Isolering av Cerebral kapillærer fra friske menneskelige hjernevev

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isolert hjernen kapillærer fra hjernevev kan brukes som prekliniske modell for å studere barriere funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra friske menneskelige hjernevev.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Forståelse blod - hjerne barrieren funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold er avgjørende for utvikling av nye strategier som holder løftet om å forbedre hjernen stoffet levering, forbedre hjernen beskyttelse og behandle hjernen lidelser. Det er imidlertid utfordrende å studere funksjonen menneskelig blod - hjerne barrieren. Dermed er det et kritisk behov for aktuelle modeller. I denne forbindelse representerer hjernen kapillærene isolert fra hjernevev et unikt verktøy å studere barriere funksjon som nær menneskelige i vivo situasjonen som mulig. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for å isolere kapillærer fra hjernevev på en høy avkastning og konsistent kvalitet og renhet. Kapillærene er isolert fra friske menneskelige hjernevev mekanisk homogenisering, tetthet-gradient sentrifugering og filtrering. Etter isolasjon, kan menneskelige hjerne kapillærene brukes til forskjellige programmer, inkludert lekkasje analyser, levende celle imaging og immun-baserte analyser for å studere protein uttrykk og funksjon, enzym aktivitet eller intracellulær signalering. Isolert menneskelige hjerne kapillærene er en unik modell å belyse regulering av funksjonen menneskelig blod - hjerne barrieren. Denne modellen kan gi innsikt i sentralnervesystemet (CNS) patogenesen, som vil bidra til utviklingen av strategier for behandling av CNS lidelser.

Introduction

Blod - hjerne barrieren er en strengt kontrollert grensesnitt mellom blod og hjernen som bestemmer hva som går inn og kommer ut av hjernen. Anatomisk, endotelceller komponere blod - hjerne barrieren og danner en kompleks, kontinuerlig capillary nettverket. Fysiologisk, leverer denne capillary nettverket hjernen med oksygen og næringsstoffer mens samtidig avhending av karbondioksid og metabolske avfallsprodukter. Viktigere, støtter bevisene at endringene barrieren bidra til mange patologi, inkludert Alzheimers, epilepsi og strek1,2,3,4,5 , 6 , 7. hjernen endotelceller også tjene som en barriere til behandling ved å blokkere narkotika opptak inn i hjernen, f.eks., kjemoterapi for glioblastom multiforme etter svulst resection8,9, 10. I denne forbindelse isolert menneskelige hjerne blodkar representerer en unik ex vivo blod - hjerne barrieren modell som ligner barriere egenskaper i vivo, som muliggjør studiet av barriere funksjon og dysfunksjon i helse og sykdom. I denne artikkelen gir vi en protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra menneskelige hjerne med konsekvent høy kapillær kvalitet og kapasitet til å studere blod - hjerne barrieren.

I 1969, Siakotos et al. 11 var først å rapportere isolering av hjernen kapillærer fra storfe og menneskelig hjernevev bruker tetthet gradert sentrifugering og glass bead kolonnen separasjon. Senere Goldstein et al. 12 forbedret denne metoden av tilføyer flere filtrering trinn for å redusere mengden vev for å studere hjernen kapillærene isolert fra rotter, stund holder på metabolsk aktivitet av glukose. Siden da optimalisert forskere kapillær isolasjon prosedyren mange ganger, forbedre metoden og hjernen kapillær modellen med hver iterasjon13,14,15. For eksempel Pardridge et al. 16 isolert bovin kapillærene bruke enzymatisk fordøyelsen i stedet for mekaniske homogenisering, og deretter gikk senere en kapillær suspensjon gjennom en 210 µm maske filter og et glass bead-kolonnen. Disse endringene forbedret trypan blå utelukkelse flekken av isolerte hjernen kapillærer, og dermed økt endothelial celle levedyktighet. Tidlig på 1990-tallet, Dallaire et al. 17 isolerte storfe og rotten kapillærene som var klare neuronal forurensning og vedlikeholdt metabolsk aktivitet γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) og alkalisk fosfatase. I 2000 Miller et al. 18, brukt isolert rotte og svin hjerne blodkar i kombinasjon med AC confocal mikroskopi vise akkumulering av transport underlag til lumen av kapillærer. Deretter vårt laboratorium har fortsatt å optimalisere hjernen kapillær isolasjon prosedyren og har nå etablert transport analyser for å avgjøre P-glykoprotein (P-gp)19,20,21, brystkreft motstand protein (BCRP)22,23og flere resistens protein 2 (Mrp2)24 transport aktivitet. I 2004 publiserte vi to rapporter der vi brukte isolert rotte hjernen kapillærer for å undersøke ulike signalveier. I Hartz et al. 21, vi fant at det peptid endothelin-1 raskt og reversibel redusert P-gp transport funksjon i hjerne blodkar handler gjennom endothelin reseptor B (ETB) reseptoren, nitrogenoksid syntase (NOS) og protein kinase C (PKC). I Bauer et al. 19, vi viste uttrykk for kjernefysisk reseptoren pregnane X reseptoren (PXR) og viste PXR-modulering av P-gp uttrykk og transport funksjon i hjerne blodkar. Eksperimenter med transgene humanized PXR mus, vi utvidet dette forskning og viste i vivo innstramming av barrieren av upregulating P-gp gjennom hPXR aktivisering25. I 2010, Hartz et al. 26 benyttet denne tilnærmingen å gjenopprette P-gp protein uttrykk og transportere aktivitet i transgene menneskelige amyloid forløper protein (hAPP) musene som overexpress hAPP. Dessuten redusert gjenoppretter P-gp i hAPP mus betydelig amyloid beta (Aβ)40og Aβ42hjernen nivåer.

I tillegg til studere signalveier, kan isolerte hjernen kapillærene brukes å finne endringer i kapillær permeabilitet som vi kaller kapillær lekkasje. Spesielt brukes Texas Red lekkasje analysen til å vurdere lekkasje av fluorescerende fargestoff Texas rødt fra kapillær lumen over tid og disse dataene brukes deretter til å analysere lekkasje priser. Endringene i fysiske integritet av blod - hjerne barrieren2indikerer økt kapillær lekkasje satsene sammenlignet med de fra kontroll kapillærer. Dette er nyttig fordi det er mange sykdomstilstander knyttet barriere avbrudd, f.eks., epilepsi, multippel sklerose, Alzheimers sykdom og traumatisk brain skader27,28,29, 30. Andre grupper har også utnyttet isolert kapillærer å tyde signalveier som regulerer protein uttrykk og transport aktivitet av proteiner31,32,33,34, 35,36,37. Til slutt, vi har fortsatt å optimalisere denne metoden for isolering av menneskelige hjerne blodkar, og nylig vi viste økt P-gp uttrykk på den menneskelige blod - hjerne barrieren hos pasienter med epilepsi sammenlignet med anfall-free kontroll enkeltpersoner38 . Samlet viser denne utviklingen at isolert hjernen kapillærene kan tjene som en allsidig modell for å studere barriere-funksjonen.

Ulike in vivo, ex vivo, og i vitro blod - hjerne barrieren modeller har blitt brukt i grunnforskning og industrielle narkotikarelaterte screening, hovedsakelig med mål om å teste stoffet levering til hjernen39,40,41 ,42,43,44. I tillegg til isolerte ex vivo hjernen kapillærene inkluderer blod - hjerne barrieren modellene i sili modeller, i vitro cellekultur av isolerte hjernen kapillær endotelceller eller udødeliggjort linjer fra ulike arter, i vitro kultur for menneskelig pluripotent stamceller (hPSC) som skiller i hjernen kapillær endotelceller og microfluidic modeller på en brikke.

I sili modeller brukes vanligvis i utviklingen for valg av narkotika kandidater basert på forventet absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon (ADME) egenskaper. Metoder som kvantitative struktur-egenskapen forholdet (QSPR) modeller og kvantitative struktur aktivitet forholdet (BLEVE) modeller er populære metoder som brukes i høy gjennomstrømming screening av bibliotekene for å forutsi hjernen penetrasjon av narkotika kandidater 45 , 46. disse modellene er nyttig å skjermen molekyler for barriere gjennomtrenging egenskaper.

Betz et al. 47 etablert monolayers av kultivert hjernen kapillær endotelceller som et i vitro blod - hjerne barrieren modell-system. In vitro celle kultur modeller med ferskt vev eller udødeliggjort endothelial cellelinjer som menneskelige hjerne microvessel endotelceller (hCMECs) kan være en annen høy gjennomstrømming screening verktøyet for hjernen penetrasjon eller mekanistisk studier. Imidlertid hjernen kapillær endothelial celle kultur modeller mangler fysiologiske skjær stress blodstrøm i kapillær lumen, begrenses i samlet biologiske kompleksitet og gjennomgå endringer i uttrykk og lokalisering av viktig barriere komponenter som tett krysset proteiner kanaler overflate reseptorer, transportører, enzymer og ion48,49,50. Derimot endotelial monolayers avledet fra hPSCs, har lav sukrose gjennomtrengelighet i forhold til hCMEC/D3 kulturer og inneholder polarisert uttrykk for noen blod - hjerne barrieren transportører, vedheft molekyler og stramt veikryss51, 52. imidlertid disse cellene er også underlagt endrer egenskapene i kultur, og systemet må valideres for sin recapitulation av i vivo barriere egenskaper52.

Nyere trender i blod - hjerne barrieren forskning omfatter utnytte 3D vev kultur systemene for å skape kunstige kapillærene, bruker orgel-on-chip teknologi til å generere microfluidic enheter, eller bruker hul fiber teknologi53, 54 , 55. kunstig kapillærene, men har betydelig større diameter (100-200 µm) enn hjerne blodkar (3 – 7 µm). Derfor, den skjær krefter i vitro ikke fullt ligner situasjonen i vivo . Dette er adressert i "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic enheter, hvor kunstige membraner skjemaet "blood" og "hjernen" rom og væsker er pumpet gjennom disse enhetene generere microfluidic skjær styrker. Tilsvarende har co kulturer av endotelceller i forskjellige kombinasjoner med astrocyttene og vaskulær glatte muskelcellene også blitt brukt med hul fiber teknologi for å gjenskape reologiske parametere finnes under i vivo forhold56 , 57 , 58. men det er uklart hvor godt denne modellen gjenspeiler andre egenskaper for blod - hjerne barrieren som transport, metabolisme, signalnettverk, og andre. Disse kunstige kapillære og chip modeller er egnet for høy gjennomstrømming screening av narkotika, men cellene som brukes til å generere disse modellene er også endres under kultur.

Frosne og fast hjernen skiver eller primære hjernen kapillær endothelial cellekulturer er flere modeller som kan brukes til åstudere den menneskelige microvasculature5,59,60,61. For eksempel immunhistokjemi av faste hjernevev brukes til å bestemme protein lokalisering og uttrykk i sunt forhold til syke vev.

I tillegg til vev skiver og modeller i vitro kan beskrevet ovenfor, fersk isolert hjernen kapillærene benyttes for å studere blod - hjerne barrieren funksjon. Begrensninger av denne isolert kapillær modellen omfatter vanskelighetsgrad å få frisk hjernevev, fravær av astrocyttene og neurons, og en relativt tidkrevende isolasjon prosess. En fordel med isolert hjernen kapillær modellen er at denne modellen ligner situasjonen i vivo , og derfor kan brukes til å karakterisere barriere funksjon og dysfunksjon. Viktigere, kan den også brukes til å skjelne signalnettverk mekanismer ved hjelp av en rekke analyser og molekylære teknikker3,19,62,63.

Vårt laboratorium har tilgang til både fersk og frossen menneskelige hjernevevet via Sanders-brun Center på aldring (IRB #B15-2602-M)64. I denne sammenheng obduksjoner følger en standardprotokoll, hjernen er oppnådd i < 4 h, og alle prosedyrer overholder NIH Biospecimen beste praksis retningslinjer65. Gitt dette unik tilgang til hjernevev, vi etablert og optimalisert en protokoll for å isolere hjernen kapillærer fra hjernevev som resulterer i en høy avkastning av intakt, levedyktig menneskelige hjerne blodkar. To vanlige endepunktene av interesse er å bestemme protein uttrykk og aktivitet. I denne forbindelse, har vi og andre etablert ulike analyser som kan brukes med isolert hjernen kapillærene protein uttrykk og aktivitetsnivå. Disse analyser inkluderer vestlige blotting, enkel Western analysen, enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA), omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR), kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR), zymography, transport aktivitet analyser, og kapillær lekkasje analyser. Disse analyser tillate forskere å studere endringer i barriere-funksjonen i menneskelige patologisk forhold, finne veier protein uttrykk og aktivitet, og identifisere pharmacologic mål for behandling av blod - hjerne barrieren forbundet sykdommer.

Tatt sammen, fersk isolert hjernen kapillærene kan tjene som en robust og reproduserbar modell av blod - hjerne barrieren. Spesielt kan denne modellen kombineres med mange ulike analyser for å avgjøre en rekke endepunktene å studere barriere-funksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informasjonen nedenfor er basert på gjeldende sikkerhet og regulatoriske standarder ved University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Som en forholdsregel henvise til institusjonens biologiske sikkerhetskabinett programmet og nyeste regler og anbefalinger før du arbeider med menneskelig vev.

FORSIKTIG: Menneskelig vev kan være en kilde til blodbårne patogener, herunder humant immunsviktvirus (HIV), hepatitt B-viruset (HBV), hepatitt C-viruset (HCV) og andre. Arbeide med menneskelig vev medfører fare for infeksjon fra blodbårne patogener. Derfor er enkelte forskrifter og sikkerhet viktig når du arbeider med menneskelig vev å beskytte laboratoriepersonell. Arbeide med menneskelig vev i USA krever et biosikkerhet nivå 2 laboratorium som sikkerhetstiltak og opplæring i henhold til NIH avsnitt IV-B-7, OSHA Act 1970 setningsdelen 5(a)(1) og brukerens institusjonelle biologiske sikkerhetskabinett programmet. Generelt, må institusjonelle Biosafety utvalget og/eller institusjonelle Review Board godkjenning hentes før noen forsker som involverer menneskelige materialer (vev, kroppsvæsker). Treningen kreves for alt personell som arbeider med menneskelige materialer og inkluderer grunnleggende laboratorium sikkerhetsopplæring, f.eks, kjemiske Hygiene og laboratoriet sikkerhet, samt spesifikk trening på biologiske sikkerhetskabinett, farlig avfall og menneskelige blodbårne patogener. Alle ansatte arbeide med menneskelige materialer anbefales sterkt å få hepatitt B vaksinasjon, før du arbeider med menneskelige materialer. Personell er pålagt å ha bestemt personlig verneutstyr når du arbeider med menneskelige materialer, f.eks., en håndjern labfrakk og en ansikt skjerme og bruke hansker til alle tider. Alt arbeid er utført i en biosafety kabinett (klasse 2). Alt utstyr som kommer i kontakt med menneskelige materialer og alle avfall fra menneskelige materialer er håndtert på riktig måte for å hindre forurensning og/eller infeksjon av personell. Alt utstyr og overflater rengjøres med 10% blekemiddel og 75% etanol etter hver prosedyre som involverer menneskelige materialer. Utslipp med menneskelige materialer må rengjøres umiddelbart. Glass er den må byttes etter hver bruk. Avfall, inkludert unfixed menneskelig vev, er samlet i en merket biohazard avfall pose og autoklaveres. Sharps er samlet i en punktering - og lekkasjefri container merket som biologisk farlige. Alle avfall fra menneskelige materialer er fjernet etter institusjonens biologiske sikkerhetskabinett forskrifter.

Merk: Vårt laboratorium henter frisk frontal cortex prøver fra døde individer gjennom Sanders-brun Center på aldring (IRB #B15-2602-M). Inklusjonskriterier er: innmelding i UK-ADC langsgående obduksjon kohort studien og en Post-Mortem intervall (PMI) ≤4 h64. Obduksjoner følger en standardprotokoll og alle prosedyrer overholder NIH Biospecimen beste praksis retningslinjer65. En kort PMI av mindre enn 4 h er av høyeste viktighet å sikre kapillær levedyktighet etter isolasjon. Både fersk og frossen vev kan brukes. Hvis frysing er nødvendig, fersk innhentet hjernevev skal sjokk-frosset i flytende nitrogen og lagret på-80 ° C. Friske eller tinte vev skal lagres i isolasjon buffer (se nedenfor) og behandles raskt. Vi finner at 10 g fersk menneskelig vev gir ca 100 mg av hjerne blodkar (våt vekt).

1. installasjon

  1. Buffer forberedelse
    Merk: Volumet av buffer nødvendig, avhenger av mengden vev. Alle buffer volumer i følgende protokollen er basert på 10 g av menneskelige hjerne cortex vev.
    1. L isolasjon Buffer: Bruke 1,5 L Dulbeccos fosfat-bufret saltoppløsning (DPBS, 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2) og supplere med 5 mM D-glukose (1.35 g ) og 1 mM natrium pyruvate (0.165 g). Etter å legge til glukose og pyruvate, justere pH 7.4 med natriumhydroksid. Cool og lagre buffer til 4 ° C før bruk.
    2. Storfe Serum Albumin (BSA): Legge til 10 g BSA pulver 1 L isolasjon buffer en siste BSA konsentrasjon av 1%. Røres sakte å unngå bobler, justere pH 7.4 og lagre på 4 ° C over natten. Umiddelbart før bruk, forsiktig røre; unngå danner bobler å unngå albumin rødsprit.
    3. tetthet gradert medium: veie 18 g av tetthet gradert medium i ett glassflaske og legge en magnetic røre bar. Legg til 60 mL isolasjon bufferen og rist godt i 5 minutter før alle pulver er suspendert. Store natten på 4 ° C tillate tetthet gradert medium å oppløse. Rør i 10 min rett før bruk.
    4. Lagre alle buffere på 4 ° C; holde alle verktøy og buffere på is under hele isolasjon prosedyren. Rør alle buffere før bruk.
  2. Eksperimentelle oppsett
    1. Montere pistil av Potter-Elvehjem vev vinkelsliperen på den elektroniske overhead rørestang. Plass Potter-Elvehjem vev jeksel og Dounce homogenizer med støter på is under panseret. Forberede en 300 µm filter mesh (5 x 5 cm2), kaste det til en kjegle, og sett inn og knytte den til en 50 mL Falcon tube med tape (figur 1A).
    2. Plasser tilkobling ringer og celle belastning filtre (pore størrelse: 30 µm) på 50 mL Falcon rør. Forberede biologisk farlige avfall poser. Plassere alle nødvendige utstyr i fravær av smittefarlige stoffer skap (se Tabell for materiale).

2. hjernen eksempel forberedelse

Merk: Figur 1A viser arbeidsflyten diagrammet hele isolasjon prosedyren beskrevet nedenfor. Hjernevev kan stamme fra noen del av cortex og kan brukes friske eller frosne. Frosne hjernevev kan tines ved romtemperatur (ingen buffer; ~ 30 min for 10 g). For å oppnå sammenlignbare resultater, kan hjernevev skaffes fra samme hjernen regionen for hvert eksperiment. Denne protokollen er optimalisert for frisk (PMI < 4 h) menneskelige hjernebarken som ikke har vært frosset.

  1. Utarbeidelse av hjernevev: dokumentere vekten av hjernevevet. Alle tall i følgende protokollen er aktuelle for 10 g fersk hjernevev. Plass hjernevev i en 100 mm Petriskål. Forsiktig fjerne alle meninges med tang. Bruk en skalpell for å kutte av hvit substans.
  2. Hakking av hjernevev: nøye kuttet opp hjernevevet og hakke det med en skalpell. Hakke for om 5 min (2-3 mm stykker). Overføre hjernevev til Potter-Elvehjem vev jeksel. Legge til 30 mL av isolasjon buffer.
    Merk: Bitene hakket vev er vanskelig å se siden hjernevev blir grøt gjennom hakking prosessen.

3. homogenisering

  1. Potter-Elvehjem vev jeksel (klarering: 150-230 µm): Homogenize hvert utvalg med 100 slag med en homogenizer hastighet på 50 rpm. Dokument tid hver 25 streker og den totale tiden som er nødvendig for 100 slag. Se tabell 1 for en foreslått homogenisering protokoll; total tid for homogenisere 10 g av menneskelig frontal cortex er ca 22 min. Ikke rør i luften for å hindre bobler.
  2. Dounce homogenizer (klarering: 80-130 µm): overføring av homogenate til en Dounce homogenizer på is. Homogenize suspensjon med 20 slag (~ 6 s/slag, totalt ~ 2 min). Unngå bobler.

4. sentrifugering

  1. Distribuere hjernen homogenate likt til fire 50 mL sentrifugering rør og dokumentet det totale volumet av homogenate. Distribuere 50 mL av tetthet gradert buffer i sentrifugering rør (12.5 mL per rør). Bruk 10 mL av isolasjon buffer skyll pistil og homogenizer og distribuere i fire sentrifugering rør (~2.5 mL per rør).
  2. Tett Lukk sentrifuge rør med caps. Bland i homogenate, tetthet gradert medium og buffer ved kraftig risting rørene. Sentrifuge 5800 x g i 15 min på 4 ° C (fast vinkel rotor); velge en middels retardasjon hastighet å holde pellets festet til røret. Forkast nedbryting og resuspend hver pellet i 2 mL 1% BSA.

5. filtrering

Merk: Separate kapillærene fra røde blodlegemer og andre celle rusk, flere filtrering trinn er nødvendig.

  1. 300 µm mesh: etter re suspenderes pellet, filtrere suspensjon gjennom 300 µm mesh. Kapillærene er filtrert gjennom nettet, mens større fartøy og større hjernen rusk liggende på nettet. Nøye vask mesh med opptil 50 mL 1% BSA. Kast mesh.
    Merk: Dette trinnet filtrering fjerner kapillær suspensjon fra større fartøy eller biter av hjernen avfall.
  2. 30 µM celle belastning filter
    Merk: Dette trinnet filtrering skiller kapillærer fra røde blodlegemer og andre hjernen rusk.
    1. Distribuere kapillær filtratet fra trinn 6.1 over fem 30 µm celle belastning filtre (ca 10 mL av kapillær filtratet per celle belastning filter). Kapillærene er holdt tilbake av dette filteret, mens røde blodlegemer, andre enkeltceller og liten hjerne rusk passerer gjennom filteret og er samlet i filtratet.
    2. Vask hvert filter med 25 mL 1% BSA. Etterpå hell alle filtratet over sjette filteret å øke avkastningen. Vask hvert filter med 50 mL 1% BSA; holde cellen belastning filtre med inneholder kapillærene og kast filtratet.

6. kapillær samling

  1. Slå filtrene opp ned og vask kapillærene med 50 mL 1% BSA for hvert filter i 50 mL rør. Forsiktig presse med Pipetter spissen av en 5 mL hindre og flytter den over til å vaske hjernen kapillærene.
  2. Sørg for å vaske av alle hjernen kapillærene, spesielt fra kanten av filteret. Unngå bobler siden dette gjør filtrering prosessen vanskeligere og øker sjansen for kapillær tap.

7. vask

  1. Etter samle kapillærene, sentrifuge alle prøver 1500 x g i 3 minutter på 4 ° C (svinger bøtte rotoren). Fjern nedbryting og re suspendere pellet i ca 3 mL isolasjon buffer. Kombiner alle resuspended pellets fra en prøve i et 15 mL konisk rør og fylle den med isolasjon buffer. Sentrifuge igjen på 1500 x g i 3 minutter på 4 ° C og vask to ganger.
  2. Dokumentere kapillær renheten mikroskopet (100 X forstørrelse) og kameraet (figur 1B).
    Merk: Hjernen kapillær avkastningen fra 10 g av hjernevev er vanligvis ca 100 mg. Isolert hjernen kapillærene kan nå brukes i eksperimenter, behandlet (f.eks., lysate, membran isolasjon), eller være flash-frosne og lagret på-80 ° C i cryotubes i minst 6-12 måneder (unngå flere fryse-Tin sykluser).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolasjoner fra hjernevev gi en suspensjon beriket i menneskelige hjerne blodkar (figur 1B) med små mengder større fartøy, røde blodlegemer, andre enkeltceller og noen celle rusk. Noen kapillærene er forgrenet, og i noen, røde blodlegemer er fanget i kapillær lumen. Den typiske kapillær 3 – 7 µm og diameteren er ca 100-200 µm lang med åpne lumen; de fleste kapillær ender er skjult. Bruke AC confocal mikroskopi, avsløre isolerte menneskelige hjerne blodkar en rørformet, intakt struktur og morfologi. Figur 2A viser en representant overføres lett bilde av en menneskelig hjerne kapillær med en tilknyttet pericyte og en røde blodlegemer i lumen. Alle resultatene om diameter, størrelse og morfologi er i samsvar med tidligere rapporter på strukturen i isolerte hjernen kapillærene12,17,18. Den isolerte menneskelige hjernen kapillær i figur 2B var immunostained for P-gp (grønn) med C219 som det primære antistoffet (1 µg/mL); kjerner var counterstained med DAPI (1 µg/mL).

Figure 1
Figur 1: flytskjema kapillær isolering. (A) Piktogrammet viser store steg i prosedyren for å isolere hjernen kapillærer fra frisk menneskelig vev. (B) bildet viser isolert menneskelige hjerne blodkar under lys mikroskop rett etter isolasjon (100 X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: isolert menneskelige hjerne kapillær. (A) A overføres lett bilde av en isolert menneskelige hjerne kapillær. (B) AC confocal mikroskopet bildet viser en isolert menneskelige hjerne kapillært immunostained for P-gp (grønn; C219 1 µg/mL); kjerner var counterstained med DAPI (blå, 1 µg/mL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: feilsøking tetthet sentrifugering. Piktogrammet viser utarbeidelse etter tetthet gradert sentrifugering. Det fremhever effekten av for mye og for lite tetthet gradert medium og hvordan dette påvirker separasjon og det resulterende kapillær pellet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: P-gp protein uttrykk i isolerte menneskelige hjerne blodkar. Western blot viser sterk band for P-gp (1 µg/mL) i isolerte menneskelige kapillærene sammenlignet hCMEC\D3 celler. Β-utgangen ble brukt som en lasting (1 µg/µL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: programmer for isolert menneskelige hjerne blodkar. En oversikt over de vanligste programmene for isolert hjernen kapillærene publisert i litteraturen. Isolert kapillærene er brukt for: 1) Genomics85,86, 2) Proteomikk3,38,87,88,89,90, 91,92,94,95,96, 3) funksjonelle Proteomikk2,38og 4) Cellomics82, 83,84,97,98,99. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Streker Tid [min]
1-25 7-7.5
26-50 5-5.5
51-75 5-5.5
76-100 5-5.5
Total tid: 22-24 min

Tabell 1: homogenisering protokollen. Homogenisering protokollen for Potter-Elvehjem vev vinkelsliperen til homogenize 10 g av menneskelig frontal cortex med homogenisering hastighet på 50 rpm. Merk at de første flere strøkene kreve ekstra tid å homogenize hakket vevet. Etter denne første homogenisering hvert strøk er 12 s varighet (6 s nedadgående bevegelse, 6 s oppadgående bevegelse). Dermed etter første homogenisering, kan 5 slag oppnås i 1 min, eller 25 slag i 5 min.

Problem Mulig årsak Løsning
Ingen kapillær Pellet 1) feil Ficoll konsentrasjon 1) Juster Ficoll konsentrasjon
2) feil sentrifugering hastighet 2) Juster sentrifugering hastighet
3) feil akselerasjon og/eller retardasjon hastighet 3) justere akselerasjon og/eller retardasjon hastighet
Lav kapillær Yield 1) meninges blokkerer filtrering trinn 1) fjerne alle meninges før filtrering
2) for mange kapillærene tapt under isolasjon prosedyre 2) beregne buffer konsentrasjon riktig, skyll pipette-spisser
3) vaske kapillærene av PluriStrainer filtre var utilstrekkelig 3) snu filtre og nøye inspisere for kapillærene (bruk mikroskopet)
4) overflødig bobler under resuspensions 4) pipette sakte å unngå bobler
Ikke-levedyktige kapillærene 1) utvidet obduksjon intervall 1) redusere intervall hvis mulig eller bruk snapin-frosne hjerne
2) bruke håndtering av frossent vev for isolering 2) bruke ferskt vev
3) tiden isolasjon prosedyre for lang 3) optimalisere arbeidsflyt
4) utstyr/buffere ble ikke beholdt på is under isolasjon prosedyren 4) holde utstyr og buffere på is under isolasjon

Tabell 2: feilsøking vanlige problemer. En liste over de vanligste feilene og problemer som oppstår under isolasjon prosedyren og hvordan de kan løses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nåværende protokollen beskriver isolering av intakt og levedyktig menneskelige hjerne kapillærer fra ferskt vev. I denne delen, vi diskutere i detalj følgende: 1) endringer protokollen, 2) feilsøking av vanlige feil, 3) begrensninger av teknikken, 4) betydningen av modellen med hensyn til eksisterende og alternative blod - hjerne barrieren modeller, og 5). potensielle søknader om isolerte menneskelige hjerne blodkar.

Protokollen beskrevet her er optimalisert for 10 g av friske menneskelige frontal cortex vev. Men det er relativt enkelt å endre denne prosedyren for: 1) mer eller mindre enn 10 g vev, 2) frosne hjernevev eller 3) hjernevevet fra hjernen regioner enn frontal cortex. Først kan med mer eller mindre enn 10 g av hjernevevet, den nødvendige mengden bufferne bare skaleres opp eller ned tilgjengelige mengden vev. Hvis bare 5 g av hjernevevet er tilgjengelig, skal dermed volumet av bufferne reduseres til det halve. Andre, beskriver vi en kapillær isolasjon som brukes frisk hjernevev, men frossent kan brukes hvis ferskt vev er utilgjengelig38. Tredje vi brukte frisk hjernevevet fra frontal cortex, men kapillærene kan være isolert fra andre kortikale hjernen regioner hvis det er nok tilgjengelig vev. Det er også mulig å isolere kapillærer fra ikke-kortikale hjernen regioner (f.eks., hvit substans), men disse områdene har en annen celle sammensetning og kapillær tetthet 66,67,68. Dermed bruker vev fra en annen hjernen regionen vil trolig kreve protokollen for å bli justert (f.eks, buffer volum, gradient middels tetthet, sentrifugering hastighet eller antall filtrering trinn).

Kapillær isolasjon prosedyren, er mens ikke komplekse per se, følsomme for små forstyrrelser eller endringer i protokollen. Endringer kan føre til redusert kapillær avkastning eller redusert kapillær levedyktighet. Tabell 2 beskriver de vanligste feilene og problemer som er oppdaget under isolasjon og viser tips for å unngå disse feilene og løsninger for feilsøking hvis de oppstår. Det vanligste problemet knyttet til prosedyren er en lav kapillær avkastning. Tap av kapillærene er ofte den akkumulerte summen av små tap på hvert trinn og skyldes lite avvik over prosedyren. Et viktig skritt i som en stor mengde kapillærene gå tapt er tetthet sentrifugering. En feil konsentrasjon i bufferen gir en feil tetthet skille kapillærene fra mobilnettet rusk som reduserer volumet av kapillær pellets. Figur 3 viser konsekvensene av for lite eller for mye tetthet gradert medium i sentrifugering trinn i forhold til hjernen homogenate. Justere til riktig konsentrasjonen kan løse dette problemet. Merk at akselerasjon og retardasjon hastighet centrifuge kan også påvirke dannelsen av hjernen kapillær pellets. Kapillærene kan også tapt under trinn 6-7 Hvis del av kapillær materialet stikker til pipette-spisser. Dette problemet kan løses ved grundig skylling hver Pipetter tips før du endrer den. I trinn 7, vaske av kapillærene fra cellen belastning filteret kan være ufullstendige og/eller kapillærene kan holde seg til kanten av filteret. Dette kan unngås ved å kontrollere filteret under mikroskopet etterfulgt av ytterligere vask trinn. Å miste capillaries under hvert trinn av isolasjon prosedyren kan resultere i ubetydelig kapillær pellets eller ikke nok kapillær materiale for videre behandling og eksperimentering.

Isolere hjernen kapillærer fra frisk menneskelig vev representerer en unik blod - hjerne barrieren modell som ligner situasjonen i vivo . Det eksisterer imidlertid flere begrensninger av teknikken. En utfordring er tilgjengeligheten av ferske menneskelig vev. Optimal PMI er ≤4 h, vil hjernevev samlet på en betydelig lengre PMI ikke være frisk nok for noen nedstrøms programmer. I noen tilfeller kan det være vanskelig å få vev beløp som er stor nok for flere eksperimentelle grupper, og dermed begrense nedstrøms programmer. Dermed kan isolere frisk kapillærer fra gnager19, hjørnetann69, storfe42eller svin70 hjernevev være mer egnet til modell blod - hjerne barrieren. Faktorer som bestemmer variasjon av hjernevev som alder, kjønn, etnisitet, sykdom tilstand, medisinering historie, hjernen regionen utvalg og PMI bør tas i betraktning når tolke og publisere data. På et eksperimentelt er det viktig å merke seg at isolert kapillærene fremdeles inkluderer pericytes, men astrocytic endfeet er fjernet av prosedyren44. Det må tas i betraktning at modellen presentert her fungerer som en ex vivo modell av blod - hjerne barrieren (dvs., kapillære endotelceller) men ikke som modell av nevrovaskulære.

Arbeide med noen menneskelig vev presenterer alltid en iboende sikkerhetsrisiko og forskere må ta nødvendige forholdsregler under isolasjon prosedyren å unngå infeksjon. Spesielt i USA krever arbeid med menneskelig vev utpekte laboratoriet plass som BSL 2-sertifisert og inkluderer en biosafety skap (klasse A2). I tillegg ansatte må bruke personlig verneutstyr (dvs., laboratoriefrakk, hansker og ansiktsskjerm) og utpekt utstyr for menneskelig vev og implementere biologisk farlige avfallshåndtering. Implementere disse sikkerhetstiltakene er tidkrevende, kostnadskrevende, og øker vanskelighetsgraden av prosedyren, spesielt for uerfarne laboratoriepersonell.

Blod - hjerne barrieren er svært bevart blant organismer med en godt definert CNS71. Modellering menneskelig blod - hjerne barrieren er vanskelig fordi det er komplisert nevrovaskulære kopling mellom cellene i nevrovaskulære enheten. En voksen menneskelige hjerne er anslått for å ha i gjennomsnitt ca 86 milliard nerveceller og det antas at nesten alle Nevron har sin egen kapillær å sikre riktig tilførsel med oksygen og næringsstoffer72,73. Kapillær endotelceller utgjør det største arealet på blod-hjerne-grensesnitt (12-18 m2 for en sunn voksent menneske). Tett veikryss representerer hinder for en rekke pharmacotherapeutics blokkerer paracellular spredning av solutes. Tallrike studier, beskriver i tillegg barriere dysfunksjon i nevrodegenerative lidelser, f.eks., Alzheimers74, hjerneslag75, epilepsi38,76, multippel sklerose77, og traumatisk brain skader28,78. Derfor er det viktig å etablere modeller som tett representerer menneskelig blod - hjerne barrieren og gi en bedre forståelse av barriere funksjon i helse og sykdom.

Mange i vitro celle kultur modeller av blod - hjerne barrieren eksisterer; se 41,,49,,51,,69,,79,,80ekspert anmeldelser om emnet. Kort, både fersk isolert hjernen kapillær endotelceller for primære kultur og udødeliggjort hjernen kapillær endothelial cellelinjer er tilgjengelige. Primære kulturer av cerebral microvessel endotelceller brukes hovedsakelig fra mus, rotte, gris og ku. Men er primært cellekulturer arbeidskrevende siden cellene må være fersk isolert. Udødeliggjort hjernen kapillær endothelial cellelinjer er tilgjengelig fra mus, rotte og menneskelig og mindre arbeidskrevende fordi de kan være passaged for langsiktig bruk. Men har også udødeliggjort cellelinjer en grense for hvor ofte de kan være passaged før de tapte deres endothelial egenskaper. Både primær celler samt udødeliggjort celler linjer er ofte kultivert på plater modell hjernen kapillær endotelet og måle barriere permeabilitet og narkotika transport over celle monolayer, dermed etterligne blod-til-hjerne transport41 ,81,82. Kultur media i disse modellene kan også endres eller suppleres med astrocyttene, pericytes eller andre fysiologisk relevante faktorer som leiren41,83,84.

Fordelen med udødeliggjort cellelinjer er deres relativt lett tilgang og tilgjengelighet. Mens kulturperler endotelceller kan nå samløpet, de mister endothelial celleegenskaper som de vokser side-ved-side i en monolayer. Kultivert hCMECs viser for eksempel redusert uttrykk for transportører som P-gp, tett krysset proteiner og vise variabel permeabilitet xenobiotics41. Figur 4 viser en Western blot P-gp protein uttrykk i hCMEC/D3 celler sammenlignet med fersk isolert menneskelige kapillærer. Et 10 ganger lavere beløp totale protein er signalet for P-gp sterkere i isolerte menneskelige kapillærene sammenlignet med hCMEC/D3 celler. Dette indikerer at hCMEC/D3 celler mistet en betydelig mengde P-gp protein uttrykk i kultur. Videre påvirke forskjeller i kultur medier, miljø og materiell viktige mål for barriere integritet, dvsTEER mål i Transwell plate analyser. Noen av disse problemene kan løses ved å benytte den isolerte hjerne kapillær modellen som nærmere representerer menneskelig blod - hjerne barrieren i vivo.

Isolert hjernen kapillærene har vært brukt i en rekke studier, deriblant genomics, Proteomikk, funksjonelle Proteomikk og cellomics studier (figur 5). I tillegg finnes mange teknikker og metoder for å analysere isolert hjerne blodkar i hvert av disse feltene. Spesielt kan den eksperimentelle teknikker som vist i figur 5 brukes på hjernen kapillærene isolert fra en rekke kilder, inkludert menneskelige, storfe, gnager og svin vev, som kan lette translasjonsforskning. For eksempel Li et al. 85 studerte genomics av blod - hjerne barrieren med undertrykkelse subtraktiv hybridisering ved rensing mRNA isolert fra rotte hjernen kapillærer. I tillegg Ott et al. 86 brukt RT PCR og qRT PCR for å studere regulering av P-gp ved PXR. Mange proteomic studier utnytte Western blotting3, Dot Blot analyse87, enkel Western analyser3,38, ELISA88,89, immunoprecipitation3, og immunostai-3,90,91. Å skjelne transporter menneskehandel i hjernen endotelet, McCaffrey et al. 92 brukes subcellular fraksjoneres av isolerte hjernen kapillærer. Sánchez del Pino et al. 93brukt isolert bovin endothelial membran blemmer for å skjelne transporter plassering og transport retning over blod - hjerne barrieren. I andre proteomic studier brukte forskerne flytende kromatografi og tandem massespektrometri for å kvantifisere transporter proteiner94,95,96. Funksjonell proteomic studier har utnyttet transporter og lekkasje søk2,38. Hartz et al. 2 brukes zymography for å avgjøre enzym aktivitet i isolerte hjernen kapillærer. I tillegg har store cellomic forskning ved hjelp av cellekultur generert mange endothelial cellelinjer og modeller av blod - hjerne barrieren82,83,84. Med disse modellene inkluderer felles analyser brukt overføring analyser97,98, levedyktighet og toksisitet analyser99og angiogenese analyser98.

Isolert hjernen kapillærene tillate nøyaktige karakterisering av protein uttrykk og aktivitet og beskrivelse av signalnettverk trasé på blod - hjerne barrieren. Dette skyldes delvis til kapillær innholdet i hjernen, som er bare ca 1% (v/v). Dermed vil bruker hele hjernen homogenate eller hjernen skiver som en erstatning for renset kapillær endotelceller sannsynligvis resultere i en dårlig signal-til-støy forholdet24. I tillegg etter isolasjon er hjernen kapillærene levedyktig minst 6 h (upubliserte data fra mus og rotten), hvilke innrømmer studier å skjelne bestemt signalveier. Det anbefales å ta en kontrollgruppe fra samme forberedelse.

Representant og translasjonsforskning modeller av blod - hjerne barrieren, som isolert kapillær modellen omtalt i denne rapporten, er nødvendig å studere barriere funksjon i helse og sykdom. Her presenterer vi en protokoll for å få isolerte menneskelige hjerne blodkar utbytte og høy kvalitet som kan tjene som en ex vivo modell av blod - hjerne barrieren. Isolert kapillærene beholder sin opprinnelige struktur og funksjon, som lar bruker dem for en rekke post isolasjon molekylær, biokjemiske, og fysiologiske analyser. Bør utvises ved håndtering av menneskelig vev eksempler, fortrinnsvis i en BSL 2 eller høyere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takke og erkjenner Dr. Peter Nelson og Sonya Anderson på UK-ADC hjernen vev Bank for å gi alle menneskelige hjerne vevsprøver (NIH gi nummer: P30 AG028383 fra National Institute on Aging). Vi takker Matt Hazzard og Tom Dolan, IT-tjenester, faglig teknologi og fakultetet engasjement, University of Kentucky for grafisk hjelp. Dette prosjektet ble støttet av grant nummer 1R01NS079507 fra National Institute av nevrologiske lidelser og slag (til bb) og gi nummer 1R01AG039621 fra National Institute on Aging (til A.M.S.H.). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institute av nevrologiske lidelser og slag eller National Institute on Aging. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz. UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4 °C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 L Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 L Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45, (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43, (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36, (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46, (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41, (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36, (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135, (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18, (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355, (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71, (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4, (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25, (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8, (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31, (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34, (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66, (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71, (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66, (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334, (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30, (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28, (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70, (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77, (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33, (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8, (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55, (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127, (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91, (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29, (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102, (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278, (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34, (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14, (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44, (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43, (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253, (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7, (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103, (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58, (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56, (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13, (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192, (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45, (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36, (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9, (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125, (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10, (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51, (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487, (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330, (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56, (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66, (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10, (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10, (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6, (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11, (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21, (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37, (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524, (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30, (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115, (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29, (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6, (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6, (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71, (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199, (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115, (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12, (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54, (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329, (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53, (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22, (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017, (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35, (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9, (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122, (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270, (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40, (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25, (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2, (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86, (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242, (2), 105-108 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics