Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Neuroscience

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Summary

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

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Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

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Abstract

Comprendre la fonction de barrière hémato - encéphalique dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques qui tiennent la promesse d’améliorer la livraison de drogue cerveau, améliorer la protection du cerveau et traiter le cerveau les troubles. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les modèles appropriés. À cet égard, capillaires de cerveau isolés à partir des tissus cérébraux humains représentent un outil unique pour étudier la fonction de barrière comme proche de la situation humaine in vivo que possible. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du tissu de cerveau humain à un rendement élevé et avec une pureté et une qualité constante. Capillaires sont isolés du tissu de cerveau humain frais utilisant la filtration, centrifugation de gradient de densité et homogénéisation mécanique. Après l’isolement, les capillaires du cerveau humain peuvent être utilisés pour diverses applications, notamment les tests de fuite, l’imagerie de cellules vivantes et analyses immunitaire pour étudier l’expression des protéines et la fonction, l’activité enzymatique ou signalisation intracellulaire. Cerveau humain isolé capillaires sont un modèle unique d’élucider la régulation de la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ce modèle peut donner un aperçu de la pathogenèse du système nerveux central (SNC), qui contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles du SNC.

Introduction

La barrière hémato - encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato - encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection8,9, 10. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato - encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato - encéphalique.

En 1969, Siakotos et al. 11 ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. 12 ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération13,14,15. Par exemple, airelles et al. 16 isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. 17 isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. 18, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de24 . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. 21, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ETB), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. 19, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation25. En 2010, Hartz et al. 26 a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)40et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau42.

En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato - encéphalique2. C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion27,28,29, 30. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines31,32,33,34, 35,36,37. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato - encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie38 . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.

Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato - encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau39,,40,41 ,42,43,44. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato - encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.

In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments 45 , 46. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.

Betz et al. 47 a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato - encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato - encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées51, 52. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière52.

Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato - encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie53, 54 , 55. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions56 , 57 , 58. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato - encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.

Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.

En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato - encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires3,19,62,63.

Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)64. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato - encéphalique associé maladies.

Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato - encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.

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Protocol

Les informations ci-dessous repose sur la sécurité actuelle et des normes de réglementation à l’Université du Kentucky, Lexington, KY, é.-u.. Par mesure de précaution, se référer au programme de biosécurité de l’institution et les plus récents règlements et recommandations avant de travailler avec les tissus humains.

ATTENTION : Le tissu humain peut être une source de pathogènes à diffusion hématogène, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), virus de l’hépatite B (VHB), virus de l’hépatite C (VHC) et d’autres. Travailler avec des tissus humains pose le risque d’infection par des pathogènes à diffusion hématogène. Par conséquent, certaines considérations réglementaires et de sécurité sont indispensables lorsque vous travaillez avec des tissus humains pour protéger le personnel de laboratoire. L’utilisation de tissus humains aux Etats-Unis exige un laboratoire de niveau 2 de biosécurité ainsi que de mesures de sécurité et de formation conformément aux NIH Section IV-B-7, Loi OSHA de 1970 Clause 5(a)(1) et programme de biosécurité institutionnels de l’utilisateur. En général, approbation Comité institutionnel de biosécurité et/ou Institutional Review Board doit être obtenue avant d’effectuer toute recherche impliquant le matériel humain (tissus, fluides corporels). La formation est nécessaire pour tout le personnel travaillant avec des matériaux humains et comprend la formation de sécurité de laboratoire de base, par exemple, chimique hygiène et sécurité en laboratoire, ainsi qu’une formation spécifique sur la sécurité biologique, déchets dangereux et l’homme agents pathogènes transmissibles par le sang. Tout le personnel travaillant avec des matériaux humains est fortement recommandé afin d’obtenir des vaccins contre l’hépatite B, avant de travailler avec le matériel humain. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle spécifique tout en travaillant avec le matériel humain, par exemple., une blouse collerette et un visage de bouclier et porter des gants en tout temps. Tous les travaux dans une placard de biosécurité (classe 2). Tout le matériel qui vient en contact avec le matériel humain et tout déchet de matériel humain est géré adéquatement pour éviter la contamination ou infection du personnel. Tous les équipements et les surfaces sont nettoyées avec 10 % d’éthanol eau de Javel et 75 % après chaque procédure impliquant le matériel humain. Un déversement avec matériel humain doit être immédiatement nettoyé. Verrerie est stérilisé après chaque utilisation. Déchets, y compris les interprétations des tissus humains, sont recueillie dans un sac à déchets étiquetés biohazard et stérilisés à l’autoclave. Objets pointus ou tranchants sont recueillies dans un récipient et fuite-résistant à la perforation étiqueté comme biologiques dangereuses. Tous les déchets de matériel humain respect des normes de sécurité biologique de l’institution.

NOTE : Notre laboratoire obtient des échantillons frais de cortex frontal de personnes décédées à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M). Critères d’inclusion sont : inscription à l’étude de cohorte longitudinale autopsie UK-ADC et un intervalle Post-Mortem (PMI) ≤4 h64. Autopsies suivent un protocole standard et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Un PMI court de moins de 4 h est de la plus haute importance pour assurer la viabilité capillaire après l’isolement. Les tissus frais et congelés peuvent être utilisés. Si le gel est nécessaire, tissus cérébraux humains fraîchement obtenu devraient être choc congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C. Tissu fraîche ou décongelé devrait être stocké dans le tampon d’isolement (voir ci-dessous) et traité rapidement. Nous trouvons que 10 g de tissu humain frais fournit environ 100 mg des capillaires de cerveau (poids humide).

1. le programme d’installation

  1. Préparation du tampon
    Remarque : Le volume de tampon nécessaire dépend de la quantité de tissu. Tous les volumes de mémoire tampon dans le protocole suivant sont basés sur 10 g de tissus de cortex cérébraux humains.
    1. L isolement tampon : Utiliser 1,5 L de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD ; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) et compléter avec le D-glucose (1,35 g 5 mM ) et pyruvate de sodium 1 mM (0,165 g). Après avoir ajouté du glucose et du pyruvate, ajuster le pH 7,4 avec l’hydroxyde de sodium. Laisser refroidir et stocker le tampon à 4 ° C avant de l’utiliser.
    2. L’albumine sérique bovine (BSA) : Ajouter 10 g de poudre de BSA à 1 L de tampon d’isolement à une concentration finale de BSA de 1 %. Remuez lentement pour éviter les bulles, ajuster le pH 7.4 et conserver à 4 ° C durant la nuit. Immédiatement avant utilisation, remuer doucement ; éviter la formation de bulles pour éviter la dénaturation de l’albumine.
    3. milieu de gradient de densité : peser 18 g de milieu de gradient de densité dans une bouteille en verre et ajouter un magnétique. Ajouter 60 mL de tampon d’isolement et agiter vigoureusement pendant 5 min jusqu'à ce que toute la poudre est suspendue. Magasin pendant la nuit à 4 ° C pour permettre le milieu de gradient de densité à dissoudre. Remuez pendant 10 min juste avant utilisation.
    4. Stocker tous les tampons à 4 ° C ; garder tous les outils et les tampons sur la glace lors de la procédure d’isolement complet. Mélanger tous les tampons avant utilisation.
  2. Montage expérimental
    1. Monter le pilon de la meuleuse de tissu Potter-Elvehjem sur l’agitateur électronique généraux. Placez le moulin de tissu de Potter-Elvehjem et l’homogénéisateur Dounce avec pilon sur la glace sous le capot. Préparer une maille de filtre de 300 µm (5 x 5 cm2), pliez-le à un cône et insérer et attachez-le à un 50 mL tube Falcon avec du ruban adhésif (Figure 1 a).
    2. Placez les bagues d’étanchéité raccordement et de filtres de souche de cellules (taille des pores : 30 µm) sur tubes Falcon de 50 mL. Préparer des sacs de déchets biologiques. Placer les équipements requis dans la prévention des risques biotechnologiques armoire (voir Table des matières).

2. préparation des échantillons de cerveau

Remarque : La Figure 1 a montre le diagramme de flux de travail de la technique d’isolation complet décrit ci-dessous. Le tissu de cerveau humain peut provenir de n’importe quelle partie du cortex et peut être utilisé frais ou congelés. Tissu cérébral congelés peut être décongelé à température ambiante (pas de mémoire tampon ; ~ 30 min pour 10 g). Pour obtenir des résultats comparables, le tissu cérébral devrait provenir de la même région du cerveau pour chaque expérience. Ce protocole est optimisé pour les frais (PMI < 4 h) cortex cérébral humain qui n’a pas été congelé.

  1. Préparation du tissu de cerveau humain : documenter le poids du tissu cérébral. Tous les numéros dans le protocole suivant sont appropriés pour 10 g de tissu cérébral humain frais. Placer le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm. Enlevez soigneusement toutes les méninges avec une pince. Utiliser un scalpel pour couper la matière blanche.
  2. Hacher du tissu cérébral humain : soigneusement découpé le tissu cérébral et il mâche avec un scalpel. Hacher finement pendant environ 5 min (morceaux de 2 à 3 mm). Transférer le tissu cérébral à la meuleuse de tissu de Potter-Elvehjem. Ajouter 30 mL de tampon de l’isolement.
    Remarque : Les morceaux de tissus hachées sont difficiles à voir car le tissu cérébral se transforme en bouillie par le processus de hachage.

3. homogénéisation

  1. Moulin de tissu Potter-Elvehjem (clairance : 150 – 230 µm) : homogénéiser chaque échantillon avec 100 coups à une vitesse d’homogénéiseur de 50 tr/min. Le document le temps chaque 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Voir le tableau 1 pour un protocole proposé homogénéisation ; la durée totale de 10 g de cortex frontal humain l’homogénéisation est d’environ 22 min. Ne remuez pas dans l’air pour éviter les bulles.
  2. Dounce homogénéisateur (clairance : 80 – 130 µm) : transférer l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension avec 20 coups (~ 6 s/course, total d’environ 2 min). Éviter les bulles.

4. centrifugation

  1. Distribuer l’homogénat de cerveau également dans quatre tubes de centrifugation de 50 mL et le volume total de l’homogénat de document. Distribuer 50 mL de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation (12,5 mL par tube). 10 mL de tampon d’isolement permet de rincer le pilon et l’homogénéisateur et distribuer dans les quatre tubes de centrifugation (~2.5 mL par tube).
  2. Bien fermer les tubes de centrifugeuse avec bouchons. Mélanger l’homogénat, milieu de gradient de densité et tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifuger à 5 800 x g pendant 15 min à 4 ° C (rotor angle fixe) ; Sélectionnez une vitesse de décélération moyenne pour garder le culot au tube. Jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans 2 mL de 1 % de BSA.

5. filtration

NOTE : Pour séparer les capillaires de globules rouges et autres débris cellulaires, plusieurs étapes de filtration sont nécessaires.

  1. 300 µm maille : après re-suspension du culot, filtrer la suspension à travers les mailles de 300 µm. Capillaires sont filtrés à travers les mailles, considérant que les navires plus grands et plus gros débris de cerveau demeurent sur le maillage. Laver soigneusement la maille avec jusqu'à 50 mL, de 1 % de BSA. Jeter le filet.
    Remarque : Cette étape de filtration efface la suspension capillaire de plus gros navires ou morceaux de débris de cerveau.
  2. Filtre de 30 µM cellule souche
    Remarque : Cette étape de filtration sépare les capillaires des globules rouges et autres débris de cerveau.
    1. Distribuer le filtrat capillaire de l’étape 6.1 sur les filtres de déformation de cellule cinq 30 µm (environ 10 mL de filtrat capillaire par filtre de cellule souche). Capillaires sont freinés par ce filtre, tandis que les globules rouges monocellules et autres débris de petit cerveau passent par le filtre et sont rassemblés dans le filtrat.
    2. Lavez chaque filtre avec 25 mL de 1 % de BSA. Par la suite, tous les filtrats Napper le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 mL de BSA 1 % ; conserver la cellule souche filtres avec contenant les capillaires et d’ignorer le filtrat.

6. capillaire Collection

  1. Renversez les filtres et laver les capillaires avec 50 mL de BSA 1 % pour chaque filtre en tubes de 50 mL. Doucement, appliquer une pression avec la pointe de la pipette d’une pipette de 5 mL et déplacez-le dans le filtre pour éliminer les capillaires du cerveau.
  2. Assurez-vous de laver tous les capillaires de cerveau, en particulier de la jante du filtre. Éviter les bulles car cela complique le processus de filtration et augmente les risques de perte capillaire.

7. laver

  1. Après avoir recueilli les capillaires, centrifuger les échantillons à 1 500 x g pendant 3 min à 4 ° C (balancement seau rotor). Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans environ 3 mL de tampon d’isolement. Combiner tous les granulés resuspendues dans un échantillon dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le avec le tampon de l’isolement. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 3 min à 4 ° C et laver deux fois plus.
  2. Le document la pureté capillaire avec un microscope (grossissement de X 100) et l’appareil photo (Figure 1 b).
    Remarque : Le rendement de capillaire de cerveau de 10 g de tissus cérébraux humains est habituellement environ 100 mg. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, transformés (p. ex.., lysat, isolation membrane), ou être congelés flash et stockées à-80 ° C dans des cryotubes pour un minimum de 6 à 12 mois (éviter de multiples cycles de gel-dégel).

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Representative Results

L’isolement des tissus cérébraux humains produire une suspension enrichie dans des capillaires de cerveau humain (Figure 1 b) avec de petites quantités de gros navires, globules rouges, autres cellules individuelles et quelques débris cellulaires. Certains capillaires sont ramifiés, et, dans certains cas, les globules rouges sont pris au piège dans les lumières du capillaires. Le capillaire typique a un 3 – 7 µm de diamètre et est environ 100 à 200 µm long avec open lumens ; plus fins capillaires sont réduits. À l’aide de la microscopie confocale, capillaires du cerveau humain isolé révèlent une structure tubulaire, intacte et la morphologie. Figure 2 a montre qu'un représentant a transmis une image lumineuse d’un cerveau humain capillaire avec un pericyte attaché et un globule rouge dans la lumière. Toutes les conclusions concernant le diamètre, la taille et la morphologie sont conformes à précédents rapports sur la structure du cerveau isolé capillaires12,17,18. Le cerveau humain isolé capillaire dans la Figure 2 b a été immunomarquées pour la P-gp (vert) à l’aide de C219 comme l’anticorps primaire (1 µg/mL) ; les noyaux étaient Eosine au DAPI (1 µg/mL).

Figure 1
Figure 1 : diagramme de flux pour l’isolement capillaire. (A) le pictogramme illustre les principales étapes de la procédure pour isoler les capillaires du cerveau à partir de tissu humain frais. (B), l’image montre les capillaires du cerveau humain isolé sous un microscope optique directement après l’isolement (grossissement de X 100). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : cerveau humain isolé capillaire. (A), à la lumière transmise de A l’image d’un cerveau humain isolé capillaire. (B), la microscopie confocale image montre un immunomarquage capillaires du cerveau humain isolé pour la P-gp (vert ; C219 1 µg/mL) ; les noyaux étaient Eosine au DAPI (bleu ; 1 µg/mL). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Dépannage centrifugation densité. Le pictogramme montre la préparation après la centrifugation en gradient de densité. Il met en évidence les effets de trop et trop peu milieu de gradient de densité et comment cela influe sur la séparation et le culot capillaire qui en résulte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : expression de la protéine P-gp dans les capillaires du cerveau humain isolé. Le Western blot montre des bandes fortes pour la P-gp (1 µg/mL) dans les capillaires humains isolés par rapport aux cellules hCMEC\D3. Β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement (1 µg/µL). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Applications pour les capillaires du cerveau humain isolé. Un aperçu des applications plus courantes pour les capillaires cérébraux isolés publiés dans la littérature. Capillaires isolées ont été utilisées pour : génomique 1)85,86, protéomique 2)3,38,87,88,89,90, 91,,du9294,95,96, 3) protéomique fonctionnelle2,38et 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Accidents vasculaires cérébraux Temps [min]
1 – 25 7 – 7,5
26 à 50 5 à 5,5
51 à 75 5 à 5,5
76 à 100 5 à 5,5
Durée totale : 22 – 24 min

Tableau 1 : protocole d’homogénéisation. Le protocole d’homogénéisation de la rectifieuse de tissu de Potter-Elvehjem pour homogénéiser 10 g de cortex frontal humain à une vitesse d’homogénéisation de 50 tr/min. Notez que les premiers coups de plusieurs nécessitent un délai supplémentaire pour homogénéiser les tissus hachées. Après cette homogénéisation initiale, chaque trait est de 12 s en durée (6 s de mouvement à la baisse, 6 s pour les déplacements vers le haut). Ainsi, après l’homogénéisation initiale, 5 traits peuvent être accomplis en 1 min, soit 25 coups en 5 min.

Problème Cause potentielle Solution
Aucune granule capillaire 1) concentration de Ficoll incorrecte 1) ajuster la concentration de Ficoll
2) Vitesse de centrifugation incorrecte 2) régler la vitesse de centrifugation
3) incorrecte vitesse d’accélération ou de décélération 3) régler la vitesse d’accélération ou de décélération
Faible rendement capillaire 1) méninges bloquant les étapes de filtration 1) retirer tous les méninges avant la filtration
2) trop de capillaires perdus au cours de la procédure d’isolement 2) calculer la concentration du tampon correctement, rincer les pointes de pipette
3) lavage capillaires hors PluriStrainer filtres ne suffisait pas 3) Retournez filtres et inspecter soigneusement pour les capillaires (microscope à utiliser)
4) les bulles excès au cours de la resuspensions 4) pipette lentement pour éviter les bulles
Capillaires non viables 1) intervalle de prolongé post-mortem 1) réduire les intervalles si possible ou utilisons cerveau gelé clin d’oeil
2) utilisation congelés de tissu pour l’isolement 2) utiliser les tissus frais
3) moment de la procédure d’isolement trop long 3) optimiser le flux de travail
4) équipement/tampons n’ont pas été entretenus sur la glace lors de la procédure d’isolement 4) garder le matériel et tampons sur la glace lors de l’isolation

Tableau 2 : dépannage des problèmes courants. Une liste des erreurs et des problèmes qui se produisent au cours de la procédure d’isolement et comment ils peuvent être résolus plus courants.

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Discussion

Le présent protocole décrit l’isolement des capillaires de cerveau humain intact et viable de tissus frais. Dans cette section, nous discutons en détail de ce qui suit : 1) les modifications au protocole 2) dépannage des messages d’erreur, 3) les limites de la technique, 4) l’importance du modèle en ce qui concerne l’existant et des modèles alternatifs de barrière hémato - encéphalique, et 5). applications potentielles pour les capillaires du cerveau humain isolé.

Le protocole décrit ici est optimisé pour 10 g de tissu frais cortex frontal humain. Toutefois, il est relativement simple à modifier cette procédure pour : 1) plus ou moins que 10 g de tissu, tissu cérébral 2) congelé ou de tissu de cerveau 3) d’une région du cerveau que le cortex frontal. Tout d’abord, avec plus ou moins que 10 g de tissu cérébral, le volume nécessaire des tampons peut simplement évoluer vers le haut ou vers le bas pour la quantité de tissu disponible. Ainsi, si seulement 5 g de tissu cérébral n’est disponible, le volume des tampons devrait être réduit de moitié. Deuxièmement, nous décrivons un isolement capillaire qui a utilisé des tissus cérébraux fraîches, mais tissus congelés peuvent être utilisés si les tissus frais ne sont pas disponible38. Troisièmement, nous avons utilisé des tissus de cerveau frais prélevés sur le cortex frontal, mais capillaires peuvent être isolés des autres régions corticales cerveau s’il y a assez des tissus disponibles. Il est également possible d’isoler des capillaires de régions cérébrales non-corticale (e.g., substance blanche), mais ces régions ont une cellule différente composition et capillaire densité 66,67,68. Ainsi, à l’aide de tissus provenant d’une région du cerveau différentes exigerait vraisemblablement le protocole à être ajustée (p. ex., volume tampon, gradient moyen de densité, vitesse de centrifugation ou nombre d’étapes de filtration).

La technique d’isolation capillaire, alors que c’est pas complexe en soi, est sensible aux petites perturbations ou modifications dans le protocole. Modifications peuvent provoquer une diminution de rendement capillaire ou la viabilité capillaire réduite. Tableau 2 énonce les erreurs et les problèmes rencontrés lors de l’isolation les plus courantes et répertorie des conseils pour éviter ces erreurs et solutions pour le dépannage si elles se produisent. Le problème le plus fréquent associé à la procédure est un faible rendement capillaire. La perte des capillaires est souvent la somme cumulée de faibles pertes à chaque étape et est due à petites déviations dans l’ensemble de la procédure. Une étape cruciale pour qui une grande quantité de capillaires peut-être être perdue est la centrifugation de densité. Une concentration incorrecte dans la mémoire tampon se traduit par une densité incorrecte pour séparer les capillaires des débris cellulaires qui réduit le volume de l’extrait concentré capillaire. La figure 3 montre les conséquences de trop ou trop peu milieu de gradient de densité dans l’étape de centrifugation par rapport à l’homogénat de cerveau. Ajuster à la bonne, la concentration peut résoudre ce problème. Notez que la vitesse d’accélération et de décélération de la centrifugeuse peut également affecter la formation de la pastille capillaires du cerveau. Capillaires peuvent également être perdues pendant les étapes 6 à 7 si la partie de la matière capillaire bâtons sur les pointes de pipette. Cette question peut être réglée en rinçant soigneusement chaque embout de la pipette avant d’en changer. Au cours de l’étape 7, lavage des capillaires du filtre cellule souche peut être incomplète et/ou capillaires peuvent coller sur le bord du filtre. Cela peut être évité en vérifiant le filtre sous le microscope, suivi par des étapes de lavage supplémentaire. Perdre des capillaires au cours de chaque étape de la procédure d’isolement peut entraîner une boulette capillaire négligeable ou pas assez matériel capillaire pour un traitement ultérieur et l’expérimentation.

Isoler les capillaires du cerveau à partir de tissu humain frais représente un modèle unique de barrière hémato - encéphalique qui ressemble étroitement à la situation in vivo . Cependant, il existe plusieurs limites de la technique. Un défi est la disponibilité de tissu humain frais. Comme le PMI optimal est ≤ 4 h, les tissus cérébraux prélevés à un PMI significativement plus longs ne sera pas assez frais pour certaines applications en aval. Dans certains cas, il peut être difficile d’obtenir des quantités de tissu qui sont assez grandes pour plusieurs groupes expérimentaux, limitant ainsi les applications en aval. Ainsi, isoler capillaires frais de rongeurs19, canine69, bovine42ou tissu de cerveau de porc70 peut-être plus adapté modéliser la barrière hémato - encéphalique. Les facteurs qui déterminent la variabilité des tissus cérébraux humains tels que l’âge, le sexe, l’origine ethnique, état morbide, antécédents médicaux, région du cerveau de l’échantillon et de la PMI devrait prendre en considération lors de l’interprétation et de publication des données. Sur le plan expérimental, il est important de noter que les capillaires isolées comportent toujours des péricytes, mais endfeet astrocytaires sont éliminés par la procédure44. Il doit être pris en considération que le modèle présenté ici est un modèle ex vivo de la barrière hémato - encéphalique (c'est-à-dire, les cellules endothéliales des capillaires), mais non comme un modèle de l’unité neurovasculaire.

Travailler avec n’importe quel tissu humain présente toujours un risque de sécurité intrinsèque et les chercheurs doivent prendre les précautions appropriées lors de la procédure d’isolement pour éviter l’infection. Plus précisément, aux États-Unis, travail avec les tissus humains exige l’espace laboratoire désigné qui est certifiée BSL 2 et comprend un cabinet de prévention des risques biotechnologiques (classe A2). En outre, personnel doit utiliser des équipements de protection individuelle (i.e., blouse, des gants et un écran facial) et désigné l’équipement pour le travail avec les tissus humains et mettre en œuvre un traitement des déchets biologiques dangereuses. Mise en œuvre de ces mesures de sécurité est longue et coûteuse et augmente la difficulté de la procédure, en particulier pour le personnel des laboratoires inexpérimentés.

La barrière hémato - encéphalique est très conservée parmi les organismes avec un bien défini de CNS71. Modélisation de la barrière hémato - encéphalique humaine est difficile parce qu’il y a complexe neurovasculaire de couplage entre les cellules de l’unité neurovasculaire. Un cerveau humain adulte a été estimé en moyennes environ 86 milliards neurones et il est estimé que presque chaque neurone a ses propres capillaire dans le voisinage pour assurer une alimentation correcte avec l’oxygène et des nutriments72,73. Cellules endothéliales des capillaires constituent la plus grande surface de l’interface hémato-encéphalique (12-18 m2 pour un homme adult en bonne santé). Jonctions serrées représentent un obstacle à un large éventail de pharmacothérapie en bloquant la diffusion paracellulaire de solutés. En outre, de nombreuses études décrivent les dysfonctionnement de la barrière dans les maladies neurodégénératives, par exemple., la maladie d’Alzheimer74, course75, épilepsie38,,76,77de sclérose en plaques, et traumatisme cérébral lésion28,78. Ainsi, il est impératif d’établir des modèles qui représentent la barrière hémato - encéphalique humaine de près et permettant une meilleure compréhension de la fonction barrière de la santé et la maladie.

Il existe de nombreuses in vitro cell culture modèles de la barrière hémato - encéphalique ; pour les évaluations des experts en la matière voir 41,49,51,69,79,80. En bref, tous deux fraîchement isolement des cellules endothéliales capillaires du cerveau pour la culture primaire et des lignées de cellules endothéliales capillaire immortalisées cerveau sont disponibles. Les cultures primaires de cellules endothéliales microvaisseaux cérébral servent surtout de souris, rat, cochon et vache. Cultures de cellules primaires sont toutefois beaucoup de travail puisque les cellules doivent être fraîchement isolées. Des lignées de cellules endothéliales capillaire immortalisées cerveau n’existent pas de souris, rat et l’homme et sont beaucoup moins de travail car ils peuvent être repiquées pour une utilisation à plus long terme. Cependant, les lignées cellulaires immortalisées même ont une limite à combien ils peuvent être repiquées avant de perdre leurs caractéristiques endothéliales. Les cellules primaires ainsi que les lignes de cellules immortalisées sont souvent cultivées sur des plaques à modéliser l’endothélium capillaire cérébral et mesurer le transport barrière de perméabilité et de la drogue dans l’ensemble de la monocouche cellulaire, imitant ainsi transport sang-de-cerveau41 ,81,,82. Les milieux de culture dans ces modèles peuvent également être modifié ou additionné d’astrocytes, péricytes ou autres facteurs physiologiquement pertinents comme cAMP41,83,84.

L’avantage de lignées cellulaires immortalisées est leur accès relativement facile et leur disponibilité. Tandis que les cellules endothéliales cultivées peuvent atteindre le confluent, ils perdent des propriétés de cellules endothéliales quand ils grandissent by-side dans une monocouche. Par exemple, cultivées hCMECs afficher une expression réduite des transporteurs comme la P-gp, protéines des jonctions serrées et la perméabilité variable affichage xénobiotiques41. La figure 4 montre un Western blot de l’expression de la protéine P-gp dans les cellules hCMEC/D3 par rapport aux capillaires humaines fraîchement isolées. Malgré un montant inférieur 10 fois plus de protéines totales, le signal pour la P-gp est plus fort dans les capillaires humains isolés par rapport aux cellules hCMEC/D3. Ceci indique que les cellules hCMEC/D3 perdent une quantité significative de l’expression des protéines P-gp dans la culture. De plus, des différences dans les milieux de culture, l’environnement et équipement sur mesures clés de l’intégrité de barrière, c'est-à-dire, mesures de TEER lors d’essais de plaque Transwell. Certains de ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant le modèle capillaires cérébraux isolés qui représente plus fidèlement la barrière hématoméningée humaine in vivo.

Les capillaires cérébraux isolés ont été utilisés pour un large éventail d’études, y compris la génomique, la protéomique, protéomique fonctionnelle et études cellomics (Figure 5). En outre, beaucoup de techniques et de méthodes existent pour analyser des capillaires cérébraux isolés au sein de chacun de ces domaines. En particulier, les techniques expérimentales, illustrés à la Figure 5 peuvent être utilisés sur des capillaires de cerveau isolés à partir d’un certain nombre de sources, y compris le tissu humain, bovin, rongeur et porcin, qui pourrait faciliter la recherche translationnelle. Par exemple, Li et al. 85 a étudié la génomique de la barrière hémato - encéphalique, hybridation soustractive suppression de purifier les ARNm isolés des capillaires de cerveau de rat. En outre, Ott et al. 86 utilisé RT-PCR et qRT-PCR pour étudier la régulation de la P-gp par PXR. De nombreuses études protéomiques utilisent Western blotting3, Dot Blot analyse87, Western simples dosages3,38, ELISA88,89, immunoprécipitation3, et immunomarquage3,90,91. Discerner le transporteur traite l’endothélium cérébral, McCaffrey et al. 92 a utilisé le fractionnement subcellulaire des capillaires cérébraux isolés. Sánchez del Pino et al. 93utilisé des vésicules membranaires endothéliales bovine isolées de discerner la direction de localisation et transport transporteur à travers la barrière hémato - encéphalique. Dans d’autres études protéomiques, les chercheurs ont utilisé par chromatographie liquide et spectrométrie de masse pour quantifier le transporteur protéines94,95,,96. Protéomique fonctionnelle études ont utilisé transporteur et fuite des analyses de2,38. Hartz et al. 2 permettant de déterminer l’activité enzymatique dans les capillaires cérébraux isolés zymographie. En outre, vaste cellomic recherche à l’aide de culture cellulaire a généré de nombreuses lignées de cellules endothéliales et les modèles de la barrière hémato - encéphalique82,,du8384. Avec ces modèles, essais communs utilisés incluent migration essais97,98et de dosages de viabilité et la toxicité99angiogenèse dosages98.

Capillaires cérébraux isolés permettant la caractérisation précise de l’expression de la protéine et de l’activité et la description de la signalisation des voies à la barrière hémato - encéphalique. Cela est dû, en partie, au contenu capillaire du cerveau, qui est seulement environ 1 % (v/v). Ainsi, à l’aide d’homogénat de cerveau entier ou des tranches de cerveau comme un substitut pour les cellules endothéliales des capillaires purifiées probablement entraînera un faible rapport signal-bruit24. En outre, après l’isolement, capillaires du cerveau sont viables pendant au moins 6 h (données non publiées de la souris et le rat), qui permet de discerner les voies de signalisation spécifiques des études. Il est recommandé d’inclure un groupe de contrôle de la même préparation.

Modèles représentatifs et translationnelles de la barrière hémato - encéphalique, tel que le modèle capillaire isolé examinée dans ce rapport, sont nécessaires pour étudier la fonction barrière de la santé et la maladie. Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir les capillaires du cerveau humain isolé à un bon rendement et une qualité qui peut servir comme un modèle ex vivo de la barrière hémato - encéphalique. Capillaires isolées conservent leur structure d’origine et de fonction, ce qui permet leur utilisation pour un certain nombre de post isolement moléculaire, biochimique et de tests physiologiques. Être prudent lors de manipulation des tissus humains échantillons, préférablement dans un BSL 2 ou supérieure.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercier et remercier Dr Peter Nelson et Sonya Anderson à la Banque de tissus du cerveau UK-ADC permettant de cerveau humain tous les échantillons de tissus (numéro de licence de NIH : P30 AG028383 du National Institute on Aging). Nous remercions Matt Hazzard et Tom Dolan, Services informatiques, technologie universitaire et Engagement de faculté, Université du Kentucky pour assistance graphique. Ce projet a été soutenu par grant 1R01NS079507 numéro du National Institute of Neurological Disorders et accidents vasculaires cérébraux (à B.B.) et par grant 1R01AG039621 numéro du National Institute on Aging (à A.M.S.H).. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral ou l’Institut National sur le vieillissement. Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

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