التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يمكن استخدام حقن إينتراسبينال recombinase تعتمد المؤتلف المرتبطة بالغدة الفيروس (راف) التعامل مع أي نوع من الخلايا المسمى وراثيا في الحبل الشوكي. هنا ونحن تصف كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني. هذا الأسلوب يتيح للاستجواب الوظيفي من النوع الفرعي العصبية التلاعب بها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التلاعب الانتقائي للعمود الفقري العصبية الفئات السكانية الفرعية قد تحقق أساسا بطريقتين مختلفتين: 1) علم الوراثة المتعدد الجوانب، حيث يتم إنشاؤها بضعفين أو ثلاثة إضعاف من الفئران المحورة وراثيا بغية تحقيق التعبير الانتقائي لمراسل أو المستجيب الجينات (مثلاً، من محور Rosa26) في السكان العمود الفقري المرجوة. 2) حقن إينتراسبينال المرتبطة بالغدد العرقية-تعتمد على فيروس المؤتلف (راف)؛ هنا يتم حقن ناقلات إف Cre-تعتمد على الترميز للجينات مراسل أو المستجيب للاختيار في الحبل الشوكي من الفئران معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في يتدنى العصبية المطلوبة. هذا البروتوكول ويصف كيفية توليد نواقل راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية وشرائح كيفية ترانسدوسي الخلايا العصبية في القرن الظهري للحبل الشوكي القطني L3-L5 مع رافس. كأجزاء العمود الفقري القطني L3-L5 هي معصب من تلك الخلايا العصبية الحسية المحيطية التي تنقل المعلومات الحسية من هيندليمبس، السلوك العفوي والاستجابات للاختبارات الحسية المطبقة على اللكتات عن إلى جانب الحقن يمكن أن تكون تحليله لاستجواب وظيفة الخلايا العصبية التلاعب في المعالجة الحسية. نحن نقدم أمثلة كيف يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل وراثيا تعريف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية في العمود الفقري. المزايا الرئيسية للتعبير التحوير الفيروس بوساطة لجنة المساواة العرقية الفئران المعدلة وراثيا مقارنة بالتعبير التحوير المستحثة بالماوس مراسل الكلاسيكية هي التالية: 1) يمكن أن تعتمد لجنة المساواة العرقية المختلفة رافس ترميز مختلف البروتينات مراسل أو المستجيب حقن خط المعدلة وراثيا Cre واحد، وبالتالي التغلب على الحاجة إلى إنشاء عدة الماوس المعدلة وراثيا متعددة الأسطر. 2) حقن إينتراسبينال يحد من التلاعب بالخلايا معربا عن لجنة المساواة العرقية للحقن والوقت بعد الحقن. المساوئ الرئيسية: 1) تعبير الجينات مراسل من رافس متغير أكثر. 2) مطلوب جراحة ترانسدوسي الخلايا العصبية العمود الفقري للفائدة. أي من هاتين الطريقتين هو الأنسب يعتمد على مسألة السكان وبحوث الخلايا العصبية معالجتها.

Introduction

الحبل الشوكي الظهرية ضروري لتبادل المعلومات بين أطراف الجسم والمخ. المنبهات الحسية مثل الحرارة، البرد، لمسة، أو يتم الكشف عن المنبهات الضارة بالخلايا العصبية الطرفية المتخصصة، التي تنقل هذه المعلومات إلى الخلايا العصبية للقرن الأفريقي الظهرية الحبل الشوكي. وهنا ينظم شبكة معقدة من إينتيرنيورونس المثبطة وضادات وفي نهاية المطاف مواقع مرحلات المعلومات الحسية عن طريق الإسقاط الشوكي من الخلايا العصبية إلى سوبراسبينال1،2. العمليات الحسابية التي تقوم بها العمود الفقري في جملة-وإسقاط الخلايا العصبية من بوابة المعلومات الحسية، وبالتالي تحديد المعلومات التي قمعت أو ترحيل بكثافة التي. التغييرات في التكامل للمنبهات الحسية، مثل إلى تغيير توازن بين تثبيط والإثارة، يمكن أن يسبب اختلالات حسية مثل فرط الحساسية أو اللودينيا (الأحاسيس المؤلمة بعد التحفيز عادة غير مؤلمة). ويعتقد أن السبب الأساسي للألم المزمن مختلف الدول3،4هذه التغييرات. وهكذا، العمود الفقري الدوائر ذات أهمية عالية في المعالجة الحسية، وبالتالي في إدراك البيئة الكائن الحي والنفس. مع ظهور الأخيرة وتركيبة الجزيئي، والوراثية، والتقنيات الجراحية التي تسمح للتلاعب بدقة للفئات السكانية الفرعية المحددة وراثيا العمود الفقري العصبية، العلماء الآن بدأنا نفهم الدوائر الأساسية العمود الفقري مسؤولة عن تجهيز طرائق حسية مميزة.

ضخ إينتراسبينال راف في الفئران البرية من نوع أو المعدلة وراثيا ساهمت إلى حد كبير إلى التلاعب، والتحليل، وفهم وظيفة من مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11. يسمح هذا الأسلوب تقديم البروتينات علامة (مثل التجارة والنقل/البروتينات الانصهار بروتينات فلورية خضراء)، مراسل البروتينات (مثل جكامب)، أو البروتينات المستجيب (مثل السموم البكتيرية أو تشانيلرهودوبسين أو مستقبلات فارماكوجينيتيك) في مكانياً طريقة مقيدة للخلايا العصبية في العمود الفقري. ضخ رافس تعتمد على لجنة المساواة العرقية المحلية في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية في مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية العمود الفقري يسمح تحليل محددة من السكان الخلايا العصبية الخاصة بكل منها. وقد استخدمنا هذا الأسلوب في تسمية أو يجتذ أو تمنع أو تنشيط العمود الفقري جليسينيرجيك الخلايا العصبية مما يدل على أن تشكل جزءا أساسيا من العمود الفقري بوابة التحكم بالألم وحكة انتقال7. في هذه التجارب، مكن ضخ إينتراسبينال راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية في الفئران GlyT2::Cre التلاعب جليسينيرجيك الخلايا العصبية في الحبل الشوكي القطني الانتقائي. وبالتالي يمكن تفادي التلاعب المتزامن للدوائر سوبراسبينال التي تحتوي على جليسينيرجيك الخلايا العصبية ذات أهمية حاسمة لبقاء الحيوان.

بينما حقن إينتراسبينال رافس يحد من العدوى إلى الموقع الحقن، يمكن أن يحدث توصيل الفيروسي ليس فقط في الخلايا العصبية المحلية ولكن أيضا في الخلايا العصبية التي تتصل بالحقن عن طريق الإسقاطات محواري. هذا الأخير غالباً ما يستخدم لتتبع مناطق الجهاز العصبي المركزي توفير مدخلات العصبية لنواة معينة في الدماغ. عدوى الإسقاطات محواري، ومع ذلك، يمكن أيضا عامل التباس عندما يقوم درس عدد محدد من الخلايا العصبية في موقع معين. لمعالجة هذه القضايا، وقد أجرينا مؤخرا تحليلاً شاملا للقاح إف وكاسيتات التعبير تحديد الأنماط والمروجين التي يمكن استخدامها إلى أما تصغير أو تكبير توصيل إلى الوراء. في سياق هذا البحث المحددة في العمود الفقري الدوائر، قمنا بتحليل قدرة اللقاح مختلفة والمروجين على ريتروجراديلي ترانسدوسي الخلايا العصبية في العقد الجذرية الظهرية (DRG)، ولب فينتروميديال روسترال (RVM)، وقشرة سوماتوسينسوري 12. ولذلك التقنية المبينة في هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحليل الخلايا العصبية العمود الفقري في موقع الحقن أو لتحليل الخلايا العصبية الإسقاط التي توفر مدخلاً إلى موقع حقن الحبل الشوكي. في البروتوكول هو موضح هنا، تجري ثلاث حقن راف في الجانب الأيسر من الحبل الشوكي القطني لتمكين توصيل الخلايا العصبية في ثلاثة أجزاء القطني (L3-L5). شرائح L3-L5 تلقي معظم المدخلات الحسية من اللكتات عن الحقن. ونحن تبين أن التلاعب الوظيفية للخلايا العصبية المسماة وراثيا في L3-L5 كافية لتثير التغيرات السلوكية قوية، وبالتالي توفير الأدلة الفنية للدالة حلبة لهذه الخلايا العصبية وراثيا المسمى نوع فرعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات وقد أقر مكتب الطب البيطري الكانتون السويسري (زيورخ) ووفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة.

ملاحظة: يتم سرد جميع المواد جنبا إلى جنب مع الشركات المصنعة لكل منها و/أو البائعين في الجدول للمواد.

1-جيل ناقلات إف تعتمد على لجنة المساواة العرقية

ملاحظة: يمكن شراء مجموعة متنوعة من ناقلات تعتمد على لجنة المساواة العرقية مع المروجين مختلفة (انظر الجدول للمواد)، أو إذا لم يتوفر بناء التعبير المطلوب، فإنه يمكن إنشاؤها بواسطة تعديل القائمة بنيات إف. ملاحظة، المروج والنمط المصلي المسيطر يمكن أن يكون لها تأثير على انتشار توصيل الفيروسية (انظر 12). الجزء الأول من هذا البروتوكول بإيجاز وصف توليد اثنين من ناقلات إف تعتمد على لجنة المساواة العرقية مختلفة مناسبة لتحقيق مكاسب وخسائر التجارب الدالة، على التوالي.

  1. تنشيط فارماكوجينيتيك (كسب وظيفة)
    1. تأمر pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-مشري (انظر الجدول للمواد) لمستقبلات مصمم حصرا تنشيطه بواسطة العقاقير المحورة (دريد)-بوساطة التنشيط.
    2. عند تلقي ثقافة طعنه البكتيرية، تستكمل متواصلة من البكتيريا في لوحات رطل (البكتريولوجية الصف أجار المذاب في لوريا بيرتاني السائلة المتوسطة) مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضانها طوال الليل في 37 درجة مئوية، واختيار مستعمرة واحدة في اليوم التالي.
      ملاحظة: يمكن أن تحدث البلازميدات المحتوية على إف جينومات ناقلات يمكن أن تكون غير مستقرة ويكرر جزئ الجينوم الفيروسي، لا سيما في إطار المحطة الطرفية المقلوب الفيروسية (ساحة)، وخلال التضخيم في كولاي. أننا نقترح استخدام recA-تفتقر إلى قمعها/سلالات مثل MDS42 أو Stbl3 لتجنب جزئ داخل بلازميد يحتوي على جينوم إف.
    3. تضخيم البكتيريا اتباع الإرشادات التي يقدمها المورد المختار الحمض النووي--ماكسي-كيت وإعداد جودة عالية بلازميد الحمض النووي مع مجموعة الحمض النووي-ماكسي-مواد متاحة تجارياً (مثلاً، انظر الجدول للمواد). تنفيذ مراقبة الجودة لإعداد الحمض النووي بلازميد بالتحقق من سلامة وهوية بلازميد الحمض النووي من خلال تقييد خلاصة قاسمة بلازميد الحمض النووي.
      ملاحظة: هناك مواقع الاعتراف لتقييد endonuclease سماي داخل الإسناد. تتضمن خلاصة سماي في مراقبة الجودة التحقق من سلامة الإسناد.
    4. إرسال الحمض النووي لمنشأة النواقل فيروسية أساسية بغية إنتاج راف ذات جودة عالية.
      ملاحظة: عيار عالية، محضرات الفيروسية ذات جودة عالية حاسمة لتفادي الخلط الناجم عن التلوث في الإعدادية الفيروسية تعمل. ولذلك نوصي بوجود راف الاختيار المنتجة في منشأة أساسية متجهة ثابتة، ما لم يتم إنتاج إف راسخة في المختبر.
  2. التذرية (فقدان الوظيفة)
    ملاحظة: السموم البكتيرية أو مستقبلات السمية يمكن للتوسط في خلية التذرية أو إسكات الخلايا العصبية. ونحن قد ولدت pAAV.EF1α.flex.DTA للدفتيريا صريح السمية جزء A (DTA) بطريقة تعتمد على لجنة المساواة العرقية.
    1. لإنشاء ناقل فيروسي تعتمد على لجنة المساواة العرقية، اختر ناقل تعتمد على لجنة المساواة العرقية مع أحد المروجين مناسبة (مثلاً، pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). تضخيم تسلسل الترميز المفضل (مثلاً، DTA) بتفاعل البوليميراز المتسلسل مع الإشعال التي تشمل الإداريين ونهيي أو متوافق مع تقييد endonuclease الاعتراف بالمواقع في يتدلى بهم (انظر الحاضنة et al. 7)
    2. نفذ باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية النبذ تقييد ناقل الحمض النووي (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) ومن تضخيم PCR إدراج (ني-DTA-الإداريين) مع قيود اندونوكليسيس ني والإداريين. اضطر الشظايا المنقي.
    3. تحويل رد فعل ربط إلى البكتيريا مناسبة، وفقا للبروتوكول نظراً للمورد للبكتيريا المختصة للاختيار، ولوحة البكتيريا على لوحات رطل. استخدام recA-تفتقر إلى قمعها/السلالات، مثل MDS42 أو Stbl3، للاستنساخ والتضخيم اللاحقة من بلازميد الحمض النووي.
    4. اليوم بعد التحول، انتقاء الحيوانات المستنسخة وتطعيم منهم في المتوسط رطل وتستكمل مع المبيت المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخراج الحمض النووي بلازميد من البكتيريا المستزرعة. التحقق من نجاح الاستنساخ بتقييد النبذ وتسلسلها بلازميد استخراج الحمض النووي.
    5. تضخيم ذات جودة عالية، البكتيريا بلازميد الحمض النووي (راجع الخطوة 1-1-3). إرسال تضخيم الحمض النووي إلى مرفق النواقل فيروسية أساسية لإنتاج الفيروس.

2. توصيل خلايا العمود الفقري

  1. إعداد الفيروسات الحل
    تنبيه: الفيروسات المعدية الكواشف وينبغي التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة. وفي معظم الحالات، يمكن أن تعالج رافس على مستوى السلامة الأحيائية 1 (BSL1).
    1. في يوم الحقن، تذويب قاسمة مخزون فيروس المنقي المرجوة على الجليد وإبقائه على الجليد حتى مباشرة قبل الحقن. تجنب المتكررة في تجميد-ذوبان الجليد-دورات، هذه سوف يقلل من عيار فعال لهذا الفيروس.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، الفيروس ديفروستيد الكوة يمكن الاحتفاظ عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
    2. تمييع جزيئات الفيروس في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
      ملاحظة: عيار مناسب يعتمد على أهداف تجريبية، وينبغي أن يحدد تجريبيا. لتبدأ هو مجموع جيدة الفيروسي 3 × 109 الجينوم نسخ (GC/مل، 3 × 300 nL حقنه من 3.33x1012 ). أخذ الزائد وفقدان بعض أثناء تحميل الشعرية في الاعتبار، سوف يلزم حوالي 2.5 ميليلتر من الفيروسات الحل لكل الماوس.
  2. إعداد ميكروبيبيتيس لحقن إينتراسبينال
    1. 'سحب' الشعيرات الدموية رقيقة الجدار الزجاج (القطر الخارجي 1 مم) على ساحبة ميكروبيبيتي لإنشاء مم ~5.5 طويلة، الضحلة عرقوب. استخدام إعدادات البرنامج 00 وخيوط سخان 3.0 مم مع P(A) تكييف كما هو الحال في الجدول 1.
      ملاحظة: الانسحاب يمكن أن يتم في وقت مبكر. يجب تخزين الشعيرات الدموية سحبت في حاوية مغلقة حول نمذجة الطين لتفادي الغبار، والتي يمكن أن تسد في وقت لاحق ميكروبيبيتي. التعقيم ميكروبيبيتيس ليس ضروريا.
    2. مقطع عرقوب شعري سحبت مع الملقط الصفيحة بطول حوالي 4.5 إلى 5 مم لإنشاء تلميح فتح مع قطر داخلي ميكرو 25-35. باستخدام مجهر مع مقياس ميكرومتر، قياس القطر الداخلي لعدة ميكروبيبيتيس للحصول على شعور كبير كيف فتح ينبغي أن يكون، أو قياس لكل ميكروبيبيتي.
      ملاحظة: نصيحة صغيرة يمكن أن يؤدي إلى انسداد؛ نصيحة أكبر قد يسبب تلف الأنسجة والصعوبات لاختراق الحبل الشوكي.
  3. التحضير لإعداد العمليات الجراحية وأدوات
    1. ضمان المعدات نظيفة وجاهزة للاستخدام. تطهير منطقة العمل بالمسح مع الإيثانول 70% وتعقيم أدوات التعقيم أو التطهير منها. لا تترك أي مطهر في المحاقن ميكروليتير الذي سيضر بالنواقل الفيروسية لاستخدامها.
  4. إعداد الحيوان للجراحة والتخدير
    ملاحظة: المدة الإجمالية لعملية جراحية 60-90 دقيقة.
    1. اختر الفئران--6 إلى 10-الأسبوع القديمة لتسهيل العملية الجراحية.
      ملاحظة: إذا كان التصميم التجريبي يتطلب ذلك، من الممكن حقن الحيوانات الأصغر أو الأكبر سنا. أي سلالة ومن كلا الجنسين يمكن استخدامها في المبدأ، ولكن استخدام نفس السلالة الخلفية (مثلاً، C57BL/6J) لمقارنة سلوكيات بين خطوط مختلفة وراثيا الماوس. إذا كانت الاختلافات بين الجنسين من المتوقع أو تحليل للتحقيق، من الذكور والإناث في مجموعات منفصلة.
    2. حمل التخدير استخدام isoflurane ~ 5%. ضع الحيوان في إطار ستيريوتاكسيك على حصيرة حرارة والمحافظة على التخدير في إيسوفلوراني 1-2.5% (معدل تدفق الهواء 900 مل/دقيقة). رصد معدل التنفس طوال عملية جراحية.
    3. تطبيق مرهم العين زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
    4. يحلق الخلفي للحيوان وإزالة الشعر بعناية مع الأنسجة الرطبة. تطهير الجلد حلق بمحلول اليود وتسمح للجلد الجاف.
    5. إعطاء العلاج مسكن (مثلاً، 0.1-0.2 مغ/كغ البوبرينورفين تحت الجلد).
  5. التعرض للعمود الفقري على مستوى النخاع الشوكي القطني
    ملاحظة: نتيجة لتطور التفاضلية للحبل الشوكي والعمود الفقري، مستويات كل منها لا يتم محاذاة، ولكن الجزء القطني من النخاع الشوكي L4 في نفس المستوى كفقرة T13 الصدري.
    1. تحديد موقع زوج الضلع والذيلية أكثر من بالباتينج على طول العمود الفقري. استخدام مشرط، جعل قطع طولية 1.5-2.5 سم في الجلد بدءاً من مجرد روسترال على زوج الضلع الأكثر والذيلية.
    2. رفع الجلد بالملقط ويفصله من العضلات الأساسية مع المقص. طوال عملية جراحية، إبقاء الأنسجة المعرضة رطبة مع العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم.
    3. استخدام الملقط غرامة ومقص صغير، جعل شق في الطبقة غشائي القادم، رقيقة بجوار خط الوسط وقطع من العمليات الشائكة. أنه منفصل عن العضلات باراسبينوس الكامنة، ولكن تعلق على العمليات الشائكة.
  6. تحديد فقرات على مستوى النخاع الشوكي القطني
    ملاحظة: عندما يتعرض العمود الفقري، عمليات الشائكة الظهرية والأربطة إينتيرترانسفيرسي يجب أن تكون مرئية. معالم تشريحية عدة يمكن أن تساعد في تحديد فقرة الصحيح للهدف (الشكل 1B).
    1. سحب الجلد إلى الوراء نحو الذيل لفضح الحرقفي. بنفس المستوى، ينضم الزوج الأكثر والذيلية الأربطة إينتيرترانسفيرسي تظهر العملية الشائكة L6. عد إلى الوراء في والذيلية لاتجاه روسترال لتحديد الفقرة الفائدة.
    2. جس على طول العمود الفقري. يقع زوج الضلع الأكثر والذيلية روسترال فقط إلى فقرة T13 وعظم الحوض على مستوى الفخذ على مستوى فقرة L6.
    3. قم بتحديد موقع بقعة فيها وتر بجانب العمود الفقري بياضا وآخر وسطى. ويقع فقرة T13 روسترال فقط. الجزء القطني من النخاع الشوكي L4 يقع داخل هذا الفقرة.
  7. تثبيت العمود الفقري والتعرض للحبل الشوكي القطني
    1. ضع الحيوان على وسادة أنسجة الظاهرة لرفع ذلك إلى المشابك العمود الفقري للإطار ستيريوتاكسيك.
    2. تصحيح فقرة الهدف لتجنب تحركات العمود الفقري نتيجة للتنفس. لهذا الهدف، محاذاة المشابك المتاخمة لفقرة الهدف، إصلاح المشبك واحد في الموضع بالعمود الفقري مع الملقط أدزون أثناء تحديد المشبك الثاني.
      ملاحظة: العمود يجب أن يكون عمودي على الطائرة الحقن وثابتة بقوة حتى أن لم تتحرك عند الضغط من أعلى. إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون ثابتة زوج ثاني من المشابك للعمود الفقري. وفي هذه الحالة، أنها مفيدة لإصلاح اثنين من الأزواج من المشابك لفقرات اثنين المتاخمة لفقرة الهدف.
    3. إزالة العضلات باراسبينوس أعلاه الفقرات الفائدة. استخدام مشرط، جعل شق موازية الآنسي فقط على الأوتار التي موازية للعمود الفقري، فضلا عن شقوق عمودي روسترال ووالذيليه لفقرة الهدف. أن يكون حريصا على عدم قطع عميق جداً. المسيل للدموع/قص بعيداً العضلات باستخدام رونجيورس. استخدام الملقط حسب الحاجة لإزالة الأنسجة المتبقية في الفقرة أو أعلاه دوراً في الفضاء الفقرية.
    4. في الفضاء الفقرية، وينبغي أن تكون الأوعية الدموية الظهرية مرئية مناسبة خط الوسط النخاع الشوكي. لحقن أحادية الجانب، تؤدي الاستئصال جزئي بحفر حفرة في منتصف الجهة المستهدفة من الفقرة. استخدم طب الأسنان غرامة الحفر الجهاز مع قطع كروية 0.5 مم وحفر بعناية خاصة عند الاقتراب من الحبل الشوكي. قم بإزالة أي شظايا العظام المتبقية بإبرة مشطوف الحواف ز 26 لفضح الحبل الشوكي.
    5. باستخدام إبرة مشطوف الحواف ز 26، التسلخات دوراً في حفر حفرة، وفي الفضاء الفقرية روسترال وإلى فقرة الهدف، كل شيء تقريبا 200 ميكرومتر الجانبي للأوعية الدموية الظهرية والذيلية. ينبغي الفرار النخاعي من الثقوب وينبغي أن يكون قليلاً انتفاخ الحبل الشوكي.
  8. التحضير للحقن الحقن
    ملاحظة: ينبغي إعداد حقنه حقنه مباشرة قبل بداية الحقن الحد من خطر انسداد ميكروبيبيتي ذرات الغبار.
    1. جبل الشعرية الزجاج على حقنه ميكروليتير استخدام ضغط إبرة قابلة للإزالة المناسب كيت. ربط الجوز صارمة لضمان تناسب ضيق وآمنة.
    2. ملء المحاقن ميكروليتير بماء مقطر معقم والبدء في الضغط عليها بالمكبس.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك مقاومة كبيرة جداً حتى أن الماء لا يخرج بسهولة من الطرف، ميكروبيبيتي يرجح أن يتم حظر وينبغي تبادل.
    3. جبل حقنه على ميكرومانيبولاتور متصلاً ميكروينجيكتور التي تسيطر عليها إلكترونيا. احرص على عدم لمس أي شيء مع ميكروبيبيتي.
    4. باستخدام ميكروينجيكتور، وضع حوالي 1 ميليلتر من الجو لخلق فقاعة بين الماء والفيروس.
    5. وضع معالجة تجميعية 2.5 ميليلتر من الفيروسات الحل على قطعة من الفيلم البارافين، الانتقال بعناية غيض من ميكروبيبيتي إلى الحبرية استخدام الإطار ستيريوتاكسيك واستدراجه. ثم بعناية الصحافة الاستغناء حتى يخرج قليلاً من الفيروسات الحل في التلميح.
    6. سحب المحاقن، واستخدام قلم، مارك ميكروبيبيتي بمقياس رسم وملاحظة مستوى الحل الفيروس؛ وهذا سيسهل رصد ما إذا كان الضخ يسير حسب ما هو مبرمج.
  9. حقن إينتراسبينال
    1. نقل غيض من ميكروبيبيتي أعلاه واحدة من الثقوب في دوراً، وثم إلى الأسفل حتى يلاحظ تأثير طفيف في دوراً. لاستهداف حقن هورن الظهرية العمود الفقري، تحريك لأسفل 500 ميكرومتر في 100 ميكرومتر زيادات متتالية (سرعة 1 مم/s) وثم 200 ميكرون حتى السماح للاستقرار الميكانيكية في الأنسجة.
      ملاحظة: عمق التلميح نهائي هو 300 ميكرون وفي هذه الحالة، ولكن يمكن تكييفها تبعاً للمنطقة المستهدفة.
      1. في حالة مقاومة لاختراق النسيج، قد يتم اصطياد ميكروبيبيتي في بلده دوراً. وفي هذه الحالة، سحب ونقل قليلاً إلى أوفيرلي في الحفرة، أو استخدام الإبرة مرة أخرى التسلخات في بلده دوراً بشكل صحيح قبل تكرار محاولة اختراق.
    2. برنامج للمضخة لكمية حقن المستهدف من 300 nL بسرعة حقن 50 nL/دقيقة واضغط على زر ابدأ لبدء الضخ.
    3. بعد الانتهاء من الحقن، تحقق من مقياس لمعرفة ما إذا كان قد انخفض مستوى الفيروس وتترك في ميكروبيبيتي في مكان 3 دقيقة إضافية للسماح للضغط من أجل حجته قبل تراجعه حقنه ببطء.
    4. كرر الخطوة 2.9.1.-2.9.3. لمواقع أخرى لحقن اثنين.
  10. خياطة والانتعاش
    1. إزالة العمود الفقري المشابك ووسادة أسفل الماوس.
    2. إغلاق الجرح في طبقات مع غرز مقاطعته، خياطة طبقات الأنسجة سطحية بخيوط قابلة للامتصاص والجلد بخيوط غير-قابلة للامتصاص. تطبيق مطهر اليود على الجرح ستورد.
    3. إنهاء التخدير وترك الحيوان على حصيرة الحرارة حتى أنه يتعافى قبل إعادته إلى قفصة المنزل.
  11. الرعاية ما بعد الجراحة
    1. مراقبة صحة الحيوان في اليوم لعملية جراحية، وفي اليوم التالي، وبعد ذلك كل 2-3 أيام. التأكد من أن الحيوان له مشيه المعتاد، مظهر صحي (الوزن والعيون والفراء والسلوك)، وأن يتم التئام الجرح.
    2. مواصلة العلاج مسكن (مثلاً، 0.1-0.2 مغ/كغ البوبرينورفين تحت الجلد) حسب الاقتضاء، ثلاث مرات في اليوم الواحد.

3-السلوكية والمورفولوجية التحليلات

  1. التحليل السلوكي
    ملاحظة: السماح للحيوانات لاستيعاب الإعداد الخاصة بكل منها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البدء في القياسات للسماح لهم بالتكيف مع بيئة تجريبية جديدة.
    1. اختبار فون فري
      1. ضع الحيوانات فردياً في المقصورات الفردية من حوالي 10 سم × 10 سم على أرضية شبكة معدنية.
      2. تحفز على سطح هيندباو عن اللفافة للحقن مع خيوط فراي فون ديناميكية. مذكرة القوة التي تسحب الحيوان مخلب لها من الحافز.
      3. كرر خمس مرات وحساب عتبة انسحاب متوسط من القياسات ستة لكل الحيوانات.
    2. اختبار وخز دبوس
      1. ضع الحيوانات في المقصورات الفردية من حوالي 10 سم × 10 سم على أرضية شبكة معدنية.
      2. حفز سطح أخمصي هيندباو عن للحقن بإبرة 26-ز يتثلم دون اختراق للجلد. نقاط السلوك صفر (لا رد فعل) أو أحد (رد الفعل).
      3. كرر 9 مرات مع فترات زمنية من 3 دقيقة بين التحفيز وحساب النسبة المئوية واستجابة من القياسات 10 لكل الحيوانات.
    3. حقن دريد-يجند الكلوزابين-N-أكسيد (CNO)
      1. حل CNO في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لإنشاء حل أسهم من 0.2 ملغم/ميليلتر، التي يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
      2. في يوم التجربة، تمييع الحل الأسهم في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم إلى 0.2 ميكروغرام/ميليلتر وحقن 10 ميليلتر/غرام وزن الجسم إينترابيريتونيلي. حقن الحيوانات التحكم بالسيارة ([دمس] 0.2% في 0.9% كلوريد الصوديوم).
        ملاحظة: وفقا للتجربة، آثار الذروة على السلوكيات يمكن المتوقع 1-3 ح بعد الحقن، وآثار ينبغي أن تهدأ تماما بعد 24 ساعة. في حالة تنشيط الخلايا العصبية جليسينيرجيك، ولاحظ السلوكيات تشمل انخفاض الاستجابات ألم وحكة. السلوكيات التي أثارت من قبل تنشيط الخلايا العصبية بوساطة درياد سيعتمد على مجموعة فرعية مستهدفة من الخلايا العصبية في العمود الفقري.
    4. حقن بروريتوجينس لحمل حكة
      1. حل بروريتوجينس في 0.9% كلوريد الصوديوم بحلول 8 ملغ/مل (الكلوروكين) أو 10 ملغ/مل (الهستامين). ح 2 بعد الإدارة CNO، ضخ 10 ميليلتر لحل بروريتوجين أو المركبات تحت الجلد في سطح أخمصي هيندباو عن موقع حقن العمود الفقري. بدلاً من ذلك، ضخ في بروريتوجين إينتراديرمالي في العجل، الذي قد تم حلق قبل يوم واحد للحد من السلوك البرود التي تسببها الحلاقة نفسها.
    5. التصوير بالفيديو لتحليل نوسيفينسيفي عفوية أو السلوكيات التي يسببها بروريتوجين حكة
      1. ضع الحيوانات فردياً في المقصورات الشفافة (حوالي 10 سم القطر) مع قليلاً من الفراش من بها القفص المنزل كل منهما في الكلمة.
      2. شريط فيديو الحيوانات لمدة 5 دقائق لسجل عفوية ومدة 30 دقيقة لتسجيل السلوكيات الناجمة عن بروريتوجين. تحليل أشرطة الفيديو دون اتصال في سلال لمدة 5 دقائق.
    6. ألم مقابل السلوكيات حكة
      1. مراقبة وملاحظة الجفل ولعق وعض السلوكيات.
        ملاحظة: الجفل ولعق موقع المتأثرة النظر في الردود على الألم، حين قضم يرتبط مع حكة.
      2. تحليل أشرطة الفيديو في السرعة العادية، وقياس الوقت بأن الماوس قضى لعق أو قضم المواقع المتأثرة، أو قياس البطيء لتمييز أدق بين لعق وعض ردود الفعل. وبدلاً من ذلك، عد من نوبات لعق/العض/الجفل.
  2. تحليل الخصائص المورفولوجية
    1. إجراء التحليلات المورفولوجية من واحد إلى ثلاثة أسابيع بعد الحقن بالفيروس أو بنهاية تجربة السلوكية.
      ملاحظة: أننا قد الكشف عن التعبير اجفب أقرب وقت ممكن 48 ساعة بعد الحقن، ولكن وجد أيضا أن التعبير تزيد بشكل كبير داخل المقبل أيام وحتى أسابيع. أسبوع واحد من الحضانة (من إينتراسبينال حقن حتى نضح) للخلايا مع مراسل قوي التعبير، قد يكون كافياً. للخلايا مع التعبير التحوير ضعيفة، والفيروسات مع المروجين ضعيفة أو fluorophores الأضعف، قد يلزم تعبير أطول لضمان مستويات لا يمكن اكتشافها.
    2. تثبيت الأنسجة
      1. نتخلل كل ترانسكارديالي الماوس، أولاً مع 20 مل من محلول النخاعي اصطناعية المثلج (قام) (كلوريد الصوديوم 125 مم، 25 مم، نة2بو4 1.25 ملم، د-الجلوكوز 20 مم بوكل 2.5 ملم و CaCl2 2 MgSO4 1 مم ناكو3 )، ثم مع 100 مل من 4% بارافورمالدهيد المثلج (في م 0.1 فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7.4).
        تنبيه: بارافورمالدهيد سامة ويجب التعامل معها بحذر.
      2. فورا تشريح النخاع الشوكي القطني، وبعد إصلاح الأنسجة ح 2 مع بارافورمالدهيد 4% على الجليد. تغسل الأنسجة الثابتة بعد مع العازلة فوسفات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.4) بإيجاز واحتضان عليه ثم في محلول السكروز 25% (في م 0.1 فوسفات الصوديوم العازلة، درجة الحموضة 7.4) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      3. قطع الأنسجة كريوبروتيكتيد في 30 ميكرومتر في كريوستات وتحميل المقاطع على شرائح المجهر.
    3. تلوين الفلورة
      1. بعد يغسل موجزة في برنامج تلفزيوني، تطبيق 300 ميكروليتر من عرقلة الحل (10% مصل حمار عادي في 0.3% تريتون-برنامج تلفزيوني) على الأقسام ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
      2. احتضان الشرائح مع 300 ميكروليتر تركيبات كل الأجسام الأولية في عرقلة الحل (انظر الجدول للمواد) طوال الليل في 4 درجات مئوية. تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
      3. احتضان الشرائح مع مجموعات كل منها من الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل الأجزاء 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
      4. باختصار شطف الشرائح في ddH2س، ثم جبل كوفيرسليبس استخدام تركيب نيون متوسطة.
      5. الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مزودة بعلامة x 20 وهدف 40 س.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل توضيح مستويات التعبير التي يمكن الحصول عليها بحقن إينتراسبينال راف ترميز بروتين ماركر، نحن أولاً حقن AAV1. CAG.eGFP في الحبل الشوكي القطني من الفئران البرية من نوع. أنتجت ثلاث حقن متباعدة حوالي 1 ملم بعيداً عدوى مستمرة تقريبا من قطاعات العمود الفقري القطني L3 إلى L5 (الشكل 1A). حقن الفيروس في عمق من 300 ميكرون من سطح العمود الفقري يؤدي إلى الإصابة الغالبة للخلايا في الحبل الشوكي الظهرية القرن الأفريقي. ومع ذلك، يمكن أيضا العثور على الخلايا المصابة في القرن البطني (الشكل 1). بعد ذلك، كان الهدف توضيح الاختلاف في التعبير بوساطة راف عند حقن راف تعتمد على لجنة المساواة العرقية في ماوس لجنة المساواة العرقية المحورة وراثيا. ولذلك نحن حقن AAV1 تعتمد على لجنة المساواة العرقية. CAG.flex.eGFP متجه إلى الحبل الشوكي من الفئران المعدلة وراثيا GlyT2::Cre. كما لوحظ من قبل، التعبير اجفب في القرن الظهري والبطني. ومع ذلك، كما هو متوقع، أصبح أكثر تقييداً، مما يعكس توزيع GlyT2 + الخلايا العصبية، أي التعبير ضئيلة نسبيا في القرن الأفريقي الظهرية سطحية والتعبير كثيفة في القرن الأفريقي عميقة الظهرية (الشكل 1E) التعبير عن اجفب.

المقبل، إلى إثبات إمكانية التصدي لمهمة الدائرة للعمود الفقري في الفئات السكانية الفرعية العصبية، هما آفس تعتمد على لجنة المساواة العرقية المختلفة الترميز للبروتينات المختلفة المستجيب (DTA و hM3Dq) تم حقن الفئران المعدلة وراثيا GlyT2::Cre. مماثل للتعبير الفيروسية لوحظ بعد ثلاث حقنات من AAV1. CAG.eGFP في البرية من نوع الفئران، كان هناك الاجتثاث قوية من الخلايا العصبية المثبطة (Pax2 +) في شرائح القطني L3-L5 بعد حقن AAV1. EF1a.flex.DTA في الفئران Glyt2::Cre (الشكل 2 أ، ج). فقدان الخلايا العصبية المثبطة جليسينيرجيك في هذه المقاطع أثارت فرط حساسية ميكانيكية ملحوظ (الشكل 2D) والسلوك البرود عفوية موجهة نحو اللكتات عن (الشكل 2E). سلوك البرود أدى إلى آفات ذاتيا، التي يمكن ملاحظتها على آثار أقدام والساق، والفخذ (للحصول على البيانات، راجع الحاضنة et al. 7) مقابل تأثيرات لوحظت عند تنشيط الخلايا العصبية جليسينيرجيك عن طريق حقن AAV1.hSyn.flex.hM3Dq والحقن داخل اللاحقة من CNO (الشكل 2). أصبح المنزوعة الحساسية الفئران إلى تحفيز الميكانيكية الضارة (الشكل 2 واو) والمحفزات الضارة الأخرى (انظر الحاضنة et al. 7) وبالإضافة إلى ذلك، عندما تعامل مع الهستامين بروريتوجينس أو الكلوروكين، كفاءة قمعت التنشيط hM3Dq بوساطة الخلايا العصبية جليسينيرجيك بروريفينسيفي الردود (الشكل 2). تبين هذه النتائج أن ثلاث حقن راف في الحبل الشوكي القطني قادرة على ترانسدوسي منطقة الحبل الشوكي القطني كافية لمراقبة التغيرات السلوكية قوية أثارت قبل تنشيط اللكتات المقابلة.

في مجموعة نهائية من التجارب، أردنا إظهار الاختلافات المحتملة في استخدام الفئران مراسل لجنة المساواة العرقية بالمقارنة مع فيروسات مراسل لجنة المساواة العرقية. ولذلك، اختير جين سائق لجنة المساواة العرقية التي قد وصفت سابقا كعرض نمط تعبير مقيدة في الحبل الشوكي الماوس. وقد اقترح هذا الجين RORβ يعبر عنه غالباً في المثبطة إينتيرنيورونس13،عميقة الظهرية القرن14. هذه الدراسة تستخدم RORβCre تدق في الفئران وعبرت منها إلى Rosa26لوكس-توقف-لوكس-تدتوماتو (R26توم) Cre مراسل الفئران، مما يؤدي إلى التعبير عن تدتوماتو في كافة الخلايا عرض التعبير لجنة المساواة العرقية في أي وقت قبل التحليل ( الشكل 3 ألف). توصيف تدتوماتو + الخلايا في RORβلجنة المساواة العرقية؛ وكشفت الفئرانتوم R26 التعبير في الخلايا العصبية وأستروسيتيس من القرن الأفريقي الظهرية (الشكل 3، ج). وفي الواقع، التقدير الكمي للخلايا تدتوماتو + تشير إلى أن غالبية الخلايا تمر باقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية (58%) غير العصبية. ونحن بعد ذلك حقن راف مراسل تدتوماتو تعتمد على لجنة المساواة العرقية (AAV1. CAG.flex.tdTomato) في الحبل الشوكي من الفئران P40 RORβلجنة المساواة العرقية (3D الشكل). على عكس R26توم-بوساطة التعبير مراسل، وجدنا جميع تدتوماتو + الخلايا المسماة بالفيروس المراسل أن تكون الخلايا العصبية (3E الشكل، و). وأخيراً، وقد تم تحليل هوية الخلايا العصبية تدتوماتو + في كلتا المجموعتين من الفئران (RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم و RORβCre حقن AAV1. CAG.flex.tdTomato). وفي كلتا الحالتين، كانت غالبية الخلايا العصبية المثبطة (> 85 ٪) والأقلية من الخلايا العصبية ضادات (< 20%) (الشكل 3 ز--أنا)، وهو الاتفاق مع التقييمات السابقة من هوية RORβ + الخلايا العصبية13،14.

Figure 1
الشكل 1: حقن إينتراسبينال من AAV1-اجفب/AAV1--فليكس-اجفب
(أ) التوضيح التخطيطي لحقن إينتراسبينال AAV1. CAG.eGFP (AAV1-اجفب) في الحبل الشوكي القطني، الذي هو معصب من اللكتات. (ب) موقع تشريحي لأجزاء الحبل الشوكي القطني L3-L4 يمكن تبينه من أعلى إلى أسفل طريقة العرض في الجزء الخلفي من الماوس. وافتتح الجلد لفضح العمود الفقري. عمليات العمود الفقري من فقرات T13-L6 ملونة كمراجع تشريحية ويشير سهم إلى الحرقفي. (ج) صورة الممثل من الحبل الشوكي القطني جبل كله. الفلورية الخضراء تشير إلى مجالات ترانسدوسيد الفيروسات من الحبل الشوكي. (د) صورة تمثيلية لمقطع عرضي من خلال AAV1-اجفب-ترانسدوسيد قطني حبل الشوكي من ماوس البرية من نوع. (ه) صورة تمثيلية لمقطع عرضي AAV1. ترانسدوسيد CAG.flex.eGFP الحبل الشوكي بالماوس GlyT2::Cre. وتمثل الخطوط المتقطعة مخطط الرمادية وسطحية القرن الظهرية للنخاع الشوكي. تغيير حجم أشرطة ج = 1 مم، د = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: التلاعب الوظيفية Cre العمود الفقري-الإعراب عن الخلايا العصبية جليسينيرجيك
(ألف + باء) الرسم التوضيحي التخطيطي لحقن إينتراسبينال AAV1. EF1a.flex.DTA (أ) أو AAV1. EF1a.flex.hM3Dq (ب) في الحبل الشوكي القطني. التعبير تعتمد على لجنة المساواة العرقية من الخناق (الدفتريا) والتكسينية جزء A (DTA) سيؤدي إلى الاجتثاث من الخلايا العصبية (GlyT2 +) جليسينيرجيك (A)، بينما تعتمد لجنة المساواة العرقية على التعبير عن hM3Dq فارماكوجينيتيك مستقبلات مصمم سيجعل الخلايا العصبية GlyT2 أكتيفاتابل من الكلوزابين-N-أكسيد (CNO) (ب). (ج) ثلاث حقنات من AAV1. EF1a.flex.DTA إلى شرائح L3-L5 الفئران GlyT2::Cre أدت إلى فقدان ملحوظ للخلايا العصبية المثبطة في قطاعات كل منها عن ولكن ليس على الجانب كونترالاتيرال. (د) آثار فقدان GlyT2 الخلايا العصبية فرط حساسية طويلة الأمد لحفز فراي فون الميكانيكية في مخلب هند عن الفئران GlyT2::Cre حقن AAV1. EF1a.flex.DTA، ولكن أي تغيير قد لوحظ إذا تم حقن الفئران سالب لجنة المساواة العرقية. (ه) فقدان GlyT2 الخلايا العصبية أثارت عفوية السلوك البرود يذكرنا بحكة مزمنة. (و) hM3Dq بوساطة تنشيط الخلايا العصبية GlyT2 تخفيف الألم الميكانيكية الضارة أثارت قبل التحفيز المزعجة. (ز) hM3Dq بوساطة تنشيط الخلايا العصبية GlyT2 تخفيض بروريتوجين (الكلوروكين أو الهيستامين)-أثارت السلوك البرود. وتمثل البيانات كمتوسط ± sem. * * * ف < 0.001؛ ف < 0.01. تغيير حجم شريط ج = 1 ملم. ز = غراما. يتم إعادة استخدام الصور وتعديلها من الحضانة et al. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: العلامات الوراثية والفيروسات بوساطة الخلايا معربا عن RORβ. (أ) رسم تخطيطي يوضح استراتيجية تعتمد لجنة المساواة العرقية على التعبير عن مراسل تدتوماتو الفلورية في RORβلجنة المساواة العرقية؛ Rosa26لوكس-توقف-لوكس-تدتوماتو (R26توم) الفئران. (ب) إيمونوستاينينج على أقسام النخاع الشوكي من RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران كشفت عن أنه يمكن إيجاد الخلايا العصبية NeuN + RORβ-توم في عن من الأول إلى الرابع. (ج) لجنة المساواة العرقية-تعتمد على التعبير عن تدتوماتو كما لوحظ في توصيني + الخلايا من RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران، مما يوحي بأن أعرب عن RORβ في أستروسيتيس أثناء التطوير. تشير رؤوس الأسهم astrocytes المسمى مزدوجة في الصفيحة الثالث. (د) رسم تخطيطي يوضح حقن إينتراسبينال من الفيروسات إف-فليكس-توم (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) في الفئران RORβلجنة المساواة العرقية إلى محرك الأقراص المحلي لجنة المساواة العرقية-تعتمد على التعبير من تدتوماتو. (ه) إيمونوستينينج في أقسام النخاع الشوكي من الفئران RORβلجنة المساواة العرقية الذين تم حقنهم بالفيروس إف-فليكس-توم. توم RORβ الخلايا العصبية كانت المترجمة إلى سطحية عن القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري، والتعبير عن تدتوماتو كان غائبا من أستروسيتيس. (و) النسبة المئوية من توم RORβ الخلايا معربا عن علامة العصبية NeuN في أقسام العمود الفقري من RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران والفئران RORβلجنة المساواة العرقية الذين تم حقنهم بالفيروس إف-فليكس-توم. (ز-ح) إيمونوستينينج على أقسام النخاع الشوكي من RORβ (ز) لجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران والفئران RORβ (ح) لجنة المساواة العرقية الذين تم حقنهم بالفيروس إف-فليكس-توم عرض كولوكاليزيشن بين الخلايا العصبية RORβ-توم وعلامة المثبطة Pax2 أو علامة ضادات Lmx1b. (ط) النسبة المئوية من توم RORβ الخلايا العصبية الإعراب عن Lmx1b و Pax2 في RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران والفئران RORβلجنة المساواة العرقية الذين تم حقنهم بالفيروس إف-توم. وتمثل البيانات كمتوسط ± sem. بيانات مأخوذة من الفئران 2-3 و 1-3 أقسام كل الماوس. تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر (ب، ه) و 20 ميكرومتر (ج، ه في الصور عالية التكبير، و زاي ، و حاء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

متغير تعيين القيمة وحدة
الحرارة (H) 450 -(القيمة النسبية لطاقة الحرارة الإشعاعية)
قوة الجذب الأولية (F(TH)) 20 --(قيمة متناسبة مع الجهد المطبقة على قوة لفائف)
عتبة المسافة (s(TH)) 25 0.12 ملم
تأخير هيتستوب (t(H)) 30 0.5 مللي ثانية
هيتستوب المسافة (s(H)) 0 0.12 ملم
تأخير الانسحاب 1 (t(F1)) 200 0.5 مللي ثانية
قوة الجذب 1 (F1) 300 --(قيمة متناسبة مع الجهد المطبقة على قوة لفائف)
بعد سحب 2 (s(F2)) 30 0.12 ملم
قوة الجذب 2 (F2) 600 --(قيمة متناسبة مع الجهد المطبقة على قوة لفائف)
ضبط (AD) 0 -

الجدول 1: ساحبة الإعدادات

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حقن إينتراسبينال من آفس قد أصبحت تقنية قوية في مختبر لبحوث، مما يتيح تحليل خلايا العمود الفقري مع حل زمنية ومكانية عالية. هذا البروتوكول يمكن توصيل من ثلاثة أجزاء العمود الفقري الرئيسي معصب من الخلايا العصبية الحسية تمتد على محاور عصبية طرفية اللكتات. وتنتج ترانسدوسينج ثلاثة أجزاء البيانات السلوكية قوية واستنساخه. ويمكن أيضا اختبار لمنطقة حسية أكبر مما كان ممكناً بعد حقنه واحدة إينتراسبينال. على سبيل المثال، يسمح نظام حقن نفسه للاختبار في مخلب (فون فراي، هارجريفز، إلخ) والفخذ (الحقن داخل الأدمة، تحفيز مستقبلات mechano)، وبالتالي توسيع طرائق الحسية التي يمكن معالجتها.

خطوات حاسمة:

هناك العديد من الخطوات الهامة للحصول على بيانات قوية المورفولوجية والسلوكية وتجنب المصنوعات اليدوية. تصميم النواقل الفيروسية واختيار المروج والنمط المصلي المسيطر يمكن أن يكون لها تأثير قوي على كفاءة توصيل ومدى من منطقة ترانسدوسيد، ومن ثم على النتائج السلوكية (لمزيد من التفاصيل حول انتشار الفيروس وكفاءة توصيل، انظر 12)-الاستعدادات فيروسية عالية الجودة المطلوبة للتقليل إلى أدنى حد من الآثار الجانبية لحقن الفيروس، الذي يمكن أن يحدث إذا الملوثات أو خلية الحطام موجودة في حل الفيروس. الجراحة مطلوبة لحقن الحبل الشوكي قد يضطلع بعناية كبيرة تجنبا للمصنوعات اليدوية المورفولوجية والسلوكية الأخذ بعملية جراحية. مطلوب عناية خاصة في التعامل مع الحبل الشوكي، خاصة خلال في الصفيحة وانثقاب دوراً مع الإبرة. الضرر للحبل الشوكي يمكن أن يعوق الأحاسيس الجسدية والتنسيق الحركي من الماوس، وبالتالي المساس بأي تجارب السلوكية المخططة. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن التجمع حقنه بعناية. الجمعية غير لائق أو انسداد ميكروبيبيتي يمكن أن تعوق هذه التجربة. وقد أنسجة العمود الفقري في موقع الحقن لفحصها في نهاية التجربة بغية التحقق من نجاح الحقن وتوصيل لمنطقة حقن واستبعاد تلف الأنسجة المفرط نتيجة لعملية جراحية. قد تستخدم هذا البروتوكول التتر الفيروسية حتى بتركيز 1 × 1013 GC/مل دون سمية واضحة، ولكن التتر أعلى من الفيروسات قد تصبح سامة عند نقطة معينة في الوقت. وباﻹضافة إلى ذلك، سمية على الأرجح ستعتمد أيضا على البروتين مرمزة بواسطة إف حقن.

التعديلات:

يمكن تكييفها للسكان الخلايا العصبية والسؤال البحثي دراسة العديد من المعلمات في البروتوكول. حقن 300 nL الفيروسات الحل على عمق 300 ميكرون يؤدي إلى توصيل الخلايا العصبية في جميع أنحاء، والغالب في القرن الأفريقي الظهرية. إذا كان الهدف هدف العصبية كذلك البطني، يمكن تعديلها العمق. حقن كميات أكبر من الفيروسات (قد استخدمنا يصل إلى 500 nL للحقنة) سوف يؤدي إلى انتشار أكبر في دورسوفينترال واتجاهات روستروكودال. وهذا قد يكون مفيداً لتحقيق استهداف خلايا إضافية في مدى روستروكودال، ولكن يمكن أن تزيد من امتداد للجانب كونترالاتيرال، التي قد تعيق استخدام الجانب contralateral كرقابة داخلية. وبالإضافة إلى ذلك، ستزيد نطاق الخلايا ترانسدوسيد دورسوفينترال، الذي قد يكون التأثير المطلوب أو ينبغي تجنبها. حقن 300 nL على عمق الجانب 300 ميكرون تجنب الآثار في التحكم في المحركات في الفئران GlyT2::Cre، بينما حقن 500 nL أو الحقن على عمق أكبر تنتج أحياناً تعمل المحركات، مثل تمديد التشنجي اللكتات (البيانات لا تظهر). يمكن استخدام الحقن بكميات أصغر للحد من استهداف لأكثر المناطق المحصورة5. عيار الفيروسية هو آخر المعلمات التي يمكن تعديلها، وفي الواقع ينبغي أن تحدد لكل الفيروسات. مستويات منخفضة من التعبير للسموم البكتيرية، مثل DTA ذات كفاءة عالية، قد تكون كافية لحمل النتيجة المرجوة، بينما التتر أعلى للصحفيين الفلورسنت ودريدس، قد تكون ضرورية للتعبير يمكن كشفها أو فعالة.

أهمية الأسلوب فيما يتعلق بالأساليب القائمة البديلة:

وحتى الآن، استخدمت أساسا اثنين من التقنيات لاستجواب وظيفيا الدارات العصبية اللازمة لنقل الإشارات الحسية. واستخدمت العديد من الباحثين حقن إينتراسبينال راف الترميز لمراسل والمستجيب البروتينات في الفئران الإعراب عن ريكومبيناسي من أجل تسمية والتلاعب في العمود الفقري العصبية من الفئات السكانية الفرعية. حقن إينتراسبينال كأسلوب التعامل مع خلايا العمود الفقري قد سبق وصف15،16. البروتوكول الواردة هنا صمم خصيصا ترانسدوسي الخلايا العصبية المسماة وراثيا في ثلاثة أجزاء متتالية من الحبل الشوكي القطني مع التقليل من التلاعب بالعمليات الجراحية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع اثنين من الحقن الثلاث في الفضاء الفقرية روسترال ووالذيليه T13 فقرات والثانية، بحفر حفرة في T13 لحقن الثالثة بدلاً من إزالة الفقرات. شرائح L3-L5 المستهدفة هي منطقة إنهاء الرئيسي للخلايا العصبية الحسية إينيرفاتينج اللكتات. ونحن تبين أن هذا النوع من توصيل كافية لإحداث تغيرات سلوكية قوية بعد التلاعب بالخلايا العصبية جليسينيرجيك، وتشير إلى أنها مناسبة لتحليل مجموعة متنوعة من مختلف الخلايا العصبية العمود الفقري وراثيا المسمى.

ويستند الأسلوب الثاني الذي تم استخدامه من أجل التعامل مع وظيفة العمود الفقري العصبية مجموعات فرعية عبور الحيوانات المحورة وراثيا. هنا، يكون الفئران معربا عن ريكومبيناسي في مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية في العمود الفقري لتكون متقاطعة للفئران مراسل تحقيقا للتعبير عن علامة المطلوب أو البروتين المستجيب بفرعيه الخلايا العصبية كل منهما17،18، 19-لتوضيح بعض الخلافات التي يمكن أن تحدث عند مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام الفئران مراسل أو حقن فيروس إينتراسبينال نحن أما عبر RORβCre تدق في الحيوانات إلى ماوس مراسل تعتمد على لجنة المساواة العرقية أو حقن RORβ لجنة المساواة العرقية الفئران مع راف مراسل تعتمد على لجنة المساواة العرقية. نحن مقارنة التعبير الجيني مراسل حصل من راف مراسل الجينات التي تم الحصول عليها في RORβلجنة المساواة العرقية؛ R26توم الفئران. وقيدت مراسل الجينات التي تم الحصول عليها من حقن راف Cre-تعتمد على إينتراسبينال للخلايا العصبية للحبل الشوكي، بينما مراسل R26توم التعبير أثارت الماوس تدتوماتو موجود أيضا في أستروسيتيس. وهذا يوحي بأن RORβ وهو أعرب عن عابر في أستروسيتيس. وبالمثل، وجد جوتيريز-ميسيناس et al. تعبير مراسل أكثر تقييداً (مكانياً ونوع الخلية المحددة) بعد حقن الفيروسي مقارنة بتعبير مراسل أثارت الماوس في الفئران Tac1Cre 20. باستخدام الحقن إينتراسبينال مراسل راف في الحبل الشوكي من الفئران الكبار، يمكن أن المراسل و/أو المستجيب التعبير الجيني كفاءة يقتصر على سكان الخلايا التي التعبير عن الجينات في الكبار، وبالتالي تفادي جزئ/التعبير في هؤلاء السكان بنشاط الجينات عابرة سابقة.

ميزة رئيسية ثانية للحقن راف إينتراسبينال هو القدرة على تقييد التعبير عن الجينات المرمزة راف إلى موقع الحقن. في الفئران المعدلة وراثيا، التعبير السائق بوساطة لجنة المساواة العرقية غالباً ما لم يتم فقط العثور على في يتدنى العصبية من الفائدة، بل أيضا في سائر السكان داخل الجهاز العصبي. ديميكي والزملاء، فضلا عن مجموعات Ma وغولدنغ، تطورت طرق أنيقة من استخدام النهج المستندة إلى الماوس مراسل المتعدد الجوانب الذي تجنب جزئ في أجزاء من الجهاز العصبي التي تظل دون تغيير17، 18،،من1921،،من2223. استخدام تدق في الفئران للحصول على تعبير البروتينات علامة أو المستجيب أيضا يمكن أن يفترض أن يكون أقل متغير، كما أن هناك نسخة واحدة فقط الجينوم من كاسيت تعبير كل منهما كل خلية وكاسيت التعبير موجود في كافة الخلايا الموجودة في المنطقة لمصلحة . وفي المقابل، وجود كاسيت تعبير الخاصة بكل منها، وكذلك عدد نسخ الكاسيت التعبير بعد توصيل الفيروسية تعتمد على كفاءة توصيل، التي قد تختلف من خلية إلى خلية ومن الحقن بالحقن، ويعتمد على هناك الكثير من الفيروسات. وأخيراً، العيب الرئيسي في التعبير الجيني بوساطة الفيروسات عبر الطرق الوراثية التقليدية هو ضرورة الجراحة. جراحة بوساطة الإصابة/التهاب قد تؤثر على الخلايا العصبية والدوائر مباشرة. ولذلك إدراج مكافحة الفئران التي خضعت لعملية جراحية نفس إلزامية.

التطبيقات المستقبلية:

يمكن استخدام حقن إينتراسبينال لتحليل ومعالجة أي يتدنى العمود الفقري وراثيا التي تم تحديدها من خلال overexpression بروتينات ماركر والمستجيب. في المستقبل فمن المحتمل كثير سوف تعتمد هذا الأسلوب لدراسة السكان الخلايا العصبية في تركيزها محددة. وعلاوة على ذلك، إلى جانب استخدام حقن إينتراسبينال رافس لتحقيق overexpression بروتينات المستجيب خارجية، هذا الأسلوب يمكن أيضا استخدامها للبروتينات الذاتية الصمت أو أوفيريكسبريس وذلك لدراسة وظيفة أي جين معين مع ارتفاع المكانية والأزمنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر هانز أولريتش زيلهوفير لسخاء في دعم هذا العمل. وأيد ويلدنير هندريك مؤسسة أولغا مايينفيش. ونحن نشكر كارمن بيرتشميير لجسم Lmx1b.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)
Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11, (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89, (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92, (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508, (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91, (6), 1413 (2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85, (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93, (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87, (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13, (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125, (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168, (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33, (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350, (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160, (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159, (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158, (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35, (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63, (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics