新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Neuroscience

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Summary

人間の脳組織から分離脳の毛細血管は、生理学的および病態生理学的条件下でバリア機能を研究する臨床モデルとして使用できます。ここでは、新鮮な人間の脳から脳の毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルを提案する.

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Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

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Abstract

脳保護を改善し、脳を扱う脳ドラッグデリバリーを強化する約束を保持する新しい治療上の作戦の開発の重要な生理学的および病態生理学的条件下で血液脳関門の機能を理解、障害。ただし、ひと血液脳関門の機能を勉強するは困難です。したがって、適切なモデルの重要な必要性があります。この点で、人間の脳組織から分離した脳の毛細血管は、できるだけ人間体内の状況に近いとバリア機能を勉強するユニークなツールを表します。ここでは、高収率に一貫した品質と純度で人間の脳組織から毛細血管を分離するための最適化されたプロトコルについて述べる。毛細血管は、機械の均質化、密度勾配の遠心分離、ろ過を使用して新鮮な人間の脳組織から分離されます。分離後、脳毛細血管のタンパク質発現と機能、酵素活性や細胞内シグナル伝達の研究に漏れの試金、ライブセル イメージング免疫アッセイなど様々 な用途に使用できます。分離脳の毛細血管は、ひと血液脳関門の機能調節を解明するユニークなモデルです。このモデルは、中枢神経系疾患を治療するための治療戦略の開発を助ける中枢神経系 (CNS) の病因に洞察力を提供できます。

Introduction

血液脳関門は、血液と何が入るし、脳から出てくるを決定する脳の間厳重に管理されたインターフェイスです。解剖学的, 血管内皮細胞は血液脳関門を作成し、複雑で、連続的な毛細血管網を形成します。生理、この毛細血管網は同時に炭酸ガスや代謝の廃棄物を処分しながら脳に酸素と栄養素を供給します。重要なは、証拠は、バリアへの変更が多数の病理学、アルツハイマー病、てんかん、脳卒中1,2,3,4,5などに貢献することをサポートしています,6,7. 脳血管内皮細胞はまた、例えば脳に薬剤の吸収をブロックすることによって治療にバリアとして役立つ、膠腫瘍切除術8,9,を次の化学療法。10. 分離脳毛細血管がバリア特性生体内でバリア機能と健康障害の研究では、これとよく似たユニークな体外血液脳関門モデルを表現するこの点では、疾患。この記事では、一貫して高品質の毛細血管で人間の脳から脳の毛細血管を分離し、血液脳関門の研究をもたらすのためのプロトコルを提供します。

1969 年に Siakotos11は、脳の毛細血管密度勾配遠心分離とガラス ビーズ列分離を用いたウシと人間の脳組織からの分離を報告する最初でした。その後、ゴールドスタイン12は、脳毛細血管グルコース輸送の代謝活性を維持しながら、ラットから分離された研究に必要な組織の量を削減する複数の濾過手順を追加することによってこの方法を改善しました。その後、研究者は何度もキャピラリー分離手順を最適化し、各イテレーション13,14,15法と脳毛細血管モデルを改善します。たとえば、Pardridge16機械の均質化ではなく、酵素消化を使用して牛の毛細血管を分離し、210 μ m のメッシュ フィルターとガラス ビーズの列を介して毛細血管の懸濁液をその後渡されます。これらの変更は、分離脳毛細血管のトリパン ブルー色素排除汚れを改善し、したがって、内皮細胞生存率を増加します。1990 年代初頭にダレール17は、γ - グルタミルトランスフェラーゼ (γ-GTase) およびアルカリホスファターゼの代謝活性を維持され神経汚染の明確なウシおよびラットの毛細血管を分離しました。2000 年、ミラー18毛細血管の内腔に輸送基質の蓄積を共焦点顕微鏡との組み合わせでラットとブタ脳毛細血管を使用しました。その後、当研究室は、脳毛細血管分離手順を最適化するために続けているし、P-糖タンパク質 (P gp)19,20,21, 乳癌を決定する輸送アッセイを設けて抵抗蛋白質 (BCRP)22,23日、多剤耐性蛋白質 2 (Mrp2)24交通活動。2004 年、我々 は様々 なシグナル伝達経路を調査するラット脳毛細血管を用いて 2 つのレポートを公開しました。ハルツ21、そのペプチドのエンドセリン 1 急速かつ可逆的減少 P gp トランスポート機能 (PKC) エンドセリン受容体 B (エB) 受容体、一酸化窒素合成酵素 (NOS) および蛋白質キナーゼ C を介して作用することにより脳の毛細血管でわかりました。バウアー19、我々 は核内受容体有する X レセプター (PXR) の発現と脳の毛細血管で P gp 式とトランスポート機能の示した PXR 変調を実証しました。遺伝子組換えヒト PXR マウスでの実験、研究のこのラインを拡大し、体内バリアにより骨折 P gp hPXR 活性化25まで引き締めを示した。2010 年にハルツ26 P gp タンパク質発現を復元し、トランスポート ノザン ハップ トランスジェニック人間アミロイド前駆体タンパク質 (ハップ) マウスの動作このアプローチを使用します。また、ハップの P gp を復元するマウス大幅削減アミロイド β (a β)40と a β42の脳レベル。

シグナル伝達経路を検討するほか、分離脳の毛細血管は毛細血管漏出として参照する毛細血管の透過性の変更を確認する使用できます。特に、テキサス赤の漏出試金は、時間とこれらのデータで毛細血管の内腔からテキサス赤は漏洩率を分析に使用し、蛍光色素の漏出を評価するために使用されます。コントロールの毛細血管からのそれらと比較して増加した毛細血管漏出率は、血液-脳関門2の物理的な整合性の変化を示します。バリア、例えばに関連付けられている多くの病気の状態があるので、これは貴重な、てんかん、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳傷害27,28,29、。 30です。他のグループはまた蛋白質の表現、蛋白質31,32,33,34,の輸送活性を調節するシグナル伝達経路を識別する孤立した毛細血管を利用します。 35,36,37。最後に、人間の脳の毛細血管を分離するためこのメソッドを最適化してまいりましたし、最近、我々 はてんかん発作のない制御個人38 に比べて患者におけるひと血液脳関門で P gp 発現の増加を示した.一緒に取られて、これらの開発は、分離脳の毛細血管がバリア機能を勉強する汎用的なモデルとして使用できることを示します。

様々 な体外体内、および体外血液脳関門モデルの基礎研究および産業創薬スクリーニング、脳39,40,41 への薬物送達をテストの目的で主に使用されています。 ,42,43,44。脳毛細血管分離前のヴィヴォに加えてには現在血液脳関門モデル、インシリコモデル、分離脳毛細血管内皮細胞の様々 な由来不死化細胞株の in vitro細胞培養種の培養脳内毛細血管内皮細胞とマイクロ流体チップのモデルに区別するひと多能性幹細胞 (hPSC) の文化。

インシリコモデルは、予測吸収、分布、代謝、排泄 (ADME) プロパティに基づく新薬候補を選択するため医薬品開発で最も一般的に使用されます。定量的構造物性相関 (QSPR) モデルなど量的な構造活動関係 (QSAR) モデル メソッドは、脳浸透薬剤の候補者を予測するライブラリの高スループット スクリーニングで使用される人気のあるメソッド45,46. これらのモデルは、バリア貫通性の分子を画面に便利。

ベッツ47は、体外血液脳関門モデル システムとしての培養脳内毛細血管内皮細胞の単分子膜を設立しました。人間の脳微小血管内皮細胞 (hCMECs) など新鮮な組織や不死化血管内皮細胞を用いて細胞文化モデルの in vitro脳浸透または機構研究のための別の高スループット スクリーニング ツールをすることができます。ただし、脳毛細血管内皮細胞培養モデル毛細血管の内腔内の血流の生理学的な剪断応力がない、全体的な生物学的複雑さに限られている、重要なバリア成分の発現や局在の変化を受けタイト結合タンパク質など表面の受容器、トランスポーター、酵素、イオン チャンネルは48,49,50。逆に、内皮細胞膜に由来する hPSCs hCMEC/D3 の文化と比較して低糖透磁率がある、いくつかの血液脳関門輸送、接着分子、タイトな接合51,の偏光式が含まれて52です。 しかし、これらの細胞も文化でのプロパティの変更は、体内バリアのプロパティ52・のシステムを検証する必要があります。

血液脳関門の研究の新しい動向、マイクロ流体デバイスを生成する臓器・ オン ・ チップ技術を使用してまたは中空繊維技術53,を利用した人工の毛細血管を作成する 3 D 培養システムを利用54,55。 人工の毛細血管、脳毛細血管 (3-7 μ m) よりも大幅に大きい直径 (100-200 μ m) があります。したがって、せん断力、体外で完全に似ていない体内状況。これは、"blood-brain-barrier-on-a-chip"マイクロ流体デバイス、マイクロ流体せん断力を生成するこれらのデバイスを人工膜フォームの「血」と「脳」のコンパートメントと流体を励起しているに扱われます。同様に、アストロ サイトのさまざまな組み合わせで血管内皮細胞や血管平滑筋細胞の共培養もで使用されている中空繊維技術体内条件56下の粘弾性パラメーターを再作成するには,57,58です。 ただし、わかりにくい方法もこのモデルは血液脳関門輸送、代謝、シグナル伝達、などなどの他のプロパティを反映します。これらの人工毛細血管とチップのモデルは薬の高スループット スクリーニングに適したが、文化の中に、これらのモデルを生成するために使用するセルが予告なく変更も。

冷凍と固定脳スライスまたは原発性脳毛細血管内皮細胞の文化は人間の血管を研究5,59,60,61に使用することができます追加のモデル。たとえば、固定脳組織の免疫組織化学を使用して蛋白質のローカリゼーションを決定、健康式は病気にかかったティッシュと比較します。

組織スライスとの in vitroモデルに加えて上記、新鮮な分離脳の毛細血管は血液脳関門の機能を研究する利用できます。この孤立した毛細血管モデルの制限新鮮な人間の脳組織を取得する難しさを含んで比較的時間のかかる分離プロセスと神経細胞、アストロ サイトの不在。分離脳毛細血管モデルの利点は、このモデル体内状況を密接に似ているし、したがって、バリア機能不全の評価に使用できます。重要なは、試金および分子生物学手法3,19,,6263の多数を使用してシグナルを見分けることも使用することができます。

加齢に関するサンダース ブラウン センターを介して両方の生鮮、冷凍人間の脳組織へのアクセス研究室 (IRB #B15-2602-M)64。このコンテキストで解剖標準プロトコルに従う、脳には求め < 4 h、およびすべての手順は NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に適合。人間の脳組織へのこのユニークなアクセスを与えを設置し、そのまま、実行可能な人間の脳の毛細血管の高収率の結果人間の脳から脳の毛細血管を分離するためのプロトコルを最適化します。関心の 2 つの一般的なエンドポイントは、タンパク質の発現と活性を決定します。この点で、我々 と他の蛋白質の表現および活動レベルを勉強する分離脳の毛細血管で使える様々 なアッセイを設けてください。これらのアッセイは、西部にしみが付くこと、シンプルなウエスタン アッセイ、酵素免疫測定法 (ELISA)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)、ザイモグラフィー、輸送活動のアッセイと毛細血管漏出試金。これらの試できる研究者が人間の病理学的条件でバリア機能の変化を研究、蛋白質の表現や活動を支配する経路を決定する、関連付けられている血液脳関門の治療のための薬理学的ターゲットを特定するには病気。

一緒に、新鮮な分離脳の毛細血管は血液-脳関門の堅牢かつ再現可能なモデルとして利用できます。特に、このモデルは、さまざまなバリア機能を勉強するエンドポイントを決定する多くの異なるアッセイと組み合わせることができます。

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Protocol

以下の情報は、現行の安全およびケンタッキーの大学, レキシントン、ケンタッキー、米国で規制の基準に基づいています。安全対策として人間の組織で作業する前に機関の生物学的安全プログラムと最新の規則と推奨事項を参照してください。

注意: 人間の組織は、ひと免疫不全ウイルス (HIV)、B 型肝炎ウイルス (HBV)、C 型肝炎ウイルス (HCV) を含む血液媒介病原体の源をすることができます。人間の組織での作業血液媒介病原体からの感染リスクがあります。したがって、研究者を保護するために人間の組織を操作するとき、特定の規制や安全性は不可欠です。米国における人の組織のバイオ セーフティ レベル 2 の実験室と同様、安全上の注意と NIH のセクション IV B 7、1970年句 5(a)(1) とユーザーの制度的生物学的安全性プログラムの OSHA の法律に従ってトレーニングが必要です。一般に、人間の材料 (組織、体液) を含む任意の研究を行う前に機関のバイオ セーフティ委員会や治験審査委員会の承認を得なければなりません。訓練は全員人間材料での作業に必要な基礎実習安全教育など、化学衛生学および実験室の安全と同様、生物学的安全性、有害廃棄物、人間の特定のトレーニングが含まれています血液媒介病原体。人間の材料とすべての職員は、人間の材料で作業する前に、B 型肝炎の予防接種を取得する一押しです。人事は人間の材料、例えば作業中の特定の保護具を着用する必要。、カフ付き白衣とシールド、および手袋を着用してすべての回での顔。バイオ セーフティ キャビネット (クラス 2) で、すべての作業が実行されます。ひと由来資料から人間の材料との接触や、廃棄物は、すべての装置は、汚染や職員への感染を防ぐために適切に処理されます。すべての機器と表面は人間の材料を含む各手順に従って 10% 漂白剤と 75% エタノールで洗浄します。ひと由来資料の流出はすぐにクリーンアップする必要があります。ガラス製品は使用後オートクレーブです。固定されていない人間の組織を含む廃棄物はラベル バイオハザード廃棄袋に収集され、オートクレーブです。シャープは、ラベルとしてバイオハザード穿刺と漏れ防止コンテナーにまとめられます。人間の材料からすべての廃棄物は、機関の生物学的安全規則に従って破棄されます。

注: 当研究室の高齢化・ サンダース ブラウン センターを通じて故人個人から新鮮な前頭葉サンプルを取得 (IRB #B15-2602-M)。包含の規準がある: 英国 ADC 縦剖検例のコホート研究と Post Mortem 間隔 (PMI) ≤4 登録 h64。解剖標準プロトコルに従う、すべてのプロシージャが NIH ラット ベスト プラクティスのガイドライン65に準拠します。4 h 未満の短い PMI 分離後キャピラリーの生存を保証するために最も重要です。新鮮および凍結組織を使用ことができます。新たに得られた人間の脳組織ショック液体窒素で凍結する必要があります、-80 ° C で保存凍結が必要な場合新鮮なまたは解凍組織を分離バッファー (下記参照) に格納され、迅速に処理する必要があります。我々 は、新鮮な人間の組織利回り脳毛細血管 (湿重量) の約 100 mg の 10 g を見つけます。

1. セットアップ

  1. 緩衝液調製
    注: 必要なバッファーの量は、組織の量に依存します。次のプロトコルのすべてのバッファーのボリュームは、人間の脳皮質組織の 10 グラムに基づいています。
    1. L 分離バッファー: 使用ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS; 2.7 mM KCl、1.47 mM KH2PO4、136.9 mM NaCl、Na2HPO48.1 mM、0.9 mM の CaCl2、0.49 mM MgCl2) の 1.5 L 5 mM D-グルコース (1.35 g で補うと) と 1 mM ピルビン酸ナトリウム (0.165 g)。追加するとグルコース、ピルビン酸、水酸化ナトリウムで pH 7.4 に調整します。クールは、使用する前に 4 ° C にバッファーを格納します。
    2. ウシ血清アルブミン (BSA): は、BSA の最終濃度 1% の分離バッファーの 1 L に BSA 粉末 10 g を追加します。泡を避けるため、pH 7.4 に調整、一晩 4 ° C で保存するゆっくりとかき混ぜます。すぐに使用前に軽くかき混ぜます。アルブミンの変性を避けるために気泡を形成しないでください。
    3. 密度勾配媒体: ガラス瓶の中に密度勾配媒体の 18 グラムの重量を量るし、電磁攪拌棒を追加。60 mL の分離バッファーを追加し、すべての粉末が中断されるまでに 5 分は積極的に振る。溶解する密度勾配媒体を許可する 4 ° C で一晩ストア。使用前に 10 分間かき混ぜます。
    4. 4 ° C ですべてのバッファーを保存します。全体の分離のプロシージャの間にすべてのツールおよび氷の上のバッファーを維持します。使用する前にすべてのバッファーをかき混ぜます。
  2. 実験のセットアップ
    1. 電子オーバーヘッド攪拌にポッター エルベジェム組織グラインダーの杵をマウントします。フードの下で氷の上杵・ ポッター エルベジェム組織グラインダー、Dounce ホモジナイザーを配置します。300 μ m フィルター メッシュ (5 × 5 cm2) を準備、円錐形に折ると挿入し、50 mL ファルコン管テープ (図 1 a) に添付します。
    2. 接続リングを置き、セルの歪みフィルター (細孔サイズ: 30 μ m) 50 mL の隼の管に。バイオハザード廃棄物バッグを準備します。キャビネット、バイオ セーフティに必要なすべての機器を配置 (材料の表を参照してください)。

2. 脳サンプル準備

注:図 1 aは、以下の全体の分離手順のワークフロー グラフを示します。人間の脳組織は皮質の任意の部分に由来することが、新鮮なまたは冷凍に使用することができます。冷凍脳組織は、(バッファーがありません; 10 g ~ 30 分) 室温で解凍できます。同等の結果を達成するために脳組織は各実験のため同じ脳の領域から取得必要があります。新鮮なこのプロトコルを最適化 (PMI < 4 h) 凍結されていない人間の大脳皮質。

  1. 人間の脳組織の準備: 脳組織の重量を文書化します。次のプロトコルのすべての数値は 10 g の新鮮な人間の脳組織に適しています。100 mm のペトリ皿に脳組織を配置します。すべての髄膜をピンセットで慎重に取り外します。白質を切断するには、メスを使用します。
  2. 人間の脳組織のミンチ: 慎重に脳組織をカットし、メスでミンチします。約 5 分 (2-3 mm 個) をみじん切り。・ ポッター エルベジェム組織グラインダーに脳組織を転送します。30 mL の分離バッファーを追加します。
    注: みじん切りの組織部分、肉挽きのプロセスをドロドロに脳組織を回すので参照してくださいすることは困難。

3. 均質化

  1. ・ ポッター エルベジェム組織グラインダー (クリアランス: 150-230 μ m): ホモジナイザー速度 50 rpm で 100 ストロークで各サンプルをホモジナイズしてください。すべての 25 のストロークと 100 ストロークに必要な合計時間は、時間を記録します。提案された均質化プロトコル; の表 1を参照してください。ヒトの前頭皮質の 10 g を均質化の合計時間は、約 22 分です。気泡を防ぐために空気で攪拌しないでください。
  2. Dounce ホモジナイザー (クリアランス: 80-130 μ m): 氷上 Dounce ホモジナイザーにホモジュネートを転送します。20 ストローク (~ 6 秒/ストローク、〜 2 分の合計) で懸濁液をホモジナイズしてください。泡を避けるため。

4. 遠心分離

  1. 4 つの 50 mL の遠心管とドキュメント磨砕液の総量に脳乳剤を均一に分散します。遠心分離管 (チューブあたり 12.5 mL) に 50 mL の密度勾配バッファーを配布します。10 mL の分離バッファーを使用して、杵、ホモジナイザー、リンスし、4 つの遠心分離管 (~2.5 mL チューブあたり) に配布します。
  2. キャップと遠沈管をしっかりと閉じます。チューブを活発に揺することによって乳剤、密度勾配媒体、およびバッファーをミックスします。4 ° c (固定角ロータ); 15 分 5,800 × gで遠心分離します。チューブに接続されているペレットを維持する中減速速度を選択します。上澄みを廃棄し、1 %bsa の 2 mL にペレットを再懸濁します。

5. ろ過

注: 赤い血液細胞と他の細胞の残骸から毛細血管を分離、ろ過のいくつかの手順が必要です。

  1. 300 μ m メッシュ: ペレットを再懸濁後、300 μ m メッシュを介して懸濁液をフィルタ リングします。毛細血管がメッシュでろ過する大きな船や大きな脳の破片は、メッシュに対し。最大 50 ml の 1 %bsa のメッシュを慎重に洗います。メッシュを破棄します。
    注: このろ過ステップは、大きな血管や脳の破片の塊から毛細血管の懸濁液をクリアします。
  2. 30 μ M の細胞の歪みフィルター
    注: このろ過ステップは、赤色の血液細胞や他の脳の破片から毛細血管を分離します。
    1. 6.1 またぎ 5 30 μ m セル歪みフィルター (キャピラリー濾液セル歪みフィルターあたり約 10 mL) から毛細血管の濾液を配布します。このフィルターでは、フィルターを通過し、濾液に集められ赤い血液細胞、他の単一セル、および小さな脳の破片に対しに戻って毛細血管を開催します。
    2. 25 ml の 1 %bsa の各フィルターを洗浄します。その後、全ろ液を収穫を増加する 6 番目のフィルターに注ぐ。1 %bsa; の 50 mL の各フィルターを洗浄します。維持の細胞毛細血管を含むひずみフィルター、濾液を廃棄します。

6. 毛細血管コレクション

  1. フィルターを裏返し、50 mL の管に 50 ml の各フィルターに対して 1 %bsa の毛細血管を洗います。慎重に 5 mL pipettor のピペット先端部で圧をかけ、脳の毛細血管を洗浄するフィルターに移動します。
  2. 特にフィルターの縁から、すべての脳毛細血管を洗浄することを確認します。このろ過プロセスが難しくキャピラリーの損失の可能性が高くなりますので、泡を避けるため。

7. 洗濯

  1. 毛細血管を収集した後、1,500 × g (スイング バケツの回転子) 4 ° C で 3 分間ですべてのサンプルを遠心します。上澄みを除去し、再分離バッファーの約 3 mL にペレットを中断します。15 mL コニカル チューブに 1 つのサンプルからすべての再懸濁のペレットを組み合わせて、分離バッファーでそれを埋めます。再び 4 ° C で 3 分間 1,500 × gで遠心分離し、さらに 2 回を洗ってください。
  2. 顕微鏡 (100 倍) とカメラ (図 1 b) キャピラリーの純度を文書化します。
    注: 人間の脳組織の 10 g から脳の毛細血管収量は通常約 100 mg です。分離脳の毛細血管は処理の実験のため今すぐ使用ことができます (e.g。、ライセート、膜分離)、またはフラッシュ凍結し、(複数の凍結融解サイクルを避けるため) 6-12 ヶ月の最小のため cryotubes には-80 ° C で保存されます。

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Representative Results

人間の脳組織から分離は、大きな船、赤の血液細胞、他の単一セル、いくつかの細胞の残骸の量が少ない人間の脳毛細血管 (図 1 b) の濃縮懸濁液をもたらします。いくつかの毛細血管を分岐すると、そして、いくつかは、赤血球が毛細血管の内腔に捕捉されました。典型的な毛管 3-7 μ m の直径を持つ、約 100-200 μ m; オープン ルーメンと長いほとんどの毛細血管の先が折りたたまれています。共焦点の顕微鏡を使用して、孤立した人間の脳の毛細血管は、鋼管、そのままの構造と形態を明らかにします。図 2 aは、代理送信添付周皮細胞内腔で赤の血液細胞と毛細血管の人間の脳の画像を示しています。形態、サイズ、直径に関する知見のすべて、分離脳毛細血管12,17,18の構造前のレポート。図 2 bにキャピラリー分離人間の脳は一次抗体 (1 μ g/mL); として C219 を使用して P gp (グリーン) immunostained核を DAPI で counterstained された (1 μ g/mL)。

Figure 1
図 1: キャピラリー分離のフローチャート。ピクトグラム (A) は、新鮮な人間のティッシュから脳の毛細血管を分離するプロシージャの主な手順を示しています。図 (B) は、(100 倍) の分離後直接光学顕微鏡による分離脳毛細血管を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 分離脳毛細血管。キャピラリー分離脳の (A) 透過光はイメージです。(B) 共焦点顕微鏡画像は、分離脳毛細血管 immunostained P gp (緑;C219 1 μ g/mL);核は、DAPI (青; 1 μ G/ml) と counterstained いた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 密度遠心分離のトラブルシューティングします。ピクトグラムは、密度勾配遠心後準備を示しています。それはあまりとあまりにも少ない密度勾配培地および分離と結果毛細血管ペレットへの影響の効果を強調表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: P gp 蛋白質の分離脳毛細血管表現します。西部のしみは P gp の強力なバンドを示しています (1 μ g/mL) hCMEC\D3 細胞と比較して分離人間の毛細血管で。Β-アクチンは、ロード コントロール (1 μ g/μ L) として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 分離脳毛細血管のためのアプリケーション。分離脳の毛細血管の最も一般的なアプリケーションの概要を文献で公開。孤立した毛細血管を使用されている: 1) ゲノム85,86, 2) プロテオミクス3,38,87,88,89,90 91,92,94,95,96, 3) 機能・発現プロテオミクス2,38, と 4) Cellomics82, 83,84,,9798,99この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ストローク 時間 [分]
1-25 7-7.5
26-50 5-5.5
51-75 5-5.5
76-100 5-5.5
合計時間: 22-24 分

表 1: 均質化プロトコル。均質化速度 50 rpm でヒトの前頭皮質の 10 g を均一にポッター エルベジェム組織グラインダー用均質化プロトコルです。最初のいくつかのストロークがみじん切りにした組織を均質化するための追加の時間を必要とすることに注意してください。この初期の均質化後各ストロークは 12 時間で s (6 の下方への移動、6 s 上向きの動きの s)。したがって、初期の均質化後 1 分、または 5 分の 25 のストロークで 5 ストロークを実現できます。

問題 潜在的な原因 ソリューション
ない毛細血管のペレット 1) 不適切な Ficoll 濃度 1) Ficoll 濃度を調整します。
2) 不正なの遠心分離速度 2) 遠心分離速度を調整します。
3) 不正な加速および/または減速速度 3) 加速および/または減速の速度を調整します。
キャピラリー極低降伏点 1) ろ過ステップ ブロック髄膜 1) ろ過する前にすべての髄膜を削除します。
分離のプロシージャの間に失った 2) 余りにも多くの毛細血管 2) 緩衝溶液濃度を正しく計算、ピペット チップをすすいでください。
3) PluriStrainer フィルターをオフ毛細血管の洗浄が十分でなかった 3) フィルターを裏返して、慎重に毛細血管 (使用顕微鏡) の検査
Resuspensions の中に 4) 余分な泡 4) 泡を避けるためにゆっくりとピペット
非実行可能な毛細血管 1) 拡張死後間隔 1) できれば間隔を縮小またはスナップ冷凍脳を使用してください
2) 使用分離のための組織を凍結 2) 新鮮な組織を使用します。
3) 分離手順も長い時間 3) ワークフローを最適化します。
4) 機器/バッファーの分離のプロシージャの間に氷の上保管されていません。 4) 分離中に機器や氷の上のバッファーを維持します。

表 2: 一般的な問題のトラブルシューティングします。最も一般的なエラーとどのように彼らは解決することができます分離手順中に発生する問題の一覧です。

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Discussion

この議定書では、新鮮な組織からそのままで、実行可能な人間の脳毛細血管の分離について説明します。次の詳細に議論我々 このセクションで: 1) プロトコル、2) の一般的なエラーのトラブルシューティング、手法の限界 3)、4) に関して、既存モデルと代替血液脳関門モデルの意義への変更と 5)。分離脳毛細血管の潜在的なアプリケーション。

ここで説明されているプロトコルは、新鮮な人間の前頭皮質の組織 10 g に最適です。しかし、それは比較的単純なためこのプロシージャを変更する: 1)、多かれ少なかれ組織、2) 冷凍脳組織、または 3) 脳前頭葉以外の脳の領域からの 10 g より。まずと脳組織の 10 g 以上バッファーに必要な量だけ拡張できます組織の利用可能な量の上下。したがって、脳組織の 5 g だけの場合、バッファーのボリュームは半分に減少する必要があります。第二に、新鮮な脳組織を使用するキャピラリー分離について述べるが、新鮮な組織が利用できない38の場合、凍結するティッシュを使用可能性があります。第三に、前頭皮質から採取した新鮮な脳組織を用いて、毛細血管分離することが他の皮質頭脳領域から十分な利用可能な組織がある場合。また、非皮質脳領域から毛細血管を分離することが可能だ (e.g。、白質)、これらの地域が、別の細胞組成と毛細血管密度66,67,68。したがって、異なる脳領域からティッシュを使用して必要がありますするプロトコル (例えばバッファーのボリューム、グラデーションの中密度、遠心分離速度およびろ過ステップ数) を調整します。

キャピラリー分離手順自体では、複雑ではなく、小さな摂動またはプロトコルの変化に敏感です。キャピラリー収量の減少または減少毛管生存率の変更可能性があります。テーブル2最も一般的なエラーは、分離中に発生する問題の概要を説明し、これらのエラーと発生した場合のトラブルシューティングのためのソリューションを避けるためのヒントを示します。プロシージャに関連付けられている最も一般的な問題は、キャピラリーの軟鋼です。毛細血管の損失は各ステップで小規模な損失の累積合計は、しばしばとプロシージャ間でわずかなずれによるものです。重要なステップ密度遠心分離は毛細血管の大規模な量が失われる可能性があります。バッファー内の不適切な濃度キャピラリーのペレットの体積を減らして細胞の残骸から毛細血管を分離する不適切な密度で起因します。図 3は、脳のホモジネートを基準にして遠心分離のステップで少なすぎる、またはあまりにも多くの密度勾配媒体の結果を示します。濃度を適切に調整すると、この問題が解決可能性があります。遠心分離機の加速と減速の速度も脳毛細血管ペレットの形成に影響を与えることができます注意してください。毛細血管場合もあります失われた 6-7 の手順の中にピペット チップにこだわってキャピラリー材料の一部。この問題は、徹底的にそれを変更する前に各ピペット先端部を洗浄によって対処することができます。ステップ 7 の間に細胞の歪みフィルターから毛細血管を洗浄を完了できない場合がありますおよび/または毛細血管フィルターの縁に固執する可能性があります。これは、追加の洗浄のステップが続く顕微鏡下でフィルターをチェックすることによって回避できます。分離手順の各ステップの中に毛細血管を失うことは、取るに足らないキャピラリー ペレットやさらなる処理と実験に十分なキャピラリー材料で起因できます。

新鮮な人間のティッシュから脳の毛細血管を分離する体内の状況を密接に似ているユニークな血液脳関門モデルを表します。ただし、技術のいくつかの制限があります。1 つの課題は、新鮮な人間の組織の可用性です。最適な PMI は、≤4 h は、大幅に長く PMI で収集された脳組織はいくつかのダウン ストリーム アプリケーションに十分な新鮮なできません。いくつかのケースでは、下流のアプリケーションを制限することにより、複数の実験グループの十分な組織量を得ることが困難があります。したがって、齧歯動物19、犬69、牛42、または豚70脳組織から新鮮な毛細血管を分離する血液脳関門をモデル化するより適切な可能性があります。年齢、性別、民族、病気の状態、薬歴など人間の脳組織の変動を決定する要因、サンプル、および PMI の脳の領域必要があります考慮する解釈したりデータをパブリッシュするとき。実験レベルで孤立した毛細血管はまだ周を含めるが、アストロ サイト終足、44プロシージャによって削除されますに注意してくださいすることが重要です。それはここに示すモデル機能単位のモデルではなく血液脳関門 (すなわち、毛細血管内皮細胞) のex vivoモデルとして、考慮される必要があります。

すべての人間の組織での作業は常に安全性リスクを提示し、研究者は感染を避けるための隔離プロシージャ中に適切な予防措置を取る必要があります。具体的には、米国では、人体組織との仕事バイオ セーフティ キャビネット (クラス A2) が含まれています、BSL 2 認定検査機関スペースが必要です。さらに、スタッフは個人用保護具を使用する必要があります (すなわち。、白衣、手袋、顔面シールド)、人間の組織と実装バイオハザード廃棄物処理作業のための機器を指定。これらの安全対策は時間がかかる、コストがかかると特に経験の浅い研究者のための手順の難易度が上がります。

血液脳関門は、明確に定義された中枢神経系71と生物の間で保存性が高い。ひと血液脳関門をモデリングは、複雑な神経血管神経単位の細胞間結合があるため困難です。成人の脳は平均約 860 億ニューロンであると推定されている、ほぼすべてのニューロンでは、酸素や栄養素の72,73の適切な供給を確保するため周辺の独自のキャピラリーと考えられます。毛細血管内皮細胞は、血液-脳インターフェイス (健康な大人の人間のための 12-18 m2 ) の最大の表面積を構成します。タイトな接合は、溶質の傍細胞拡散を遮断することによって pharmacotherapeutics の広い配列を阻害するものを表します。また、数多くの研究の記述が神経変性疾患、例えばバリア機能不全、アルツハイマー病74ストローク75、てんかん38,76、多発性硬化症77、と。外傷性脳損傷の28,78。したがって、密接に人間の血液-脳関門を表し、健康および病気のバリア機能のよりよい理解を可能にするモデルを確立することが不可欠です。

体外細胞文化の多数のモデル、血液脳関門が存在します。件名に専門家のレビュー 41,49,51,69,79,80を参照してください。簡単に言えば、両方はたての初代培養脳内毛細血管内皮細胞を分離、不死化脳毛細血管内皮細胞ラインは利用できます。脳微小血管内皮細胞の初代培養はマウス、ラット、ブタ、牛から大抵使用されます。ただし、一次電池文化、労働集約的な細胞が新鮮な分離である必要がありますので。不死化脳毛細血管内皮細胞ラインはマウス、ラットおよび人間から利用でき、彼らは長期的な使用のため継代することができますは、手間がかからない。ただしも不死化細胞株はどのくらいの頻度彼らすることができますその内皮細胞の特性を失う前に継代する制限を持ちます。不死化細胞ラインと同様、両方の細胞、脳毛細血管内皮細胞をモデル化しそれにより頭脳への血の輸送41 を模倣細胞単層バリア透過性と薬物輸送現象を計測するプレートに培養頻繁 ,,8182。これらのモデルで文化メディアの変更またはキャンプ41,83,84のような他の生理学的関連要因や周アストロ サイトで補完はまた。

不死化細胞株の利点は、比較的簡単にアクセスと可用性です。サイド ・ バイ ・ サイドを成長するにつれて、内皮細胞特性を失う彼ら培養内皮細胞合流点に到達することができます、間単分子層で。たとえば、培養 hCMECs は薬物動態41P gp、タイト結合蛋白質および表示可変透湿のようなトランスポーターの発現低下を表示します。図 4は、新鮮な分離人間の毛細血管と比較して hCMEC/D3 セルに P gp 蛋白質の表現のための西部のしみを示します。下の 10 倍総蛋白量にもかかわらず P gp のための信号は hCMEC/D3 セルに比べて分離人間の毛細血管で強いです。これは、hCMEC/D3 セルが P gp 蛋白質の表現文化のかなりの量を失ったことを示します。また、文化メディア、環境、および機器の違いバリア完全性、すなわちのキー対策 TEER Transwell プレート アッセイの測定に影響を与えます。これらの問題のいくつかより密接に生体内で人間の血液-脳関門を表す分離脳毛細血管モデルを活用して克服できます。

分離脳の毛細血管は、ゲノミクス、プロテオミクス、機能・発現プロテオミクス研究 cellomics (図 5) などの研究の広い範囲のために使用されています。さらに、多くの技術と方法存在分離脳の毛細血管内でこれらの各フィールドを分析します。特に、図 5に示すように実験的手法は、数など、トランスレーショナルリサーチを促進するかもしれない人間、ウシ、ネズミ、ブタの組織から分離した脳の毛細血管で使用できます。たとえば、李85は、サブトラクション法を用いたラット脳の毛細血管から分離された mRNA を浄化血液-脳関門のゲノム解析を勉強しました。さらに、オット86 RT-PCR および qRT PCR PXR による P gp の規制を検討するのにために使用します。多くのプロテオーム研究活用3点のしみの分析87、シンプルなウエスタン アッセイ3,38、ELISA88,89、免疫沈降法3ウエスタンブロット、免疫染色の390,91。脳血管内皮細胞、マカフリー氏の人身売買の運送者を識別するには92は、分離脳の毛細血管の細胞レベル下の分別を使用しました。サンチェス ・ デル ・ ピノ93は、血液-脳関門輸送の場所と輸送方向を識別するのに孤立したウシ内皮膜小胞を使用しました。他のプロテオーム研究では、研究者はトランスポーター蛋白質94,95,96を定量化するのに液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析法を使用しました。機能プロテオミクス研究は、トランスポーターを利用した、漏れ2,38の試金。ハルツ2は、分離脳の毛細血管で酵素活性を決定するのにザイモグラフィーを使用しました。さらに、細胞培養を利用した広大な cellomic 研究では、多数の血管内皮細胞と血液脳関門82,83,84のモデルを生成しています。これらのモデルで使用される一般的な試金は移行の試金97,98、生存率、毒性の試金99、および血管新生アッセイ98を含まれます。

分離脳の毛細血管には、蛋白質の表現および活動の正確な特性評価と血液脳関門でシグナルの説明ができます。これは、一部は約 1% (v/v)、脳の毛細血管のコンテンツによるものです。したがって、貧しい信号対雑音比24精製の毛細血管内皮細胞の代用として全脳ホモジネートまたは脳スライスを使用してが、最も可能性が高い。さらに、分離後、脳の毛細血管が少なくとも 6 h (マウスおよびラットから未発表データ)、特定のシグナル伝達経路を識別する研究を可能にするために実行可能。同じ準備からコントロールのグループを含むようにそれをお勧めします。

このレポートで説明した孤立した毛細血管モデルなど、血液-脳関門の代表と並進モデルは、健康と病気でバリア機能を研究に必要です。ここで良好な収率と血液-脳関門の前のヴィヴォモデルとして使用できる高品質の分離脳毛細血管を取得するためのプロトコルを提案する.孤立した毛細血管は、元の構造と後分離分子、生物の数のためにそれらを使用できる関数と生理学的アッセイを保持します。サンプル人間組織を処理、できれば BSL 2 またはより高い設定でときに注意が必要があります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 は感謝し、ピーター ネルソン博士とすべての人間の脳組織サンプルを提供するため英国 ADC 脳組織銀行でソニア ・ アンダーソンを認める (NIH 付与数: 国立老化研究所から P30 AG028383)。グラフィカルな援助、マット ・ ハザードとトム ・ ドーラン、情報技術サービス、学術技術と学部婚約、ケンタッキー大学に感謝しますこのプロジェクトはだった (B.B.) に国立神経疾患と脳卒中から許可番号 1R01NS079507 によって (A.M.S.H.) に国立老化研究所から許可番号 1R01AG039621 でサポートされています。内容は著者の責任と高齢化に関する国立研究所の神経疾患と脳卒中や国立研究所の公式見解を必ずしも表さない。著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

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