הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מניפולציה סלקטיבי של עמוד השדרה subpopulations עצביים בעיקר הושגה על ידי שתי שיטות שונות: 1) גנטיקה Intersectional, לפיה העכברים הטרנסגניים כפולים או משולשים נוצרים על מנת להשיג ביטוי סלקטיבי של הכתב או אפקטור . ג'ין (למשל, ממיקומה Rosa26) באוכלוסייה הרצוי בעמוד השדרה. 2) הזרקה תוך ב- Cre תלוית רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV); כאן וקטורים תלויי-Cre AAV קידוד הגן כתב או אפקטור להתמקד מוזרקים לתוך חוט השדרה של עכברים לבטא recombinase Cre ב subpopulation עצביים הרצוי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור וקטורים rAAV תלויי-Cre, כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני מגזרים L3-L5 עם rAAVs. כמו הקטעים בעמוד השדרה המותני L3-L5 הם innervated על ידי אלה החישה הניריונים היקפיים, המעבירים מידע חושי hindlimbs, ניתן הספונטניות, תגובות החישה בדיקות ליישם את hindlimb חולשת לצד הזרקה נותחו על מנת לחקור את הפונקציה של הנוירונים מניפולציה בעיבוד חושי. אנו מספקים דוגמאות כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לנתח גנטית מוגדרת על ידי קבוצות משנה של נוירונים בעמוד השדרה. היתרונות העיקריים של וירוס בתיווך transgene ביטוי Cre העכברים הטרנסגניים בהשוואה העיתונאי הקלאסית transgene העכבר-induced ביטוי הן הבאות: 1) rAAVs תלויי-Cre שונים קידוד חלבונים כתב או אפקטור שונים יכול להיות מוזרק Cre הטרנסגניים שורה אחת, ובכך להתגבר על הצורך ליצור עכבר הטרנסגניים מרובים במספר שורות. 2) הזרקה תוך מגביל מניפולציה של התאים לבטא-Cre ההזרקה, הפעם לאחר ההזרקה. החסרונות העיקריים הם: 1) כתב ביטוי גנים של rAAVs הוא משתנה נוסף. 2) הניתוח נדרש מגלי הנוירונים בעמוד השדרה של עניין. וזה מתאים יותר משתי השיטות תלוי נוירון האוכלוסייה ומחקר השאלה יש לטפל.

Introduction

חוט השדרה הגבי חיוני חילופי מידע בין הפריפריה של הגוף והמוח. גירויים כגון חום, קור, מגע, או גירויים יתמודד מזוהים על ידי נוירונים היקפיים מיוחדים, אשר מעבירים את המידע הזה נוירונים של הקרן הגבי של חוט השדרה. . הנה, רשת מורכבת של interneurons מעכבות, מעוררים שמחליש, בסופו של דבר ממסרי מידע חושי באמצעות הקרנה בעמוד השדרה נוירונים כדי supraspinal אתרים1,2. חישובי שביצעו השדרה אינטר-הקרנה נוירונים בשער המידע החושי, ובכך לקבוע איזה מידע הוא לדכא או מועבר בעוצמה אילו. שינויים קליטת גירויים, כגון איזון שונה בין עיכוב ו עירור, עלולים לגרום תפקוד חושי כגון רגישות יתר או allodynia (כואב תחושות לאחר גירוי שאינו מכאיב בדרך כלל). שינויים אלה הם חשבו להיות שהגורם הבסיסי של כאב כרוני שונים קובע3,4. לפיכך, מעגלים בעמוד השדרה הם בעלי חשיבות גבוהה בעיבוד חושי ומכאן בתפיסת העצמי וסביבה של אורגניזם. עם כניסתו האחרונה, שילוב של מולקולרית, גנטי, ואת טכניקות ניתוחיות המאפשרות מניפולציה מדויק של נוירון בעמוד השדרה גנטית מזוהה subpopulations, מדענים עכשיו מתחיל להבין את המעגלים בעמוד השדרה הבסיסית אחראי על העיבוד של שיטות חושית ברורים.

הזרקה תוך של rAAV לתוך עכברים פראי-סוג או הטרנסגניים תרם באופן משמעותי אל מניפולציה, ניתוח, הבנה של הפונקציה של הנדונים של נוירונים בעמוד השדרה5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. טכניקה זו מאפשרת המסירה של סמן חלבונים (כגון GFP / GFP פיוז'ן חלבונים), כתב חלבונים (כגון GCaMP), או אפקטור חלבונים (כגון חיידקים רעלים, channelrhodopsin או קולטני pharmacogenetic) ב במרחב באופן מוגבל את הנוירונים בעמוד השדרה. הזרקה מקומית של rAAVs תלויי-Cre לתוך העכברים הטרנסגניים לבטא Cre recombinase בקבוצת משנה ספציפית של נוירונים בעמוד השדרה מאפשר ניתוח מסוים של האוכלוסייה עצביים בהתאמה. לנו המועסקים טכניקה זו תווית, ablate, לעכב או להפעיל את glycinergic בעמוד השדרה נוירונים והוכח כי הם חלק חיוני של השער בעמוד השדרה שולט כאב, גירוד שידור7. בניסויים אלה, תוך הזרקה של rAAV תלויי-Cre לתוך GlyT2::Cre עכברים להפעיל מניפולציה סלקטיבי של glycinergic הנוירונים בחוט השדרה המותני. ובכך, ניתן להימנע מניפולציה סימולטני של מעגלים supraspinal המכילים glycinergic נוירונים קריטי להישרדותה של החיה.

בזמן זריקה תוך של rAAVs מגביל זיהום לאתר של הזרקת, התמרה חושית ויראלי יכול להתרחש לא רק בנוירונים המקומי, אלא גם בנוירונים להתחבר ההזרקה דרך עצב תחזיות. האחרון משמש לעתים קרובות לאזורים CNS מעקב לספק קלט עצביים גרעין מסוים במוח. הזיהום של תחזיות עצב, עם זאת, ניתן גם גורם מבלבלים כאשר אוכלוסיה מוגדרים של נוירונים להילמד באתר מסוים. כדי לטפל בבעיות אלה, לאחרונה ערכנו ניתוח מקיף של AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם, קסטות הביטוי לזהות אשר נגרמו מהזנים אליהם ואת היזמים יכול לשמש כדי להקטין או להגדיל את התמרה חושית רטרוגרדית. בהקשר של מחקר ספציפי זה ב מעגלים בעמוד השדרה, ניתחנו את היכולת של שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם, היזמים retrogradely מגלי נוירונים של גרעיני הבסיס העזוב (DRG), rostral ventromedial לשד (RVM) ו קליפת המגע 12. לכן ניתן להשתמש בטכניקה המתוארות ב פרוטוקול זה לנתח נוירונים בעמוד השדרה במקום ההזרקה או לנתח נוירונים הקרנה לספק קלט לאתר מוזרק של חוט השדרה. בפרוטוקול המתוארים כאן, כולל שלוש זריקות של rAAV בצד השמאלי של עמוד השדרה המותני מבוצעות כדי לאפשר התמרה חושית של נוירונים לשלושה חלקים המותני (L3-L5). המקטעים L3-L5 לקבל את רוב הקלט החושי hindlimb חולשת באתר הזרקת. נדגים כי מניפולציה פונקציונלי של נוירונים גנטית שכותרתו ב L3-L5 מספיקה לעורר שינויים התנהגותיים חזקים, ובכך לספק ראיות פונקציונלי עבור הפונקציה מעגל של כזה תת סוג תווית גנטית נוירון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי המשרד הווטרינרי הקנטונים שוויצרי (ציריך), נמצאים בהתאמה ותאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים.

הערה: כל החומרים יחד עם יצרני בהתאמה ו/או לספקים רשומים לפי הטבלה של חומרים.

1. דור של וקטורים תלויי-Cre AAV

הערה: מגוון רחב של וקטורים תלויי-Cre עם היזמים השונים ניתן לרכוש (ראה טבלה של חומרים) או, אם הבונה ביטוי הרצויה אינה זמינה, זה יכול להיווצר על-ידי שינוי בונה AAV הקיים. שימו לב, יזם של serotype יכולה להיות לו השפעה על התפשטות התמרה חושית ויראלי (ראה 12). החלק הראשון של פרוטוקול זה מתאר בקצרה את הדור של שני וקטורים תלויי-Cre AAV שונים מתאימים בשביל רווח הפסד של הפונקציה ניסויים, בהתאמה.

  1. Pharmacogenetic הפעלה (רווח של פונקציה)
    1. סדר pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (ראה טבלה של חומרים) עבור מעצבים קולטנים מופעל באופן בלעדי על ידי מעצב סמים (DREADD)-מתווכת הפעלה.
    2. עם קבלת התרבות חיידקי דקירה, פס החוצה חיידקים על צלחות ליברות (אגר בקטריולוגית-כיתה מומס בינוני נוזלי לוריא-Bertani) בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס ולבחור שמושבה בודדת ביום הבא.
      הערה: פלסמידים המכיל AAV וקטור הגנום יכול להיות לא יציב וחוזר רקומבינציה של הגנום הנגיפי, בעיקר בתוך הטרמינל הפוכה ויראלי (ITR), יכול להתרחש במהלך הגברה ב e. coli. אנו מציעים שימוש רקה לקויה /-מודחקים זנים כאלה כמו MDS42 או Stbl3 כדי להימנע רקומבינציה בתוך פלסמיד המכיל את הגנום AAV.
    3. להגביר את ההוראות שניתנו על ידי הספק של הנבחרת חיידקים ה-DNA-מקסי-ערכת ולהכין דנ א פלסמיד באיכות גבוהה עם זמינים מסחרית DNA-מקסי-ערכת (למשל, ראה טבלה של חומרים). לבצע בקרת איכות של התכשיר דנ א פלסמיד על-ידי אימות את תקינות ואת זהותו של פלסמיד הדנ א באמצעות הגבלת תקציר aliquot של פלסמיד הדנ א.
      הערה: ישנם אתרים זיהוי עבור endonuclease הגבלת מרק פורטנוי בתוך ITRs. כולל תקציר מרק פורטנוי בקרת האיכות כדי לוודא את תקינות ITRs.
    4. לשלוח את ה-DNA מתקן הליבה וקטור ויראלי כדי לייצר באיכות גבוהה rAAV.
      הערה: כייל נוגדנים גבוה, preps ויראלי באיכות גבוהה הן חיוני כדי למנוע בלבול פנוטיפים נגרם על-ידי מציג ב ההכנות ויראלי. לכן מומלץ שיש את rAAV של בחירה המיוצר במתקן הליבה וקטור הוקמה, אלא אם כן הייצור AAV מעוגנת היטב במעבדה.
  2. אבלציה (אובדן תפקוד)
    הערה: טוקסינים חיידקיים או קולטני הרעלן יכול לשמש כדי לתווך תא אבלציה או להשתיק עצביים. יש לנו שנוצר pAAV.EF1α.flex.DTA למקטע אקספרס דיפטריה טוקסין A (DTA) באופן תלוי-Cre.
    1. כדי להפיק וקטור ויראלי תלויי-Cre, לבחור וקטור תלויי-Cre עם מקדם מתאימים (לדוגמה, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). להגביר את רצף קידוד של בחירה (למשל, DTA) על ידי תגובת שרשרת פולימראזית עם צבעי יסוד הכוללים AscI ו NheI או תואם הגבלת endonuclease זיהוי אתרים ב שלהם המסוכך (ראה פוסטר. et al. 7)
    2. באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית סטנדרטי, לבצע מעכל ההגבלה של וקטור דנ א (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) והכנס של ה-PCR-מוגבר (NheI-DTA-AscI) עם endonucleases הגבלה AscI ו- NheI. מאתרים ומפסיקים את השברים מטוהרים.
    3. להפוך את התגובה מצדו לתוך החיידקים מתאימים, לפי הפרוטוקול שניתנו על ידי הספק של החיידק המוסמכים של בחירה, ו צלחת את החיידקים על גבי לוחות ליברות. השתמש רקה לקויה /-מודחקים זנים, כגון MDS42 או Stbl3, לקראת שיבוט, הגברה עוקבות של פלסמיד הדנ א.
    4. ביום לאחר השינוי, לבחור שיבוטים, לחסן אותם במדיום LB בתוספת הלילה אנטיביוטי המתאים ב- 37 מעלות צלזיוס. ביום הבא, לחלץ פלסמיד DNA מ חיידקים בתרבית. ודא מוצלחת שיבוט על ידי הגבלת מעכל רצף של פלסמיד שחולצו הדנ א.
    5. להגביר את איכות גבוהה, פלסמיד חיידקי ה-DNA (ראה שלב 1.1.3). שלח DNA מוגבר למתקן הליבה של וקטור ויראלי לייצור וירוס.

2. התמרה חושית של תאים בעמוד השדרה

  1. הכנת וירוס פתרון
    התראה: וירוסים זיהומיות ריאגנטים, צריך להיות מטופל על פי הנחיות הרלוונטיים. ברוב המקרים, ניתן לטפל rAAVs ברמת אבטחה 1 (BSL1).
    1. ביום של הזרקת, הפשרה של aliquot מניות של הנגיף מטוהרים הרצוי על הקרח ולשמור אותו על הקרח עד ישירות לפני הזריקה. הימנע חוזרות ההקפאה-הפשרה-מחזורי, כמו אלו יפחיתו את כייל יעיל של הנגיף.
      הערה: אם יש צורך, הווירוס defrosted aliquot ניתן לשמור ב 4 ° C עד 3 ימים.
    2. לדלל את חלקיקי וירוס סטרילי 0.9% NaCl או פוספט buffered תמיסת מלח (PBS).
      הערה: כייל המתאים תלוי מטרות הניסוי, צריך להיות נחוש השפעול. עומס נגיפי הכולל טובה היא להתחיל עם 3 x 109 הגנום עותקים (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL מוזרק). עודף ובמעשי מאובדן בעת טעינת את נימי לתוך חשבון, יהיה צורך בערך 2.5 µL של וירוס פתרון עבור כל עכבר.
  2. הכנת Micropipettes לזריקות תוך
    1. 'למשוך' נימים דקים-קיר זכוכית (הקוטר החיצוני 1 מ מ)-פולר micropipette ליצירת ~5.5 מ מ אורך, רדוד shank. השתמש פילמנט החימום של 3.0 מ מ והגדרות של תוכנית 00 עם P(A) הותאם כמו טבלה 1.
      הערה: משיכת יכול להיעשות מראש. הנימים משך לאחסן במיכל סגור על בפלסטלינה כדי למנוע אבק, אשר מאוחר יותר יכול לסתום את micropipette. Autoclaving של micropipettes אינה נחוצה.
    2. קליפ את הדוקרן של נימי משך עם laminectomy מלקחיים באורך של 4.5 עד 5 מ מ כדי ליצור קצה פתיחת עם הקוטר הפנימי של 25-35 μm. באמצעות מיקרוסקופ עם קנה מידה מיקרומטר, למדוד את הקוטר הפנימי של מספר micropipettes כדי לקבל תחושה כמה גדול הפתח צריך להיות או למדוד עבור כל micropipette.
      הערה: טיפ קטן יותר יכול להוביל סתימת; טיפ גדול עלול לגרום נזק לרקמות וקשיים לחדור חוט השדרה.
  3. הכנת כלים וההתקנה כירורגי
    1. ודא הציוד נקי ומוכן לשימוש. לחטא את משטח העבודה על ידי מנגב עם 70% אתנול ולחטא כלים על-ידי autoclaving או חיטוי אותם. אל תשאיר שום חומר חיטוי על המזרק microliter מה שיזיק וקטור ויראלי כדי לשמש.
  4. הכנה של החיה ניתוח והרדמה
    הערה: משך הזמן הכולל של הניתוח הוא 60-90 דקות.
    1. לבחור עכברים 6 עד 10 - בן שבועיים כדי להקל על הליך כירורגי.
      הערה: אם הנבחנים מחייב זאת, ההזרקה של בעלי חיים צעירים או בוגרים אפשרי. כל זן של שני המינים יכולים לשמש באופן עקרוני, אך להשתמש המתח מאותו הרקע (למשל, C57BL/6J) להשוואה של התנהגויות בין קווים העכבר הטרנסגניים שונים. אם סקס הבדלים צפויים או להיחקר, לנתח זכרים ונקבות בשתי קבוצות נפרדות.
    2. לגרום הרדמה באמצעות ~ 5% איזופלוריין. מקם את החיה במסגרת stereotaxic על מזרון חום ולשמור על הרדמה בבית 1-2.5% איזופלוריין (זרימת אוויר לדרג 900 mL/min). לנטר את קצב הנשימה במהלך הניתוח.
    3. להחיל משחה העין סיכה כדי למנוע ייבוש הקרנית במהלך הניתוח.
    4. לגלח הגב של החיה ולהסיר את השיער היטב עם במטלית לחה. לחטא את העור מגולח עם יודיפלור תמיסה ומאפשרים לעור יבש.
    5. לתת טיפול להרגעה (לדוגמה, 0.1-0.2 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously).
  5. חשיפת בעמודה השדרה ברמת חוט השדרה המותני
    הערה: עקב התפתחות דיפרנציאלית של חוט השדרה, את עמוד השדרה, הרמות בהתאמה שאינם מיושרים, אבל קטע חוט השדרה המותני L4 באותה רמה כמו החוליה בית החזה T13.
    1. אתר את זוג צלעות סימטרית ביותר על-ידי palpating לאורך עמוד השדרה. באמצעות אזמל, עושים חתך אורכי 1.5-2.5 ס מ לתוך העור החל רק rostral זוג צלעות הכי סימטרית.
    2. הרם את העור עם מלקחיים, הפרדתה של השריר המשמש כבסיס עם מספריים. במהלך הניתוח, לשמור את רקמות חשופות לחות עם סטרילי 0.9% NaCl.
    3. שימוש בסדר מלקחיים ומספריים קטנות, בחתך אל שכבת עלי הלוואי קרומיים הבא, רזה ממש ליד האמצע ולנתק אותו מפני תהליכי קוצניים. זה הוא נפרד מן השריר paraspinous הבסיסית, אך התהליכים קוצניים.
  6. זיהוי של החוליות ברמת חוט השדרה המותני
    הערה: לאחר בעמודה השדרה חשוף, הרצועות intertransverse ואת התהליכים קוצניים הגבי צריך להיות גלוי. מספר ציוני דרך אנטומי יכול לסייע בזיהוי החוליה הנכון למטרה (איור 1B).
    1. משוך את העור חזרה לכיוון הזנב לחשוף את האגן. באותה רמה, הזוג הכי סימטרית והרצועות intertransverse גלוי מצטרף תהליך L6 קוצניים. תספור לאחור בסימטרית כיוון rostral לזהות את החוליה של עניין.
    2. ימשש לאורך עמוד השדרה. זוג הצלעות הכי סימטרית ממוקם רק rostral את החוליה T13 והוא עצם הבושת ברמת היפ ברמה של החוליה L6.
    3. אתר המקום איפה הגיד לאורך צדי בעמודה השדרה הפרוע, ביותר המדיאלי. החוליה T13 ממוקם רק rostral. המקטע חוט השדרה המותני L4 ממוקם בתוך החוליה הזאת.
  7. קיבוע של עמוד השדרה, חשיפה של עמוד השדרה המותני
    1. מקם את החיה על גבי כרית של רקמות אגריגציה כדי להגביה את זה התפסים בעמוד השדרה של המסגרת stereotaxic.
    2. לתקן את החוליה היעד כדי להימנע מתנועות בעמודה השדרה עקב נשימה. למטרה זו, יישר את התפסים הסמוכים החוליה היעד, לתקן את המלחציים אחד בעמדה והחזק בעמודה השדרה עם מלקחיים לאדאמסון בעת לתקן את המלחציים השני.
      הערה: העמודה צריכה להיות בניצב למישור הזרקת ותוקנו בחוזקה כך הוא אינו זז בעת לחץ מלמעלה. במידת הצורך, ניתן לתקן זוג שני תופסנים עמוד השדרה. במקרה זה, זה שימושי כדי לתקן את שני זוגות מלחציים בחוליות שני סמוך החוליה היעד.
    3. הסר את השריר paraspinous מעל החוליות עניין. באמצעות אזמל, לבצע חתך במקביל המדיאלי רק כדי הגידים המקבילים ל עמוד השדרה, כמו גם חתכים בניצב rostral, סימטרית החוליה היעד. תיזהרי לא לחתוך עמוק. דמעה/גזור משם השריר באמצעות rongeurs. להשתמש מלקחיים לפי הצורך כדי להסיר רקמה שנותרו על החוליה או מעל השכבה הקשה של המוח במרחב בין-חולייתי.
    4. במרחב בין-חולייתי, כלי הדם הגבי צריך להיות גלוי סימון הקו האמצעי של חוט השדרה. לזריקות חד צדדית, לבצע laminectomy חלקית על ידי לקדוח חור באמצע של הצד היעד של החוליה. השתמש של רפואת שיניים בסדר קידוח מכשיר בחותך כדורי 0.5 מ מ, קודח בקפידה במיוחד כאשר אתם ניגשים חוט השדרה. הסר כל רסיסי עצם עם מחט משופע 26 גרם לחשוף את חוט השדרה.
    5. באמצעות מחט משופע 26 גרם, לנקב את דורא בתוך החור מסועף, במרחב בין-חולייתי rostral, סימטרית כדי החוליה היעד, כל כ 200 מיקרומטר לרוחב כלי דם הגבי. נוזל מוחי שדרתי צריך להיות בריחה מכל החורים, חוט השדרה צריך להיות מעט ותפוחות.
  8. הכנת המזרק הזרקה
    הערה: המזרק הזרקת צריך להיות מוכן מיד לפני תחילת ההזרקה כדי להפחית את הסיכון של חלקיקי אבק חוסם את micropipette.
    1. לטעון את נימי זכוכית לתוך מזרק microliter באמצעות דחיסת את המחט נשלף ערכת. הדקו את האגוז בחוזקה כדי להבטיח התאמה הדוקה ומאובטח.
    2. למלא את המזרק microliter עם מים מזוקקים סטריליים ולהתחיל הקשה על זה עם הבוכנה.
      הערה: אם יש בהתנגדות רבה מדי, כך המים אינה באה בקלות החוצה הקצה micropipette סביר נחסם ולאחר צריך להירכש.
    3. לטעון את המזרק אל micromanipulator מחובר microinjector מבוקר אלקטרונית. יש להיזהר לא לגעת בכלום micropipette.
    4. שימוש של microinjector, צייר למעלה כ 1 µL של אוויר כדי ליצור בועה בין המים את הוירוס.
    5. מקום 2.5 µL droplet של וירוס פתרון על חתיכת סרט פרפין, הזז בזהירות קצה micropipette לתוך ה-droplet באמצעות המסגרת stereotaxic, למשוך את זה. ואז בזהירות העיתונות לוותר עד קצת פתרון וירוס מתגלה בקצה.
    6. . משכי את המזרק, באמצעות עט, לסמן את micropipette עם קנה מידה ושים לב לרמת הפתרון וירוס; זה יקל את הפיקוח על החדרת מתקדם כשהתרגום מתוכנת.
  9. זריקות תוך
    1. להזיז את קצה micropipette מעל אחד החורים השכבה הקשה של המוח ואז ומטה, עד גומה קטנה נרשמה בהשכבה הקשה של המוח. כדי למקד את הזריקה ל הקרן בעמוד השדרה הגבי, העבר מיקרומטר 500 במרווחים של 100 מיקרומטר רצופים (מהירות מ מ 1/s), ואז 200 מיקרומטר למעלה לאפשר מייצב מכני של הרקמה.
      הערה: עומק הסופי של הקצה מיקרומטר 300 במקרה זה, אך ניתן להתאים בהתאם לאזור המטרה.
      1. אם הרקמה עמיד לחדירה, micropipette עשוי להיות תופס השכבה הקשה של המוח. במקרה זה, תמשוך ולהעביר מעט החמים החור, או להשתמש את המחט שוב כדי לנקב את דורא כראוי לפני חוזר ניסיון חדירה.
    2. לתכנת את המשאבה לאמצעי הזרקת היעד של 300 nL במהירות הזרקה של 50 nL/min ולחץ לחצן start כדי להתחיל את העירוי. התנגשות.
    3. לאחר הזריקה הושלם, בדוק את קנה המידה לראות אם רמת וירוס ירד ולהשאיר את micropipette במקום? 3 דקות נוספות לאפשר את הלחץ equilibrate לפני לאט פותחים את המזרק.
    4. חזור על שלב 2.9.1.-2.9.3. עבור הזרקה שני אתרים אחרים.
  10. תפירת ושחזור
    1. הסר את התפסים בעמוד השדרה את הכרית מתחת העכבר.
    2. לסגור את הפצע בשכבות עם קטע אוקיי, תפירת הרבדים רקמות שטחיות בתפרים נספגים ואת העור בתפרים נספגים. החל חומר חיטוי יוד על הפצע sutured.
    3. לסיים את ההרדמה ולהשאיר את החיה על השטיח חום עד זה יחלים לפני שחזר אותה לכלוב שלה הביתה.
  11. טיפול לאחר הניתוח
    1. מעקב של החיה ביום הניתוח, למחרת ולאחר מכן כל 2-3 ימים. להבטיח כי החיה יש שכזאת נורמלי, מראה בריא (משקל העיניים, פרווה, התנהגות), וכי הפצע מחלים.
    2. המשך טיפול להרגעה (לדוגמה, 0.1-0.2 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין subcutaneously) לפי הצורך, שלוש פעמים ביום.

3. התנהגותי, מורפולוגיים ניתוחים

  1. ניתוח התנהגותי
    הערה: מאפשרים לבעלי להכיל ההגדרות המתאימות לפחות 30 דקות לפני התחלת מדידות לתת להם להסתגל לסביבה ניסיוני חדש.
    1. מבחן פון פריי
      1. לחוד חיות לתוך תאים בודדים של בערך 10 ס"מ x 10 ס"מ על רצפת רשת מתכת.
      2. לעורר פני plantar hindpaw חולשת באתר ההזרקה עם נימה דינמי פון פריי. הערה הכוח שבו החיה נסוג כפת שלה מבית הגירוי.
      3. חזור על חמש פעמים ולחשב את סף ממוצע נסיגה מן המדידות 6 עבור כל חיה.
    2. בדיקת ה-pin
      1. מקום חיות לתוך תאים בודדים של בערך 10 ס"מ x 10 ס"מ על רצפת רשת מתכת.
      2. לעורר פני plantar hindpaw חולשת על ההזרקה עם מחט 26-G קהות ללא חדירה של העור. ציון התנהגות כאפס (אין תגובה), או אחד (תגובה).
      3. חזור על 9 פעמים עם מרווחים של 3 דקות בין stimulations, לחשב אחוז התגובה של המדידות 10 עבור כל חיה.
    3. הזרקה של DREADD-ליגנד קלוזאפין-N-אוקסיד (מפקדת)
      1. להמיס מפקדת דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות של 0.2 מ ג/µL, אשר ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.
      2. ביום של הניסוי, לדלל מניות פתרון סטרילי 0.9% NaCl כדי µg 0.2/µL ולהזריק 10 µL/גרם משקל intraperitoneally. מזריקים חיות בקרת רכב (דימתיל סולפוקסיד 0.2% ב- 0.9% NaCl).
        הערה: על פי הניסיון, שיא השפעות על התנהגויות יכול להיות h 1-3 הצפוי לאחר ההזרקה, אפקטים יחלשו לחלוטין לאחר 24 שעות. במקרה של ההפעלה של נוירונים glycinergic, נצפו התנהגויות כוללות תגובות בגירוד וכאב מופחת. התנהגויות עורר החשפות בתיווך DREADD של נוירונים תלויות המשנה יישוב של נוירונים בעמוד השדרה.
    4. הזרקה של Pruritogens כדי לגרום לגרד
      1. להמיס pruritogens ב- 0.9% NaCl לפתרונות של 8 מ"ג/מ"ל (כלורוקין) או 10 מ"ג/מ"ל (היסטמין). 2 h לאחר מפקדת הממשל, להזריק 10 µL של pruritogen או הרכב פתרון subcutaneously לתוך פני plantar hindpaw חולשת לאתר זריקה בעמוד השדרה. לחלופין, להזריק את pruritogen intradermally לתוך העגל, אשר יש התגלחתי יום לפני כדי להפחית התנהגות aversive הנגרמת על ידי הגילוח עצמה.
    5. מצלמים כדי לנתח Nocifensive ספונטנית או התנהגויות בגירוד הנוצרות על-ידי Pruritogen
      1. מקום חיות בנפרד לתוך תאים שקופים (כ- 10 ס מ קוטר) עם קצת תשתית מן הכלוב הבית בהתאמה שלהם על הרצפה.
      2. לצלם את החיות עבור 5 דקות רשומה ספונטנית, 30 דקות כדי להקליט התנהגויות הנוצרות על-ידי pruritogen. לנתח את קטעי וידאו מקוון פחים של 5 דקות.
    6. הכאב לעומת בגירוד התנהגויות
      1. להתבונן ורשום להירתע מלקקים, נושכים התנהגויות.
        הערה: להירתע וליקוקה של אתר המושפעים הם נחשבים התגובות כאב, ואילו לנשוך משויכת בגירוד.
      2. לנתח קטעי וידאו במהירות רגילה, למדוד את הזמן כי העכבר ליקוק או נשיכת האתר המושפעות או למדוד בהילוך איטי עבור הבחנה מדויקת בין מלקק ו בייטינג רפלקסים. לחלופין, לספור את מספר התקפי ליקוק/נשיכות/להירתע.
  2. ניתוח מורפולוגי
    1. לבצע המורפולוגיים מאחד עד שלושה שבועות לאחר ההזרקה של הוירוס או בסוף בניסוי התנהגותי.
      הערה: אנחנו זוהה eGFP ביטוי ברגע 48 שעות לאחר ההזרקה, אך גם מצאו כי הביטוי מגביר באופן משמעותי שתוך ימים, אפילו שבועות. עבור תאים עם ביטוי כתב חזק, שבוע אחד של דגירה (מ הזרקה תוך עד זלוף) עשוי להיות מספיק. עבור תאים עם ביטוי transgene חלש, וירוסים עם היזמים חלש או fluorophores חלשים, ביטוי ארוך עשוי להידרש כדי להבטיח רמות לגילוי.
    2. קיבוע הרקמה
      1. Perfuse כל transcardially העכבר, תחילה עם 20 מ של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי כקרח (כלנית חדד) פתרון (NaCl 125 מ"מ, NaHCO3 25 מ"מ,2PO NaH4 מ מ 1.25, D-גלוקוז 20 מ מ, אשלגן כלורי 2.5 ממ, CaCl2 2 מ"מ MgSO4 1 מ"מ), ואז עם 100 מ של 4% paraformaldehyde קר כקרח (במאגר 0.1 M סודיום פוספט, pH 7.4).
        התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
      2. מיד לנתח חוט השדרה המותני, פוסט-לתקן את הרקמה כבר שעתיים עם 4% paraformaldehyde על הקרח. בקצרה לשטוף את הרקמה שלאחר קבוע עם מאגר סודיום פוספט 0.1 M (pH 7.4), ואז דגירה זה בתמיסה 25% סוכרוז (0.1 M סודיום פוספט מאגר, pH 7.4) בן לילה ב 4 º C.
      3. חותכים את הרקמה cryoprotected μm 30-cryostat והר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ.
    3. Immunofluorescence מכתים
      1. לאחר שוטף קצר ב- PBS, החל μL 300 של חסימת פתרון (10% סרום חמור רגיל ב- 0.3% טריטון-PBS) על הסעיפים לשעה בטמפרטורת החדר.
      2. דגירה של השקופיות עם 300 μL בהתאמה השילובים האפשריים של ראשוני נוגדנים בחסימה פתרון (ראה טבלה של חומרים) במשך הלילה ב 4 º C. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- PBS.
      3. דגירה של השקופיות עם הצירופים המתאימים של נוגדנים משניים בפתרון החסימה לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- PBS.
      4. בקצרה לשטוף את השקופיות ddH2O, ולאחר מכן לטעון על coverslips באמצעות הרכבה פלורסנט בינוני.
      5. רוכשים פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצוידים עם סימן x 20 מטרה 40 x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את רמות הביטוי שניתן להשיג על ידי הזרקה תוך של rAAV קידוד סמן חלבון, הזרקנו קודם AAV1. CAG.eGFP לתוך חוט השדרה המותני של פראי-סוג עכברים. שלוש זריקות במרחק של-1 מ מ לגזרים המיוצר זיהום כמעט רציפה של מקטעי בעמוד השדרה המותני L3 L5 (איור 1 א'-C). הזרקת וירוס בעומק של 300 מיקרומטר מפני השטח בעמוד השדרה מוביל לזיהומים הדומיננטית של תאים בחורן הגבי חוט השדרה. עם זאת, תאים נגועים עלול להימצא גם ב הצופר הגחון (איור 1D). בשלב הבא, המטרה הייתה כדי להמחיש את ההבדל בביטוי בתיווך rAAV כאשר הזרקת rAAV תלויי-Cre לתוך עכבר Cre. לכן הזרקנו את AAV1 תלויי-Cre. וקטור CAG.flex.eGFP לתוך חוט השדרה של העכברים הטרנסגניים GlyT2::Cre. כמו בעבר, נצפתה eGFP ביטוי ב הצופר הגבי ו הגחון. עם זאת, כצפוי, הביטוי של eGFP הפך מוגבל יותר, המשקף את ההפצה של GlyT2 + הנוירונים, כלומר הביטוי דליל יחסית ב הצופר הגבי שטחית וביטוי צפופה ב הצופר עמוק הגבי (איור 1E).

בשלב הבא, כדי להדגים את הכדאיות של מיעון מעגל הפונקציה של עמוד השדרה subpopulations עצביים, שני AAVs תלויי-Cre שונים קידוד חלבונים שונים אפקטור (DTA ו- hM3Dq) היו מוזרק העכברים הטרנסגניים GlyT2::Cre. מקביל לביטוי ויראלי נצפתה לאחר שלוש זריקות של AAV1. CAG.eGFP לתוך פראי-סוג עכברים, היו חזקים אבלציה של נוירונים מעכבות (Pax2 +) בקטעים המותני L3-L5 לאחר ההזרקה של AAV1. EF1a.flex.DTA לתוך Glyt2::Cre עכברים (איור 2 אג). אובדן של נוירונים מעכבות glycinergic בקטעים האלה עורר רגישות יתר מכנית מסומן (איור דו-ממדי), התנהגות aversive ספונטנית מכוונים חולשת hindlimb (2E איור). ההתנהגות aversive הוביל נגעים עצמית, אשר יכול להיות שנצפו על כפות רגליים, עגל, ירך (עבור נתונים, ראה פוסטר. et al. 7) מול תופעות נצפו בעת הפעלה של glycinergic הנוירונים באמצעות הזרקה של AAV1.hSyn.flex.hM3Dq, הזרקה בקרום הבטן עוקבות של מפקדת (איור 2B). עכברים הפך האחד יתמודד גירוי מכני (איור 2F), גירויים רעילים אחרים (ראה פוסטר. et al. 7) בנוסף, כאשר מטופלים עם pruritogens היסטמין או כלורוקין, בתיווך hM3Dq ההפעלה של נוירונים glycinergic ביעילות מדכאת תגובות prurifensive (איור 2G). תוצאות אלו מדגימים כי שלוש זריקות של rAAV לתוך חוט השדרה המותני מסוגלים מגלי שטח של חוט השדרה המותני מספיק להתבונן חזקים שינויים התנהגותיים עורר על ידי גירוי של hindlimb המתאים.

סט הסופי של ניסויים, רצינו להדגים את ההבדלים פוטנציאל שימוש בעכברים כתב Cre בהשוואה Cre כתב וירוסים. לכן, גן הנהג Cre נבחר זה בעבר מתוארת כ מציג תבנית הביטוי מוגבל בחוט השדרה העכבר. הגן RORβ הוצע לבוא לידי ביטוי בעיקר interneurons מעכבות קרן עמוק הגבי13,14. במחקר זה נעשה שימוש RORβCre טוק-אין עכברים ועברנו אותם Rosa26סלומון-עצור-סלומון-tdTomato (R26טום) Cre כתב לעכברים, אשר להוביל הביטוי של tdTomato בתאים כל הצגת Cre ביטוי בכל נקודת זמן לפני ניתוח ( איור 3A). איפיון תאים tdTomato + RORβCre; R26טום עכברים התגלה ביטוי נוירונים, האסטרוציטים הקרן הגבי (איור 3Bג). למעשה, כימות של התאים tdTomato + הציע כי הרוב המכריע של תאים שעברו רקומבינציה בתיווך Cre (58%) היו ללא עצבית. אנחנו לאחר מכן מוזרק rAAV כתב tdTomato תלויי-Cre (AAV1. CAG.flex.tdTomato) לתוך חוט השדרה של עכברים P40 RORβCre (דמות תלת-ממד). בניגוד R26טום-מתווכת הביטוי העיתונאי, מצאנו את כל tdTomato + תאים עם תוויות על ידי וירוס כתב להיות נוירונים (איור 3EF). בסופו של דבר, ניתחנו את זהותו של הנוירונים tdTomato + שתי קבוצות של עכברים (RORβCre; R26טום , RORβCre הזריק AAV1. CAG.flex.tdTomato). בשני המקרים, רוב הנוירונים היו מעכבות (> 85%) לבין המיעוט של נוירונים סינאפסות (< 20%) (איור 3 G-אני), שבו הוא מסכים עם הערכות קודמות של זהותו של RORβ + נוירונים13,14.

Figure 1
איור 1: הזרקה תוך של AAV1-eGFP/AAV1-פלקס-eGFP
(א) איור סכמטי של זריקה תוך של AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) לתוך חוט השדרה המותני, אשר הוא innervated מ hindlimb. (B) מיקום אנטומי המקטעים חוט השדרה המותני L3-L4 ניתן לראות מלמעלה למטה תצוגה של החלק האחורי של עכבר. העור נפתח כדי לחשוף את עמוד השדרה. תהליכי בעמוד השדרה בחוליות T13-L6 נצבעים כהפניות אנטומיים, חץ המציין את האגן. (ג) תמונה ייצוגית של חוט השדרה המותני הר שלמה. קרינה פלואורסצנטית ירוק מציין אזורים transduced-וירוס של חוט השדרה. (ד) נציג תמונה של חתך דרך כבל AAV1-eGFP-transduced ' השדרה המותני של עכבר פראי-סוג. (ה) נציג תמונה של חתך רוחב של AAV1. CAG.flex.eGFP-transduced חוט השדרה של עכבר GlyT2::Cre. קווים מקווקווים מייצגים המתאר של החומר האפור, שטחי קרן הגבי של חוט השדרה. גודל ברים C = 1 מ"מ, D = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מניפולציה פונקציונלי לביטוי בעמוד השדרה Cre-נוירונים Glycinergic
(A + B) איור סכמטי של זריקה תוך של AAV1. EF1a.flex.DTA (א) או של AAV1. EF1a.flex.hM3Dq (B) לתוך חוט השדרה המותני. תלויי-Cre ביטוי של דיפטריה טוקסין קטע א' (DTA) יוביל אבלציה של נוירונים (GlyT2 +) glycinergic (א), בעוד תלויי-Cre הבעת קולטן מעצב pharmacogenetic hM3Dq יעבד הנוירונים GlyT2 activatable על ידי קלוזאפין-N-אוקסיד (מפקדת) (B). (ג) שלוש זריקות של AAV1. EF1a.flex.DTA למקטעים L3-L5 של עכברים GlyT2::Cre הוביל לאובדן מסומן של נוירונים מעכבות בקטעים בהתאמה את חולשת אך לא של הצד contralateral. (ד) אובדן של GlyT2 נוירונים עורר לטווח ארוך של רגישות יתר גירוי מכני פריי פון ביד האחוריות חולשת של עכברים GlyT2::Cre מוזרק עם AAV1. EF1a.flex.DTA, אך אין שינוי נצפתה אם הוזרקו עכברים Cre-שלילי. (ה) הפסד של GlyT2 נוירונים עורר התנהגות aversive ספונטנית מזכירה הגירוד כרוני. הפעלת בתיווך hM3Dq (F) של נוירונים GlyT2 הביאו להקלה יתמודד כאב מכני עורר מאת pinprick גירוי. הפעלת בתיווך hM3Dq (G) של נוירונים GlyT2 מופחת pruritogen (כלורוקין או היסטמין)-עורר aversive התנהגות. הנתונים מיוצגים בתור זאת אומרת ± ב- SEM. * * * p < 0.001; p < 0.01. קנה המידה של בר C = 1 מ מ. g = גרם. תמונות בהם שימוש חוזר, שונה פוסטר. et al. 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הגנטי של וירוס בתיווך תיוג של תאים לבטא RORβ. (א) דיאגרמה המציגה את האסטרטגיה לביטוי תלויי-Cre tdTomato פלורסנט כתב ב- RORβCre; Rosa26סלומון-עצור-סלומון-tdTomato (R26טום) עכברים. Immunostaining (B) על חוט השדרה חלקים של RORβCre; עכבריםטום R26 חשף כי ניתן למצוא NeuN + RORβ-טום נוירונים שנבזזו I-IV. (ג) ביטוי תלויי-Cre tdTomato נצפתה גם בתאים GFAP + של RORβCre; R26טום עכברים, רומז כי RORβ מתבטאת האסטרוציטים במהלך הפיתוח. ראשי חצים מצביעות על התווית על-ידי כפול האסטרוציטים בתוך הנדן השלישי. (ד) דיאגרמה המציגה תוך הזרקת וירוס AAV-פלקס-טום (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) לתוך RORβCre עכברים כונן מקומי תלויי-Cre כביטוי של tdTomato. Immunostaining (ה) על חוט השדרה חלקים של עכברים RORβCre מוזרק עם וירוס AAV-פלקס-טום. . טום RORβ נוירונים היו מקומית של סחוס שטחית של ' קרן ' בעמוד השדרה הגבי, ביטוי של tdTomato נעדר מן האסטרוציטים. (נ) אחוז של RORβ-טום תאים המבטאים את סמן עצביים NeuN בסעיפים בעמוד השדרה של RORβCre; עכבריםטום R26 ועכברים RORβCre מוזרק עם וירוס AAV-פלקס-טום. (G-H) Immunostaining במקטעי חוט השדרה של RORβ (G) Cre; עכבריםטום R26 ועכברים (H) RORβCre הזריק AAV-פלקס-טום שהנגיף colocalization בין נוירונים. טום RORβ, דה מרקר מעכבות Pax2 או את סמן סינאפסות Lmx1b. (א) אחוז של RORβ-טום נוירונים לבטא Lmx1b ו- Pax2 ב RORβCre; עכבריםטום R26 ועכברים RORβCre מוזרק עם וירוס AAV-טום. הנתונים מיוצגים בתור זאת אומרת ± נתונים ב- SEM הם 2-3 עכברים, סעיפים 1-3 לכל העכבר. סרגלי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר (B, E), 20 מיקרומטר (C, E בתמונות בהגדלה, G ו- H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משתנה ערך ערכת יחידה
חום (H) 450 -(ערך יחסי הכוח של החום הקרין)
כוח משיכה ראשונית (F(TH)) 20 -(ערך יחסי מתח להחיל כדי לאלץ את סליל)
מרחק סף (s(TH)) 25 0.12 מ מ
עיכוב heatstop (t(H)) 30 0.5 ms
מרחק heatstop (s(H)) 0 0.12 מ מ
עיכוב למשוך 1 (t(F1)) 200 0.5 ms
כוח משיכה 1 (F1) 300 -(ערך יחסי מתח להחיל כדי לאלץ את סליל)
מרחק למשוך 2 (s(F2)) 30 0.12 מ מ
כוח משיכה 2 (F2) 600 -(ערך יחסי מתח להחיל כדי לאלץ את סליל)
להתאים (AD) 0 -

טבלה 1: הגדרות פולר

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הזרקה תוך של AAVs עשויה להפוך טכניקה חזקה במעבדת מחקר, המאפשר הניתוח של תאים בעמוד השדרה עם פתרון זמני מרחבית גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר את התמרה חושית המקטעים בעמוד השדרה המרכזית שלוש innervated על ידי נוירונים סנסוריים הארכת שלהם אקסונים היקפיים כדי hindlimb. Transducing לשלושה חלקים מייצר ועמיד לשחזור נתונים התנהגותיים. זה גם מאפשר בדיקה של אזור חושית גדול יותר מאשר אפשרי לאחר זריקה תוך אחת. לדוגמה, המשטר הזרקת אותו מאפשרת בדיקה הכפה (פון פריי, הארגריבס, וכו) כמו הירך (intradermal זריקות, גירוי קולטן mechano), ובכך מרחיבה את שיטות חושית שיכול הליות ממוען.

שלבים קריטיים:

ישנם מספר שלבים קריטיים עבור קבלת נתונים מורפולוגיים והתנהגותיים, הימנעות חפצים. העיצוב של וקטור ויראלי והבחירה של יזם, serotype יכולה להיות השפעה חזקה על יעילות התמרה חושית וההיקף של אזור transduced, ולכן על תוצאות התנהגותיות (לפרטים על להפצת ופעולות התייעלות התמרה חושית, ראה 12). ההכנות נגיפית איכותי נדרשים כדי למזער את תופעות הלוואי של הזרקת וירוס, אשר יכול להתרחש אם מזהמים או תא פסולת נמצאים בהפתרון וירוס. הניתוח נדרש להחדיר חוט השדרה חייב להתבצע בקפידה רבה על מנת להימנע חפצים מורפולוגיים והתנהגותיים שהוצגו על ידי הניתוח. תשומת לב מיוחדת נדרשת בטיפול חוט השדרה, במיוחד במהלך laminectomy ובמהלך את הנקב. של דורה עם המחט. פגיעה בחוט השדרה יכול לפגום תחושות הסומטית, קואורדינציה של מצביע העכבר, לפיכך להתפשר על ניסוי מדעי ההתנהגות המתוכננת. בנוסף, חשוב להרכיב את המזרק בקפידה. הרכבה לא תקין או סתימת micropipette יכול לעכב את הניסוי. רקמות בעמוד השדרה במקום ההזרקה יש להיבדק בסוף הניסוי כדי לאמת זריקה מוצלחת, התמרה חושית של האזור מוזרק ולא לשלול נזק לרקמות מוגזמת בעקבות הניתוח. פרוטוקול זה משמש titers ויראלי עד ריכוז עונה 1 פרק 1013 GC/mL ללא רעילות לכאורה, עדיין גבוה יותר titers של וירוס עלול להיות רעילים בנקודה מסוימת בזמן. בנוסף, רעילות סביר גם תלוי מקודד על ידי AAV מוזרק החלבון.

שינויים:

מספר פרמטרים בפרוטוקול ניתן להתאים האוכלוסייה עצביים ואת שאלת המחקר שילמדו. הזרקה של 300 פתרון וירוס nL בעומק של 300 מיקרומטר מוביל התמרה חושית של נוירונים ברחבי, בעיקר ב הצופר הגבי. אם המטרה היא היעד נוירונים נוספים הגחון, ניתן להתאים את העומק. הזרקה של אחסון גדולים יותר של וירוס (השתמשנו עד 500 nL לכל זריקה) יוביל בכפולה גדולה יותר ב- dorsoventral rostrocaudal כיוונים. זה עשוי להיות מועיל להשיג מיקוד של תאים נוספים במידה rostrocaudal, אך ניתן להגדיל את העודפים לצד contralateral, אשר ייתכן ה"בלתי השימוש של הצד contralateral בקרה פנימית. בנוסף, במידה dorsoventral של תאים transduced יגדל, אשר ייתכן האפקט הרצוי או להימנע. הזרקה של 300 nL בעומק של 300 מיקרומטר נמנע צד משפיע על השליטה המוטורית בעכברים GlyT2::Cre, תוך הזרקה של 500 nL או הזרקת בעומק רב יותר מדי פעם הפיק פנוטיפים מוטוריות, כגון עוויתות הארכת hindlimb (נתונים לא מוצג). הזרקה של אמצעי אחסון קטן יותר יכול לשמש כדי להגביל את המיקוד אזורים סגורים יותר5. כייל נגיפי הינו פרמטר נוסף יכול להיות שונה, למעשה צריך להיות נחוש עבור כל וירוס. רעלנים חיידקים, כגון DTA יעילים ביותר, רמות הביטוי נמוך עשוי להיות מספיק כדי לגרום את התוצאה הרצויה, ואילו עבור עיתונאים פלורסנט ו- DREADDs, titers גבוה יותר עשוי להיות נחוץ עבור ביטוי לזיהוי או יעיל.

משמעות השיטה ביחס שיטות קיימות/חלופית:

עד כה, שימשו בעיקר שתי שיטות לחקור באופן פונקציונלי של מעגלים עצביים הדרושים עבור שידור של אותות החישה. חוקרים רבים השתמשו תוך זריקות של rAAV קידוד עבור עיתונאי ו אפקטור חלבונים לתוך לבטא recombinase עכברים כדי לתייג ולטפל subpopulations עצביים בעמוד השדרה. הזרקה תוך כמו טכניקה לתמרן תאים בעמוד השדרה כבר בעבר תיאר15,16. פרוטוקול שמפורטות כאן תוכננה במיוחד כדי מגלי גנטית שכותרתו נוירונים בשלושה מקטעים של עמוד השדרה המותני תוך מזעור טיפול כירורגי. זו מושגת על ידי הצבת שני של שלוש זריקות במרחב בין-חולייתי rostral, סימטרית של חוליות T13, שנייה, על ידי לקדוח חור T13 עבור הזריקה השלישית במקום להסיר את החוליות. הקטעים L3-L5 יישוב הם אזור סיום הראשי של נוירונים סנסוריים innervating את hindlimb. נדגים כי סוג זה של התמרה חושית מספיקה לייצר שינויים התנהגותיים חזקים לאחר המניפולציה של נוירונים glycinergic, מראים כי הוא מתאים לניתוח של מגוון שונה גנטית שכותרתו נוירונים בעמוד השדרה.

הטכניקה השנייה שבה השתמשו על מנת לתפעל את הפונקציה של נוירון בעמוד השדרה קבוצות משנה מבוססת על מעבר בעלי חיים מהונדס. . כאן, עכברים המבטאים של recombinase בקבוצת משנה ספציפית של נוירונים בעמוד השדרה צריך להיות חצה לעכברים כתב על מנת להשיג ביטוי של הסמן הרצוי או חלבון אפקטור משנה עצביים בהתאמה17,18, 19. להמחשת חלק מההבדלים יכול להתרחש בעת השוואת התוצאות שהושגו באמצעות כתב עכברים או זריקות תוך וירוס אנחנו חצה RORβCre בטוק חיות עכבר כתב תלויי-Cre או מוזרק RORβ Cre עכברים עם rAAV כתב תלויי-Cre. השווינו ביטוי גנים כתב המתקבל את rAAV על ביטוי גנים כתב בשנת RORβCre; R26טום עכברים. ביטוי גנים כתב המתקבל הזרקה תוך של rAAV תלויי-Cre הייתה מוגבלת את הנוירונים של חוט השדרה, ואילו הכתב R26טום ביטוי tdTomato עורר-עכבר מצוי גם האסטרוציטים. הדבר מצביע על כך RORβ transiently ביטוי האסטרוציטים. באופן דומה, Mecinas גוטיירז. et al. מצאו ביטוי עיתונאי מוגבל יותר (במרחב מסוג תאים ספציפיים) לאחר ההזרקה ויראלי לעומת כתב עורר העכבר ביטוי Tac1Cre עכברים20. באמצעות זריקות תוך כתבת rAAV לתוך חוט השדרה של עכברים בוגרים, כתב ו/או אפקטור גנים ביעילות ניתן להגביל באוכלוסייה של תאים לבטא את הגן של במבוגר, ובכך להימנע רקומבינציה/ביטוי אוכלוסיות אלה עם פעילות הגן ארעי קודמות.

יתרון נוסף הראשי של זריקות תוך rAAV הוא היכולת להגביל את הביטוי של גנים המקודדים rAAV ההזרקה. ב, העכברים הטרנסגניים Cre בתיווך הנהג ביטוי לעתים קרובות לא נמצא רק את subpopulation עצביים של עניין, אלא גם אוכלוסיות אחרות בתוך מערכת העצבים. Dymecki, עמיתים, כמו גם את הקבוצות של אמא ושל גולדינג, פיתחו דרכים אלגנטי של שימוש בגישות intersectional כתב עכבר מבוססי להימנע רקומבינציה חלקים של מערכת העצבים שתישמר שהודעה17, 18,19,21,22,23. שימוש בטוק בעכברים כדי לקבל ביטוי של חלבונים סמן או אפקטור ניתן גם להניח, להיות פחות משתנה, כפי יש עותק אחד בלבד גנומית בקלטת ביטוי בהתאמה לכל תא הקלטת הביטוי הוא נוכח כל התאים באזור עניין . לעומת זאת, הנוכחות של קלטת ביטוי בהתאמה ומספר גם העתק בקלטת ביטוי לאחר התמרה חושית ויראלי תלויה היעילות התמרה חושית, אשר עשוי להשתנות מתא לתא, הזרקת כדי זריקה, ותלוי וירוסים רבים. לבסוף, החיסרון העיקרי של וירוס בתיווך גנים על פני שיטות גנטיות המסורתית היא נחיצות הניתוח. פגיעה/דלקת בתיווך הניתוח עשוי להשפיע ישירות נוירונים, מעגלים. הכללה של עכברים הבקרה שעברו את הניתוח אותו לכן חובה.

יישומים עתידיים:

הזרקה תוך ניתן לנתח ולטפל בכל subpopulation בעמוד השדרה גנטית מזוהה באמצעות ביטוי של חלבונים סמן ו אפקטור. לכן סביר בעתיד כי רבים יאמץ טכניקה זו ללמוד אוכלוסיות עצביים בפוקוס הספציפי שלהם. יתר על כן, מלבד באמצעות הזרקה תוך של rAAVs כדי להשיג ביטוי של חלבונים אפקטור אקסוגני, טכניקה זו ניתן להשתמש גם חלבונים אנדוגני שקט או overexpress, ולכן ללמוד את הפונקציה של כל הגנים נתון עם גבוה מרחבית ו רזולוציה טמפורלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים האנס אולריך Zeilhofer על בנדיבות התומכים עבודה זו. הנדריק Wildner נתמכה על ידי קרן אולגה Mayenfisch. אנו מודים כרמן Birchmeier על הנוגדן Lmx1b.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)
Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11, (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89, (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92, (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508, (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91, (6), 1413 (2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85, (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93, (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87, (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13, (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125, (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168, (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33, (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350, (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160, (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159, (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158, (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35, (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63, (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics