Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

Biology

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Summary

Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

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Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

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Abstract

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo excepcional en el que estudiar el metabolismo de los lípidos y la homeostasis de la energía. Muchos de sus genes de lípidos se conservan en los seres humanos y están asociados con el síndrome metabólico u otras enfermedades. Examen de la acumulación de lípidos en este organismo puede realizarse por fijadores colorantes o métodos libres de etiqueta. Manchas de fijador como Nilo rojo y aceite O rojo son maneras baratas, confiables para medir cuantitativamente los niveles de lípidos y observar cualitativamente la distribución de lípidos a través de los tejidos, respectivamente. Por otra parte, estas manchas permiten proyección de alto rendimiento de varios genes del metabolismo de lípidos y vías. Además, su carácter hidrofóbico facilita la solubilidad en lípidos, reduce la interacción con los tejidos circundantes y evita la disociación en el solvente. Aunque estos métodos son eficaces en el examen de contenido lipídico general, no proporcionan toda la información sobre la composición química y la diversidad de los depósitos de lípidos. Para estos propósitos, métodos libres de etiqueta tales como microscopia de GC-MS y los coches son mejores satisfecho, sus costos no obstante.

Introduction

Los lípidos son esenciales para la vida. Son componentes integrales de las membranas, actúan como mensajeros secundarios y transductores de señales y tienen funciones cruciales en almacenamiento de energía. Cuando el metabolismo lipídico se altera, conduce a enfermedades como obesidad y diabetes tipo II, que están presionando de preocupaciones de salud pública9. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo excelente estudiar el metabolismo de los lípidos ya que tiene un ciclo de vida relativamente corto, un cuerpo transparente, un linaje de la célula conocidos y un genoma completamente secuenciado. Principalmente un hermafrodita C. elegans permite a los investigadores levantar grandes cantidades de animales isogénicas en breve períodos de tiempo a realizar alto rendimiento adelantados pantallas genéticas para estudiar una amplia gama de genes y rutas metabólicas4. Este enfoque ha revelado un alto grado de conservación de genes de metabolismo de lípido de C. elegans 273 entre los seres humanos, ratones, ratas y drosophila. Además, más de 300 genes de lípido en C. elegans tienen orthologues humano que están asociadas con enfermedades no relacionadas con el síndrome metabólico11. Tradicionalmente, examen del almacenaje del lípido en C. elegans ha dependido sobre todo de ensayos marcados con tinte, que proporcionan información confiable sobre la acumulación de lípidos. Menos común es una descripción de donde localización los lípidos y medidas diferencias en abundancia de lípidos en los tejidos. Sin embargo, trabajo reciente ha revelado que la distribución de lípidos puede ser tan importante como la acumulación de lípidos6.

Últimamente, los estudios han comenzado a integrar métodos tales como alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría de masas (HPLC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), y anti-stokes coherente microscopia de Raman dispersión (coches) a la dirección del deficiencias de los enfoques basados en la mancha analizando directamente el contenido de extractos de lípidos y fracciones de lípidos específicos depósitos de lípido, respectivamente10,11. Por otra parte, microscopia de coches ha revelado que el rojo Nilo sólo puede servir como un proxy para la acumulación de grasa cuando se utiliza como un colorante fijador, para su uso como una tinción vital conduce al objetivo de tinción de organelos fluorescentes auto10. Sin embargo, los conocimientos técnicos requeridos y los costos asociados con estos cromatografía y los métodos de microscopía hacen su uso insostenible para muchas preguntas de investigación. En este artículo, discutimos un método conveniente y confiable para fijar y depósitos de lípidos neutros en C. elegans con Nilo rojo de la mancha y aceite O rojo para distinguir la abundancia de lípidos en animales enteros y en tejidos específicos.

Nilo rojo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, es un tinte benzophenoxazone que fácilmente se disuelve en disolventes orgánicos varios, pero sobre todo es insoluble en agua. Es un excelente lysochrome colorante utilizado para teñir lípidos neutros como los triglicéridos o ésteres de colesterol ya que cuenta con un color fuerte, solubiliza bien en lípidos tiene insignificante interacción con los tejidos circundantes y es menos solubles en el solvente que en lípidos. Tiene una máxima excitación y de emisión de 450-500 y 520 nm, respectivamente1. Cuando Nilo teñido de rojo C. elegans para la fluorescencia verde, cuerpos lípidos discreta pueden ser observados a lo largo del intestino y otros tejidos ya sea en grupos o disperse uniformemente, dependiendo del genotipo del animal o el tratamiento experimental 7.

Aceite rojo O es a lysochrome, soluble en la grasa colorante utilizado para teñir los triglicéridos y las lipoproteínas. Se llama un colorante azo porque su estructura química contiene dos grupos azo a tres anillos aromáticos. Es difícil ionizar, que hace que sea altamente soluble en lípidos. Su color de tinte es rojo y su absorción de la luz máxima es 518 nm 3. C. elegans manchado con aceite O rojo muestran gotas lipídicas rojo que destacan contra el cuerpo del animal transparente, que facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos diferentes6.

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Protocol

1. el Nilo rojo (NR) tinción de lípidos

  1. Preparación de solución 5 mg/mL NR
    1. En una botella de 500 mL, añadir 100 mg de polvo NR a 200 mL de acetona al 100%.
    2. Cubrir la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.
    3. Antes de usar, agitar la solución durante 2 h en la oscuridad.
    4. Para uso a largo plazo, guarde la solución NR en un frasco bien sellado sin ninguna exposición a la luz. Solución madre de escala NR según las necesidades de investigación. Asegúrese de que la misma solución se utiliza en experimentos NR-coloración para obtener coloración consistente y resultados de la proyección de imagen.
  2. Preparación de solución de trabajo NR
    1. Por cada 1 mL de isopropanol al 40% (v/v), añadir 6 μl de solución stock de NR.
    2. Preparar 600 μl de solución de trabajo NR para cada muestra.
      Nota: Asegúrese de NR fresco derecho solución de trabajo antes de la tinción. Según necesidades de la solución madre de NR, utilice un tubo cónico aforado de 50 mL o 15 mL.
  3. Preparación de gusanos para la tinción de lípidos NR
    1. Crecer gusanos a etapa temprana de la L4 a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembrado con fines registro OP50 e. coli.
    2. Lavar los gusanos la placa con 1 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato + solución al 0.01% Tritón X-100 (SAFT) y la suspensión de gusano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante y repetir este paso hasta que e. coli se borra de la suspensión.
    4. Añadir 100 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    5. Centrifugue los gusanos a 560 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante sin interrumpir la pelotilla del gusano.
      Nota: Volúmenes más altos de uso de SAFT para lavar los gusanos de las placas si usando las placas de mayor tamaño o coloración más gusanos por placa. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Realizar lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.
  4. Lípidos tinción con NR
    1. En la oscuridad, añadir 600 μl de solución de trabajo NR a cada muestra. Invertir los tubos tres veces y mezclar completamente los gusanos en la solución NR.
    2. Girar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
    3. Después de la incubación, centrifugar los gusanos a 560 x g durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante.
    4. Añadir 600 μl de Saft e incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos remover exceso mancha NR.
    5. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y quitar todo pero aproximadamente 50 μl de sobrenadante.
      Nota: Incubación NR no requiere agitación. Adaptación de gusanos es común durante esta etapa.
  5. Preparación de transparencias para proyección de imagen de microscopio
    1. Resuspender el precipitado de gusano en el sobrenadante restante.
    2. Colocar 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y un cubreobjetos en cuidadosamente para evitar atrapar burbujas de aire.
    3. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de gusanos la proyección de imagen.
    4. Preparar sólo unas diapositivas a la vez. Esto garantizará la proyección de imagen NR es constante a través de las muestras. La calidad de imágenes teñidas de NR disminuye después de 6 h. discreto lípido gotitas son difíciles de observar y aumenta la fluorescencia del fondo, que interfiere con la detección de señal NR.
  6. Proyección de imagen de gusanos NR-manchado
    1. Imagen de los gusanos en el aumento de 5 X para capturar a varios animales por el campo de visión.
    2. Cambiar a 10 aumentos para la mejor cuantificación de los gusanos.
    3. Utilice FITC/GFP canal imagen gusanos NR-manchadas y tiempos de exposición diferentes para determinar las condiciones óptimas para la cuantificación.
    4. Guardar archivos en formato TIF para evitar perder datos debido a la compresión.
      Nota: Exposición típica veces desde el 100-1000 Sra. teniendo un tiempo de exposición óptima, utilizarlo para todas las muestras para mantener la coherencia de imagen.
  7. Cuantificación de imagen tinción NR
    1. Subir imágenes a ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.
    2. En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.
    3. En el mismo menú desplegable, ajustar brillo y contraste de la pila de la imagen y propagar los cambios a todas las imágenes haciendo clic en aplicar.
    4. Emplear la herramienta de selección de polígono para delinear cada gusano imagen y utilice la función de medida del menú desplegable de análisis para cuantificar la intensidad de la fluorescencia emitida por NR.
    5. Para cada imagen, medir cinco localidades de fondo y calcular la intensidad de la fluorescencia de fondo promedio.
    6. Restar la intensidad de la fluorescencia de fondo de cada gusano reflejada mediante la fórmula N = G - (A x B), donde N es neta fluorescencia, G para fluorescencia bruta, A para el área total de gusano y B por fluorescencia del fondo promedio.
    7. Para normalizar la intensidad de fluorescencia por el tamaño del gusano, dividir fluorescencia neto de cada gusano por su área total. Los resultados se informan como intensidad de la fluorescencia en unidades arbitrarias (a.u.) por píxel.
      Nota: Evitar exportar imágenes en formato JPEG. Mientras que la compresión hace archivos más manejables para almacenar, integridad de los datos se ve comprometida por este formato. Asegúrese de que todas las imágenes se modifican y analizadas idénticamente. Recuerde incluir una barra de escala para evaluar adecuadamente el tamaño en diferentes aumentos. Para visualizar mejor las diferencias en la intensidad de fluorescencia con ImageJ, cambiar el tipo de imagen de RGB a 8 bits y seleccione fuego desde el menú de tablas (LUT) de búsqueda de imagen. Esto crea una imagen de mapa de calor en el color que mayor brillo se correlaciona con la intensidad creciente de la fluorescencia.

2. aceite rojo O manchas (ORO) de lípidos

  1. Preparación de solución madre de ORO
    1. En una botella de 250 mL, Añadir 500 mg de polvo ORO a 100 mL de isopropanol al 100% y mezclar bien.
    2. Una vez preparado, guarde la solución cerrada con ninguna exposición a la luz.
  2. Preparación de solución de trabajo de ORO
    1. Diluir solución stock de ORO en agua (3:2) isopropanol al 60%.
    2. Antes de usar, filtrar la solución de trabajo de ORO a través de un filtro de jeringa estéril de acetato de celulosa de 0,2 μm.
      Nota: Para mejor calidad de la solución, preparar solución de trabajo de ORO el día antes y deje mezclar durante la noche. Sin embargo, si la solución es mismo día necesario, diluir y mezclar ORO solución en un rockero durante al menos 2 h antes de su uso. Antes de mecedora, envuelva el tubo cónico en las cintas de parafina para evitar la salida de la solución ORO.
  3. Preparación de gusanos para la tinción de lípidos ORO
    1. Crecen los gusanos a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con fines registro OP50 e. coli a la etapa de la vida deseada.
    2. Añadir 1 mL de solución de SAFT a la placa y agitar hasta que los gusanos están fuera de la placa. Incline la placa y lavar con 1 mL de SAFT. Transferir la suspensión de gusano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto sacar el sobrenadante sin perturbar el pellet y repetir el lavado paso con 1 mL de SAFT tres veces. Quitar todo flotante pero 100 μl.
    4. Añadir 600 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano y el rock a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    5. Centrifugue los gusanos en 560 x g durante 30 s y quite todo flotante pero 100 μl sin perturbar el pellet de gusano.
      Nota: Use mayores volúmenes de SAFT para lavar gusanos de placas si la coloración de alto rendimiento. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Hacer lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.
  4. Lípidos tinción con ORO
    1. Añadir solución de trabajo de ORO de 600 μl de cada muestra. Invertir el tubo tres veces y mezclar los gusanos bien en ORO.
    2. Rotar las muestras a 30 rpm por 2 h a temperatura ambiente.
    3. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo flotante pero 100 μl.
    4. Resuspender las muestras en 600 μl de Saft y gire los tubos a 30 rpm por 30 min eliminar exceso mancha ORO.
    5. Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo pero 50 μl del sobrenadante.
    6. Para distinguir mejor la ubicación de la línea germinal y células intestinales del animal, la mancha núcleos mediante la adición de 1 μl de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) para cada 1 mL de solución de trabajo de ORO. Realizar coloración de ORO por 2 h con la adición de DAPI antes del montaje de diapositivas para la proyección de imagen. Núcleos intestinales son más grandes en tamaño y la gónada se distingue por las células germinales en desarrollo.
      Nota: Después de la coloración de ORO, gusanos pueden adherirse a los lados del tubo de microcentrífuga y no formar un pellet sensible. Si esto sucede, centrifugar los gusanos otra vez o permitir gusanos a asentarse por gravedad durante al menos 10 minutos.
  5. Preparación de las diapositivas para la proyección de imagen del gusano
    1. Suspender los gusanos en el sobrenadante restante y mezcle bien la solución.
    2. Poner 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos cuidadosamente, asegurando que ningunas burbujas de aire forma.
    3. El cubreobjetos con esmalte de uñas y gusanos de la imagen del sello.
      Nota: Después de la fijación y tinción, gusanos pueden ser muy rígido y difícil de pipetear. Para evitar esto, asegúrese de pipetas ancha cortando sus consejos.
    4. Almacenar las diapositivas en un rack de microcentrífuga a 4 ° C hasta 24 horas si no de imágenes inmediatamente después de la tinción.
  6. Proyección de imagen de gusanos teñidos de ORO
    1. Utilice una cámara compatible con color a los gusanos de ORO manchado de imagen.
    2. Utilice 5 aumentos para varios gusanos en un campo de visión de la imagen.
    3. Cambiar a 10 aumentos para mejor examen de los gusanos.
    4. Exportar imágenes en formato TIF para evitar pérdida de datos debido a la compresión.
      Nota: Si la coloración con ORO + DAPI, cambiar la cámara color a uno que puede captar la fluorescencia.
  7. Análisis de imagen de gusanos teñidos de ORO
    1. Cargar micrograph(s) en ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.
    2. En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.
    3. Ajustar brillo y contraste en el mismo menú desplegable para mejorar la visibilidad de las gotitas de lípidos.
    4. Clasificar las imágenes según la acumulación de lípidos en el cuerpo del animal o en tejidos específicos.
    5. Para la mejor evaluación de la localización de los lípidos y para la identificación de los artefactos de imagen inespecífica con ImageJ, seleccionar la función de Color en el menú desplegable de imagen y haga clic en pila de RGB para mostrar las señales de cada componente RGB.

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Representative Results

SKN-1 es un bZip, factor de transcripción de cytoprotective que comparte homología con NRF2 mamíferos y se ha demostrado para mediar la oxidación de los ácidos grasos. Dependiendo de la concentración de glucosa en su dieta, gusanos con un alelo activado constitutivamente skn-1 muestran los niveles de lípidos diferentes cuando manchados con rojo Nilo7. Figura 1A -C muestra activado skn-1 animales expuestos a condiciones que conducen al aumento de los niveles de lípidos. Fluorescencia de NR con un canal FITC/GFP es prominente a lo largo del intestino, pero es atenuador en la cabeza, la cola y el lumen intestinal. Como aumentan los niveles de lípidos, partículas discretas de NR-manchadas son más difíciles de discernir, que puede requerir menores tiempos de exposición. Aunque este método utiliza la intensidad de la fluorescencia como proxy cuantitativo para la acumulación de lípidos, es inadecuada en distinguir la coloración inespecífica de estructuras celulares que no son reservas de grasa y es propensa a interferencias de auto intestinal de señales fluorescencia. Por lo tanto, métodos no contiene la etiqueta y etiqueta alternativa deben utilizar en paralelo para cuantificar inequívocamente lípidos neutros en el animal10.

Edad-dependiente somáticos agotamiento de grasa (Asdf), es un fenotipo que se produce en de worms por el que los animales mostrar disminución de lípidos de células somáticas, mientras que los lípidos de la célula de germen permanecen sin cambios6. Aceite rojo O manchas no es un método que cuantifica los niveles de lípidos, de forma fiable pero es excelente para visualizar la localización de lípidos y es útil para determinar fenotipos de agotamiento de la grasa como Asdf en el gusano. Mientras que es fácil de categorizar los gusanos según la presencia o ausencia de Asdf, puede ser difícil de identificar a los animales con pérdida de grasa intermedia (figura 2A). Comparado con animales no Asdf, que muestran manchas por todo el cuerpo con pocas áreas translúcidas (figura 2B) color rojo brillante, Asdf gusanos exhiben agotamiento sensible grasa en las células intestinales (figura 2). Animales en el desarrollo de Asdf (Figura 2D) a menudo muestran manchas translúcidas donde finalmente se produce más pérdida de grasa. Por otra parte, Asdf gusanos todavía pueden presentar coloración rojo brillante en las regiones de cabeza y la cola porque el fenotipo no se define por pérdida de grasa somática completa, pero por el agotamiento de grasa extensa en relación a animales sin edad (no Asdf). El uso de aceite rojo O manchas, así, permite la determinación cualitativa de la localización de los lípidos y la identificación de fenotipos que cambian sustancialmente los depósitos de grasa en el gusano.

Figure 1
Figura 1: tinción de lípidos por Nilo rojo Nilo rojo teñido de activa mutantes skn-1 bajo las condiciones que provocan la acumulación de lípidos mayor (A-C). La ganancia de tensión de skn-1 función (lax188) alberga una substitución del aminoácido de E237K que SKN-1 constitutivamente activa. Gusanos de L4-etapa fueron expuestos a 0, 15 y 30 J/m2 seguida por un período de recuperación de 12 h en placas NGM no sembradas antes NR-la coloración y la proyección de imagen de luz UV. Imágenes mostradas son representativas del fenotipo. Cuantificación de lípidos se realizó como se ha mencionado en la sección 1.7. El fuego es un ImageJ look up table (LUT) utilizado para crear una imagen térmica muestra fluorescencia intensidad diferencias entre imágenes. Combinación muestra imágenes FITC/GFP y DIC combinadas. Cuantificación de la intensidad de la fluorescencia para cada imagen se muestra en la parte inferior del montaje imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: tinción de lípidos por aceite rojo O. Aceite rojo O manchas de activan skn-1 mutantes (lax188) que muestra la presencia o ausencia del fenotipo de Asdf (A-d). A & animales D Mostrar fenotipos intermedios de Asdf. B y C Mostrar la coloración de ORO enfrente. Mientras que B es no Asdf, C muestra agotamiento grasa somático importante con aumento concomitante en la acumulación de grasa del germline, que define el fenotipo de Asdf. Los gusanos fueron manchados con ORO seguido por proyección de imagen 144 animales sincronizados L1 hafter fueron colocados en medios NGM sembrados con bacterias OP50. Imágenes mostradas son representativas de animales con o sin el fenotipo de Asdf. Dibujos animados de la ilustración se modifican de Lynn, et al. 6 y representan el (B) la ausencia o presencia (C) de agotamiento somático de grasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El aumento de la obesidad y las tasas de enfermedad metabólica hace que C. elegans un modelo adecuado para estudiar los mecanismos que regulan la acumulación de grasa en las células y tejidos. La evidencia reciente sugiere que los cambios en los niveles de lípidos están correlacionados con los procesos celulares que van desde8, la activación de la hormona receptores2, salida reproductiva5de señalización de la insulina. En comparación con microscopia etiqueta-libre y los métodos de cromatografía, Nilo rojo y aceite rojo O son relativamente baratos colorantes utilizados para teñir lípidos neutros en el gusano consistente y reproducible10,12,13. La primera permite la cuantificación de los niveles de lípidos totales, mientras que el segundo facilita la evaluación de la distribución de lípidos entre los tejidos como la hipodermis, el intestino y la línea germinal. Cuando se utiliza conjuntamente, NR y ORO permiten a los investigadores a determinar cómo genotipo y cambios ambientales afectan la acumulación de lípidos y donde en el gusano se producen estos cambios.

Estos tintes, sin embargo, no directamente evaluar acumulación del lípido de la misma manera no invasiva como coches microscopia12. Por lo tanto, son propensos a errores durante la fijación y coloración, que puede comprometer la exactitud de medición13. Además, estos tintes sin darse cuenta pueden interactuar con la lipofuscina y gránulos intestinales, resultando en fluorescencia sin relación a la grasa neutra intracelular almacena10,14. Además, en los casos donde los niveles de lípidos aparecen bajos, NR y ORO la coloración no puede distinguir si el resultado resulta de problemas de permeabilidad o reduce la acumulación de grasa. Por otra parte, la sensibilidad de estas manchas a la luz requiere medidas especiales durante el almacenamiento y la manipulación activa ese límite la degradación y la foto de blanqueo. Sin embargo, si es con cautela al realizar y sacar conclusiones de análisis basada en etiquetas, NR y coloración de ORO es medios excelentes de adelantados pantallas genéticas para estudiar vías de metabolismo de lípido y examinar sus interacciones con otros fisiológicos funciones. Se recomienda el uso de daf-2 y 6 de grasa para hacer comparaciones relativas de la acumulación de lípidos aumento y disminución, respectivamente. El lavado y fijación pasos para NR y ORO tinción son similares. Por lo tanto, ambos pueden realizarse el mismo día. Sin embargo, sólo las diapositivas con los gusanos de ORO manchado pueden guardarse para la proyección de imagen más tarde porque NR tinción es inconsistente después de 6 h. Durante el lavado, es fundamental incluir Triton X 100 no sólo para mejorar la permeabilidad NR y ORO, sino también para evitar la pérdida de gusano debido a la excesiva adherencia al plástico. Además, los gusanos deben lavarse menos de 30 minutos antes de la tinción para asegurar la máxima permeabilidad para cada mancha. Mientras que tiempos de incubación de NR y el ORO pueden ser reducidos a 1 h y 30 min, respectivamente, se animan a seguir el tiempo sugerido en este artículo para tinción y resultados de la proyección de imagen más consistente. Exposición prolongada de solución NR a la luz y falta de filtro solución ORO antes de uso aumentará durante proyección de imagen de la fluorescencia de fondo. Llevar a cabo estos protocolos de tinción requiere 3-4 h además de proyección de imagen del tiempo. Aunque mancha de incubación ofrece a más de 2 h de pausa entre pasos, se recomienda que los protocolos se llevan a cabo con interrupciones como pocos como sea posible para reducir las muchas fuentes de error inherente a todos los métodos de cuantificación de lípidos teñir-basada y examen.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de interés.

Acknowledgments

Este trabajo fue posible por la concesión de NIH: R01GM109028 (criador)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

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References

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