Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Immunology and Infection
 

Summary

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

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Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

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Abstract

Rigidez da matriz extracelular é composto por um dos vários estímulos mecânicos ambientais que são bem conhecidos para influenciar o comportamento celular, função e destino em geral. Embora respostas dos cada vez mais tipos de células aderentes à rigidez da matriz foram caracterizadas, como aderente a susceptibilidade das células à infecção bacteriana depende da rigidez da matriz é desconhecida, como é o efeito de infecção bacteriana sobre o biomecânica das células do hospedeiro. Nós hypothesize que a susceptibilidade das células endoteliais do hospedeiro a uma infecção bacteriana depende da rigidez da matriz em que estas células residem, e que a infecção do hospedeiro células com bactérias mudará sua biomecânica. Para testar estas duas hipóteses, células endoteliais foram usadas como modelo hosts e Listeria monocytogenes como um patógeno de modelo. Através do desenvolvimento de um ensaio de romance formato multi bem, mostramos que o efeito da rigidez da matriz na infecção de células endoteliais por L. monocytogenes pode ser avaliado quantitativamente através de citometria de fluxo e imunocoloração seguido por microscopia. Além disso, utilizando microscopia de força de tração, o efeito da infecção por L. monocytogenes em biomecânica endothelial da pilha de anfitrião pode ser estudado. O método proposto permite a análise do efeito da mecânica de tecido-relevantes na infecção bacteriana das células aderentes, que é um passo crítico para a compreensão das interações biomecânicas entre células, sua matriz extracelular, e bactérias patogênicas. Este método também é aplicável a uma grande variedade de outros tipos de estudos sobre a biomecânica do celular e resposta à rigidez do substrato onde é importante ser capaz de realizar muitas repetições em paralelo em cada experimento.

Introduction

Células em tecidos mais animais são tipicamente aderentes, anexar às células vizinhas e a sua matriz extracelular (ECM). A ancoragem das células para o ECM é essencial para muitos processos celulares, variando de motilidade de célula para célula de proliferação e sobrevivência1,2. Celular ancoragem para o ECM depende da composição de ECM e a rigidez. As células respondem às mudanças no último, dinamicamente, re-organizando seu citoesqueleto, aderências célula-ECM e célula-célula, que por sua vez criticamente alteram a célula biomecânica e funções3,4,5,6 . Rigidez de ECM pode variar no espaço (ou seja, local anatómico), tempo (ou seja, envelhecimento), em processos fisiopatológicos (por exemplo, arteriosclerose, câncer, infecções, etc.). Por exemplo, é amplamente aceito que endoteliais células que residem na mais rígida-em comparação com o mais suave-matrizes exercer forças aumentada para seu ECM e uns aos outros e apresentam aumento da mobilidade e proliferação de7,8. Da mesma forma, fibroblastos que residem em matrizes mais aguerridas dar altas forças contráteis para seu ECM e mostram maior proliferação, motilidade e produção de ECM a9,10,11. Embora a célula mecânica e resposta à rigidez do ECM têm sido estudados extensivamente por vários tipos de células, a relação entre células aderentes, a rigidez de seus ECM e infecções bacterianas ainda é desconhecida.

Para estudar o papel da rigidez de ECM em interações de células de bactérias-host, L. monocytogenes (Lm) foi escolhido como o patógeno de modelo. LM é uma bactéria de origem alimentar onipresente que pode causar infecção sistêmica em uma ampla variedade de hospedeiros mamíferos. Este patógeno intracelular facultativo pode mover do epitélio intestinal para órgãos distantes, atravessando diferentes tipos de endothelia vascular. Se rompe a barreira sangue - cérebro, Lm pode causar meningite, e quando atravessa a placenta, pode causar aborto espontâneo12,13. LM pode infectar tipos de células de host diferente e pode fazê-lo por meio de estratégias distintas de patogenicidade. Infecção de LM tem sido estudada principalmente no contexto de células epiteliais, enquanto muito menos se sabe sobre como a Lm pode infectar e desvio células endoteliais que revestem o lúmen dos vasos sanguíneos14,15,16. Além disso, ainda é desconhecida como a rigidez do ECM onde residem as células endoteliais modula a capacidade do Lm para invadir estas células hospedeiras e depois se espalhou. LM e várias espécies bacterianas adicionais (ou seja, Rickettsia parkeri) aproveitar o citoesqueleto de actina do host células que infectam a ambos invadem em seu citoplasma e facilitam a difusão de célula para célula17 , 18 , 19. eles realizam isso através da expressão de proteínas que possam interferir com vias de polimerização de actina de acolhimento e para produzir as caudas dos cometas actina que facilitam a sua propulsão para a frente de16,20. Como resultado de infecção, o citoesqueleto de actina da célula hospedeira precisa reorganizar dinamicamente de forma ainda não totalmente caracterizada, potencialmente afetando a biomecânica de células hospedeiras incluindo as forças físicas exercem no seu ECM e em cada outros. Para examinar esses processos, células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1) foram escolhidas como células hospedeiras de modelo por três razões: 1. células endoteliais são conhecidas por serem altamente mechanosensitive como eles estão constantemente expostos a diferentes pistas físicas21; 2. as estratégias que LM emprega para infectar as células endoteliais ainda são em grande parte desconhecido22; e 3. HMEC-1 são uma linhagem celular imortalizado e pode, portanto, ser facilmente cultivadas e submetido a manipulação genética.

Infecção bacteriana das células do hospedeiro principalmente tem sido estudada em vitro por semeadura de células no vidro ou poliestireno substratos que são significativamente mais duros que o ECM fisiológica da maioria das células12,14,23. Para examinar a infecção de células semeado em uma matriz cuja rigidez é fisiologicamente relevante e elucidar o papel da rigidez de ECM na infecção de células por patógenos bacterianos, seguimos uma abordagem inovadora, baseada na fabricação de fina hidrogel de poliacrilamida Microconta embutida de rigidez sintonizável em placas multi bem. A novidade da abordagem proposta reside em que permite monitorar condições múltiplas simultaneamente devido ao seu formato multi bem e em que é compatível com várias técnicas devido à forma particular como os substratos são construídos. HMEC-1 células foram semeadas sobre estes hidrogel de proteína-revestido e então infectadas com diferentes cepas de Lm que tornam-se fluorescentes em cima de internalização ou são constitutivamente fluorescente. O papel da rigidez de ECM na susceptibilidade de infecção HMEC-1 das células do hospedeiro foi avaliado por citometria de fluxo. Além disso, microscopia imunocoloração e fluorescência foram usados para diferenciar entre bactérias aderindo e interiorizadas. Finalmente, microscopia de força de tração (TFM) realizou com êxito para caracterizar o efeito da infecção Lm sobre as tensões de tração que as células endoteliais do hospedeiro exercem sobre suas matrizes durante a infecção. O ensaio apresentado pode ser facilmente modificado para habilitar mais estudos sobre o efeito da rigidez do ECM na susceptibilidade de infecção das células aderentes, usando linhas celulares diferentes ou patógenos.

Protocol

1. fabricação de hidrogel de poliacrilamida de duas camadas finas (PA) em placas multi bem

  1. Persulfato de amónio (APS), dissolva em água destilada água ultrapura para atingir uma concentração final de 10 g/mL. Alíquota e armazenar a solução a 4 ° C para uso a curto prazo (3 semanas).
    Nota: A solução acima pode ser preparada com antecedência fabricação de hidrogel.
  2. Ativação de vidro de pratos 24-poço
    1. Incube 24-bem vidro placas de fundo com 13 poços de mm de diâmetro (ver Tabela de materiais) para 1 h com 500 µ l de 2 M NaOH por bem à temperatura ambiente.
    2. Lavar os poços 1 x com água ultrapura e adicione 500 µ l de triethoxysilane de 2% (3-aminopropil) (ver Tabela de materiais) em etanol a 95% para cada um bem por 5 min.
    3. Lavar os poços 1 x novamente com água e adicionar 500 µ l de 0,5% de glutaraldeído a cada poço para 30 min. enxágue os poços 1 x com água e secá-los no 60 ˚ c com a tampa.

Figure 1
Figura 1 : Ensaio de infecção bacteriana das células do hospedeiro que residem em hidrogel fina duas camadas fluorescentes incorporado no grânulo poliacrilamida (PA) de rigidez diferentes. R. as lamelas de vidro são quimicamente modificadas para permitir a fixação de hidrogel. B. 3.6 µ l de misturas de PA são depositados no fundo do vidro. C. A mistura é coberta com uma lamela de vidro circular de 12 mm para permitir a polimerização. D. A lamela é removida com uma seringa de agulha. E. 2.4 µ l de uma solução de PA com microbeads é adicionado no topo da camada inferior e tampado com uma lamela de vidro circular. F. um buffer é adicionado no poço e a lamela é removida. G. irradiação UV para 1h garante a esterilização. H. uma solução contendo Sulfo-SANPAH é adicionada nos géis, que são então colocados sob UV para 10 min. e eu. O hidrogel é lavado com um buffer e então incubado durante a noite com colágeno I. J. O hidrogel é incubado com mídia de célula. K. as células hospedeiras são semeadas. L. Bactérias de LM são adicionadas à solução, e a infecção é sincronizada via centrifugação. M. bactérias de pós-infecção 1h na solução são lavadas e mídia suplementada com antibiótico é adicionada. N. A pós-infecção 4h, Lm (JAT985) começa fluoresce. O. HMEC-1 células estão separadas da sua matriz e as soluções são transferidas para tubos para realizar medições de citometria de fluxo. Note-se que dias e tempos aproximados para cada etapa do ensaio também são indicados. Esta figura foi modificada de Bastounis e Mais_que_lindo59Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Fabricação de hidrogel de poliacrilamida
    Nota: Ver Figura 1.
    1. Preparar soluções aquosas que contêm 3-10% de solução de acrilamida estoque de 40% (ver Tabela de materiais) e 0,06 - bis-acrilamida solução de reserva de 0,6% de 2% (ver Tabela de materiais) para a fabricação de hidrogel de rigidez sintonizável variando de 0,6 kPa para 70 kPa. Consulte a tabela 1.
      1. Para 0,6 kPa hidrogel, mistura de 3% do acrilamido com 0,045% bis-acrilamida. Para 3 kPa hidrogel, misture 5% do acrilamido com 0.074% bis-acrilamida. Para 10 kPa hidrogel, misture 10% do acrilamido com 0,075% bis-acrilamida. Para 20 kPa hidrogel, mistura do acrilamido 8% com 0,195% bis-acrilamida. Para 70 kPa hidrogel, misture 10% do acrilamido com 0,45% bis-acrilamida.
        Nota: Mais detalhes em alcançar a rigidez de hidrogel desejável PA podem ser encontrados em outro lugar24,25,26,27.
    2. Prepare duas soluções aquosas para cada rigidez desejável hidrogel. Preparar a solução 1 para ser livre do grânulo e a solução 2 para conter 0,03% 0,1 µm de diâmetro fluorescente microgrânulos (ver Tabela de materiais).
    3. Degas soluções 1 e 2 por vácuo durante 15 minutos para eliminar o oxigênio que é conhecido por inibir a polimerização das soluções.
    4. Adicione 0,6% do estoque de 10 g/mL solução APS e 0,43% tempted (TEMED) a solução 1 para permitir uma iniciação de polimerização. Agir rápido.
    5. Adicionar 3,6 µ l de solução 1 ao centro de cada poço do prato 24-poço (consulte a etapa 1.2 para sua preparação).
    6. Imediatamente cobrir os poços com lamelas de circulares não tratadas-12mm e deixe a solução 1 descansar por 20 min para que isso plenamente se polimeriza.
    7. Bata levemente uma agulha de seringa para uma superfície para criar um pequeno gancho na sua ponta para facilitar a remoção das lamelas. Levante as lamelas utilizando a agulha da seringa.
    8. Adicionar 0,6% da 10 g/mL de solução APS e 0,43% TEMED a solução 2. Depósito de 2,4 µ l da mistura em cima da primeira camada em cada poço do prato 24-bem.
    9. Cobrir 2 solução com lamelas de vidro circular-12mm, suavemente, pressionando para baixo, usando um par de pinças para garantir a espessura da segunda camada é mínimo. Deixe a solução 2 polimerizar por 20 min.
    10. Adicionar 500 µ l de pH HEPES 50mm 7.5 para cada um dos poços e remova as lamelas de vidro com a agulha da seringa e fórceps.
  2. Esterilização, colágeno-revestimento e equilibrio de hidrogel de poliacrilamida
    1. UV-expor o hidrogel para 1h de cultura de tecidos capuz para permitir a esterilização.
    2. Prepare uma mistura de 0.5% peso/volume sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, consulte Tabela de materiais) em 1% DMSO e 50 mM pH HEPES = 7,5.
    3. Adicione 200 µ l desta solução à superfície superior do hidrogel. Agindo rápido, expô-los aos raios UV (302 nm) por 10 min para ativá-los.
    4. Lave o hidrogel duas vezes com 1 mL de pH HEPES 50 mM = 7,5. Repetir se necessário para garantir que qualquer agente reticulante em excesso é removido.
    5. O hidrogel com 200 µ l de rato de 0,25 mg/mL de proteína-casaco cauda colágeno eu (ver Tabela de materiais) em 50 milímetros de HEPES. Incube o hidrogel, com a solução de colágeno no topo, durante a noite em temperatura ambiente.
      Nota: Para evitar a desidratação/evaporação, coloque as placas multi bem em uma contenção secundária e adicionar laboratório limpeza tecidos embebidas em água na periferia interna de contenção.
    6. Use um epifluorescência ou microscópio confocal com um objetivo X 40 para medir a espessura do hidrogel. Fazê-lo localizando as posições de z do fundo (onde a superfície de vidro é) e top aviões do hidrogel (onde a intensidade dos grânulos a fluorescente é máxima). Em seguida, subtrai as posições de z para determinar a altura.
      Nota: Usamos um microscópio de epifluorescência invertido e um objectivo X 40 com abertura numérica 0,65 para medir a espessura do hidrogel. Medições de microscopia de força atômicas (AFM) também podem ser realizadas neste momento, para confirmar a rigidez exata do hidrogel (ver Figura 2).
    7. Antes da semeadura das células de interesse sobre o hidrogel, adicionar 1 mL de mídia sobre o hidrogel e incube-os a 37 ˚ c por 30 min a 1 h para garantir o equilíbrio.
      Nota: Nós adicionamos MCDB-131 mídia completa porque isso é a mídia onde as células hospedeiras de modelo (HMEC-1) foram cultivadas em (consulte etapa 2.1 para obter detalhes).

Figure 2
Figura 2: medições de AFM de rigidez de hidrogel PA e distribuição dos grânulos. A. dados mostram o esperado módulo de Young (medida de rigidez) da PA, hidrogel, dada a quantidade de acrilamida e bis-acrilamida usado contra o módulo de Young medido através do AFM (N = 5-6). As barras horizontais retratam a média. A rigidez da 0,6 kPa hidrogel não poderia ser medida porque o hidrogel eram muito macios e aderidas à ponta AFM. B. esta é uma imagem da fase de confluentes HMEC-1 e a correspondente imagem dos grânulos incorporado na superfície superior de um hidrogel suave 3 kPa-PA. O HMEC-1 foram semeadas por 24 h a uma concentração de 4 x 105 células por poço. C. esta imagem é o mesmo como Figura 2B , mas para as células que residem em um hidrogel de PA dura 70-kPa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. cultura de células endoteliais Microvascular humana e propagação em hidrogel

  1. Cultura HMEC-1 (humanos, microvascular endotelial) células MCDB-131 cheio de mídia contendo mídia MCDB-131 suplementada com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 1 µ g/mL de hidrocortisona e 2mm da L-glutamina (ver tabela de materiais de ).
  2. Dividir as culturas confluentes 6:1 a cada 3-4 dias e manter as células até a passagem 40.
  3. Um dia antes do experimento, separe as células da sua nave de cultura usando 0,25% tripsina/EDTA. Primeiro lave as células e a sua embarcação de cultura 1 x com fosfato estéril tampão salino (PBS) e em seguida, adicionar a quantidade apropriada de 0,25% tripsina/EDTA (2 mL por 100-mm prato ou 75cm balão, 1ml por prato 60mm ou balão de 25 cm), incubando o balão a 37 ° C por 5-10 min para permitir o desprendimento das células da sua carcaça.
  4. Neutralize a tripsina adicionando o volume desejado de meios cheios de MCDB-131, pipeta suavemente para separar os aglomerados de células e em seguida, coloque a solução em um tubo de centrifuga conico.
  5. Suavemente agitar a solução de células para garantir que as células são distribuídas uniformemente e retire 20 µ l da solução e muito suavemente, preencher as duas câmaras debaixo da lamela de um hemocytometer de vidro.
  6. Para a solução de células contidas no tubo de centrifuga conico usando centrifugação por 10min a 500 x g de Pelotas.
  7. Durante o período de espera de 10 minutos, conte as células usando um hemocytometer. Usar um microscópio, focalizar as linhas de grade do hemocytometer com um objetivo X 10 e então usar um contador de contagem de mão para contar o número de células em um 1 x 1 mm quadrado.
  8. Mover a hemocytometer para outro quadrado de 1 x 1 mm, contar as células de lá e repita o processo mais duas vezes. Calcular a média das quatro medições e então multiplicar a média por 104. O valor final é o número de células viável/mL na suspensão de célula que está sendo centrifugada.
  9. Retire o líquido do tubo de centrifuga conico, garantindo que o centrifugado não é interrompido. Ressuspender as células na mídia MCDB-131 completa em uma concentração de 4 x 105 células/mL.
  10. As células em suspensão sobre o hidrogel primeiro removendo os meios com os quais o hidrogel foram incubadas e em seguida, adicionar 1 mL de suspensão de células em cada hidrogel de semente.

3. infecção das células endoteliais Microvascular humanas com L. monocytogenes

  1. Preparação antecipada
    Nota: Prepare as seguintes soluções antecipadamente.
    1. Estoques de estreptomicina, cloranfenicol e gentamicina
      1. Prepare 50 mg/mL de estreptomicina soluções estoque pesando 0,5 g de sulfato de estreptomicina e dissolvendo-a completamente em 10 mL de água ultrapura.
      2. Prepare a 7,5 mg/mL de cloranfenicol Soluções conservadas em estoque, pesando 75 mg de cloranfenicol e dissolvendo-a completamente em 10 mL de etanol a 100%.
      3. Prepare-se 20 mg/mL de gentamicina soluções estoque por peso 0,2 g de sulfato de gentamicina e dissolvendo-a completamente em 10 mL de água ultrapura.
      4. Filtro-esterilizar todas as soluções com um filtro de seringa 0,2 µm e armazená-los em-20 ° C para uso a longo prazo (1-2 meses).
    2. Cérebro coração (BHI) de infusão mídia e ágar placas
      1. Localize dois frascos de 1 L e adicionar uma barra de agitação magnética dentro de cada balão.
      2. Para a mídia BHI, adicionar 37 g de pó BHI em um frasco e adicione água ultrapura até 1 L. Mix a solução vigorosamente colocando o balão em uma placa de agitação magnética até que o pó é dissolvido.
      3. Para as placas de ágar BHI, adicionar 37 g de pó BHI e 15 g de ágar granulado (ver Tabela de materiais) no segundo frasco e adicione água ultrapura até 1 L. mistura a solução vigorosamente, colocando o frasco em uma placa de agitação magnética até que o pó é dissolvido.
      4. Dane-se as tampas dos frascos não demasiado firmemente e autoclave as soluções usando o líquido de configuração ou de acordo com as especificações do autoclave.
      5. Remover a solução da autoclave, em seguida, esfriar a solução de agar-BHI a 55 ° C. Se a mídia BHI no recipiente de 1 L é mantida estéril, ele pode ser usado por até um mês.
      6. Para preparar as bactérias placas de agar-BHI, primeiro adicione antibióticos, se for caso disso, para o frasco contendo BHI e agar (dependendo as cepas bacterianas para ser cultivada). Brevemente, colocar o balão em uma placa de agitação magnética para permitir a mistura rápida.
        Nota: Os antibióticos usados aqui são específicos para as cepas de Lm usadas, mas qualquer antibiótico necessário pode ser usado em placas de agar-BHI. Nós adicionamos estreptomicina a uma concentração de 200 µ g/mL e cloranfenicol a uma concentração de 7,5 µ g/mL, porque 10403S Lm cepas são resistentes a estreptomicina. Estas cepas foram conjugados com um plasmídeo que contém o chloramphenicol acetyltransferase frame de leitura aberto, portanto, a resistência ao cloranfenicol.
      7. Despeje a mistura em bactérias poliestireno 10cm placas de cultura (aproximadamente 20 mL por placa). Para se livrar das bolhas, a superfície superior das placas da flama brevemente. Legais placas durante a noite em temperatura ambiente.
      8. No dia seguinte, selar as chapas secas e armazená-los em 4 ° C.
  2. Infecção de células endoteliais microvasculares humanas com L. monocytogenes
    1. Três dias antes da infecção, raia fora o Lm estirpe para ser usado em um estoque de glicerol (armazenado a-80 ° C) em uma placa de ágar BHI que contém 7,5 µ g/mL de cloranfenicol e 200 µ g/mL de estreptomicina, se for o caso.
      Nota: A tensão a ser listado para fora pode ser um selvagem-tipo ou mutante, expressando constitutivamente fluorescência (para immunostaining que jat1045 foi usado) ou expressar fluorescência sob o promotor ActA (para fluxo cytometry ou tração microscopia de força JAT983 ou JAT985 foram utilizados)22.
    2. Incube as placas a 37 ° C até colônias discretas são formadas (1-2 dias).
    3. O dia antes da infecção, cresce a tensão desejada durante a noite, sacudindo-a 150 rpm a 30 ° C, em mídia BHI com 7,5 µ g/mL de cloranfenicol (se apropriado).
      1. Lugar 5 mL de mídia BHI em um tubo de centrifuga conico de 15 mL, adicionar 7,5 µ g/mL de cloranfenicol (se for o caso) e em seguida inocular uma única colônia da placa de ágar usando um estéril 10 µ l ponta.
    4. No dia seguinte, antes de ser infecção, medir a densidade óptica da solução de bactérias em 600 nm (OD600), diluindo a amostra 1:5; Use uma cubeta contendo BHI sozinho para servir como um espaço em branco.
    5. Diluir a cultura durante a noite para um OD600 de 0.1 e incubar, agitação por 2 h a 30 ° C, em mídia BHI com 7,5 µ g/mL de cloranfenicol (se apropriado) para permitir que as bactérias alcançar crescimento de log-fase.
    6. Medir a OD600 da solução bacteriana, que deverá ser em torno de 0.2 - 0.3. Se o OD600 é mais elevada, diluir a 0,2 - 0,3 com BHI sozinho.
    7. Tome 1 mL de solução bacteriana em um tubo de microcentrifugadora. Girá-lo para baixo por 4 min a 2.000 x g usando centrifugação à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em 1 mL de PBS grau de cultura de tecidos, do bairro de cultura de tecidos. Lave as bactérias mais duas vezes, girando-os para baixo para min 4 a 2.000 x g, à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 1 mL de PBS.
    8. Prepare a mistura de infecção misturando 10 ou 50 µ l da bactéria resuspended em PBS com 1 mL de meios cheios de MCDB-131 para uma multiplicidade de infecção (MOI; ou seja, o número de bactérias por célula hospedeira) de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira.
    9. Remova a mídia dos poços das placas 24-bem, cuidadosos para não perturbar o hidrogel ou as células. Lavar as células 1 x 1ml de MCDB-131 cheio de mídia e em seguida, adicione 1 mL de bactérias a cada poço.
    10. Mantenha alguma mistura de infecção (pelo menos 100 µ l) para a determinação de MOI (ver passo 3.3).
    11. Cubra o prato com a sua tampa e embrulhar as placas com o envoltório de comida de polietileno para evitar fugas. Coloque as placas na centrífuga e girar as amostras durante 10 minutos a 200 g de x para sincronizar a invasão. Mover as placas para a incubadora de cultura de tecidos e incube-os por 30 min a 37 ° C.
    12. Lavar as amostras 4 x com MCDB-131 cheio de mídia e movê-las para a incubadora de cultura de tecidos. Após um adicional 30 min, troque a mídia mídia suplementada com 20 µ g/mL de gentamicina.
  3. Determinação da multiplicidade de infecção (MOI)
    1. Durante a incubação inicial de 30 minutos das células do hospedeiro com as bactérias, prepare-se 10 vezes diluições em série do mix infecção para determinar o MOI. Fazer diluições de 10 vezes misturando-se 100 µ l do mix infecção com 900 ml de 1X PBS (diluição 10-1 ). Em seguida, misture 100 µ l da diluição 10-1 com 900 µ l de PBS (diluição 10-2 ).
    2. Continue até obter uma diluição de 10-5 .
      Nota: Todas as soluções precisam ser misturados antes de dilui-los, e pontas de pipetas fresca devem ser usadas em cada etapa.
    3. Uma vez que são feitas as diluições, coloque 100 µ l da 10-2 - 10-5 diluições no centro das placas BHI/agar/cloranfenicol/estreptomicina (se apropriado).
    4. Tornar um propagador de uma pipeta de vidro usando fogo para dobrar a pipeta para criar um gancho. Mergulhar a pipeta em etanol 100% para a esterilização e em seguida queimar o etanol com uma chama.
    5. Uma vez que o espaçador tenha arrefecido, espalhe as diluições bacterianas homogeneamente nas chapas a partir da diluição de 10-5 e movendo-se para as misturas mais concentradas. Incube as placas de cabeça para baixo a 37 ° C durante 2 dias.
    6. Dependendo da densidade da colônia, determine o número de colônias da 10-3 e 10-4 ou o 10-4 e 10-5 placas de diluição. Calcule o MOI como segue:
      número de colónias × factor ÷ volume diluição inicial adicionado = número de UFC por µ l
      número de UFC por volume de × µ l do mix de bactérias por alvéolo = número de UFC por bem
      número de UFC por bem × volume das células por poço = número de bactérias por célula
      Nota: UFC defende formadoras unidades.
    7. Média os MOIs de duas placas, para obter os finais MOIs.

4. fluxo Cytometry quantificar extracelular-matriz-rigidez susceptibilidade dependente das células do hospedeiro à infecção

  1. Pesar 5 mg de colagenase e colocá-lo em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Adicionar 10 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e misturá-los bem.
  2. pós-infecção 8 h, remova a mídia dos poços da placa de 24 poços e lavar os poços 1 x com PBS de cultura de tecidos. Remover a PBS dos poços e adicione 200 µ l da mistura do trypsin-EDTA/colagenase a cada poço. Coloque isto na incubadora durante 10 minutos permitir o completo desapego das células de cultura de tecidos.
  3. Use uma pipeta fresca para cada poço e pipetar a mistura acima e abaixo de 8 x. Cuidado para não danificar as células. Adicione 200 µ l de mídia completa a cada poço para neutralizar a tripsina.
  4. Transferir a solução de célula 400 µ l de cada poço em um tubo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de filtro célula 35-µm (ver Tabela de materiais).
  5. Analise 10.000-20.000 células por amostra por citometria de fluxo. Realizar a aquisição de dados através de citometria de fluxo e determinar a porcentagem de células infectadas por bem, usando um software disponível comercialmente relevante. Use o scatter avançar contra o lado de gráficos de dispersão para portão a maior parte da distribuição da contagem de células.
    Nota: Isto assegurará a análise de células únicas e eliminar detritos ou parelhas de célula ou trigêmeos.
    1. Medir o sinal de fluorescência das células de controle-não infectados e portão a população de células infectadas, excluindo autofluorescência.

5. imunocoloração das bactérias extracelulares, microscopia e processamento de imagem

Nota: Esta abordagem é seguida para diferenciar entre adesão bacteriana dependente de ECM-rigidez na superfície da pilha de anfitrião contra internalização bacteriana (Invasão) dentro dos hosts.

Figure 4
Figura 4 : Imunocoloração de Lm-infectados HMEC-1 células residentes em hidrogel de rigidez diferentes, para diferenciar a adesão bacteriana contra invasão. Estas imagens mostram um exemplo representativo de imunocoloração diferencial, mostrando A. o núcleo de células (DAPI), B. todas as bactérias (GFP) e C. as bactérias externas (Alexa-546). As células do HMEC-1 estavam residindo em um hidrogel suave 3-kPa. As setas apontam em bactérias que podem tem sido internalizadas, então são mostrados no canal verde apenas. Dados em D-F referem-se a N = 20 imagens capturadas para as células infectadas do HMEC-1 residindo em 3-kPa macia e dura 70-kPa hidrogel eMostrar D. as bactérias totais por núcleos; E. as bactérias interiorizadas por núcleos; e F. a eficiência de invasão (a relação entre bactérias interiorizadas de bactérias totais). As barras horizontais retratam a média dos dados. O P-valor foi calculado com o teste não-paramétrico de Wilcoxon Rank Sum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. 30 min infecção pós, lave as HMEC-1 células infectadas com JAT1045 (Lm que constitutivamente expressa a proteína verde fluorescente (GFP)) x 4, com a mídia.
  2. Após a quarta lavagem, misture 1 µ l de 1 mg/mL corante Hoechst com 1 mL de mídia completa MCDB-131 e adicioná-lo a cada poço para colorir os núcleos das células. Coloca as células em cultura de tecidos incubadora para 10 min.
  3. Lavar as células 1 x com PBS. Corrigi-los com um fixador não-permeabilizing de imunocoloração diferencial por 20 min em temperatura ambiente28.
    Nota: O fixador contém 0,32 M de sacarose, pH MES de 10mm 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2mm EGTA e 4% de formaldeído (grau de microscopia eletrônica).
  4. Lavar as células 1 x com PBS. Bloquear as amostras por 30 min com 5% de albumina de soro bovino (ver Tabela de materiais) em PBS.
  5. Incubar as amostras para 1 h com um anti-Lmanticorpo primário (ver Tabela de materiais) diluído 1: 100 em PBS contendo 2% de BSA.
  6. Lavar as amostras em PBS 3 x e incube-os então para 1 h com uma AlexaFluor-546 cabra-anticoelho anticorpo secundário (consulte a Tabela de materiais) diluído 1: 250 em PBS contendo 2% de BSA. Lavar as amostras 3 x em PBS. Armazene as amostras em 1 mL de PBS para a imagem latente.
  7. Imagem e analisar mais de 1.000 células por condição.
    1. Para a imagem latente, usar um microscópio de epifluorescência invertido com uma câmera CCD (veja a Tabela de materiais) e uma 40 X objetivo de ar do ar plano fluorita com 0,6 Abertura numérica (NA).
      Nota: O poder é definido como 25% e o tempo de exposição a 100 ms. os filtros de microscópio usados para mCherry são 470/525 nm, nm GFP 530/645 e DAPI 395/460 nm, para excitação e emissão respectivamente. O microscópio que fazíamos era controlado por um de pacote de software de código aberto microscopia29.
    2. Para diferencial imunocoloração, conte todas as bactérias 'verdes' associadas a células individuais como aderente. Contagem de bactérias que são 'verde' e 'vermelho' (devido à ligação de anticorpos) como não-internalizada.
      Nota: Nós identificamos o número de núcleos, executando um script feito sob medido e o software CellC (ver Tabela de materiais) para enumeração de bactérias30.

6. monocamada Stress microscopia e microscopia de força de tração multi-bem

Figure 5
Figura 5: células infectadas Lm HMEC-1 diminuir a magnitude das forças de tração que exercem sobre seu ECM durante a infecção. Painel A mostra a imagem de fase, B mostra o campo de deformação, C mostra o campo de tensões de tração e programas D o campo de tensão intracelular das células não infectadas HMEC-1 que residem em um hidrogel de 20 kPa. As barras de cor da deformação mapas (µm), da tração do stress mapas (Pa) e da tensão intracelular mapas (nNµm-1) são mostrados na parte superior dos mapas de calor. As colunas mostram três pontos representativos de tempo: 3, 8 e 18 h de pós infecção. E-H. Mesmo que os painéis A-D , mas para células infectadas com Lm em um MOI de 300. As imagens das bactérias (canal vermelho) se sobrepõem nas imagens fase das células. Gravações de TFM foram conduzidas por imagem poços múltiplos simultaneamente. O tamanho da janela para PIV foi 32 pixels com uma sobreposição de 16. Barra de escala é 32 µm. Esta figura foi modificada de Bastounis e Mais_que_lindo59. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Preparar o hidrogel de PA em uma placa de 24 (veja passo 1). Sementes HMEC-1 células (consulte a etapa 2) e infectá-los com JAT983 como descrito acima (ver passo 3).
  2. Prepare um meio de viver-microscopia, completando L-15 a Leibovitz com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico e 1 μg/mL hidrocortisona.
    Nota: O L-15 já contém 2 mM L-glutamina, portanto, não é necessário adicionar extra, como no caso da mídia MCDB-131.
  3. pós-infecção de 4 h (quando o JAT983 interiorizado começa fluoresce), misturar 1 μL de 1 mg/mL corante Hoechst com 1 mL de meios cheios de L-15 e adicioná-lo a cada poço para colorir os núcleos das células. Colocar as células em cultura de tecidos incubadora para 10 min, em seguida, substituir em cada poço, a mídia completa L-15 com 1 mL de meios cheios de L-15, suplementados com 20 µ g/mL de gentamicina.
  4. Tampa da placa com a tampa e um lugar na câmara ambiental do microscópio (ver Tabela de materiais) incubada a 37 ˚ c.
    Nota: Para a imagem latente, usar um microscópio de epifluorescência invertido com uma câmera CCD (veja a Tabela de materiais) e uma 40 X objetivo de ar do ar plano fluorita com 0.6 NA.
  5. Adquira imagens de lapso de tempo multi-canal de grânulos fluorescentes e as bactérias fluorescentes e imagens de contraste de fase de células hospedeiras, cada 10min para 4 a 12 h.
    Nota: Para o tratamento de imagens, o poder foi definido como 25% e o tempo de exposição a 100 ms. os filtros de microscópio (excitação/emissão) usados para mCherry e as boas práticas agrícolas são 470/525 nm e 645/530 nm respectivamente.
  6. No final da gravação, adicione 500 µ l de 10% sulfato dodecyl de sódio (SDS) em cada um dos poços de água.
    Nota: As células serão desanexadas do hidrogel e o hidrogel retornará ao seu estado inicial indeformado desde que é elástica.
  7. Criar uma imagem do hidrogel e usá-lo como a imagem de referência indeformadas.
  8. Determine a deformação bidimensional do hidrogel a cada instante de tempo usando o particle image velocimetry (PIV)31, comparando cada imagem da série de lapso de tempo com a imagem de referência do hidrogel indeformada. Usar os tamanhos de janela apropriada e se sobrepõem, dependendo do experimento.
    Nota: Nós usamos o windows de 32 pixels com uma sobreposição de 16 pixels.
  9. Calcule as tensões de tração 2D que células exercem sobre o hidrogel, conforme descrito em outro lugar32,33.
  10. Calcular a tensão de monocamada a partir das tensões de tração conforme descrito anteriormente34 , resolvendo as equações de equilíbrio mecânico para uma placa fina e elástica sujeita as forças de reação criado pelo hidrogel PA sobre a monocamada, que são de um em frente ao sinal para as tensões de tração medido.
    Nota: Consulte o Material complementar 1.

7. microscopia de lapso de tempo quantitativa para avaliar Extracellular-matriz-rigidez dependente de L. monocytogenes divulgação através de células endoteliais

Figure 6
Figura 6: dados de microscopia quantitativa do tempo-lapso de divulgação Lm através de HMEC-1 monocamadas semeado em substratos com rigidez 3-kPa e 70 kPa. R. este painel mostra ainda imagens de dois focos de infecção representativa em 0, 200, 400 e 600 min. O canal de fase retrata monocamadas de células HMEC-1, e o canal vermelho retrata Lm intracelular (consulte a etapa 7 do protocolo). B. este painel mostra a área do casco convexo englobando o foco de infecção plotado como uma função do tempo. A área de foco da condição 3-kPa (vermelho) cresce mais rápido do que o 70-kPa (verde). C. este painel mostra que a distância radial do centro para a borda do foco de infecção plotado como uma função do tempo para representante focos de infecção, crescendo em monocamadas HMEC-1 semeadas em substratos de PA 3-kPa (vermelho) e rigidez de 70-kPa (verde). A velocidade radial (dr/dt) é constante para a condição 3-kPa, mas bifásica para a condição de 70 kPa. D. estes dados mostram a velocidade radial para o primeiro 200 min de dez focos de infecção independente. O vermelho (3-kPa) e verde (70-kPa) pontos de dados retratam as encostas dos dois focos descritos nos painéis anteriores. As barras horizontais retratam a média dos dados. O P-valor foi calculado com o teste não-paramétrico de Wilcoxon Rank Sum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Preparar o hidrogel de PA em uma placa de 24 (consulte a etapa 1), sementes de células HMEC-1 (consulte a etapa 2) e crescer durante a noite JAT983 de culturas, como descrito acima (ver passo 3).
  2. O dia de infecção, prepare a mistura de infecção pela mistura de 10 µ l de pelota bacteriana por mL de mídia completa MCDB-131. Cuidadosamente remova a mídia dos poços das placas de 24 poços e adicionar 1,9 mL da mídia completa MCDB-131 e 0,1 mL da mistura bacteriana a cada poço.
    Nota: O menor MOI utilizado neste ensaio é necessário analisar os eventos de divulgação que começam a partir de uma única bactéria invadindo uma célula hospedeira.
  3. Cubra o prato com a sua tampa e selá-lo com um filme plástico para evitar fugas. Coloque as placas na centrífuga e girar as amostras durante 10 minutos a 200 g de x para sincronizar a invasão.
  4. Mover as placas para a incubadora de cultura de tecidos e incube-os por 5 min.
  5. Lavar as amostras 4 x com mídia e movê-los para a incubadora de cultura de tecidos. Após um adicional 5-7 min, troque a mídia mídia suplementada com 20 µ g/mL de gentamicina.
  6. Incube a placa na incubadora para um acréscimo de 5 h para permitir que o promotor de actA ativar e dirigir a expressão da mTagRFP aberta ler quadro35.
  7. Prepare um meio de viver-microscopia, completando L-15 a Leibovitz com 10% de soro fetal bovino, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico e 1 µ g/mL hidrocortisona.
    Nota: O L-15 já contém 2 mM L-glutamina, portanto, não é necessário adicionar extra, como no caso da mídia MCDB-131.
  8. Misturar 1 μL de 1 mg/mL Hoechst tingir com 1 mL de meios cheios de L-15 e adicioná-lo a cada poço para colorir os núcleos das células. Colocar as células em cultura de tecidos incubadora para 10 min, em seguida, substituir em cada poço, a mídia completa L-15 com 1 mL de meios cheios de L-15, suplementados com 20 µ g/mL de gentamicina. Tampa da placa com a tampa e um lugar na câmara ambiental do microscópio (ver Tabela de materiais) incubada a 37 ˚ c.
    Nota: Para a imagem latente, um microscópio de epifluorescência invertido foi usado com uma câmera CCD (veja a Tabela de materiais) e um 20 X objetivo de ar do ar plano fluorita com 0,75 NA. O poder foi definido para 50% e o tempo de exposição de 50 ms. os filtros de microscópio usados para mCherry são 470/525 nm de excitação e emissão respectivamente.
  9. Imagem de múltiplas posições cada 5 min, usando um recurso de autofoco para monitorar como Lm espalha através do HMEC-1 monocamadas semeadas em variáveis de rigidez hidrogel.
    Nota: L-15 é armazenado em buffer com HEPES, portanto, não é necessário usar CO2 durante a geração de imagens.

Representative Results

Susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à infecção de Lm:
PA hidrogel de rigidez diferentes, todos revestidos na superfície com colágeno eu, foram construídos em placas de vidro multi bem fundo, conforme descrito na etapa 1 do protocolo (ver Figura 1). Foram realizadas medidas de AFM para confirmar a rigidez exata do hidrogel, conforme descrito anteriormente,26,27 (ver Figura 2). Estudos anteriores mostraram que a conformidade local da membrana basal das células endoteliais pode variar de 1 kPa (por exemplo, tecido cerebral) a 70 kPa (por exemplo, aorta)36,37,38, 39 , 40. portanto, optamos por testar a infecção de células HMEC-1 residentes em matrizes com rigidez a seguir: 0.6 kPa, 3-kPa, 20 kPa e 70 kPa. Para cada rigidez de hidrogel, seis hidrogel foram fabricados para avaliar a reprodutibilidade dos resultados.

Citometria de fluxo foi usada para avaliar a susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à infecção Lm (ver Figura 3). HMEC-1 células foram infectadas com uma cepa de Lm (JAT985) que expressa um marcador fluorescente após internalização (actAp::mTagRFP), permitindo a detecção de bactérias intracelulares única (ver figuras 1 L - 1N). JAT985 também carece de ActA, desabilitando as bactérias de se espalhar de uma célula para outra, desde que a ActA é necessário para a formação de caudas dos cometas actina e posterior disseminação bacteriana. 7 - pós-infecção de 8 h, infecção das células HMEC-1 foi avaliada utilizando citometria de fluxo. Para garantir a análise de células únicas, a maior parte da distribuição da contagem de células foi fechada usando o avançado contra a dispersão de lado, e em seguida realizou-se uma segunda etapa associada para excluir as células que exibem autofluorescência (ver Figs. 3A - 3C ). Os resultados preliminares, representados na Figura 3 mostram que a infecção HMEC-1 com Lm é aproximadamente duas vezes maior para o HMEC-1 células que residem sobre a dura 70 kPa hidrogel em comparação com células residentes no macio 0,6 kPa hidrogel (ver figuras 3B - 3D). A maior suscetibilidade de infecção Lm do HMEC-1 células que residem na rígida em comparação com as matrizes macias pode ser devido a: 1. aumento da aderência de Lm para HMEC-1; 2. maior invasão Lm HMEC-1; ou 3. ambos o co ocorrendo acima. Para testar quais hipótese porões, células HMEC-1 foram semeadas na suave (3 kPa) e dura hidrogel (70 kPa) e infectadas com constitutivamente GFP expressando Lm (ver figuras 4A - 4C). As amostras foram fixadas logo após a infecção e as bactérias externas (aderente) foram coradas com anticorpos. Usando microscopia quantitativa, achamos que são significativamente mais bactérias aderindo ao HMEC-1, quando as células hospedeiras residem na rígida em comparação com os geles macios (ver Figura 4D). Consistentes com os dados de citometria de fluxo, são significativamente mais bactérias internalizadas pelo HMEC-1, quando as células hospedeiras residem na rígida em comparação com os geles macios (ver Figura 4E). No entanto, a eficiência de invasão (bactérias internalizadas/número total de bactérias) de Lm em células HMEC-1 é semelhante, independentemente da rigidez de substrato (ver Figura 4F).

Microscopia de força de tração de células infectadas Lm HMEC-1:
Infecção de LM de células HMEC-1 poderia alterar a biomecânica de células hospedeiras infectadas, incluindo a força de fixação para seu ECM ou para o outro, afetando sua integridade da barreira. Procuramos avaliar se isso poderia ser o caso, por meio de microscopia de força de tração32 para calcular as forças de tração de célula-ECM e monocamada Stress microscopia41 para calcular as forças tensionais intracelulares. A Figura 5 mostra mapas do campo de deformação, campo de tensões de tração e campo de tensão intracelular do HMEC-1 células residentes em hidrogel de 20 kPa no tempo diferente pontos pós infecção. Figuras 5A - 5D referem-se às células não infectadas controle HMEC-1 enquanto figuras 5E - 5h referir HMEC-1 células infectadas com Lm em uma multiplicidade de infecção igual a 300 bactérias/célula. Este trabalho preliminar sugere que células infectadas do HMEC-1 reduzem a magnitude de sua célula-ECM e salienta intracelular no decurso de uma infecção com Lm, Considerando que não é observada por células controle não infectados.

Divulgação Lm rigidez dependente ECM, em monocamadas HMEC-1:
Microscopia de lapso de tempo foi usada para investigar o efeito de rigidez da matriz tem na divulgação de Lm através de monocamadas HMEC-1. Como Lm se espalha através da monocamada, as bactérias criam um foco de infecção que cresce em função do tempo (ver Figura 6A e vídeo figuras 1 e 2). A área de foco da infecção foi medida pelo desenho de uma superfície convexa, o menor polígono convexo que engloba um conjunto de pontos, em torno das bactérias42. Não há nenhum padrão métrico no campo para medir a eficiência da L. monocytogenes propagação de célula para célula através de uma monocamada de células hospedeiras. Para avaliar a eficiência de propagação, alguns têm contado o número de células hospedeiras em um foco de infecção41, e outros têm limites desenhados manualmente em torno do grupo de células de hospedeiro infecção43. Nós escolhemos desenhar um polígono convexo ao redor as bactérias, porque é um processo automatizado, consistente e computacionalmente barato para medir a eficiência da propagação de L. monocytogenes . Ao fazer isso, encontramos um ligeiro decréscimo na área de foco de infecção nas células HMEC-1 semeadas em 70 kPa hidrogel quando comparados àqueles semeado em 3 matrizes de kPa (ver Figura 6B e a figuras 1 e 2). Para determinar a taxa de crescimento do foco de infecção, a distância radial foi plotada como uma função do tempo tomando a raiz quadrada da área do foco da infecção e dividindo isso por pi. Essa transformação matemática pressupõe que a forma do foco de infecção é aproximadamente circular44. Para medir a velocidade do crescimento do foco, foi medida a taxa de variação (ou seja, a inclinação) da distância radial para ambas as matrizes 3 e 70 kPa. Esta abordagem elucidado que o foco de infecção cresceu mais rapidamente e monotônico nas células HMEC-1 semeadas em matrizes 3-kPa. No entanto, o foco cresceu significativamente mais lento (min 200 primeiro) e um pouco mais lento (200 a 600 min) nas células semeadas em matrizes de 70 kPa (consulte a Figura 6C). Com efeito, a análise de dados mais confirmado que o foco de infecção cresceu, em média, duas vezes mais lento nas matrizes de 70 kPa, especialmente durante o primeiro 200 min (ver Figura 6D).

Figure 3
Figura 3 : Susceptibilidade de rigidez dependente de ECM do HMEC-1 células à invasão de Lm medido usando citometria de fluxo .  HMEC-1 células foram infectadas com Lm (JAT985) e a infecção foi analisada por citometria de fluxo. A. este painel mostra um lado contra o avanço de dispersão para representante HMEC-1 células provenientes de um único poço. A distribuição em massa de células foi selecionada através do canal para excluir os restos (à esquerda) e célula parelhas ou trigêmeos (à direita). B. este gráfico mostra um histograma do logaritmo da intensidade da fluorescência Lm por célula de HMEC-1 chapeado na macio 0,6 kPa. C. este gráfico mostra um histograma do logaritmo da intensidade da fluorescência Lm por célula de HMEC-1 chapeado na dura 70 kPa hidrogel. Os histogramas para N = 4-6 repetições são mostradas em cores diferentes. Histograma das células controle não infectado é roxa. O portão usado para definir o que está infectado é mostrado em vermelho. O MOI é 100 e a infecção foi avaliada 8h pós infecção. D. os dados mostram a percentagem de células infectadas do HMEC-1 contra a rigidez de hidrogel (N = 5). As barras horizontais retratam a média dos dados. O P-valor foi calculado com o teste não-paramétrico de Wilcoxon Rank Sum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video Figure 1
Video Figura 1: divulgação de Lm intracelular (canal vermelho) através de uma monocamada de células HMEC-1 (fase) semeadas em um substrato de 3-kPa. As células foram fotografadas em mídia de L-15 do Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL de gentamicina) dentro de uma câmara ambiental incubada a 37 ˚ c. As imagens foram coletadas a cada 5 min. A velocidade do filme é 15 frames/s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Video Figure 2
Vídeo Figura 2: divulgação de Lm intracelular (canal vermelho) através de uma monocamada de células HMEC-1 (fase) semeadas em um substrato de 70 kPa. As células foram fotografadas em mídia de L-15 do Leibovitz (10% FBS, 20 µ g/mL de gentamicina) dentro de uma câmara ambiental incubada a 37 ° C. As imagens foram coletadas a cada 5 min. A velocidade do filme é 15 frames/s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Módulo de Young (E, kPa) Acrilamida % (a partir de 40% das ações) Bisacrylamide % (a partir de 2% das ações)
0.6 3 0,045
3 5 0,075
10 10 0,075
20 8 0,195
70 10 0.45

Tabela 1. Composição de hidrogel de poliacrilamida (PA) de rigidez diferentes. Nesta tabela, a percentagem da solução estoque do acrilamido 40% e a percentagem de estoque 2% bis-acrilamida solução para atingir uma determinada rigidez (módulo de Young, E) são indicados em colunas diferentes.

Supplemental Material
Material suplementar 1. Cálculo de tensão intracelular de tensões de tração calculada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

As células podem sentir uma variedade de pistas ambientais físicas, o que pode afetar não só a morfologia das células, mas também a sua expressão e proteína atividade de gene, afectando assim a célula crítica funções e comportamentos45,46. A rigidez de ECM de células é cada vez mais apreciada como um modulador importante da motilidade celular, diferenciação, proliferação e, finalmente, célula destino47,,48,49. Embora tenha havido muitos avanços recentes na compreensão da complexa interação biomecânica entre células e seu ECM, pouco é conhecido sobre a rigidez como ambiental afeta a susceptibilidade das células à infecção bacteriana. Para facilitar tais estudos, desenvolvemos este ensaio multi bem romance baseado na fabricação de hidrogel de poliacrilamida de rigidez ajustável que é compatível com infecção ensaios50bem estabelecida. Tradicionalmente, uma infecção bacteriana das células em cultura de tecidos tem sido estudada em vidro ou superfícies de poliestireno que são aproximadamente 1-3 ordens de magnitude mais duras que o ECM natural de mais aderente células8,51. O ensaio descrito aqui abre novas estradas, permitindo o estudo das interações de bactérias-host em um regime de rigidez ambiental fisiologicamente relevantes.

Para a prova de conceito do ensaio apresentado, células HMEC-1 foram escolhidas como células aderentes modelo e Lm como um patógeno bacteriano do modelo. No entanto, o ensaio pode ser estendido para mais estudos se modificado da maneira apropriada. Tais estudos podem envolver a infecção dos tipos de células diferentes mamíferos anfitrião aderentes por patógenos adicionais, incluindo bactérias e vírus. Para este teste específico, géis foram proteína-revestidas com colágeno eu, mas dependendo do tipo de célula do hospedeiro, é possível usar um revestimento-proteína de ECM diferente, tais como laminina ou fibronectina, para facilitar a fixação de células hospedeiras de juros sobre o hidrogel 52. uma consideração adicional que depende do tipo de célula do hospedeiro é a escala de rigidez de hidrogel para ser estudado. A gama de rigidez deve depender do que é fisiologicamente relevante para o tipo de célula de host específico e como bem que hospedam anexa formando uma monocamada em um hidrogel de determinada rigidez. Da mesma forma, dependendo do patógeno modelo desejado a ser examinado, pequenas modificações talvez precise ser implementado sobre o ensaio de infecção aqui descrito.

A inovação do ensaio em comparação com os métodos anteriores para fabricação de poliacrilamida hidrogel24,50,53 encontra-se em certas características únicas integrados o ensaio proposto infecção. Primeiro, o hidrogel é construídas sobre placas de vidro multi bem fundo, que permite a seleção de várias condições simultaneamente, bem como a automatização de determinados procedimentos. Monitoramento de várias condições no mesmo momento ou examinando várias repetições é crucial, pois o resultado dessa abordagem pode ser influenciado por fatores como a passagem de células do hospedeiro e o número exacto de bactérias adicionadas para infectar os hosts, que mudam frequentemente entre experimentos independentes. Uma característica adicional exclusiva deste teste é que o hidrogel tem uma altura de aproximadamente 40 µm, que é fina o suficiente para a imagem usando microscopia convencional. Mostramos que podemos com sucesso realizar microscopia célula viva e a fixação da pilha e imunocoloração seguido por imagens, sem a introdução de fluorescência de fundo elevado. Por último, o hidrogel é feitos de duas camadas, com o superior tendo incorporado microbeads fluorescente, confinado em um único plano focal. Este atributo garante que não haverá nenhuma luz fora de foco, interferindo durante a imagem latente. A presença dos grânulos permite que tanto o exame da topografia superficial dos geles para garantir que eles são uniformes e melhora o desempenho do TFM e MSM de32,24,41. Com TFM e MSM, é possível calcular as forças ECM-célula e célula-célula, respectivamente das células que residem em variáveis de matrizes de rigidez. Usando este ensaio de romance, é possível fazer tais medições de forças físicas, comparando a contribuição de rigidez ambiental e de infecção simultaneamente. Seguindo esta abordagem, a infecção de efeito tem na célula hospedeira mecânica ao longo de seu curso pode ser determinada. Além disso, a evolução das tensões intracelulares de células pode ser calculada usando MSM e pode ser usada como uma medida da integridade da barreira da monocamada. Finalmente, dada a natureza multi bem do ensaio, é possível simultaneamente introduzir perturbações genéticas e farmacológicas com uma infecção bacteriana, para investigar mais a fundo a complexa interação entre a mecânica de células do hospedeiro e infecção.

Uma limitação inerente da técnica reside na rigidez de substrato efeito teria sobre a taxa de proliferação de células. Normalmente, em ensaios de infecção, precisamos garantir que a densidade de pilha de anfitrião em diferentes condições é o mesmo. Isso é porque a densidade celular por si só pode ter um efeito sobre a susceptibilidade de hospedeiros a infecção. As células do HMEC-1 que foram usadas como células hospedeiras não mostram uma diferença significativa no seu número quando semeado durante 24 h sobre o hidrogel. No entanto, diferentes tipos de células podem apresentar proliferação diferencial, dependendo da rigidez de hidrogel, que pode influenciar a estudos de infecção. Da mesma forma, o viés de infecção podem surgir quando as células não formam monocamadas ou não fixe bem sobre o hidrogel, como ocorre quando certos tipos de células são semeados em matrizes muito macias (por exemplo, células endoteliais humanas de cordão umbilical ou rim canino Madin-Darby células epiteliais semearam em 0.6 kPa hidrogel54,55). Que respeita aos agentes patogénicos, certas bactérias (por exemplo, Borrelia burdgorferi) podem anexar para hospedar as células e invadi-los, mas também podem transmigrar através deles56. Nós ainda não testei se este ensaio trabalharia para estudos de transmigração do patógeno, mas parece possível, já que estudos anteriores sobre os neutrófilos reencarnando células endoteliais semeadas em hidrogel de PA foram documentados para trabalhar, com êxito,57. Tem havido muitos estudos realizados mostrando como produzir hidrogel de poliacrilamida de um determinado módulo de Young, misturando as concentrações adequadas de acrilamida e bis-acrilamida24,25,26 ,,27. No entanto, especialmente quando um deseja realizar TFM experiências em células que residem em hidrogel de rigidez variável, é essencial para confirmar a rigidez esperada o hidrogel através de AFM ou outras técnicas de recuo58. Ligeiros desvios em relação ao valor esperado podem ocorrer devido um solvente diferente usado ou uma solução de acrilamida envelhecido, ou das formas AFM as medições são realizadas (por exemplo, a forma da ponta do AFM). Finalmente, a abordagem apresentada neste documento baseia-se na semeadura de células hospedeiras em matrizes 2D, que podem diferir de um cenário 3D mais realista e fisiologicamente relevante. No entanto, fabricação 3D géis com rigidez sintonizável, semeando-os com células hospedeiras e em seguida, infectando-os com patógenos, ainda abrange certas dificuldades técnicas. Não obstante, prevemos que num futuro próximo seremos capazes de estender o atual ensaio para estudar a infecção em um ambiente 3D.

Para resumir, o protocolo descrito em conjunto com os resultados preliminares fornecem evidências de que este romance ensaio pode tornar-se uma ferramenta extremamente útil para estudar a infecção de células aderentes com bactérias patogênicas de forma quantitativa e de uma forma muito mais ambiente fisiologicamente relevante do que o anteriormente examinadas. O poder de fabricar poliacrilamida hidrogel na configuração da proposta reside em que o ensaio é compatível com o desempenho de várias técnicas como citometria de fluxo, immunostaining seguido por microscopia de luz e força de tração microscopia. O ensaio pode ser usado para estudos que envolvem a infecção dos tipos de células aderentes de host diferente por patógenos, que prevemos que terá um impacto significativo em ambos desvendar as estratégias pelas quais patógenos infectam hospedeiros e facilitar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas contra infecções.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Nossos agradecimentos a M. rodapé, R. Lamason, M. Rengaranjan e membros do laboratório de Mais_que_lindo para suas discussões e suporte experimental. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), a Irmandade de Gilliam HHMI para estudo avançado (F.E.O.), o Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) e a associação americana do coração (E.E.B.). Citometria de fluxo foi realizada na instalação de FACS compartilhado de Stanford.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

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