti-serum (ikincil antikorlar türetildiği aynı tür) PBS içinde.
  4. Engelleme çözüm her kuyudan kaldırın ve her şey için birincil antikor içeren boyama çözümün 300 µL ekleyin.
    Not: Boyama çözüm engelleme çözüm olarak, ancak mevcut anti-serum aynıdır. Yazarlar, 1: 200 1: 400 için dilutions birincil antikorlar ile kuluçka başarıya sahiptir.
  5. 4 ° C'de 24 h için çözüm boyama içinde birincil antikorlar kuluçkaya
  6. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve 3 kez TBS içinde % 0.5 ara 20 dk her oda sıcaklığında hafif sallanan ile yıkayın. Üçüncü yıkama sonra taze yıkama arabellek ile tekrar yerine ve gecede 4 ° C'de depolayın.
  7. Oda sıcaklığında 2 h için çözüm boyama içinde seyreltilmiş floresan antikor ikincil 1: 1000 ile kuluçkaya.
  8. İkincil antikor boyama çözümü kaldırmak ve 5 kez 20 dk için her oda sıcaklığında hafif sallanan ile % 0.5 arayı içeren TBS ile yıkayın.
  9. PBS nükleer leke sulandırmak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    Not: Bu protokol PBS seyreltilmiş Höchst 1:10000 ile büyük bir başarı olmuştur.
    Not: Görüntüleme önce nükleer boyama çözümü kaldırmak için gerek yoktur.
  10. Görüntü en uygun floresan sinyal yakalamak için boyama tamamlama bir kaç gün içinde.

11. tahlil Quantification çimlenme

  1. Filizi yansıma sonra görüntü dosyaları ImageJ almak ve Brüksel lahanası saymak için sayma aracı veya Filiz uzunlukları ölçmek için Çizgi aracını kullanın.
    Not: Lahanası endotel çıkıntılar uzunluğu sıfırdan büyük veya eşit hangi onlar çimlenme boncuk çapı olarak tanımlanır. 11 Filiz uzunluğu Filiz Filiz ucuna boncuk kapalı çıkıntılı başlar noktadan mesafe olarak ölçülebilir. Ortalama uzunluğu boncuk başına Filiz ve filizi boncuk başına ortalama sayısı angiogenez çimlenme gen damping fenotipik etkiler değerlendirmek için yararlı ölçümlerdir. Tedavi grubu başına en az bir filiz içeren boncuk ortalama sayısı da bir ölçü olarak çimlenme sağlamlık değerlendirmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iletişim kuralı iki hücre türleri in vitro sıkı bir Derneği için izin verir ve perisitlerden varlığı çimlenme (şekil 1A, B) oluşumunu tamamlar. Sağlayan protokol Ayrıca etkili susturmak (örneğin RNA müdahale yoluyla) bir genin bir hücre tipi faiz (özellikle de endotel hücreleri VEGFA) veya perisitlerden PDGFRβ gibi7,12 ilgi tahlil sırasında hangi tahlil içinde filizlenen fenotip inhibisyonu için çevirebilir. Bu iletişim kuralını kullanan araştırmacılar paralel perisitlerden vasküler işlevlerindeki benzersiz katkıların daha ayrıntılı araştırmaya pericyte kaplı çimlenme tahlil için bir standart endotel hücre Sadece filizlenen tahlil gerçekleştirmek için teşvik edilir ve fenotipleri okudu.

Bu protokolde tanımlanan koşullara sağlam fibrin jel çimlenme geçmesi mümkün olacak yeterince kaplı boncuk (şekil 2A, B) elde etmek için uygun açısından önemlidir. Yazarlar bu kuyunun içinde farklı vasküler yapılar ayırt etmek tüm iyi ve sonraki yetersizlik pericyte büyüme perisitlerden (örneğin, perisitlerden 1 HUVEC 1 10T1/2 oranında kaplı) sonucu aşırı bulduk.

Figure 1
Şekil 1. Perisitlerden sıkı bir şekilde tahlil çimlenme boncuk endotel gemiler ile ilişkilendirmek. (A)HUVEC sadece kaplamalı boncuk ile standart çimlenme tahlil. (B) Confocal mikroskobu görüntüleri tahlil çimlenme pericyte perisitlerden çimlenme tahlil endotel damarlarının etrafında sarın ama onların çimlenme engel değil göstermektedir. Mavidir Höchst (nükleer leke); CD31 kırmızı (endotel leke), ve Desmin (pericyte leke) yeşildir. Tüm barlar, 50 µm. ölçek Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Kaplamalı boncuk görünüm gibi kaba, bir golf topu var. Çıplak microcarrier boncuk(a)var tamamen pürüzsüz bir yüzey, boncuk fibrin jel implantasyon (B) için hazır uygun şekilde kaplı bir kaba, golf topu gibi bir görünüm var ise. Ölçek bar, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı için karmaşık aşamaları ve araştırmacı ayrıntılı mekanik soruşturma yapma genetik ve görüntüleme yaklaşımlar istihdam sağlayarak angiogenez çimlenme heterotypic hücresel etkileşimlerin karakterize bir yöntem sunuyor. Tahlil gerçekleştirirken, verimli endotel kaplama boncuk boncuk sırasında ajitasyon adımlar yer alır gereklidir. Zavallı endotel kaplama boncuklar bir golf topu gibi pütürlü yüzeyi jel implantasyon öncesinde ertesi sabah olması ve bunun yerine tamamen düzgün görünür gibi görünüyorsa belirgin yapılacaktır. Boncuk yeterince şiddetle endotel hücrelere boncuk yüzeyinin maksimum etkiyi sağlamak için tüpler Tantanacı tarafından her ajitasyon adımı sırasında resuspended sağlamak için özen, ama değil çok agresif öyle zaten endotel hücreleri neden olur boncuk müstakil olmak için bağlı.

Perisitlerden tahlil içine eklerken, endotel hücrelere 5 1 pericyte oranı korunur önemlidir. Perisitlerden aşırı sarmak ve endotel hücre popülasyonlarının tahlil sırasında sollamak onları neden olur ve gemilerin zavallı kapsama perisitlerden bir eksikliği neden olur. Uygun hücre yoğunluğu korunur, ancak yoksul pericyte kapsama gemilerin hala görülmektedir perisitlerden zamanla ajitasyon değiştirilmesi gerekebilir. Cep numaraları değişmiş tavsiye edilmez. Alternatif bir yaklaşım olabilir 4 h için sadece endotel hücreleri ile boncuk kat için tıklatıp boncuk resuspending tarafından medyadan endotel hücre kaldırma ve hücre çözümü ve boncuk yerleşmiş bir kez ama önce hücreleri medya kaldırma yerleşmiş , o zaman perisitlerden içinde ekleme ve her 20 dakikada bir ek saat için kışkırtmaktan.

Kaplamalı boncuk fibrin pıhtısı katıştırırken, pıhtı oluşumu sırasında Kalenin alt üst etmelerinden jel bütünlüğünü bozmamaya da önemlidir. Bozulma matris oluşumu anormal çimlenme neden olabilir. Uygun boncuk yoğunluklu jel içinde korunur emin olmak için önemlidir. Boncuk nüfusu çok yoğun ise, yakın bir başka boncuk boncuk komşu çimlenme etkiler ve birbirlerine karşı Filiz ve anastomose başlayacak. Araştırmacı ve gemi-gemi etkileşimleri karakterize ilgi nihai hedefi bağlı olarak, boncuk yoğunluğu değiştirilmesi gerekebilir. Ancak, izole boncuk ve boncuk jel içinde birbirlerine yakın bir mesafede türdeş olmayan nüfusu büyük ölçüde değişken çimlenme fenotipleri verebilir. Boncuk yoğunluğu FACS tüpler için protokol ajitasyon adımı sırasında eklenen boncuk çözüm hacmi değiştirme veya jel implantasyon öncesinde boncuk resuspend eskiden fibrin çözüm hacmi değiştirerek ayarlanabilir.

Sağlıklı NHLFs mL başına 20.000 hücre yoğunluğu, üstünde tepe-in her fibrin pıhtısı kaplama esastır. Lütfen aktif bölme NHLFs tarafından sağlanan büyüme faktörlerinin sürekli tedarik sağlam tahlil sırasında çimlenme için gerekli olduğunu unutmayın. NHLF klimalı EGM2 yeterli bir alternatif değildir. 13 zavallı çimlenme sırasında tahlil gözlem yapılırsa, komple bir medya taze bir şişe ve NHLF hücrelerinin yeni, sağlıklı bir geçit kullanılır önerilir.

Her ne kadar bu tahlil angiogenez büyük çözünürlükte hücresel ve fenotipik karmaşıklığı gidermek başlıyor, hala gerçek, vivo içinde bağlam göre oversimplified bir sistemini temsil eder. Buna ek olarak, bu tahlil meydana gelen çimlenme angiogenez daha sağlıklı, fizyolojik bağlamında tümör angiogenez gibi patolojik bir bağlam aksine benzerdir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamalar ek hücre türleri (örn. anjiogenik yanıtları modüle bağışıklık hücre popülasyonlarının) giriş içerebilir karmaşık bu süreçte daha fazla heterotypic hücresel etkileşimlerin özetlemek için söz konusu. Giriş dış stresler - patolojik angiogenez vitro benzetimini yapmak için fibrin jel - çimlenme damarları yakınında gömülü bir tümör gibi aynı zamanda daha kapsamlı, mekanik karakterizasyonu izin vermek için istihdam edilebilir Moleküler yolları patolojik bağlamlarda aktif. Bu gelişmeler araştırmacılar karmaşık aşamaları angiogenez sonuçta keşif daha derinlemesine malzemelerin ve hedefleme için yeni tedavi yolları etkinleştirme daha kontrollü bir ortamda çalışma yeteneğini artırmak için önemli olacak patolojik angiogenez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz yararlı tartışmalar için Drs. Victoria Bautch ve Joshua Boucher teşekkür ederim ve standart boncuk en iyi duruma getirme konusunda tavsiye tahlil koşulları ve filizlenen bir tahlil Protokolü boyama, çimlenme. S.H.A. kısmen bir hibe--dan ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü altında tarafından desteklenen 5T32 GM007092 ödül.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86, (3), 353-364 (1996).
  2. Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
  3. Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8, (5), 491-500 (2009).
  4. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
  5. Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, (3), 311-322 (1995).
  6. Sims, D. E. The pericyte--a review. Tissue Cell. 18, (2), 153-174 (1986).
  7. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21, (2), 193-215 (2011).
  8. Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19, (2), 201-215 (2016).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, (5706), 58-62 (2005).
  10. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  11. Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (5), 1011-1019 (2014).
  12. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, (7070), 937-945 (2005).
  13. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22, (20), 3791-3800 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Very nice

    Reply
    Posted by: huihui a.
    June 5, 2019 - 4:58 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics