בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הבנת מחסום הדם - מוח הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological הוא קריטי עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות להחזיק את ההבטחה לשיפור משלוח סמים המוח, לשפר את המוח הגנה, מתייחסים המוח הפרעות. עם זאת, לומד את הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח הוא מאתגר. לפיכך, יש צורך קריטי עבור מודלים המתאימים. בהקשר זה, נימים המוח מבודדים מרקמות המוח האנושי מייצגים כלי ייחודי כדי ללמוד מכשול לתפקד קרוב המצב האנושי ויוו ככל האפשר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד נימים מרקמות המוח האנושי-תשואה גבוהה ועם איכות עקבית וטוהר. נימים מבודדים מרקמות המוח האנושי טריים באמצעות המגון מכני, צפיפות-הדרגה צנטריפוגה סינון. לאחר הבידוד הנימים המוח האנושי יכול לשמש ליישומים שונים כולל מבחני דליפה, הדמיה תא חי המבוסס על החיסון מבחני ללמוד ביטוי חלבון, פונקציה, פעילות אנזים או איתות תאיים. המוח האנושי מבודד נימים הם מודל ייחודי התירי ברגולציה של הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח. מודל זה יכול לספק תובנות לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) פתוגנזה, אשר יסייע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

מחסום הדם - מוח הוא ממשק פיקוח הדוק בין הדם לבין המוח שקובע מה נכנס ומה יצא המוח. מבחינה אנטומית, תאי אנדותל להלחין את מחסום הדם - מוח וצורות מורכבות, רציף לרשת הנימים. מבחינה פיזיולוגית, רשת נימי זו מספקת את המוח עם חמצן וחומרים מזינים בזמן בו זמנית חיסולו של פחמן דו-חמצני, חומרי פסולת מטבולית. חשוב לציין, ראיה תומכת כי השינויים המכשול לתרום פתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, שבץ מוחי1,2,3,4,5 , 6 , 7. המוח תאי אנדותל גם לשמש מחסום לטיפול על ידי חסימת ספיגת התרופה לתוך המוח, למשל., כימותרפיה של גליובלסטומה בעקבות הגידול כריתה8,9, 10. בהקשר זה, המוח האנושי מבודד נימים מייצגים ייחודי שמחוץ מחסום הדם - מוח מודל הדומה מכשול מאפיינים ויוו, מה שמאפשר עבור המחקר של המכשול ותפקוד לקוי בבריאות ומחלות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבודד נימים המוח של המוח האנושי באיכות נימי בעקביות גבוהה, תשואה ללמוד את מחסום הדם - מוח.

בשנת 1969, Siakotos et al. 11 היו הראשונים לדווח את ניתוקה של נימי הדם במוח של רקמת המוח שור ואנושי שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה וזכוכית חרוז עמודה ההפרדה. גולדשטיין. מאוחר יותר, et al. 12 חל שיפור בשיטה זו על-ידי הוספת שלבים מרובים סינון כדי להקטין את כמות רקמת צריך ללמוד נימים המוח מבודד חולדות, תוך שמירה על פעילות חילוף החומרים של הגלוקוז תחבורה. מאז, חוקרים אופטימיזציה ההליך בידוד נימי פעמים רבות, שיפור המודל נימי שיטת והמוח עם כל איטרציה13,14,15. לדוגמה, Pardridge et al. 16 מבודד שור נימים באמצעות עיכול אנזימטי במקום מכני המגון ולאחר מכן עברה השעיה נימי דרך מסנן רשת מיקרומטר 210 ו עמודה חרוז זכוכית. לבצע שינויים אלה משופרת הכתם הדרה trypan blue של נימי הדם במוח מבודד, לפיכך, גדלה הכדאיות תא אנדותל. בתחילת שנות התשעים, Dallaire et al. 17 מבודדים נימים שור, חולדה היו ברורות של זיהום עצביים ומתוחזק פעילות חילוף החומרים של γ-glutamyl transpeptidase (וγ-GTase), אלקליין פוספטאז. בשנת 2000, מילר ואח. 18, המשמש עכברוש מבודד, המוח חזירי נימים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להראות ההצטברות של סובסטרטים תחבורה לתוך לומן של נימים. לאחר מכן, המעבדה שלנו ממשיכה לייעל את ההליך בידוד נימי המוח, הקמנו מבחני תחבורה כדי לקבוע P-גליקופרוטאין (P-gp)19,20,21, סרטן השד ההתנגדות חלבון (BCRP)22,23, ו רב תרופתיים חלבון 2 (Mrp2) פעילות תחבורה24 . בשנת 2004, פרסמו שני דוחות כאן היינו מבודדים עכברוש המוח נימים לחקור איתות המסלולים השונים. ב- Hartz ואח. 21, מצאנו כי ה-פפטיד endothelin-1 במהירות, הפיכה צמצם P-gp תחבורה פונקצית נימים המוח על ידי משחק דרך endothelin קולטן B (ETB) קולטן, תחמוצת החנקן סינתאז (NOS), חלבון קינאז C (PKC). ב. באוור et al. 19, להדגים ביטוי של הקולטן pregnane X קולטן גרעיניים (PXR), הראה PXR-אפנון של P-gp הביטוי ואמצעי התחבורה פונקציה של נימי הדם במוח. בניסויים עם העכברים הטרנסגניים PXR humanized, אנחנו הרחיבה את הקו הזה של מחקר והראו ויוו הידוק של המכשול באמצעות upregulating קולטני P-gp באמצעות הפעלת hPXR25. בשנת 2010 Hartz ואח. 26 להשתמש בגישה זו לשחזר P-gp חלבון ביטוי ולהעביר פעילות בעכברים חלבון (מא) הטרנסגניים קודמן עמילואיד אנושי זה overexpress בשמחה. יתר על כן, שחזור P-gp ב מא עכברים הקטינה באופן משמעותי עמילואיד ביתא (Aβ)40ו- Aβ42המוח רמות.

בנוסף למדתי איתות המסלולים, נימים המוח מבודדים ניתן לקבוע שינויים בחדירות נימי אשר אנו מתייחסים כאל זליגת נימי. בפרט, וזמינותו זליגת טקסס האדום משמש כדי להעריך את דליפת הפלורסנט טקסס האדום של לומן נימי לאורך זמן נתונים אלה משמשות לאחר מכן לנתח את זליגת המחירים. המחירים זליגת נימי מוגברת בהשוואה לאלו של שליטה נימים מצביעים על שינויים שלמות פיזית מחסום הדם - מוח2. זה חשוב כי יש מצבי מחלה רבים הקשורים עם מחסום הפרעה, למשל., אפילפסיה, טרשת נפוצה, אלצהיימר, מוח טראומטית פציעה27,28,29, 30. קבוצות אחרות גם נעזרו נימים מבודד להבחין איתות המסלולים המווסתים ביטוי חלבון ופעילות התחבורה של חלבונים31,32,33,34, 35,36,37. בסופו של דבר, המשכנו למטב את שיטה זו עבור בידודו של המוח האנושי נימים ו, לאחרונה, הראנו ביטוי מוגבר של P-gp-האדם מחסום הדם - מוח בחולים עם אפילפסיה בהשוואה לאנשים ללא פרכוס שליטה38 . התפתחויות אלה יחדיו, מדגימים כי המוח מבודדים נימים יכול לשמש מודל רב תכליתי ללמוד מכשול פונקציה.

שונים ויוו, ex-vivo, ומודלים במבחנה מחסום הדם - מוח שימשו מחקר בסיסי, תעשייתי והתרופות הקרנה, בעיקר עם המטרה של בדיקת משלוח הסמים המוח39,40,41 ,42,43,44. בנוסף מבודד שמחוץ נימים המוח, המודלים הנוכחיים של מחסום הדם - מוח כוללים סיליקו מודלים, במבחנה תרבית תאים של תאי אנדותל נימי המוח מבודדים או שורות תאים מונצחים מ שונים מינים, in vitro לקשרי תרבות של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) כי להבדיל לתוך תאי אנדותל נימי המוח, ומודלים microfluidic על שבב.

אין סיליקו מודלים משמשים בדרך כלל פיתוח תרופות לבחירת המועמדים סמים המבוסס על הקליטה החזוי, הפצה, חילוף החומרים ומאפיינים הפרשה (גלית נחמני). שיטות כגון מבנה כמותית-מאפיין יחסים (QSPR) מודלים ודגמים היחסים (QSAR) מבנה כמותית-פעילות הן השיטות הפופולריות בשימוש תפוקה גבוהה ההקרנה של ספריות לחזות המוח חדירה של מועמדים סמים 45 , 46. מודלים אלה שימושיים מסך מולקולות למאפייני חדירה מכשול.

Betz. et al. 47 נוסדה monolayers של תאי אנדותל נימי המוח מתורבתות כמו מערכת מודל מחסום הדם - מוח במבחנה . במבחנה תא תרבות מודלים באמצעות רקמות טריים או קווים מונצחים תא אנדותל כגון תאי אנדותל microvessel במוח האנושי (hCMECs) יכול להיות עוד כלי ההקרנה תפוקה גבוהה עבור המוח חדירה או מחקרים מכניסטית. עם זאת, של התרבות תאי אנדותל נימי מוח חסר גזירה הפיזיולוגיות של זרימת הדם בתוך נימי לומן מוגבלים בסיבוכיות הכולל וחיסונים, עוברים שינויים בביטוי, לוקליזציה של רכיבים חשובים מכשול כגון חלבונים צומת חזק, קולטנים משטח, שנאים, אנזימים, יון ערוצי48,49,50. לעומת זאת, monolayers אנדותל נגזר hPSCs, יש חדירות נמוכה סוכרוז לעומת תרבויות hCMEC/D3, מכילים את הביטוי מקוטב של מובילי מחסום הדם - מוח מסוימים, מולקולות אדהזיה צמתי צר51, 52. עם זאת, תאים אלה קיימת גם שינוי מאפיינים בתרבות, המערכת יש לאמת עבור שלה רפריזה ויוו מכשול מאפיינים52.

מגמות חדשות בחקר מחסום הדם - מוח כוללים ניצול מערכות תרביות רקמה תלת-ממד כדי ליצור נימים מלאכותי, באמצעות הטכנולוגיה איברים על שבב לייצר מכשירים microfluidic, או ניצול הטכנולוגיה הולופייבר53, 54 , 55. נימים מלאכותיים, עם זאת, יש קטרים גדולים משמעותית (200-100 מיקרומטר) מאשר המוח נימים (3-7 מיקרומטר). לפיכך, ההטיה כוחות במבחנה לא לגמרי דומים המצב ויוו . זה נשלח בהתקנים microfluidic "blood-brain-barrier-on-a-chip", שבו שאוב ממברנות מלאכותיות טופס "דם", "המוח" תאים ונוזלים דרך התקנים אלה לייצר כוחות גזירה microfluidic. באופן דומה, תרבויות המשנה של תאי אנדותל בשילובים שונים עם האסטרוציטים ותאים השריר החלק בכלי הדם היו בשימוש גם עם הטכנולוגיה הולופייבר ליצור מחדש נוכח תחת ויוו תנאים56 rheological פרמטרים , 57 , 58. עם זאת, לא ברור עד כמה המודל הזה משקף מאפיינים נוספים של מחסום הדם - מוח כגון תחבורה, חילוף החומרים, איתות, ואחרים. מודלים מלאכותיים אלה נים ו- chip מתאימים להקרנה תפוקה גבוהה של סמים, אבל התאים המשמש ליצירת מודלים אלה הם גם עשויים להשתנות במהלך תרבות.

פרוסות המוח מוקפאים ולא קבוע או מוח ראשוניים תא אנדותל נימי שהתרבויות דגמים נוספים יכול לשמש כדילחקור את microvasculature האנושית5,59,60,61. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח קבוע משמש לקביעת חלבון לוקליזציה, ביטוי בריא לעומת רקמות חולות.

בנוסף רקמת פרוסות הדגמים במבחנה המוח תוארו לעיל, טרי מבודד נימים יכול להיות מנוצל כדי לחקור פונקציה מחסום הדם - מוח. מגבלות של מודל נימי מבודד זה כוללים את הקושי להשיג רקמת המוח האנושי טריים, היעדר האסטרוציטים הנוירונים ואת תהליך בידוד יחסית זמן רב. יתרון של המודל נימי המוח מבודדים היא כי מודל זה הדומה המצב ויוו , לפיכך, יכול לשמש כדי לאפיין את מחסום ותפקוד לקוי. חשוב, זה יכול לשמש גם להבחין מנגנוני איתות באמצעות שפע של מבחני ו טכניקות מולקולריות3,19,62,63.

המעבדה שלנו יש גישה אל רקמת המוח האנושי טריים וקפואים שני דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ')64. בהקשר זה, בצע נתיחות שלאחר המוות פרוטוקול תקני, המוח מתקבלים ב < 4 שעות ולאחר כל ההליכים לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. בהתחשב גישה ייחודית זו רקמת המוח האנושי, אנו נוסדה, אופטימיזציה פרוטוקול לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי שתוצאתו תשואה גבוהה של נימי הדם במוח האדם ללא פגע, מעשית. שתי נקודות הקצה נפוץ עניין הן לקבוע את ביטוי חלבון ופעילות. בהקשר זה, אנו ואחרים הקימו מבחני שונות, יכול לשמש עם נימים המוח מבודדים ללמוד ביטוי חלבון ו רמות הפעילות. מבחני אלה כוללים סופג המערבי, מערביים פשוטים assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), zymography, מבחני פעילות תחבורה, ו מבחני זליגת נימי. מבחני אלה לאפשר לחוקרים ללמוד שינויים בתפקוד מכשול בתנאים פיפטות האדם לקבוע מסלולים המפקחים על ביטוי חלבון ופעילות, לזיהוי מטרות תרופתי לטיפול של מחסום הדם - מוח הקשורים מחלות.

נלקח יחד, טרי המוח מבודדים נימים יכולים לשמש כמודל לשחזור ועמיד של מחסום הדם - מוח. במיוחד, מודל זה יכול להיות משולב עם מבחני שונות רבות כדי לקבוע מגוון רחב של נקודות קצה ללמוד מכשול פונקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המידע שלהלן מבוסס על תקני הרגולציה ב אוניברסיטת קנטאקי, בלקסינגטון, KY, ארה ב ובטיחות הנוכחי. כאמצעי בטיחות, עיין תוכנית בטיחות ביולוגית של המוסד ועל תקנות העדכני ביותר ואת המלצות לפני שעבדה עם רקמה אנושית.

התראה: רקמה אנושית יכולה להיות מקור של נישא בדם פתוגנים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (בזכות) ואחרים. עבודה עם רקמה אנושית מהווה את הסיכון של הידבקות נישא בדם פתוגנים. לכן, שיקולים מסוימים התקינה והבטיחות הם הכרחי בעת עבודה עם רקמה אנושית כדי להגן על עובדי מעבדה. עבודה עם רקמה אנושית בארה ב דורשת מעבדה רמה 2 אבטחה, כמו גם אמצעי זהירות והדרכה בהתאם NIH חלק IV-B-7, OSHA מעשה 1970 הסעיף 5(a)(1) ותוכנית בטיחות ביולוגית מוסדיים של המשתמש. באופן כללי, יש להשיג אישור ועדת אבטחה מוסדיים ו/או מוסדיים המנהלים לפני כל מחקר מעורבים חומרים אנושיים (רקמות, נוזלי גוף). ההכשרה נדרשת עבור כל העובדים לעבוד עם חומרים אנושיים וכולל הדרכות בנושאי בטיחות מעבדה בסיסית, למשל, היגיינה כימי בטיחות מעבדה, וכן הכשרה ספציפית על בטיחות ביולוגית, פסולת מסוכנת, אדם נישא בדם פתוגנים. כל אנשי הצוות עובד עם חומרים אנושיים מומלץ מאוד לקבל חיסונים הפטיטיס B, עובדים עם חומרים אנושיים. אנשי נדרשות ללבוש ציוד מגן אישי ספציפי תוך כדי עבודה עם חומרים אנושיים, למשל., חלוק מעבדה קשורים באזיקים ופנים מגן, ללבוש כפפות בכל עת. כל העבודה מתבצעת ב- cabinet אבטחה (שיעור 2). כל הציוד מגיע מגע עם חומרים אנושיים, יותר פסולת מחומרים האדם מטופל כראוי כדי למנוע זיהום ו/או זיהום של כוח אדם. כל ציוד ומשטחים מנוקים עם 10% מלבין ו- 75% אתנול בעקבות כל הליך מעורבים חומרים אנושיים. נזילה עם חומרים אנושיים יש לנקות מיד. כלי זכוכית היא בלוק אחרי כל שימוש. פסולת, כולל רקמה אנושית מבולבל, הוא נאסף בתוך שק פסולת חומרים מסוכנים שכותרתו בלוק. שרפ נאספים במיכל פנצ'רים - והוא עמיד בפני נזילה שכותרתו כמו ותברואה. כל פסולת מחומרים האנושי מושלך על פי תקנות הבטיחות הביולוגי של המוסד.

הערה: המעבדה שלנו משיג החזיתית טריים דוגמאות מאנשים המנוח דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ'). קריטריוני ההכללה הם: הרשמה במחקר עוקבה הנתיחה האורך של בריטניה-ADC ו ≤4 פוסט-מורטם מרווח (PMI) של h64. נתיחות שלאחר המוות בצע פרוטוקול תקני, כל הפרוצדורות לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. PMI קצרה של פחות מ- 4 h יש חשיבות הגבוהה ביותר כדי להבטיח הכדאיות נימי לאחר בידוד. ניתן להשתמש רקמות טריים וקפואים. אם הקפאה זה נחוץ, רקמת המוח האנושי טרי צריך להיות הלם-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. רקמות טריים או המופשרים צריך להיות מאוחסן במאגר בידוד (ראה להלן), לעבד במהירות. אנו מוצאים את 10 גרם של רקמה אנושית טריים התשואות בערך 100 מ ג של נימי הדם במוח (משקל רטוב).

1. הגדרת

  1. הכנת מאגר
    הערה: הנפח של מאגר הדרושים תלוי כמות הרקמה. כל אמצעי האחסון מאגר בפרוטוקול הבאים מבוססים על 10 גרם של רקמת קליפת המוח האנושי.
    1. L מאגר בידוד: להשתמש 1.5 ליטר תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS; מ מ 2.7 אשלגן כלורי, מ"מ 1.47 אינץ ח'2PO4, 136.9 מ מ NaCl, 8.1 מ"מ נה2HPO4, 0.9 מ"מ CaCl2, 0.49 מ מ MgCl2) והשלמה עם 5 מ מ D-גלוקוז (1.35 g ) ו פירובט נתרן 1 מ מ (0.165 g). לאחר הוספת הסוכר ו פירובט, להתאים את ה-pH 7.4 עם נתרן הידרוקסידי. מגניב ולאחסן את המאגר כדי 4 ° C לפני השימוש.
    2. אלבומין שור (BSA): להוסיף 10 גרם של אבקת BSA 1 ליטר בידוד המאגר כדי ריכוז BSA הסופי של 1%. מערבבים לאט כדי להימנע בועות, להתאים את ה-pH 7.4 לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מיד לפני השימוש, מערבבים בעדינות; הימנע ויוצרים בועות כדי למנוע דנטורציה אלבומין.
    3. צפיפות בינונית הדרגתיות: שוקל 18 גרם צפיפות בינונית הדרגתיות לתוך בקבוק זכוכית, להוסיף פס מגנטי מערבבים. להוסיף 60 מ של בידוד מאגר ומנערים נמרצות במשך 5 דקות עד כל אבקת מושהה. חנות בן לילה ב 4 ° C כדי לאפשר המדיום הדרגתיות צפיפות להתמוסס. מערבבים במשך 10 דקות לפני השימוש.
    4. לאחסן כל מאגרי ב 4 ° C; שמור כל מאגרי בקרח וכלים במהלך ההליך כולו בידוד. מוסיפים את כל מאגרי לפני השימוש.
  2. הגדרת הניסוי
    1. לטעון את שהעקב של מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem על גבי קדירות תקורה אלקטרונית. המקום פוטר-Elvehjem רקמות מטחנות, את מהמגן דאונס עם המרוסקים על קרח מתחת למכסה המנוע. הכנת רשת סינון מיקרומטר 300 (5 x 5 ס מ2), קפלו אותו לחצי קונוס, ולא להוסיף ולחבר אותו 50 מ ל בז צינור עם קלטת (איור 1 א').
    2. המקום מחברים הטבעות וסלולרי המתח מסננים (גודל הנקבוביות: 30 מיקרומטר) על צינורות בז 50 מ ל. להכין שקיות פסולת ותברואה. הכנס כל נדרש ציוד אבטחה ארון (ראה טבלה של חומרים).

2. המוח הכנת הדוגמא

הערה: איור 1A מציג את התרשים זרימת עבודה הליך הבידוד כולה המתוארים להלן. רקמת המוח האנושי יכולה לנבוע מכל חלק של קליפת המוח, והוא יכול לשמש טרי או קפוא. יכול להיות הקרת רקמת מוח קפוא בטמפרטורת החדר (אין מאגר; ~ 30 דקות עבור 10 גרם). כדי להשיג תוצאות דומות, רקמת המוח צריכה להתקבל מאזור המוח זהה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה ממוטבת עבורו טריים (PMI < 4 h) קליפת אדם זה לא מוקפא.

  1. הכנה של רקמת המוח האנושי: לתעד את המשקל של רקמת המוח. כל המספרים בפרוטוקול הבא מתאימים עבור 10 גרם של רקמת המוח האנושי טריים. מקם את רקמת המוח 100 מ מ פטרי. הסר בזהירות את כל קרומי המוח עם מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן.
  2. הא של רקמת המוח האנושי: בזהירות לחתוך את רקמת המוח, מינצ זה עם אזמל. האוהב למשך בערך 5 דקות (מ מ 2-3 חתיכות). להעביר את רקמת המוח מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem. להוסיף 30 מ של מאגר בידוד.
    הערה: חתיכות רקמה טחון קשים מאז רקמת המוח הופך לדייסה בתהליך mincing.

3. המגון

  1. מטחנות רקמות פוטר-Elvehjem (סיווג: 150-230 מיקרומטר): Homogenize כל מדגם במשיחות 100 במהירות מהמגן של 50 סל ד. המסמך הזמן כל 25 ומילוי הזמן הכולל הדרוש עבור 100 קווים. ראה טבלה 1 עבור פרוטוקול המגון המוצע; הזמן הכולל עבור homogenizing 10 גרם של קליפת האדם הוא כ- 22 דקות. לא לעורר באוויר כדי למנוע בועות.
  2. מהמגן דאונס (סיווג: 80-130 מיקרומטר): להעביר את homogenate מהמגן דאונס על קרח. Homogenize התליה במשיחות 20 (~ 6 s/קו, סך ~ 2 דקות). להימנע בועות.

4. צנטריפוגה

  1. להפיץ את homogenate המוח באופן שווה לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 50 מ ל, המסמך הנפח הכולל של homogenate. להפיץ 50 מ של מאגר הדרגתיות צפיפות לתוך הצינורות צנטריפוגה (מ"ל למחזור). השתמש 10 מ"ל של בידוד מאגר לשטוף את שהעקב ואת מהמגן, ולהפיץ לתוך צנטריפוגה ארבעה הצינורות (~2.5 mL למחזור).
  2. סגור בחוזקה את צינורות צנטריפוגה עם כמוסות. מערבבים את homogenate צפיפות בינונית הדרגתיות, מאגר ע י ניעור נמרצות הצינורות. צנטריפוגה ב x 5,800 g למשך 15 דקות ב 4 ° C (זווית קבועה רוטור); בחר מהירות בינונית ההאטה לשמור בגדר לחבר את הצינור. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב 2 מ של 1% BSA.

5. סינון

הערה: כדי להפריד בין הנימים לבין תאי דם אדומים ופסולת תאים אחרים, מספר פעולות סינון נחוצים.

  1. רשת מיקרומטר 300: לאחר מחדש השעיית בגדר, לסנן את המתלים מבעד לרשת מיקרומטר 300. נימים מסוננים דרך הרשת, ואילו כלי גדול ופסולת המוח גדולים יותר להישאר על רשת השינוי. לשטוף היטב את רשת השינוי עם עד 50 מ של 1% BSA. למחוק את רשת השינוי.
    הערה: שלב סינון זה מנקה את המתלה נימי מכל כלי גדול יותר או נתחי המוח פסולת.
  2. מסנן מתח התא 30 מיקרומטר
    הערה: שלב סינון זה מפריד נימים של כדוריות דם אדומות ושרידים נוספים במוח.
    1. להפיץ את פילטרט של נימי מהשלב 6.1 על המסננים זן תא חמש 30 מיקרומטר (בערך 10 מ"ל של פילטרט של נימי לכל תא המתח מסנן). נימים מתקיימים בחזרה על ידי מסנן זה, בעוד תאי דם אדומים, אחרים תאים בודדים, ופסולת מוח קטן לעבור דרך המסנן ולאחר שנאספו ב פילטרט.
    2. לשטוף כל מסנן עם 25 מ של 1% BSA. לאחר מכן שופכים filtrates כל המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. לשטוף כל מסנן עם 50 מ של BSA 1%; לשמור התא המתח מסננים עם המכיל הנימים וזורקים את פילטרט.

6. אוסף נימי

  1. הפוך את המסננים ולשטוף את נימי הדם עם 50 מ של BSA 1% עבור כל מסנן לתוך צינורות 50 מ. בעדינות הפעילו לחץ עם קצה pipet pipettor מ ל ולהעביר אותה על פני המסנן כדי לשטוף את נימי הדם במוח.
  2. ודא לשטוף את כל הנימים המוח, במיוחד מן השפה של המסנן. להימנע בועות מאז זה מקשה תהליך הסינון, מגדילה את הסיכוי לאובדן נימי.

7. כביסה

  1. לאחר איסוף הנימים, centrifuge כל דוגמאות ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C (מנופף דלי רוטור). הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה כ 3 מ"ל של מאגר בידוד. לשלב את כל כדורי resuspended מהדגימה אחד צינור חרוטי 15 מ"ל ולמלא אותו מאגר בידוד. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים נוספות.
  2. המסמך טוהר נימי עם מיקרוסקופ (100 X הגדלה), המצלמה (איור 1B).
    הערה: המוח התשואה נימי מ- 10 גרם של רקמת המוח האנושי הוא בדרך כלל כ- 100 מ ג. הנימים המוח מבודדים יכול כעת לשמש לניסויים, מעובד (למשל., lysate, בידוד קרום), או להיות קפואה, המאוחסנת ב- 80 ° C ב- cryotubes למשך תקופה מינימלית של 6 – 12 חודשים (למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ומשום מרקמות המוח האנושי תשואות השעיה מועשר בתמציות המוח האנושי נימים (איור 1B) עם כמויות קטנות של כלי שיט גדולים יותר, תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת תאים מסוימים. כמה נימים מסתעפות, ו, בחלק, תאי הדם האדומים הם לכודים בתוך נימי לומן. נימי טיפוסי יש קוטר מיקרומטר 3 – 7 והוא כ 100-200 מיקרומטר הרבה זמן עם לומן פתוח; רוב קצוות נימי מכווצות. המוח האנושי מבודד נימים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, לחשוף מבנה צינורי, שלם עם מורפולוגיה. איור 2A מראה שנציג ששודרו תמונת אור של מוח אנושי נימי ועם pericyte המצורפת של תא דם אדום של לומן. כל הממצאים בנוגע קוטר, בגודל מורפולוגיה הינם בהתאם לדיווחים קודמים על מבנה המוח מבודדים נימים12,17,18. המוח האנושי מבודד נימי ב איור 2B היה immunostained עבור P-gp (ירוק) באמצעות C219 כמו הנוגדן הראשי (1 µg/mL); הגרעינים היו counterstained עם דאפי (1 µg/mL).

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה לבידוד נימי. (א) pictogram מתארת שלבים עיקריים של ההליך לבודד את המוח נימים מרקמות אנושיות טריים. (B) התמונה מראה מבודד המוח האנושי נימים תחת מיקרוסקופ אור ישירות לאחר בידוד (100 X הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: המוח האנושי מבודד נימי. (א) א אור מסור תמונה של המוח האנושי מבודד נימי. (B) מיקרוסקופ קונפוקלי תמונת מראה של המוח האנושי מבודד immunostained נימי עבור P-gp (ירוק; C219 1 µg/mL); הגרעינים היו counterstained עם דאפי (כחול; µg 1/mL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פתרון בעיות צפיפות צנטריפוגה. Pictogram מראה ההכנה לאחר צנטריפוגה הדרגתי צפיפות. זה מדגיש את ההשפעות של יותר מדי ולא פחות מדי צפיפות בינונית הדרגתיות, איך זה משפיע על ההפרדה, בגדר נימי וכתוצאה מכך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: P-gp ביטוי חלבון מבודד המוח האנושי נימים. תספיג מראה חזק להקות P-gp (1 µg/mL) במבודד נימים האנושית בהשוואה לתאים hCMEC\D3. Β-אקטין שימש פקד הטעינה (µg 1/µL). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: יישומים עבור המוח האנושי מבודד נימים. סקירה כללית של היישומים הנפוצים ביותר עבור המוח מבודדים נימים פרסם בספרות. נימים המבודד שימשו:85,1) גנומיקה86, 2) פרוטאומיקס3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3)2,פרוטאומיקס פונקציונלי38ו- 4) Cellomics82, 839998,97,84,,. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משיכות זמן [מינימום]
1 – 25 7-7.5
26 – 50 5-5.5
51-75 5-5.5
76-100 5-5.5
הזמן הכולל: 22 – 24 min

טבלה 1: פרוטוקול המגון. פרוטוקול המגון למטחנה רקמות פוטר-Elvehjem homogenize 10 גרם של האדם החזיתית במהירות המגון של 50 סל ד. שימו לב כי מספר הקווים הראשון דורשים זמן נוסף כדי homogenize את הרקמה טחון. לאחר המגון הראשוני הזה, כל קו הוא 12 s במשך (6 s לתנועה כלפי מטה, 6 s עבור תנועה כלפי מעלה). לפיכך, לאחר המגון הראשונית, ניתן להשיג קווים 5 1 דקות, או משיכות 25 ב 5 דקות.

הבעיה סיבה אפשרית פתרון
אין גלולה נימי 1) ריכוז Ficoll שגוי 1) להתאים את ריכוז Ficoll
2) מהירות צנטריפוגה שגוי 2) להתאים את מהירות צנטריפוגה
3) מהירות האצה ו/או ההאטה שגוי 3) להתאים את מהירות האצה ו/או ההאטה
להפיק נימי 1) קרומי המוח חוסם שלבים סינון 1) להסיר כל קרומי המוח לפני סינון
2) נימים רבים מדי איבד במהלך הליך הבידוד 2) לחישוב ריכוז מאגר כראוי, לשטוף פיפטה טיפים
3) שטיפת נימים את מסנני PluriStrainer הספיקה 3). להתהפך מסננים ולבדוק בקפידה על נימים (שימוש מיקרוסקופ)
4) בועות עודף במהלך resuspensions 4) פיפטה באיטיות כדי למנוע בועות
נימים כלכלית 1) מרווח מורחב פוסט-מורטם 1) להקטין מרווח במידת האפשר או להשתמש בשכל snap-קפוא
באמצעות 2) קפוא רקמות על הבידוד 2) להשתמש רקמות טריים
3) בתקופה של בידוד הליך ארוך מדי 3) לייעל את זרימת העבודה
4) ציוד/באפרים שלא נשמרו על קרח במהלך ההליך בידוד 4) לשמור על ציוד, מאגרים על קרח במהלך הבידוד

בטבלה 2: פתרון בעיות נפוצות- רשימה של שגיאות ובעיות הנפוצות המתרחשות במהלך ההליך בידוד, איך הם יכולים להיות נפתרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של נימי הדם במוח האדם ללא שינוי בר -קיימא מרקמות טריים. בסעיף זה, נדון בפירוט את הפעולות הבאות: 1) שינויים בפרוטוקול, 2) פתרון בעיות של שגיאות נפוצות, 3) מגבלות של הטכניקה, 4) המשמעות של המודל ביחס הקיימת לבין מודלים חלופיים שיטת, ו- 5). יישומים אפשריים עבור המוח האנושי מבודד נימים.

הפרוטוקול המתואר כאן ממוטב 10 גרם של רקמת טריים החזיתית אנושי. עם זאת, היא פשוטה יחסית לשנות הליך זה: 1) פחות או יותר מ- 10 גרם של רקמת, רקמת המוח 2) קפוא או רקמת המוח 3) מאזור המוח חוץ בצמוד. ראשית, עם יותר או פחות מ- 10 גרם של רקמת המוח, הנפח של מאגרי פשוט וניתן לשנותם למעלה או למטה, את כמות רקמת זמינים. לפיכך, אם רק 5 גרם של רקמת המוח זמין, צריך להיות מופחת האחסון של מאגרי בחצי. שנית, אנו מתארים בידוד נימי בשימוש רקמת מוח טרי, אבל רקמות קפואים עשוי לשמש אם הרקמה טריים זמינים38. שלישית, השתמשנו רקמת המוח טריים שנלקחו בצמוד, אך נימי ייתכן מבודד מאזורים אחרים במוח בקליפת המוח אם יש מספיק רקמה זמין. זה גם אפשרי לבודד נימים מאזורים במוח בקליפת המוח (למשל., חומר לבן), אבל יש אזורים אלה של תאים שונים הלחנה ו נימי צפיפות 66,67,68. לפיכך, השימוש ברקמה מאזור המוח שונה סביר ידרוש הפרוטוקול להיות מותאם (למשל, מאגר אחסון, צפיפות בינונית הדרגתיות, מהירות צנטריפוגה, ו/או מספר שלבי סינון).

ההליך בידוד נימי, בעוד לא מורכבים בדיוק, הוא רגיש לפליטת קטן או שינויים בפרוטוקול. השינויים עלולים לגרום מופחתת התשואה נימי או מופחתת הכדאיות נימי. טבלה 2 מתאר את השגיאות הנפוצות ואת בעיות שבהן אתה נתקל במהלך הבידוד ורשימות טיפים כדי להימנע אלה שגיאות ופתרונות לפתרון בעיות אם הם מתרחשים. הבעיה הנפוצה ביותר הקשורים ההליך הוא נימי תשואה נמוכה. האובדן של נימים הוא לרוב הסכום המצטבר של הפסדים קטנים בכל שלב, הוא עקב סטיות קטנות על פני ההליך. שלב קריטי ב כמות גדולה של נימים עלול ללכת לאיבוד וזה צנטריפוגה צפיפות. ריכוז שגוי בתוצאות מאגר בצפיפות שגוי להפריד פסולת הסלולר אשר מפחית את כמות בגדר נימי הנימים. איור 3 מראה את ההשלכות של פחות מדי או יותר מדי צפיפות בינונית הדרגתיות בשלב צנטריפוגה ביחס homogenate במוח. התאמת כדי לתקן את הריכוז עשוי לפתור את הבעיה. שימו לב כי מהירות האצה והאטה לצנטריפוגה יכולים להשפיע גם על היווצרות בגדר נימי המוח. נימים גם יאבדו במהלך שלבים 6-7 אם חלק מהחומר נימי ומודבקת העצות פיפטה. בעיה זו ניתן לטפל בשטיפת ביסודיות כל עצה pipet לפני שינויה. במהלך שלב 7, לשטוף את הנימים של המסנן מתח התא עשוי להיות חלקי ו/או נימים עשויים לדבוק השפה של המסנן. זה יכול להמנע בבדיקת המסנן תחת המיקרוסקופ ואחריה כביסה נוספים שלבים. לאבד את נימי הדם במהלך כל שלב של ההליך בידוד יכול לגרום גלולה נימי זניח או לא מספיק חומר נימי עבור עיבוד נוסף וניסוי.

לבודד את המוח נימים מרקמות אנושיות טריים מייצג מודל ייחודי שיטת הדומה המצב ויוו . עם זאת, קיימות מספר מגבלות של הטכניקה. אתגר אחד הוא הזמינות של רקמה אנושית טריים. כמו PMI האופטימלית ≤4 h, שנאספו ב- PMI באופן משמעותי יותר רקמת המוח לא יהיו טריים מספיק עבור יישומים מסוימים במורד הזרם. במקרים מסוימים, ייתכן שתתקשה לקבל כמויות רקמות גדולים מספיק לקבוצות ניסיוני מרובים, ובכך הגבלת יישומים במורד הזרם. לפיכך, בידוד נימים טריים מכרסמים19, הכלבים69, שור42או רקמת המוח חזירי70 עשוי להיות מתאים יותר לדגם את מחסום הדם - מוח. גורמים הקובעים את ההשתנות של רקמת המוח האנושי כגון גיל, מין, מוצא אתני, המחלה, תרופות היסטוריה, אזור במוח של המדגם, PMI צריכים להילקח בחשבון כאשר לפרש ופרסום נתונים. ברמה הניסיונית, חשוב לציין כי נימים מבודדים עדיין לכלול pericytes, אבל astrocytic endfeet יוסרו על ידי הליך44. זה צריך לקחת בחשבון כי המודל המוצג כאן משמשת כמודל vivo לשעבר של מחסום הדם - מוח (קרי, תאי אנדותל נימי), אבל לא כמודל של היחידה נוירו-וסקולריים.

עבודה עם כל רקמה אנושית מציג תמיד את סיכון בטיחות הגלום, החוקרים לנקוט באמצעי זהירות מתאימים במהלך ההליך בידוד כדי למנוע זיהום. באופן ספציפי, בארצות הברית, עבודה עם רקמה אנושית דורש שטח המיועד BSL 2-מוסמך, כולל ארון אבטחה (כיתת A2). בנוסף, הצוות חייב להשתמש ציוד מגן אישי (כלומר., חלוק, כפפות, מגן הפנים) ייעודיות ציוד לעבודה עם רקמה אנושית וטיפול פסולת ותברואה ליישם. נקיטת אמצעי בטיחות אלה היא גוזלת זמן, עלות עתירי ומגביר את הקושי של ההליך, במיוחד עבור עובדי מעבדה לא מנוסים.

מחסום הדם - מוח מאוד כולו בין אורגניזמים עם CNS71מוגדרים היטב. מידול של האדם מחסום הדם - מוח קשה כי יש מורכבות נוירו-וסקולריים צימוד בין התאים של היחידה נוירו-וסקולריים. המוח האנושי למבוגרים הוערך כי ממוצע כ- 86 מיליארד נוירונים, הוא חשב כי כמעט כל נוירון יש נים משלה בסביבה כדי להבטיח אספקה נאותה עם72,של חמצן וחומרים מזינים-73. תאי אנדותל נימי מהווים את פני השטח הגדול ביותר של הממשק דם-מוח (12-18 מ'2 עבור אדם מבוגר בריא). צמתי צר מייצגים מכשול מגוון רחב של pharmacotherapeutics על ידי חסימת paracellular דיפוזיה של מומסים בגבול. בנוסף, מחקרים רבים לתאר את תפקוד המחסום הפרעות ניווניות, למשל., מחלת אלצהיימר74, קו75, אפילפסיה38,76, טרשת נפוצה77ו פגיעה מוחית טראומטית28,78. לכן, זה הכרחי ליצור מודלים מקרוב לייצג את האדם מחסום הדם - מוח וגם מאפשרים הבנה טובה יותר של הפונקציה מכשול על בריאות ומחלה.

רבים במבחנה תא תרבות דגמי מחסום הדם - מוח קיים; לסקירות מומחה בנושא ראה 41,49,51,69,79,80. בקצרה, שניהם טריים בודדו תאי אנדותל נימי המוח לתרבות העיקרי, שורות תאים אנדותל נימי מונצחים המוח הינם זמינים. תרבויות העיקרי של תאי אנדותל microvessel מוחי משמשים בעיקר עכבר, חולדה, חזיר, פרה. עם זאת, תרביות תאים הראשי הם עתירי עבודה מאז התאים חייבים להיות טריים מבודד. שורות תאים אנדותל נימי מונצחים המוח הינם זמינים עכבר, עכבר, אדם, הם פחות עתירי עבודה, כי הם יכולים להיות passaged לשימוש ארוך טווח. אולם, שורות תאים מונצחים אפילו יש מגבלה על מה פעמים הם יכולים להיות passaged. לפני שאיבדתי את המאפיינים אנדותל שלהם. הן ראשי תאים, כמו גם שורות תאים מונצח לעיתים קרובות מתורבתים על צלחות דגם אנדותל נימי את המוח ולמדוד התעבורה מחסום חדירות התרופות, מעבר חד-שכבתי התא, ובכך מחקה תחבורה דם-כדי-מוח41 81, ,82. התקשורת תרבות במודלים אלה עשויים להיות גם שונה או בתוספת האסטרוציטים, pericytes או אחרים הגורמים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כמו מחנה41,83,84.

היתרון של שורות תאים מונצחים היא גישה נוחה יחסית והזמינות שלהם. ואילו בתרבית תאי אנדותל להגיע למפגש, הם מאבדים מאפייני תא אנדותל ככל שהם גדלים side-by-side ב טפט. לדוגמה, hCMECs בתרבית להציג ביטוי מופחתת של מובילי כמו P-gp, צומת חזק חלבונים חדירות משתנה התצוגה ואינטראקציות41. איור 4 מראה של תספיג ביטוי חלבון P-gp בתאים hCMEC/D3 בהשוואה נימים אנושי טרי מבודד. למרות סכום נמוך יותר 10-fold של חלבון הכולל, האות P-gp היא חזקה יותר מבודד נימים האנושית בהשוואה לתאים hCMEC/D3. אפשרות זו מציינת כי תאים hCMEC/D3 איבד כמות משמעותית של P-gp ביטוי חלבון בתרבות. יתר על כן, הבדלי תרבות המדיה, סביבה וציוד להשפיע על המדדים המרכזיים של המכשול שלמות, קרי, TEER מידות מבחני צלחת Transwell. חלק מהנושאים הללו ניתן להתגבר על ידי ניצול המודל נימי המוח מבודדים, המייצג יותר מקרוב את מחסום אנושי הדם - מוח ויוו.

המוח מבודדים נימים שימשו עבור מגוון רחב של מחקרים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקס, פרוטאומיקס פונקציונלי של מחקרים cellomics (איור 5). בנוסף, שיטות וטכניקות רבות קיים כדי לנתח את המוח מבודדים נימים בתוך כל אחד מהשדות הללו. ראוי לציין, טכניקות ניסיוני המוצג באיור 5 יכול לשמש על נימים המוח מבודדים ממספר מקורות, כולל רקמה אנושית, שור, מכרסמים, חזירי, אשר עשוי להקל על המחקר translational. לדוגמה, Li. et al. 85 למד את גנומיקה של מחסום הדם - מוח באמצעות הפחתה וטיהור mRNA מבודד מן החולדה המוח נימים. בנוסף, Ott. et al. 86 משמש RT-PCR לרביעיית-PCR ללמוד ברגולציה של P-gp על-ידי PXR. מחקרים רבים פרוטיאומיה מבנית לנצל המערבי סופג3, נקודה כתם ניתוח87, מערביים פשוטים מבחני3,38, אליסה88,89, immunoprecipitation3, ו- immunostaining3,90,91. להבחין טרנספורטר סחר בבני אדם אנדותל המוח, מקאפרי. et al. 92 המשמש fractionation subcellular של המוח מבודדים נימים. Sánchez דל פינו ואח. 93היה מבודד שור אנדותל קרום שלפוחית להבחין טרנספורטר מיקום ותחבורה בכיוון לרוחב מחסום הדם - מוח. במחקרים אחרים פרוטיאומיה מבנית, השתמשו החוקרים כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה טנדם לכמת טרנספורטר חלבונים94,95,96. פרוטיאומיה מבנית תפקודית מחקרים נעזרו טרנספורטר, זליגת מבחני2,38. Hartz. et al. 2 בשימוש zymography כדי לקבוע את פעילות האנזים המוח מבודדים נימים. בנוסף, המחקר cellomic עצום באמצעות תרבית תאים יצר רבים שורות תאים אנדותל ודגמים של83,82,84מחסום הדם - מוח. עם מודלים אלה, מבחני נפוצים בשימוש כוללים העברת מבחני97,98, מבחני הכדאיות ורעילות99אנגיוגנזה מבחני98.

המוח מבודדים נימים מאפשרים אפיון מדויק של ביטוי חלבון ופעילות ותיאור של איתות המסלולים-מחסום הדם - מוח. זה נובע, בין השאר, לתוכן נימי של המוח, אשר רק כ-1% (v/v). לכן, באמצעות כל המוח homogenate או פרוסות המוח כתחליף מטוהרים תאי אנדותל נימי קרוב לוודאי תגרום יחס אות לרעש המסכן24. בנוסף, לאחר בידוד, המוח נימים הם קיימא עבור פחות 6 שעות (שלא פורסמו נתוני עכבר, חולדה), מה שמאפשר לימודי להבחין ספציפי איתות המסלולים. מומלץ לכלול קבוצת ביקורת של הכנת אותו.

נציג והתרגום דגמי מחסום הדם - מוח, כגון המודל נימי מבודד שנסקרו בדו ח זה, נדרשים ללמוד מכשול פונקציה על בריאות ומחלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג את המוח האנושי מבודד נימים תשואה טובה, באיכות גבוהה, זה יכול לשמש מודל ex-vivo של מחסום הדם - מוח. נימים מבודד שומרים על המבנה המקורי שלהם ואת הפונקציה, מה שמאפשר להשתמש בהם עבור מספר שלאחר בידוד מולקולרית, ביוכימיה, מבחני פיזיולוגיים. כדאי לשים לב בעת טיפול רקמה אנושית דגימות, רצוי BSL 2 או הגדרה גבוהה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ואנו מכירים ד ר פיטר נלסון, סוניה אנדרסון מהבנק רקמת המוח בבריטניה-ADC למתן כל המוח האנושי דגימות רקמה (NIH להעניק מספר: P30 AG028383 מן המכון הלאומי לזיקנה). אנו מודים האזרד מאט, טום דולאן, שירותי טכנולוגיית מידע, טכנולוגיה אקדמי, סגל האירוסין, אוניברסיטת קנטאקי לסיוע גרפי. פרויקט זה נתמך על ידי מענק 1R01NS079507 מספר מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו (כדי B.B.) ועל ידי גרנט 1R01AG039621 מספר מן המכון הלאומי לזיקנה (כדי A.M.S.H.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמי של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו או המכון הלאומי על הזדקנות. המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45, (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43, (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36, (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41, (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36, (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135, (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18, (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355, (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71, (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4, (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8, (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31, (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34, (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66, (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71, (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66, (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334, (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70, (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77, (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33, (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8, (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55, (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127, (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91, (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29, (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102, (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278, (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34, (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14, (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43, (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253, (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7, (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56, (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13, (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192, (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45, (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9, (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51, (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487, (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330, (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56, (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66, (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10, (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10, (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6, (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11, (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37, (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524, (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30, (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115, (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29, (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6, (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199, (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115, (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12, (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54, (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329, (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53, (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22, (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017, (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35, (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9, (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122, (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270, (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40, (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25, (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2, (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86, (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242, (2), 105-108 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics