長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

Cancer Research

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Summary

住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルを説明します。

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

住セルイメージ投射は、直接時間の長時間にわたって単一のセルの生物学的現象を視覚化するために使用できる強力な手法です。過去 10 年間新しい、革新的な技術は、大きく住セルイメージ投射の実用性を強化しています。セルでフォーカスで保つことができるようになりました、継続的に細胞培養条件の下で維持された 37 °C と 5% CO2しながら数日間かけてイメージします。さらに、異なる実験条件を表す複数のフィールドの表示を取得できます、同時に高スループット実験データを提供します。住セルイメージ投射は、直接可視化と細胞の動的イベントの一時的な定量を可能にする、固定細胞のイメージングに重要な利点を提供します。住セルイメージ投射もだろうそうでなければ見逃している人口に基づく試金を使用して単一のセルの動作の変化を識別できます。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング プロトコルについて述べる.逮捕されたのかどうか有糸分裂を可視化する有糸分裂または中間期にタイム スリップから直接セルは死にを紹介します。蛍光ユビキチン化による細胞周期のインジケーター (FUCCI) システムを使用して、細胞周期を入力し直すことができる分裂すべりから生まれた間期細胞の割合を評価する方法についても述べる。最後に、核膜破壊イベントを識別するために生細胞イメージング法について述べる。

Introduction

抗有糸分裂薬各種固形腫瘍の化学療法で用いられてきた、しばしば素晴らしい効果1,2,3を表示します。機械論的に、これらの薬は、通常の細胞分裂の進行を妨害、急速に増殖の細胞分裂の逮捕を促進する癌細胞。しかし、分裂逮捕に応答細胞の運命は非常に変数: 有糸分裂終了など四倍体細胞 (分裂のスリッページと呼ばれる、プロセス) として中間期に戻る一方、細胞の一部を経る有糸分裂から直接細胞死、4 5,6,7,8。これらの間期細胞がアポトーシスを実行、永久的な細胞周期停止を受けるまたはも細胞周期4,5,6,7,8,9 を再入力 ,,1011。再次の薬剤除去、細胞周期を入力するだけの中間期に入れることによって有糸分裂細胞死を回避する細胞したがって癌細胞の人口の再出現に貢献するかもしれない。さらに、細胞の有糸分裂からスリップが四倍体、tetraploidy はドライブの腫瘍染色体不安定性を促進するために知られている12,13,14,15 を再発します。現在治療を最適化するために重要なつまり抗有糸分裂薬治療への応答の細胞の運命を制御する要因を定義します。

このプロトコルで直接観察し、抗有糸分裂薬パクリタ キセル長引く分裂停止を受ける細胞の運命を研究する方法をについて説明します。パクリタ キセルは確立されたクリニックで治療、乳がん、卵巣、肺16,17,18,19,のそれらを含む多くの腫瘍型で非常に有効な証明されています20. パクリタ キセルは、イチイの樹皮から派生した植物アルカロイドである微小管を安定化し、その dynamicity21,22を防止すること。妨げることで、薬は有糸分裂の間スピンドル集合チェックポイントの持続的な活性化につながるパクリタ キセルによる微小管ダイナ ミックスの湿し水では1 G、2 G からの細胞周期の進行は影響しません動原体微小管結合 (23,24の深さをここの見直し)25。結果として、パクリタ キセル処理細胞で長期にわたる分裂停止の結果後期発症を防止します。

このプロトコルは最初生細胞イメージング実験で分裂期の細胞を識別する方法を説明します。2 つの顕著な細胞生物学的変化による付着性の培養細胞の有糸分裂を視覚化できます。まず、染色体になる高度に核膜崩壊の直前に凝縮します。一方、多くの場合標準的な位相差顕微鏡による検出、染色体凝縮より明確に検出できる蛍光タグ、ラベル染色体 (例えば蛍光標識したヒストン蛋白質)。第二に、細胞分裂のセルは、セルの丸めに起因する劇的な形態学的変化によっても識別できます。

このプロトコルは、生細胞イメージング技術を使用して長時間の細胞分裂停止が発生して細胞の運命を追跡する方法を示します。細胞の有糸分裂の逮捕を受ける 3 つの明瞭な宿命の一つ。まず、細胞は有糸分裂の間の細胞死を受けることができます。この現象は、死細胞が縮小、水疱、または破裂の観察光学顕微鏡検査によって容易に視覚化します。第二に、細胞が有糸分裂から終了することができます、中間期の染色体分離または分裂せずに戻り、プロセスは、細胞分裂の滑りと呼ばれます。染色体の decondensation および/または容易に分裂細胞の平坦化は、このプロセスを識別します。有糸分裂からスリップ細胞はまた頻繁に不規則な多裂片のある核を表示し、頻繁いくつかの小核5を抱きます。第三に、細胞分裂で逮捕できます後期を開始し、長い遅延の後細胞分裂に進みます。この現象の中には珍しい高い薬物濃度で、逮捕された細胞は紡錘アセンブリ チェックポイントを満たす可能性がある、または紡錘アセンブリ チェックポイントが部分的に弱体化や欠陥を示唆しています。後期発症は、染色体分配と住セルイメージ投射を使用してそれに続く細胞質分裂で視覚化できます。

分裂すべりを受けることによって有糸分裂細胞死を回避する細胞の運命を追跡する生細胞イメージング方法は説明もします。分裂すべりを受けるセルは、後続の相間で死ぬ、耐久性のある G1の細胞周期の停止をトリガーまたは細胞分裂4の新ラウンドを開始する細胞周期を再入力します。次の分裂すべり細胞周期を再入力セルの割合を決定する FUCCI (蛍光ユビキチン化による細胞周期のインジケーター) システムを使用する方法を説明します。FUCCI G1/S 遷移の直接可視化でき、長期的な生細胞イメージングの in vitroin vivo26,27と組み合わせて使用することができます。FUCCI システムは、2 つの蛍光に分類された蛋白質、hCdt1 の切り捨てられたフォームの利用 (クロマチン ライセンスと DNA 複製因子 1) と細胞周期の位置に基づいてそのレベルの振動 hGeminin。(赤の蛍光蛋白質に溶ける) hCdt1 SCFSkp2フェーズでは G1それはレプリケーションは、DNA をライセンスする行為がユビキチン E3 ユビキチンリ ガーゼによってを高いレベルで存在し、劣化を防ぐための S/G2/M フェーズ中にDNA26の再レプリケーション。対照的に、hGeminin (緑の蛍光蛋白質に溶ける)、hCdt1 の阻害剤のレベルのピーク S/G2/M 中がユビキチン E3 ユビキチンリ ガーゼ APC によってCdh1有糸分裂と G1の終わりに低下し、26します。 その結果、細胞を示す S/G2/M G1、と緑の蛍光レッド蛍光 FUCCI 細胞周期段階の簡単な蛍光読み出しを提供。FUCCI システム セル固定を必要としない単一細胞イメージングを必要とせず追加できますので、増殖性の細胞を識別するための (ブロモデオキシウリジン染色) など他のアプローチに比べて大幅な進歩は薬理学的セル人口の同期にトリートメント。このプロトコルで説明されていない、追加の生細胞センサーも PCDNA GFP30センサー、DNA リガーゼ RFP29 G128ヘリカーゼ B センサーを含む、細胞周期の進行を可視化する開発されています。S 相、最近 FUCCI 4 センサー細胞周期31のすべての段階を検出します。

最後に、核膜の破断を検出する生細胞イメージング法を説明します。最近の研究は、癌細胞の核封筒は、不安定な破裂しやすいにより、核質と混在する細胞質の内容を明らかにしました。核破壊と呼ばれる、このような現象は、DNA 損傷と自然免疫応答32,33,34,35,36,37,の刺激を促進することが38,39,40,41,42,43,44。 核破壊の根本的な原因が不完全に特徴付けられたままは、核破断42の発生率の増加と核構造の変形を関連付けることを知られています。パクリタ キセルの治療の 1 つのよく知られている効果は有糸分裂; 驚くほど異常な核構造の生成そのため、生細胞イメージングを用いた核破壊を定量化する方法もパクリタ キセル治療核破壊イベントの頻度が増加する場合を探索しながら説明されるでしょう。核破断は、細胞質 (例えば核局在化信号 TDRFP NLS に融合した RFP のタンデム ダイマーを繰り返します) に核をターゲットとした蛍光タンパク質の観察された漏出を検出できます。このリークは、破壊イベントの簡単な定量を可能にする、目ではっきりと目に見える。

このプロトコルには、エンコードされたステージ、オート フォーカス ソフトウェアが装備されている広視野落射蛍光顕微鏡が必要です。エンコードされたステージは、オート フォーカス ソフトウェア イメージングの期間の持続期間のセルにフォーカスを維持しながら定義された座標の X と Y 座標に正確な自動運動のためことができます。このプロトコルでセルと 37 ° C で湿度 5% CO2を維持するために機器が必要ですまた、雰囲気。これは温度内全体の顕微鏡を囲むことによって達成することができます、雰囲気制御エンクロージャ、またはそのローカル ステージ上のデバイスを使用して温度と環境を維持します。このプロトコルでは位相差対物レンズは計画蛍光 10 x 0.30 の開口を持つ。しかし、20 X 目的が単一焦点面の両方の丸みを帯びた細胞分裂と平坦界面セルを特定するのに足りるも。位相コントラストを実行している場合 (このメソッドで説明します)、イメージング、カバーすることができますガラスまたはプラスチック。差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡を使用する場合、光の脱分極を防ぐためにガラスのカバーを使用することが不可欠です。

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Protocol

このプロトコルは非変形および染色体安定した網膜色素上皮 (RPE-1) 細胞株を用いた生細胞イメージング実験に焦点を当てています。ただし、このプロトコルは培養条件は、必要に応じて調整されます限り、付着性のセル行に合わせることができます。すべてのプロシージャは、バイオ セーフティ制度と倫理的なガイドラインおよび規制遵守しなければなりません。

1. 住セルイメージ投射のためのセルの準備

  1. 人間ヒストン H2B 焼付蛍光蛋白質 (例えばH2B GFP)、または (参照45FUCCI 発現細胞を生成する方法の詳細なプロトコルを見つけることができます) FUCCI システムを表現する新鮮な解凍と早期通過 RPE 1 セルを使用します。分裂細胞の運命を評価します。
    1. 核破壊の周波数を測定するには、RPE 細胞 H2B GFP とタンデム ダイマー単一核局在化信号 (NLS-TDRFP) に溶ける赤の蛍光蛋白質の表現を使用します。
      注: 3 つの緑色蛍光タンパク質の構造単一の核局在化信号にタンデムで融合 (GFP3NLS) (参照42) のように破断を示すにも使用されています。
    2. 適切な培地に 10 cm 組織培養皿の細胞を維持します。網膜色素上皮細胞に保持されますフェノールレッド フリー ダルベッコ変更イーグル培地/栄養混合物 F-12 (DMEM:F12) が 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 IU/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 μ g/mL と補われます。
  2. 10 ml の滅菌、室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 残りの媒体を削除し、PBS を吸引の培養皿を洗い、セルから培地を吸引します。
    1. 0.25 %2 mL を追加セルにエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) が付いているトリプシン, 37 ° C で 3 分または細胞の大半がプレートから戸建まででと。
      注: 必要以上の時間トリプシンで細胞を保持しません。
  3. 10 mL の完全培地 10 mL の血清学的 stripette と trypsinized の細胞を収集し、15 mL の円錐管に分配するを追加します。
    1. 室温で 3 分間 180 x gで遠心分離によって細胞をペレットします。
  4. ペレットを中断しないように注意して、上清を吸引し、徹底的に再懸濁しますペレット新鮮な培地 10 mL に優しく上下に血清学的 stripette の媒体をピペッティングによる。
  5. 46セルをカウントするのに検定または自動細胞計数機を使用します。
    1. 30,000 セル/mL の完全培地に新しい円錐管の細胞を希釈します。
    2. プレートのイメージング (30-50% 合流) の次の日必要な細胞密度を達成するために皿 12 ウェル ガラス底 (#1.5 厚) ウェルあたりの 30,000 RPE 1 細胞を (1 mL ボリューム)。
      注: は常に手袋でプレートを処理し、ガラス底に触れないように注意してください。
  6. 彼らは完全に添付し、ガラス底のイメージング プレート上を平らにするまで、37 ° C の組織培養インキュベーターで成長します。細胞は 4 h ほどで添付することができます、間は細胞をない薬剤と扱われ、次の日までイメージを作成をお勧めします。
  7. パクリタ キセル (ジメチルスルホキシド (DMSO) で解散) 完全培地とミックスの所望の最終濃度に徹底的を追加します。
    1. コントロールとして使用するだけで DMSO の等量と完全培地を準備します。
    2. 37 ° c のセルに追加する前に薬物や DMSO を含む培地を温めます。これは急激な温度変化による焦点のドリフトを防ぐ。
    3. パクリタ キセル 12 ウェル イメージング皿の個々 の井戸を単独で DMSO を添加した培地 1 mL を追加します。

2。 生細胞イメージングのための顕微鏡のセットアップ

  1. 指紋やイメージングを妨げるほこりを削除する光クリーナーとイメージングの皿のガラス底をきれいに。全体のガラス表面を湿らせるに十分な光クリーナーを使用します。
  2. イメージング皿アダプターの顕微鏡ステージ上ガラス下皿を配置、皿、プラスチック カバーを取り外し、ガラス張りの部屋で包みます。商工会議所は 5% CO2から成る空気の着実な流れを許可するようにバルブを確認します。
    注: 5% CO2を加湿、ガスは滅菌水風呂ハウジングに挿入されたチューブを通しては流れます。これにより 95% の湿度に平衡になるガス。
  3. 開始/顕微鏡を制御するソフトウェア プログラムを使用してエンコードされた段階を調整します。これは正確な座標の X と Y 座標を確保し、焦点のドリフトを防ぐ。
  4. 位相差光学系を用いた細胞に焦点を当てるし、ケーラー照明 (詳細参照第47で説明) に光を集中し、最適なコントラストを提供するを実行します。
  5. 集録ソフトウェアを使用して、白色光とすべて蛍光チャンネル使用されている (この光の量は細胞に有毒、カメラに与える 75% ピクセルの彩度が理想的であるエクスポー ジャー) の最適な露出時間を確認します。
    1. 集録ソフトウェアを使用して、いくつかを選択します非重複の視野イメージングの各ウェルから。細胞がガラス底をよく遵守してし、50% と 70% の合流の間は、イメージングの領域を選択します。これは、その後の分析は難しく、周辺固定支持細胞のエリアを避けてください。
      注: 同じセルを 2 回追跡を避けるために各ウェルから非重複の視野を持つことが重要です。場合はセルは高い運動性、中心点とステッチそれらはビューの 1 つの大きなフィールドをするために一緒に戻ってから放射状に広がるいくつかの画像を取得する必要があります。
  6. 実験の期間のフォーカスのすべてのポイントが維持されるように顕微鏡のオート フォーカス機能をアクティブにします。
  7. 分裂細胞の運命を評価するために収集、画像は各ビューの選択したフィールドから 10 分毎 96 h それでも有糸分裂続く 20-40 分、10 分間隔、セルが分かれるときを識別するために十分なサンプリングを提供するためには、イメージング ソフトウェアを設定します。一時的なイベントですが、原子力の破裂を識別するために 5 分ごとの画像を取得します。
    注: 画像集録ソフトウェアを駆動コンピューターが自動更新、スクリーン セーバー、およびエネルギーの節約モードを無効にした、これらはしばしば長い実験上画像の取得を妨げることができることを確認します。
  8. イメージングの実験を開始します。定期的にビデオのコース上画像の取得がスムーズに実行されていることを確認します。

3 パクリタ キセルに対する細胞の運命を識別するビデオ分析

  1. イメージ セルがイメージング実験コースを通して、健康であることを確認します。DMSO 処理制御の細胞は、現実的かつ積極的に増殖をする必要があります。
    注: セルを示す場合、ストレスの兆候ビデオを量的に表わすしていない代わりにイメージング条件48を最適化に焦点を当てます。ストレスをイメージング兆候には、ブレブ/死細胞、プレートにアタッチ/普及に失敗する細胞と低い核分裂指数や長時間の細胞分裂を示す細胞が含まれます。ストレスの原因には、温度やイメージングの商工会議所または光毒性48内の CO2レベルの変動が含まれます。
  2. 10 X、20 X 目的全体の視野をイメージング、何百もの個々 の細胞があるかもしれない。したがって、定量分析を支援するために利用可能なソフトウェア ツールを使用してより小さい分割ビューのフィールドを分割します。各作業領域内のセルを個別に (前述の手順 3.3.1–3.6.2 で) スコアします。
  3. ビデオを分析する場合は、位相差/蛍光画像を使用してマージされたビュー内の各セルを追跡します。ソフトウェア分析ツールを使用すると、マージされたビューを作成できます。
    1. ビデオの先頭から開始して、単一間期細胞を識別し、位相光学系を用いた細胞周期の進行を追跡します。単一のセルを追跡するには、目でフレームからフレームにセルを確認します。(H2B GFP による評価) (位相差による評価) として彼らの平面的な形態と DNA の凝縮の欠如による中間期細胞を識別する (図 1 a)。
  4. セル (位相差の光学系を使用) を丸めの観察によって有糸分裂を入力セルを識別する染色体凝縮 (H2B GFP を使用) および/または (図 1 aC)。両方のセルの丸めと染色体凝縮に目で容易に視覚化されます。
    1. 注釈を細胞が有糸分裂に入ったときの時刻。その運命 (3.5 の手順、手順 3.6.1、有糸分裂から細胞死またはステップ 3.6.2 のように分裂すべりのように後期) に到達するまでセルの追跡を続けます。
  5. 制御の細胞が効率的に染色体に合わせ、後期 (図 1) 1 時間以内を入力してください。セルを 2 つにや極移動の染色体 (図 1 a) H2B GFP でラベルの可視化を挟まないように開始位相差の光学系による後期を可視化します。セルが後期を実施する場合の時間を指定します。
  6. 対照的に、パクリタ キセルで細胞は数時間 (3-40 h) (図 1 bD) 凝縮染色体を持つ丸みを帯びた残ります。
    1. 細胞死を経る有糸分裂逮捕のセルを識別します。
      注: 有糸分裂の間に死ぬ細胞は、位相差顕微鏡による可視化、細胞胞として、縮小、および/または破裂 (図 1 b)。H2B GFP をイメージングする場合染色体が細胞死の中にフラグメントも。
    2. セルの滑りを経る有糸分裂逮捕のセルを識別します。
      注: と間期に戻って平ら後期 (図 1) を経ることがなく染色体が脱凝縮したり、分裂すべりを受ける細胞は位相差顕微鏡による観察されます。大型の四倍体細胞に細胞分裂の滑りを受ける細胞上昇を与えるは、しばしば多核巨細胞 (図 1)。
  7. ビューの元のフィールドからセルの追跡を続けます。全体の視野を追跡すると、一度も同じから取得した別の視野に移動し、細胞の追跡を続けます。

4. 次の分裂すべり細胞運命を識別するビデオ分析

  1. 細胞の運命を分裂すべり (3.6.2 のステップで説明します)、次の評価 FUCCI システムを表現する網膜色素上皮細胞を使用して。位相コントラスト イメージングに加えて赤い蛍光性 (G1相を示す) と (S/G2/M を示す) 緑の蛍光画像を取得する必要がある)。
    1. FUCCI RPE 1 セル 3.3 3.7 を介しての手順で説明するように追跡します。
      1. FUCCI システムが正常に機能していることを確認するには、細胞の生細胞イメージング データ分析から適切に赤と緑の蛍光蛋白質の代替表現を制御を検証します。制御の細胞は S 期へ G1から完全核蛍光グリーン間期細胞の進捗状況としての出展へ完全核赤蛍光の出展から移行すべき。細胞は、細胞分裂が完了緑色蛍光を示す続けるべきです。有糸分裂、直後細胞は再び間期完全赤い蛍光性を表わすべきであります。
        注: 蛍光痕跡49を使用して単一セルで FUCCI システムから RFP と GFP の蛍光強度を定量化する方法が存在している間これ多くの場合必要はありません蛍光色の変化は、堅牢で目で見えるよう。
  2. 位相差顕微鏡を使用して有糸分裂で逮捕されたセルを識別し、追跡 3.4 と 3.6.2 の説明に従って分裂すべりを受けるまで。スリップ有糸分裂と間期に戻って、有糸分裂の間 (図 2 aC) G1フェーズ中に赤い蛍光緑の蛍光性を示すから変更するセルです。
    1. (図 2 D) 彼らの細胞の運命を評価する目で位相差顕微鏡および epifluorescent イメージングを用いた細胞を滑ってこれらを追跡します。
      1. 細胞周期を再入力セルを識別します。これらの細胞は、G1/S 遷移 (図 2 a) を示す FUCCI システムを使用して蛍光式の赤緑の変化によって識別されます。
      2. G1細胞周期の停止を受けるセルを識別します。これらの細胞は持続する赤色蛍光の式によって識別された > 24 h (図 2 b)。
      3. 中間期で死ぬ細胞を識別します。これらの細胞は、細胞破壊/体様/縮小位相コントラスト イメージング (図 2) を使用してによって識別されます。

5 核膜破裂の頻度を識別するビデオ分析

  1. 核膜の破断を評価するのに H2B GFP および TDRFP NLS を表現する RPE 1 セルを使用します。位相コントラスト イメージングに加え、赤い蛍光性 (TRITC) と蛍光グリーン (FITC) 画像を取得します。破断を視覚化する 5 分ごとの画像を取得します。
    注: インポート対象に TDRFP NLS は効率的に核に最小限の細胞質蛍光細胞ラインを生成するが重要です。
  2. ステップ 3.4 から 3.3 で説明したように細胞をイメージ。TDRFP NLS 蛍光信号と H2B GFP を共同間期ローカライズする必要があります。有糸分裂 (セル H2B GFP による位相光学および/または染色体凝縮を使用して丸めによって可視化) として、時に核膜の打破、TDRFP NLS シグナルが細胞質 (図 3 a) になります。有糸分裂、娘細胞の核膜を改革して、TDRFP NLS シグナルが核になります。
  3. 住セルイメージ投射によって後続の相間での娘の細胞を追跡します。周囲の細胞質に核局在 TDRFP NLS のトランジェントを観察することによって核の破壊イベントを識別します。分以内に、核膜は修復され、TDRFP NLS は核 (図 3 a) に relocalized されます。
    注: 多くの場合、核 DNA H2B GFP による可視化表示されます小さな水疱として破裂部位外に突出します。
  4. 中間期の中に破断イベントを受ける核の割合を獲得します。この画分をスコア、追跡のセルの合計数以上破壊イベントを受けるセルの数をカウントします。

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Representative Results

上記プロトコルを使用して、H2B gfp RPE 細胞は抗有糸分裂または車両コントロール (DMSO) と扱われ、住セルイメージ投射によって分析されました。解析では、100% コントロール分裂 RPE 細胞の有糸分裂 (図 1 a, 1 D) を入力した後後期は平均 22 分を開始することを明らかにしました。対照的に、パクリタ キセルで治療網膜色素上皮細胞は、深い分裂逮捕数時間 (図 1) を展示しました。イメージング明らかにしたこれらの有糸分裂逮捕された細胞の 48% が有糸分裂細胞死 (図 1 b1E) を受けたと残りの 52% は分裂すべり (図 11E) を施行しました。

どちらか低用量 50 nM パクリタ キセル投与、高用量 5 μ M パクリタ キセルで治療された FUCCI システムを表現する RPE 細胞分裂すべりを施行した RPE 1 細胞の運命を評価するためにまたは車両 (DMSO) を制御し、長期生細胞イメージングによる解析。データは分裂すべり 50 nM パクリタ キセルで治療を施行した RPE 1 細胞の 22% がその後の細胞周期 (図 2、2 D) で死んだことを明らかにした、72% による細胞周期の停止 (図 2 b、2 D) と5% だけは、S 期 (図 2 a、2 D) を再入力。対照的に、RPE 1 細胞分裂の滑り、その後の細胞周期で死亡した 35% を施行した高用量 5 μ M のキセルの 65% は、細胞周期の停止を誘導し、S 期 (図 2 D) を再入力なし。

興味深いことに、低用量パクリタ キセル治療は RPE 1 有糸分裂細胞の核膜破壊を促進します。娘細胞分裂完了後追跡し、〜 23 %10 nM パクリタ キセルで治療の娘の細胞の破裂 (の展示に対しの 〜 4% だけが破裂、(DMSO 処理) RPE 1 娘細胞をコントロールすることを明らかに任意の核破壊イベントの得点図 3 a、3 b)。

Figure 1
図 1: 抗有糸分裂処置への応答の有糸分裂細胞運命。H2B GFP を安定に発現する RPE 細胞 DMSO 車両制御 (A) または (B、C) の 5 μ M パクリタ キセルで治療され、有糸分裂細胞運命を評価する時間経過の位相コントラストと広視野落射蛍光顕微鏡を使ってイメージ化します。間期細胞 (左側パネル) は、有糸分裂 (中間パネル) を入力すると、後期 (A) を開始、有糸分裂細胞死 (B) を施行した、彼らか、または中間期 (C) に戻って有糸分裂からスリップまで追跡されました。白い矢印は、追跡対象のセルを示します。(D) 時間の量を制御する細胞 (DMSO 処理)、住セルイメージ投射により mitotic 扱われる細胞有糸分裂で過ごした (n = 各条件に対して 100 セル)。(E) 細胞の割合 (n = 100) を受けた後期、有糸分裂細胞死、または DMSO 処理細胞の 5 μ M のパクリタ キセルで細胞分裂すべり。時間、h:min. スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 分裂すべりを受ける細胞の運命します。FUCCI システムを安定に発現する網膜色素上皮 - 細胞は 50 nM パクリタ キセルの 5 μ M のパクリタ キセルで治療され、次の分裂すべり細胞運命を量的にタイムラプス位相コントラストと広視野蛍光顕微鏡を使ってイメージ化します。細胞は細胞周期を入力するか再として得点された FUCCI システム (A); 赤-緑蛍光変化によって判断されるよう永続的な赤い蛍光によって判断されるように G1段階で逮捕 > 24 h (B);または破断体様細胞/(C) によって判断されるように後続の有糸分裂の間死にます。白い矢印は、追跡対象のセルを示します。(D) セルの割合 (n = 100) にはそれぞれの運命を施行しました。誤差範囲は、2 つの独立した実験から平均値から標準偏差を表しています。時間、h:min. スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: パクリタ キセル処理細胞の核膜破裂の頻度。TDRFP NLS と H2B GFP を安定に発現する網膜色素上皮 - 細胞は 10 nM のパクリタ キセルで扱われたまたは車両 (DMSO) を制御し、コマ撮りの位相コントラストと広視野落射蛍光顕微鏡 (A) を使用してイメージを作成します。有糸分裂の間 (中期/後期) 核封筒は分解、TDRFP NLS が細胞質になります。有糸分裂、次 TDRFP NLS は間期細胞 (前破裂) の核を relocalizes します。核破壊イベントは、TDRFP-NLS の核から細胞質間期細胞 (破裂) する核が核膜修理 (後破裂)、次に TDRFP NLS の染色体に続く非局在化によって識別されます。白い矢印は、追跡対象のセルを示します。(B) 細胞の割合 (n > 条件あたり 100) 核膜破裂パクリタ キセルまたは車両コントロールの存在下で細胞分裂を示します。時間、h:min. スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

長期住セルイメージ投射の最も重要な側面は、イメージされている細胞の健康を確保することです。細胞が温度・湿度・ CO2のレベルについての不良条件など、最小限の余分な環境ストレスにさらされることが不可欠です。50セルの動作に影響を与える知られているストレスをイメージングにも蛍光励起照明から光損傷を制限することが重要です。光損傷を制限することは、48の詳細に関する説明と複数の方法で実現できます。一般的には、十分明るい蛍光信号を生成する必要な最短露光時間を使用して効率的に光毒性を抑えたり、細胞を追跡することをお勧めします。ただし、セルが 10-20 分毎 (つまりピクセル飽和に近づく) 長い露光とは、1 回だけ作成されますだけ容認 (ただし、これは、蛍光体や細胞の種類ごとに経験的に決定する必要があります)。イメージ化された細胞は環境・ イメージングのストレスに敏感なので、それは制御の細胞を常に生細胞イメージング実験に含まれ、通常の増殖を確認するために監視は不可欠です。

長期の生細胞イメージングへの 1 つの制限は温度と 5% 加湿 CO2の大気を維持する環境商工会議所ともがステージ上部室の既存の顕微鏡に装備が必要です。適切な温度と雰囲気をサポートします。セル流れの CO2が最適ですが、CO2を使用して 48 時間までもイメージ化される-独立した媒体 5% 環境の室内加湿 CO2場合は使用できません。しかし、多くの細胞の種類、このような媒体の耐性、これは細胞の成長と生存率を測定することにより経験的に決定する必要があります。鉱物油で、セルをオーバーレイは培地の蒸発を防ぐためにも使用できます。

このメソッドの 2 番目の主要な制限は、細胞運命を手動で追跡が非常に面倒で時間のかかることです。しかし、細胞追跡プログラムがあります、画像解析51,52,53を自動化する最適化可能性があります。この方法でさらに制限は「高い運動性細胞は時間長時間にわたって追跡することは困難頻繁です。これは重大な問題を引き起こす、全体もイメージすることができ、画像は、ビューの 1 つの大きなフィールドを形成するために一緒にステッチします。多くのソフトウェア プログラムでは、このメソッドをサポートします。

蛍光は、このプロトコルが対処する必要があります別の制約です。フェノールレッドの自由な媒体は、ライブセル イメージング中にバック グラウンド蛍光を低減します。また、成長媒体、リボフラビンおよびピリドキサールで見つけられる 2 つのビタミンが蛍光タンパク質の光安定性を減らすことが実証されています。したがって、これらのビタミンが不足しているメディアを使用するのノイズ配給する信号を強化する蛍光イメージング中にも。プラスチック製の底皿は安価、適切な画像処理の結果を提供することが、彼らはまた悪影響を信号対雑音比の自家蛍光の大きい量を生成します。さらに、プラスチック製の底の料理多くの顕微鏡のオート フォーカス機能を混乱させることができる厚さの大きいバリエーションがあります。このプロトコルではガラス底イメージング皿の厚さは 0.17 mm のモダンな顕微鏡で使用するための理想的なガラスであります。

最後に、長期的な映画ビューの複数のフィールドを含む、いくつかの蛍光チャンネルを取得生成大規模なデータ ファイル (数十ギガバイト、さらにテラバイト各)、データ ストレージとバックアップのための問題を提起します。この問題を軽減するためにすべての画像が得られることお勧めの解像度で損失を提供 2 x 2、4 x 4 のビニングを使用可能です。ビニングだけでなく (H2B GFP または FUCCI システムを安定に発現する細胞すなわちはずのエクスポー ジャー 500 ミリ秒未満) の露光時間を制限しますが、データ ファイルのサイズも大幅に低減 (ビン分割 2 x 2 のイメージは 4 分の 1 のファイルサイズ、非ビン分割イメージの場合)。

これらの制限にもかかわらず長期住セルイメージ投射は非常に異種細胞運命場合は特に全体の集団から個々 の細胞運命を追跡するための最良の方法を表します。生細胞蛍光マーカーとセンサーになる利用可能な生細胞と細胞生物学のいくつかの追加の側面を量的に表わすを視覚化して、アプローチをイメージングが展開されます。たとえば、生細胞センサーは現在 DNA 損傷病巣、p53 レベル、細胞周期の位置、およびアポトーシス26,54,55,56,57,58を量的に存在します。.したがって、イメージングの実験は、単一細胞応答化学療法薬剤へ必ず方法と理由を指定する基になる細胞プロパティを明らかにする能力を持っています。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

AFB、MAV NJG 原稿とエイドリアン TDRFP NLS コンストラクトの Salic コメントありがとうライアン クインしたいと思います。AFB、MAV は、日の出生体分子薬理学研修助成金 5T32GM008541 によって賄われています。NJG は、Shamim とアシュラフ Dahod 乳房がん研究所のメンバーであるおよび NIH 助成金 GM117150 と CA 154531、カリン Grunebaum 財団、スミス家族賞プログラム、サール学者プログラム、および悪性黒色腫研究に支えられて同盟。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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