Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Neuroscience

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Summary

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

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Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

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Abstract

Comprendere la funzione di barriera emato - encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che promettono di migliorare la fornitura di droga del cervello, migliorare la protezione del cervello e trattare il cervello disturbi. Tuttavia, studiare la funzione umana barriera emato - encefalica è impegnativo. Così, c'è un bisogno fondamentale per modelli appropriati. A questo proposito, capillari cerebrali isolati da tessuto cerebrale umano rappresentano uno strumento unico per studiare la funzione di barriera come vicino alla situazione umana in vivo come possibile. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari dal tessuto di cervello umano a un alto rendimento e con purezza e qualità costante. I capillari sono isolati dal tessuto di cervello umano fresco mediante filtrazione, centrifugazione in gradiente di densità e omogeneizzazione meccanica. Dopo l'isolamento, i capillari del cervello umano possono essere utilizzati per varie applicazioni tra cui saggi di perdite, live cell imaging e le analisi basate su immunitario per studiare l'espressione della proteina e funzione, l'attività enzimatica o segnalazione intracellulare. Cervello umano isolato capillari sono un modello unico per delucidare il regolamento della funzione umana barriera emato - encefalica. Questo modello può fornire intuizioni nella patogenesi del sistema nervoso centrale (SNC), che aiuterà lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di disordini dello SNC.

Introduction

La barriera emato - encefalica è un'interfaccia strettamente controllata tra il sangue e il cervello che determina ciò che entra ed esce dal cervello. Anatomicamente, cellule endoteliali compongono la barriera emato - encefalica e forma una complessa, continua rete capillare. Fisiologicamente, questa rete capillare fornisce il cervello con l'ossigeno e le sostanze nutrienti mentre contemporaneamente smaltimento dell'anidride carbonica e le scorie metaboliche. Cosa importante, la prova sostiene che le modifiche alla barriera contribuiscano a numerose patologie, tra cui il morbo di Alzheimer, epilessia e ictus1,2,3,4,5 , 6 , 7. cervello cellule endoteliali anche servono come una barriera al trattamento bloccando l'assorbimento del farmaco nel cervello, ad es., chemioterapia del multiforme di glioblastoma seguito tumore resezione8,9, 10. A questo proposito, i capillari del cervello umano isolato rappresentano un unico ex vivo barriera emato - encefalica modello che ricorda da vicino barriera proprietà in vivo, che consente lo studio della funzione della barriera e della disfunzione in salute e la malattia. In questo articolo, forniamo un protocollo per isolare i capillari del cervello dal cervello umano a una qualità costantemente elevata capillare e resa per studiare la barriera emato - encefalica.

Nel 1969, Siakotos et al. 11 sono stati i primi a segnalare l'isolamento dei capillari del cervello dal tessuto di cervello bovino e umano usando densità gradiente centrifugazione e vetro perlina colonna di separazione. Più tardi, Goldstein et al. 12 migliorato questo metodo aggiungendo più passaggi di filtrazione per diminuire la quantità di tessuto necessaria per studiare i capillari cerebrali isolati dai ratti, pur mantenendo l'attività metabolica di trasporto del glucosio. Da allora, i ricercatori hanno ottimizzato la procedura di isolamento capillare numerose volte, miglioramento del metodo e cervello modello capillare con ciascuna iterazione13,14,15. Ad esempio, atomo et al. 16 isolato bovina capillari tramite digestione enzimatica piuttosto che omogeneizzazione meccanica e quindi successivamente passata una sospensione capillare attraverso un filtro a rete 210 µm e una colonna di perlina di vetro. Queste modifiche migliorato la macchia di esclusione del trypan blu dei capillari cerebrali isolato e quindi, aumentato di attuabilità delle cellule endoteliali. Nel 1990, Dallaire et al. 17 isolato capillari bovini e ratto che erano chiare di un neurone contaminazione e mantenuto l'attività metabolica di γ-glutamil transpeptidasi (γ-GTase) e della fosfatasi alcalina. Nel 2000, Miller et al. 18, usato isolati del ratto e capillari cerebrali suina in combinazione con microscopia confocale per mostrare l'accumulo dei substrati di trasporto nel lumen dei vasi capillari. Successivamente, il nostro laboratorio ha continuato ad ottimizzare la procedura di isolamento capillare del cervello e abbiamo stabilito i saggi di trasporto per determinare la P-glicoproteina (P-gp)19,20,21, cancro al seno resistenza della proteina (BCRP)22,23e multi-farmaco resistenza proteina 2 (Mrp2) attività di trasporto di24 . Nel 2004, abbiamo pubblicato due relazioni dove abbiamo usato capillari cerebrali isolati del ratto per studiare varie vie di segnalazione. A Hartz et al. 21, abbiamo trovato che il peptide endotelina-1 rapidamente e reversibilmente ridotta funzione di trasporto P-gp in capillari cerebrali agendo attraverso del recettore dell'endotelina recettori B (ETB), l'ossido nitrico sintasi (NOS) e protein chinasi C (PKC). In Bauer et al. 19, abbiamo dimostrato l'espressione del recettore recettore nucleare pregnane X (PXR) e ha mostrato PXR-modulazione della funzione di espressione e di trasporto P-gp nei capillari del cervello. Negli esperimenti con i topi transgenici di PXR umanizzati, abbiamo ampliato questa linea di ricerca e ha dimostrato in vivo di serraggio della barriera di upregulating P-gp attraverso l'attivazione di hPXR25. Nel 2010, Hartz et al. 26 utilizzato questo approccio per ripristinare l'espressione della proteina P-gp e attività nei topi di proteina (hAPP) precursore dell'amiloide umana transgenici che sovraesprimono hAPP di trasporto. Inoltre, ripristino di P-gp in hAPP topi significativamente riducono di beta amiloide (Aβ)40e livelli del cervello Aβ42.

Oltre a studiare le vie di segnalazione, capillari cerebrali isolato possono essere utilizzati per determinare cambiamenti nella permeabilità capillare che ci riferiamo come perdita capillare. In particolare, l'analisi di perdita Texas Red è usata per valutare la perdita della tintura fluorescente Texas Red dal lume capillare nel tempo e questi dati vengono quindi utilizzati per analizzare i tassi di perdita. Tassi di perdita capillare aumentato rispetto a quelli da capillari di controllo indicano cambiamenti nell'integrità fisica della barriera emato - encefalica2. Questo è prezioso perché ci sono numerosi Stati di malattia connessi con rottura della barriera, ad es., epilessia, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer e cerebrali traumatiche lesioni27,28,29, 30. Altri gruppi hanno anche utilizzato isolati capillari per discernere le vie di segnalazione che regolano l'espressione della proteina e l'attività di trasporto delle proteine31,32,33,34, 35,36,37. Infine, abbiamo continuato ad ottimizzare questo metodo per l'isolamento dei capillari del cervello umano e, recentemente, abbiamo mostrato l'espressione aumentata di P-gp umana barriera emato - encefalica nei pazienti con epilessia rispetto a individui di controllo di grippaggio-libero38 . Presi insieme, questi sviluppi dimostrano che i capillari cerebrali isolato possono servire come un modello versatile per studiare la funzione della barriera.

Vari in vivo, ex vivoe in vitro di barriera emato - encefalica modelli sono stati utilizzati nella ricerca di base e lo screening di stupefacenti industriali, principalmente con l'obiettivo della prova di consegna della droga per il cervello39,40,41 ,42,43,44. Oltre alle isolato ex vivo capillari cerebrali, attuale barriera emato - encefalica modelli includono modelli in silico , in vitro di colture cellulari di cellule endoteliali dei capillari del cervello isolato o linee cellulari immortalizzate da vari specie, coltura in vitro di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che si differenziano in cellule endoteliali dei capillari del cervello e modelli di microfluidica su un chip.

In silico modelli sono più comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci per la selezione di candidati farmaci basati sul predetto assorbimento, distribuzione, metabolismo e l'escrezione (ADME) proprietà. Metodi quali modelli di relazione (QSPR) quantitative struttura-proprietà e modelli di relazione (QSAR) quantitativa struttura-attività sono metodi comuni utilizzati in high throughput screening di librerie prevedere cervello penetrazione di candidati farmaci 45 , 46. questi modelli sono utili per molecole di schermo per le proprietà di penetrazione della barriera.

Betz et al. 47 monostrati di cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate, ricavandone un sistema modello in vitro della barriera emato - encefalica. In vitro modelli della coltura cellulare utilizzando tessuto fresco o linee cellulari endoteliali immortalizzate come le cellule endoteliali del microvessel cerebrale umana (hCMECs) possono essere un altro strumento di screening ad alta resa per la penetrazione di cervello o studi meccanicistici. Tuttavia, modelli di cultura delle cellule endoteliali capillari del cervello mancano la sollecitazione di taglio fisiologica del flusso sanguigno all'interno del lume capillare, sono limitate nella complessità nel complesso biologico e subiscono cambiamenti nell'espressione e localizzazione dei componenti importante barriera come le proteine di giunzione stretta, ioni, trasportatori, enzimi e recettori di superficie canali48,49,50. Al contrario, monostrati endoteliali derivati da hPSCs, hanno saccarosio bassa permeabilità rispetto alle culture hCMEC/D3 e contengono espressione polarizzata di alcuni trasportatori di barriera emato - encefalica, molecole di adesione e giunzioni strette51, 52. Tuttavia, queste cellule sono anche soggetti a modifica proprietà nella cultura, e il sistema deve essere validato per la ricapitolazione di in vivo proprietà barriera52.

Le tendenze più recenti nella barriera emato - encefalica ricerca includono utilizzando sistemi di coltura del tessuto 3D per creare capillari artificiali, utilizzando la tecnologia di organo-on-chip per generare dispositivi microfluidici, o che utilizzano la tecnologia a fibra cava53, 54 , 55. capillari artificiali, tuttavia, sono significativamente più grandi diametri (100 – 200 µm) di capillari cerebrali (3 – 7 µm). Quindi, il taglio forze in vitro non completamente simile la situazione in vivo . Questo viene affrontato in dispositivi microfluidici "blood-brain-barrier-on-a-chip", dove compartimenti di "sangue" e "cervello" di forma membrane artificiali e fluidi vengono pompati attraverso questi dispositivi che generano forze di taglio di microfluidica. Allo stesso modo, co-colture di cellule endoteliali in varie combinazioni con gli astrociti e cellule muscolari lisce vascolari sono stati anche utilizzate con la tecnologia a fibra cava per ricreare i parametri reologici presenti sotto nel vivo condizioni56 , 57 , 58. Tuttavia, non è chiaro quanto bene questo modello riflette altre proprietà della barriera sangue - cervello come trasporto, metabolismo, segnalazione e altri. Questi modelli artificiali capillare e chip sono adatti per high throughput screening di farmaci, ma le cellule utilizzate per generare questi modelli sono anche soggetti a modifiche durante la coltura.

Fette del cervello congelato e fisso o colture di cellule endoteliali capillari sono ulteriori modelli che possono essere utilizzato perlo studio del microcircolo umano5,59,60,61primario del cervello. Ad esempio, immunoistochimica del tessuto cerebrale fisso viene utilizzato per determinare la localizzazione della proteina, e l'espressione in sano rispetto al tessuto malato.

Oltre alle fettine di tessuto e i modelli in vitro capillari cerebrali di cui sopra, appena isolate possono essere utilizzati per studiare la funzione di barriera emato - encefalica. Limitazioni di questo modello capillare isolato includono la difficoltà per ottenere il tessuto cerebrale umano fresco, assenza di astrociti e neuroni e un processo relativamente lungo isolamento. Un vantaggio del modello capillare del cervello isolato è che questo modello ricorda da vicino la situazione in vivo e, pertanto, può essere utilizzato per caratterizzare la disfunzione e la funzione di barriera. Importante, può anche essere utilizzato per discernere i meccanismi di segnalazione utilizzando una moltitudine di saggi e tecniche molecolari3,19,62,63.

Il nostro laboratorio ha accesso a sia il tessuto fresco e congelato del cervello umano attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M)64. In questo contesto, le autopsie seguono un protocollo standard, cervelli sono ottenuti < 4h e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Dato questo unico accesso al tessuto cerebrale umano, abbiamo stabilito e ottimizzato un protocollo per isolare i capillari del cervello dal tessuto di cervello umano che si traduce in un alto rendimento dei capillari del cervello umano intatto, praticabile. Due endpoint comune di interesse sono per determinare l'espressione della proteina e l'attività. A questo proposito, noi ed altri abbiamo stabilito vari saggi che possono essere utilizzati con capillari cerebrali isolato per studiare l'espressione della proteina e livelli di attività. Questi test includono Western blotting, analisi di Western semplice, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), zimografia, analisi di attività di trasporto, e saggi di perdita capillare. Queste analisi permettono ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella funzione della barriera in condizioni patologiche umane, determinare le vie che regolano l'attività e l'espressione della proteina e identificare bersagli farmacologici per il trattamento della barriera emato - encefalica associata malattie.

Presi insieme, appena capillari cerebrali isolato possono servire come un modello affidabile e riproducibile della barriera sangue - cervello. In particolare, questo modello può essere abbinato molti diversi saggi per determinare una vasta gamma di endpoint per studiare la funzione di barriera.

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Protocol

Le informazioni di seguito si basano su sicurezza attuale e gli standard normativi presso l'Università del Kentucky, Lexington, KY, Stati Uniti d'America. Come precauzione di sicurezza, consultare programma sicurezza biologica dell'istituzione e delle più attuali normative e raccomandazioni prima di lavorare con tessuti umani.

Attenzione: Il tessuto umano può essere una fonte di sangue agenti patogeni, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV) e altri. Lavoro con tessuto umano comporta il rischio di infezione da patogeni presenti nel sangue. Di conseguenza, alcune considerazioni di sicurezza e normativi sono indispensabili quando si lavora con tessuti umani per proteggere il personale di laboratorio. Lavorare con tessuto umano negli Stati Uniti richiede un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, nonché precauzioni di sicurezza e formazione secondo NIH sezione IV-B-7, OSHA Act del 1970 clausola 5(a)(1) e programma istituzionale sicurezza biologica dell'utente. In generale, approvazione Comitato istituzionale biosicurezza e/o Institutional Review Board deve essere ottenuto prima di svolgere qualsiasi ricerca che coinvolge umani materiali (tessuti, fluidi corporei). La formazione è necessaria per tutti coloro che lavorano con materiali umani e include training di sicurezza di laboratorio di base, ad es., chimica igiene e sicurezza del laboratorio, nonché formazione specifica sulla sicurezza biologica, rifiuti pericolosi e umani patogeni presenti nel sangue. Tutti coloro che lavorano con materiali umani è altamente raccomandati per ottenere le vaccinazioni di epatite B, prima di lavorare con materiali umani. Personale sono tenuto a indossare specifici dispositivi di protezione individuale durante il lavoro con materiali umani, ad es., un camice da laboratorio con risvolto e una faccia scudo e indossare i guanti in ogni momento. Tutto il lavoro viene eseguito in una cappa di biosicurezza (classe 2). Tutte le apparecchiature che viene in contatto con materiali di umani e ogni rifiuti da materiali umani viene gestita in modo appropriato per evitare contaminazione e/o infezione del personale. Tutte le attrezzature e le superfici vengono pulite con etanolo al 10% candeggina e il 75% dopo ogni procedura che coinvolga materiali umani. Una fuoriuscita con materiali umani dovrà essere immediatamente pulita. La cristalleria è sterilizzato nell'autoclave dopo ogni utilizzo. Rifiuti, compreso il tessuto umano non fissato, sono raccolti in un sacchetto di rifiuti con etichetta biohazard e sterilizzati in autoclave. Sharps sono raccolti in un contenitore di puntura e antiperdita etichettato come biologici pericoloso. Tutti i rifiuti da materiali umani sono stato eliminato secondo norme di sicurezza biologica dell'istituzione.

Nota: Il nostro laboratorio ottiene i campioni freschi corteccia frontale da individui deceduti attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M). Criteri di inclusione sono: registrazione in studio del gruppo di analisi longitudinale UK-ADC e un intervallo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autopsie seguono un protocollo standard e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Un breve PMI di meno di 4 ore è di massima importanza per garantire redditività capillare dopo l'isolamento. Possono essere utilizzati tessuti sia freschi che congelati. Se il congelamento è necessario, tessuto cerebrale umano appena ottenuti dovrebbe essere scossa-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C. Tessuto fresco o scongelato dovrebbe essere memorizzato nel buffer di isolamento (Vedi sotto) ed elaborato rapidamente. Troviamo che 10 g di tessuto umano fresco rendimenti circa 100 mg di capillari cerebrali (peso umido).

1. installazione

  1. Preparazione del tampone
    Nota: Il volume di tampone necessario dipende dalla quantità di tessuto. Tutti i volumi di buffer nel protocollo seguente sono basati su 10 g di tessuto di corteccia del cervello umano.
    1. L isolamento Buffer: Utilizzare 1,5 L di soluzione tampone fosfato e di Dulbecco (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completare con 5 mM D-glucosio (1,35 g ) e 1 mM sodio piruvato (0,165 g). Dopo l'aggiunta del glucosio e del piruvato, regolare a pH 7.4 con idrossido di sodio. Raffreddare e conservare il buffer a 4 ° C prima dell'uso.
    2. Albumina di siero bovino (BSA): Aggiungere 10 g di polvere di BSA a 1 L di tampone di isolamento a una concentrazione finale di BSA 1%. Mescolare lentamente per evitare bolle, regolare a pH 7.4 e conservare a 4 ° C durante la notte. Immediatamente prima dell'uso, mescolare delicatamente; evitare la formazione di bollicine per evitare la denaturazione di albumina.
    3. medio di gradienti di densità: pesare 18 g di medio gradiente di densità in una bottiglia di vetro e aggiungere un ancoretta magnetica. Aggiungere 60 mL di buffer di isolamento e agitare vigorosamente per 5 minuti fino a quando tutti i polvere viene sospesa. Archivio durante la notte a 4 ° C per consentire allo densità gradiente a sciogliere. Mescolare per 10 min destra prima dell'uso.
    4. Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C; mantenere tutti gli strumenti e buffer sul ghiaccio durante la procedura di isolamento intero. Mescolare tutti i buffer prima dell'uso.
  2. Messa a punto sperimentale
    1. Montare il pestello del macinino Potter-Chazen tessuto sull'agitatore elettronico. Posto il Potter-Chazen tessuto smerigliatrice e l'omogeneizzatore lisata con pestello su ghiaccio sotto il cofano. Preparare una maglia del filtro 300 µm (5 x 5 cm2), piegarlo ad un cono e inserire e allegarlo a un 50 mL tubo Falcon con nastro (Figura 1A).
    2. Inserire anelli di collegamento e filtri di ceppo di cella (dimensione dei pori: 30 µm) su provette Falcon da 50 mL. Preparare sacchetti di rifiuti a rischio biologico. Collocare tutte le necessarie attrezzature nella biosicurezza armadio (Vedi Tabella materiali).

2. preparazione del campione cervello

Nota: La Figura 1A Mostra il diagramma di flusso di lavoro della procedura intero isolamento descritta di seguito. Tessuto di cervello umano può provenire da qualsiasi parte della corteccia e può essere utilizzato fresco o congelato. Tessuto cerebrale congelati possa essere scongelato a temperatura ambiente (nessun buffer; ~ 30 min per 10 g). Per ottenere risultati comparabili, il tessuto cerebrale dovrebbe essere ottenuto dalla stessa regione del cervello per ogni esperimento. Questo protocollo è ottimizzato per fresh (PMI < 4h) corteccia cerebrale umana che non è stato congelato.

  1. Preparazione del tessuto di cervello umano: documentare il peso del tessuto cerebrale. Tutti i numeri nel seguente protocollo sono adatti per 10 g di tessuto cerebrale umano fresco. Posizionare il tessuto cerebrale in un 100mm di Petri. Rimuovere con cura tutte le meningi con il forcipe. Utilizzare un bisturi per tagliare la materia bianca.
  2. Macinazione del tessuto cerebrale umano: attentamente tagliare il tessuto cerebrale e usa mezzi con un bisturi. Tritare per circa 5 min (2 – 3 mm pezzi). Trasferire il tessuto cerebrale per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen. Aggiungere 30 mL di buffer di isolamento.
    Nota: I pezzi di tessuto macinate sono difficili da vedere dato che il tessuto cerebrale si trasforma in poltiglia attraverso il processo di macinazione.

3. omogeneizzazione

  1. Smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen (clearance: 150 – 230 µm): omogeneizzare ogni campione con 100 colpi ad una velocità di omogeneizzatore di 50 giri/min. Documentare il tempo ogni 25 colpi e il tempo totale necessario per 100 colpi. Vedere la tabella 1 per un protocollo di omogeneizzazione proposto; il tempo totale per l'omogeneizzazione di 10 g di corteccia frontale umana è circa 22 min. Non si mescoli in aria per evitare bolle.
  2. Lisata omogeneizzatore (clearance: 80 – 130 µm): trasferire l'omogeneizzato in un omogeneizzatore lisata sul ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione con 20 colpi (~ 6 s/corsa, totale di ~ 2 min). Evitare le bolle.

4. centrifugazione

  1. Distribuire equamente omogeneato del cervello in quattro provette da 50 mL centrifugazione e il volume totale dell'omogeneato del documento. Distribuire 50 mL di tampone di gradienti di densità nelle provette centrifugazione (12,5 mL per tubo). Utilizzare 10 mL di buffer di isolamento per sciacquare il pestello e omogeneizzatore e dividere i quattro tubi di centrifugazione (~2.5 mL per tubo).
  2. Chiudere bene le provette per centrifuga con tappi. Mescolare l'omogeneato, densità gradiente medio e buffer agitando vigorosamente i tubi. Centrifugare a 5.800 x g per 15 min a 4 ° C (rotore ad angolo fisso); Selezionare una velocità di decelerazione media di mantenere il pellet fissato al tubo. Scartare il surnatante e risospendere in 2 mL di BSA 1% ciascuna.

5. filtrazione

Nota: Per separare i capillari da globuli rossi e altri detriti cellulari, sono necessari diversi passaggi di filtrazione.

  1. maglia di 300 µm: dopo la ri-sospensione il pellet, filtrare la sospensione attraverso la maglia di 300 µm. Capillari vengono filtrati attraverso la rete, considerando che le navi più grandi e più grande cervello detriti rimangono sulla mesh. Lavare accuratamente la mesh con fino a 50 mL di BSA 1%. Scartare la mesh.
    Nota: Questo passaggio di filtrazione Cancella la sospensione capillare da qualsiasi più grandi vasi o porzioni di detriti di cervello.
  2. Filtro di ceppo di celle 30 µM
    Nota: Questo passaggio di filtrazione separa capillari da globuli rossi e altri detriti di cervello.
    1. Distribuire il capillare filtrato da 6.1 scavalcare i filtri di ceppo di cella cinque 30 µm (circa 10 mL di filtrato capillare al filtro di ceppo di celle). I capillari sono ostacolati da questo filtro, considerando che globuli rossi, altre singole cellule e detriti piccolo cervello passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato.
    2. Lavare ogni filtro con 25 mL di BSA 1%. In seguito, versare filtrati tutti sopra il sesto filtro per aumentare il rendimento. Lavare ogni filtro con 50 mL di BSA 1%; mantenere la cella ceppo filtri con contenente i capillari e scartare il filtrato.

6. prelievo

  1. Capovolgere i filtri e lavare i capillari di BSA 1% per ogni filtro 50 ml in provette da 50 mL. Applicare pressione con la punta della pipetta un pipettatore 5ml delicatamente e spostarlo attraverso il filtro per lavare via i capillari del cervello.
  2. Assicurarsi di lavare tutti i capillari cerebrali, soprattutto dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché questo rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la probabilità di perdita capillare.

7. lavaggio

  1. Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C (rotore oscillante). Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in circa 3 mL di buffer di isolamento. Combinare tutti i pellet sedimento da un campione in una provetta conica da 15 mL e riempirlo con buffer di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C e lavare due volte.
  2. Documentare la purezza capillare con un microscopio (ingrandimento 100 X) e la macchina fotografica (Figura 1B).
    Nota: La resa capillare del cervello da 10 g di tessuto cerebrale umano è in genere circa 100 mg. I capillari del cervello isolato possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati (ad es., lisato, isolamento di membrana), o essere flash-congelati e conservati a-80 ° C in provette per criogenia per un minimo di 6 – 12 mesi (evitare più cicli di gelo-disgelo).

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Representative Results

Gli isolamenti da tessuto cerebrale umano resa una sospensione arricchita nei capillari del cervello umano (Figura 1B) con piccole quantità di navi più grandi, cellule di anima rosse, altre cellule singole e alcuni detriti cellulari. Alcuni capillari sono ramificati, e, in alcuni, globuli rossi sono intrappolate in lumen capillare. Il capillare tipico ha un diametro di 3 – 7 µm ed è circa 100-200 µm lungo con lumen aperta; la maggior parte delle estremità capillare sono crollata. Usando la microscopia confocal, capillari del cervello umano isolato rivelano una struttura tubolare, intatta e morfologia. La Figura 2A Mostra che un rappresentante trasmesso luce l'immagine di un cervello umano capillare con un Pericita annesso e un globulo rosso in lumen. Tutti i risultati per quanto riguarda il diametro, dimensioni e morfologia sono in conformità con i rapporti precedenti sulla struttura del cervello isolato capillari12,17,18. Il cervello umano isolato capillare nella Figura 2B è stato immunostained per P-gp (verde) utilizzando C219 come l'anticorpo primario (1 µ g/mL); i nuclei erano controcolorati con DAPI (1 µ g/mL).

Figure 1
Figura 1: diagramma di flusso per isolamento capillare. (A), il pittogramma illustra i passaggi principali della procedura per isolare i capillari cerebrali dal tessuto umano fresco. (B), l'immagine mostra i capillari del cervello umano isolato sotto un microscopio chiaro direttamente dopo isolamento (ingrandimento 100 X). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: cervello umano isolato capillare. (A) A luce trasmessa immagine di un cervello umano isolato capillare. (B), il microscopio confocale immagine mostra un cervello umano isolato capillare immunostained per P-gp (verde; C219 1 µ g/mL); i nuclei erano controcolorati con DAPI (blu; 1 µ g/mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: risoluzione dei problemi di centrifugazione densità. Il pictogram mostra la preparazione dopo la centrifugazione in gradiente di densità. Mette in evidenza gli effetti di medio gradiente di densità troppo e troppo poco e come questo influenzi la separazione e il pellet capillare risultante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: espressione della proteina P-gp nei capillari del cervello umano isolato. Il Western blot mostra forti bande per P-gp (1 µ g/mL) in vasi capillari umani isolati rispetto alle cellule di hCMEC\D3. Β-actina è stato usato come un controllo di carico (1 µ g / µ l). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: applicazioni per i capillari del cervello umano isolato. Una panoramica delle applicazioni più comuni per capillari cerebrali isolato pubblicati nella letteratura. Capillari isolati sono stati utilizzati per: 1) genomica85,86, 2) proteomica3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) proteomica funzionale2,38e 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Strokes Tempo [min]
1 – 25 7 – 7.5
26-50 5 – 5.5
51-75 5 – 5.5
76-100 5 – 5.5
Tempo totale: 22 – 24 min

Tabella 1: protocollo di omogeneizzazione. Il protocollo di omogeneizzazione per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen omogeneizzare 10 g di corteccia frontale umana ad una velocità di omogeneizzazione di 50 giri/min. Si noti che i primi tratti diversi richiedono ulteriore tempo per omogeneizzare il tessuto macinato. Dopo questo iniziale omogeneizzazione, ogni tratto è 12 s in durata (6 s per movimento verso il basso, 6 s per movimento verso l'alto). Così, dopo l'iniziale omogeneizzazione, 5 colpi possono essere realizzati in 1 min, o 25 colpi in 5 min.

Problema Causa potenziale Soluzione
Nessun Pellet capillare 1) non corretta concentrazione di Ficoll 1) regolare la concentrazione di Ficoll
2) velocità di centrifugazione non corretto 2) regolare la velocità di centrifugazione
3) ad un'errata velocità di accelerazione o decelerazione 3) regolare la velocità di accelerazione o decelerazione
Bassa resa capillare 1) le meningi blocco passi di filtrazione 1) rimuovere tutte le meningi prima della filtrazione
2) troppi capillari perditi durante la procedura di isolamento 2) calcolare la concentrazione di buffer correttamente, sciacquare i puntali per pipette
3) lavaggio capillari PluriStrainer filtri era insufficiente 3) capovolgere filtri e ispezionare attentamente per capillari (uso microscopio)
4) in eccesso bolle durante resuspensions 4) pipetta lentamente per evitare bolle
Capillari non vitali 1) esteso post mortem interval 1) ridurre intervallo se possibile o usare il cervello congelato snap
2) usando congelati del tessuto per l'isolamento 2) utilizzare tessuto fresco
3) tempo di procedura di isolamento troppo lungo 3) ottimizzare il workflow
4) attrezzature/buffer non sono state mantenute sul ghiaccio durante la procedura di isolamento 4) mantenere attrezzature e buffer sul ghiaccio durante l'isolamento

Tabella 2: risoluzione dei problemi comuni. Un elenco dei più comuni errori e problemi che si verificano durante la procedura di isolamento e di come possano essere risolti.

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Discussion

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei capillari del cervello umano intatta e vitale dal tessuto fresco. In questa sezione discutiamo dettagliatamente quanto segue: 1) modifiche al protocollo, 2) risoluzione dei problemi di errori comuni, 3) le limitazioni della tecnica, 4) il significato del modello rispetto alle esistenti e modelli alternativi barriera emato - encefalica, e 5). potenziali applicazioni per i capillari del cervello umano isolato.

Il protocollo descritto qui è ottimizzato per 10 g di tessuto fresco di corteccia frontale umana. Tuttavia, è relativamente semplice modificare questa procedura per: 1) più o meno a 10 g di tessuto, tessuto cerebrale 2) congelato o tessuto cerebrale 3) da una regione del cervello diverso da quello della corteccia frontale. In primo luogo, con più o meno di 10 g di tessuto cerebrale, il volume necessario dei buffer può semplicemente essere scalato verso l'alto o verso il basso per la quantità disponibile di tessuto. Così, se solo 5 g di tessuto cerebrale è disponibile, il volume dei buffer dovrebbe essere ridotto di metà. In secondo luogo, descriviamo un isolamento capillare che utilizzato il tessuto cerebrale fresco, ma tessuto congelato può essere utilizzato se il tessuto fresco è disponibile38. In terzo luogo, abbiamo usato il tessuto cerebrale fresco prelevato dalla corteccia frontale, ma capillari possono essere isolati da altre regioni corticali del cervello se c'è abbastanza tessuto disponibile. È anche possibile isolare capillari da regioni non-corticali del cervello (ad es., materia bianca), ma queste regioni hanno una cella diversa composizione e capillare densità 66,67,68. Quindi, usando il tessuto da una regione diversa del cervello probabilmente richiederebbe il protocollo per essere regolato (ad es., volume tampone, gradiente di densità media, velocità di centrifugazione, e/o numero di passi di filtrazione).

La procedura di isolamento capillare, mentre non complesse per sé, è sensibile a piccole perturbazioni o alterazioni nel protocollo. Modifica può comportare una diminuita resa capillare o ridotta redditività capillare. Tabella 2 delinea i più comuni errori e problemi che si verificano durante l'isolamento e vengono elencati suggerimenti per evitare questi errori e soluzioni per la risoluzione dei problemi se si verificano. Il problema più comune connesso con la procedura è una bassa resa capillare. La perdita di capillari è spesso la somma cumulativa di piccole perdite ad ogni passo ed è a causa di piccole deviazioni attraverso la procedura. Un passaggio fondamentale in cui una grande quantità di vasi capillari potrebbero perdersi è la centrifugazione di densità. Una concentrazione non corretta nel buffer si traduce in una densità non corretta per separare i capillari da detriti cellulari che riduce il volume del pellet capillare. La figura 3 Mostra le conseguenze di medio gradiente di densità troppo o troppo poco in fase di centrifugazione relativo omogeneato del cervello. Regolazione per la corretta concentrazione potrebbe risolvere il problema. Si noti che la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga può colpire anche la formazione del precipitato capillare del cervello. Capillari possono anche essere persi durante i passaggi 6 – 7 se parte del materiale capillare bastoni per le punte di pipetta. Questo problema può essere risolto sciacquando accuratamente ogni punta della pipetta prima di modificarla. Durante il passaggio 7, lavando i capillari del filtro di ceppo cellulare potrebbe essere incompleto e/o capillari possono aderire al bordo del filtro. Questo può essere evitato controllando il filtro al microscopio, seguita da ulteriori lavaggi. Perdere i capillari durante ogni passaggio della procedura di isolamento può provocare un pellet capillare trascurabile o non abbastanza capillare materiale per un'ulteriore elaborazione e sperimentazione.

Isolando i capillari del cervello dal tessuto umano fresco rappresenta un modello unico barriera emato - encefalica che ricorda da vicino la situazione in vivo . Tuttavia, esistono diverse limitazioni della tecnica. Una sfida è la disponibilità di tessuto umano fresco. Come le PMI ottimale è ≤ 4 h, raccolto in una PMI significativamente più lungo del tessuto di cervello non sarà abbastanza fresco per alcune applicazioni a valle. In alcuni casi, può essere difficile ottenere la quantità di tessuto che sono abbastanza grandi per più gruppi sperimentali, creando una strozzatura applicazioni a valle. Quindi, isolando freschi capillari da roditore19, canini69, bovino42o porcina70 tessuto cerebrale può essere più adatto per modellare la barriera emato - encefalica. Fattori che determinano la variabilità del tessuto di cervello umano quali età, sesso, etnia, stato di malattia, storia di farmaco, regione del cervello del campione e PMI dovrebbe essere preso in considerazione nell'interpretazione e la pubblicazione di dati. A livello sperimentale è importante notare che i capillari isolati includono ancora periciti, ma astrocytic endfeet vengono rimossi tramite la procedura44. Ha bisogno di essere preso in considerazione che il modello presentato qui serve come un modello ex vivo della barriera sangue - cervello (cioè, cellule endoteliali dei capillari), ma non come modello dell'unità neurovascolare.

Lavorare con qualsiasi tessuto umano presenta sempre un rischio di sicurezza inerente e i ricercatori devono prendere le opportune precauzioni durante la procedura di isolamento per evitare il contagio. In particolare, negli Stati Uniti, lavoro con tessuti umani richiede spazio di laboratorio designato che è certificata BSL 2 e comprende un armadio di sicurezza biologica (classe A2). Inoltre, il personale deve utilizzare dispositivi di protezione individuale (cioè., camice, guanti e protezione per il viso) e designate per attrezzature per il lavoro con tessuto umano e implementare gestione dei rifiuti a rischio biologico. Attuazione di queste misure di sicurezza è che richiede tempo, costosa e aumenta la difficoltà della procedura, soprattutto per il personale di laboratorio inesperto.

La barriera emato - encefalica è altamente conservata tra gli organismi con un ben definito di CNS71. La barriera emato - encefalica umana di modellazione è difficile perché c'è complesso neurovascolare accoppiamento fra le cellule dell'unità neurovascolare. Un cervello umano adulto è stato stimato avere in media circa 86 miliardi di neuroni e si pensa che quasi ogni neurone ha una propria capillare nelle vicinanze per garantire un'adeguata alimentazione con ossigeno e sostanze nutritive72,73. Cellule endoteliali dei capillari costituiscono la più grande area di superficie dell'interfaccia sangue-cervello (12 – 18 m2 per un uomo adulto sano). Giunzioni strette rappresentano un impedimento per una vasta gamma di pharmacotherapeutics bloccando paracellulare diffusione di soluti. Inoltre, numerosi studi descrivono la disfunzione della barriera nei disordini neurodegenerative, ad es., malattia di Alzheimer74, corsa75, epilessia38,76, sclerosi multipla77, e cerebrali traumatiche lesioni28,78. Così, è assolutamente necessario stabilire modelli strettamente rappresentano la barriera emato - encefalica umana e consentono una migliore comprensione della funzione della barriera nella salute e nella malattia.

Esistono numerosi in vitro delle cellule cultura modelli della barriera sangue - cervello; per le recensioni degli esperti su questo argomento vedere 41,49,51,69,79,80. Brevemente, entrambi appena isolato cellule endoteliali dei capillari del cervello per colture primarie e linee cellulari endoteliali capillare cervello immortalata sono disponibili. Colture primarie di cellule endoteliali del microvessel cerebrale sono utilizzati principalmente da mouse, ratto, maiale e mucca. Tuttavia, colture cellulari primarie sono laboriosi poiché le cellule devono essere appena isolate. Linee di capillare delle cellule endoteliali immortalizzate cervello sono disponibili da topo, ratto e umani e sono meno laborioso perché essi possono essere attraversate per uso a lungo termine. Tuttavia, le linee cellulari immortalizzate anche hanno un limite su quanto spesso possono essere attraversate prima di perdere le loro caratteristiche endoteliali. Sia le cellule primarie, nonché linee di cellule immortalizzate sono spesso coltivate su piastre di modellare l'endotelio capillare del cervello e misurare il trasporto della barriera di permeabilità e droga attraverso il monostrato cellulare, quindi imitante trasporto sangue-cervello41 ,81,82. Terreni di coltura in questi modelli possono anche essere modificati o completati con gli astrociti, periciti o altri fattori fisiologicamente rilevanti come accampamento41,83,84.

Il vantaggio delle linee cellulari immortalizzate è loro relativamente facile accesso e la disponibilità. Mentre le cellule endoteliali in coltura possono raggiungere confluenza, perde la proprietà delle cellule endoteliali come crescono by-side in un monostrato. Ad esempio, colta hCMECs visualizzare ridotta espressione dei trasportatori come la P-gp, proteine di giunzione stretta e permeabilità variabile display a xenobiotici41. La figura 4 Mostra un Western blot per l'espressione della proteina P-gp in cellule hCMEC/D3 rispetto al recente isolati umani capillari. Nonostante una quantità 10 volte inferiore di proteine totali, il segnale per la P-gp è più forte nei capillari umani isolati rispetto alle cellule di hCMEC/D3. Questo indica che le cellule hCMEC/D3 perso una quantità significativa di espressione della proteina P-gp nella cultura. Inoltre, le differenze di cultura media, ambiente e attrezzature pregiudica le misure chiave di integrità della barriera, cioè, misure TEER in saggi di Transwell piastra. Alcuni di questi problemi possono essere superati utilizzando il modello di cervello isolato capillare che maggiormente rappresenta la barriera emato - encefalica di umano in vivo.

Capillari cerebrali isolato sono stati utilizzati per una vasta gamma di studi, tra cui la genomica, proteomica, proteomica funzionale e cellomics studi (Figura 5). Inoltre, molte tecniche e metodi esistono per analizzare i capillari cerebrali isolato all'interno di ciascuno di questi campi. In particolare, le tecniche sperimentali, illustrate nella Figura 5 possono essere utilizzate su capillari cerebrali isolati da un certo numero di fonti, compreso il tessuto umano, bovino, roditore e suino, che può facilitare la ricerca traslazionale. Per esempio, Li et al. 85 ha studiato la genomica della barriera sangue - cervello usando l'ibridazione sottrattiva di soppressione purificando mRNA isolato dai vasi capillari del cervello del ratto. Inoltre, Ott et al. 86 usato qRT-PCR e RT-PCR per studiare il regolamento della P-gp di PXR. Molti studi di proteomica utilizzano Western blotting3, Dot Blot analisi87, Western semplice analisi3,38, ELISA88,89, immunoprecipitazione3, e immunostaining3,90,91. A discernere trasportatore tratta l'endotelio cerebrale, McCaffrey et al. 92 usato frazionamento subcellulare dei capillari cerebrali isolato. Sánchez del Pino et al. 93utilizzato vescicole della membrana endoteliale bovina isolato per discernere la direzione posizione e trasporto trasportatore attraverso la barriera emato - encefalica. In altri studi di proteomica, i ricercatori hanno usato cromatografia liquida e spettrometria di massa per quantificare transporter proteine94,95,96. Studi di proteomica funzionale hanno utilizzato transporter e perdite saggi2,38. Hartz et al. 2 utilizzato zymography per determinare l'attività enzimatica nei capillari del cervello isolato. Inoltre, cellomic vasta ricerca mediante coltura cellulare ha generato numerose linee cellulari endoteliali e modelli della barriera emato - encefalica82,83,84. Con questi modelli, analisi comuni utilizzate includono migrazione saggi97,98, vitalità e tossicità saggi99e angiogenesi saggi98.

Capillari cerebrali isolato consentono accurata caratterizzazione dell'espressione della proteina e l'attività e la descrizione della segnalazione percorsi presso la barriera emato - encefalica. Ciò è dovuto, in parte, al contenuto capillare del cervello, che è solo circa l'1% (v/v). Così, usando cervello intero omogeneato o fettine di cervello come un sostituto per le cellule endoteliali capillari purificate porterà probabilmente a un povero rapporto segnale-rumore24. Inoltre, dopo l'isolamento, capillari cerebrali sono vitali per almeno 6 ore (dati non pubblicati da topo e di ratto), che consente studi di discernere specifiche vie di segnalazione. Si consiglia di includere un gruppo di controllo dalla stessa preparazione.

Modelli rappresentativi e traslazionale della barriera sangue - cervello, ad esempio il modello capillare isolato discusso in questo rapporto, sono necessari per studiare la funzione di barriera nella salute e nella malattia. Qui presentiamo un protocollo per ottenere i capillari del cervello umano isolato a una buona resa e alta qualità che può servire come un modello ex vivo della barriera sangue - cervello. Capillari isolati mantengono la loro originale struttura e funzione, che permette di utilizzarli per un certo numero di post-isolamento molecolare, biochimica e dosaggi fisiologici. Deve prestare attenzione quando Gestione tessuto umano campioni, preferibilmente in un BSL 2 o impostazione superiore.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo e riconoscere Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson presso la banca del tessuto di cervello UK-ADC per la fornitura di cervello umano tutti i campioni di tessuto (NIH concedere numero: P30 AG028383 dal National Institute on Aging). Ringraziamo Matt Hazzard e Tom Dolan, servizi di Information Technology, tecnologia accademico e impegno di facoltà, Università del Kentucky per assistenza grafica. Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione numero 1R01NS079507 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (a B.B.) e dalla concessione numero 1R01AG039621 dall'Istituto nazionale su invecchiamento (per A.M.S.H.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo o l'Istituto nazionale su invecchiamento. Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

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