À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Cancer Research

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Summary

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

Imagerie de cellules vivantes est une technique puissante qui permet de visualiser directement des phénomènes biologiques dans des cellules individuelles sur de longues périodes de temps. Ces dix dernières années, les technologies nouvelles et novatrices ont grandement amélioré l’aspect pratique de l’imagerie de cellules vivantes. Les cellules peuvent désormais être conservés en bref et imagé en continu sur plusieurs jours tout en entretien dans 37 °C et 5 % CO2 conditions de culture cellulaire. En outre, plusieurs champs de vision représentant les différentes conditions expérimentales peuvent être acquises en même temps, fournissant ainsi des données expérimentales de haut débit. Imagerie de cellules vivantes fournit un avantage significatif sur l’imagerie de cellules fixes en permettant la visualisation directe et au dosage temporelle des événements cellulaires dynamiques. Imagerie de cellules vivantes peut également identifier des variations dans le comportement des cellules simples qui aurait autrement été raté à l’aide de tests basés sur la population. Nous décrivons ici les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique. Nous démontrons que des méthodes pour visualiser si mitotiquement arrêté cellules meurent directement à partir de la mitose ou retomber dans interphase. On décrit aussi comment le système d’indicateurs (FUCCI) axée sur l’ubiquitination fluorescent de cycle de cellules permet d’évaluer la fraction des cellules en interphase né de glissement mitotique qui sont capables de rentrer dans le cycle cellulaire. Enfin, les auteurs décrivent une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour identifier des événements de rupture de membrane nucléaire.

Introduction

Les médicaments anti-mitotiques ont longtemps été utilisés dans les schémas de chimiothérapie de divers types de tumeurs solides et font souvent preuve d’efficacité grande1,2,3. Mécaniquement, ces médicaments perturbent la progression mitotique normale et promouvoir l’arrêt mitotique en prolifération rapide des cellules de cancer. Toutefois, le sort de la cellule en réponse à l’arrêt mitotique est très variable : alors qu’une fraction des cellules subit une mort cellulaire directement à partir de la mitose, d’autres quitter mitose et reprendre l’interphase comme cellules tétraploïdes (un processus appelé glissement mitotique)4, 5,6,7,8. Ces cellules en interphase peuvent exécuter l’apoptose, subissent une arrestation de cycle de cellules permanentes ou même réintègre le cycle cellulaire4,5,6,7,8,9 ,10,11. Les cellules qui se soustraire à la mort cellulaire mitotique en glissant en interphase, seulement à réintègre le cycle cellulaire après le retrait de la drogue, peuvent donc contribuer à la ré-émergence de populations de cellules de cancer. En outre, les cellules que bordereau de mitose sont tétraploïdes et tétraploïdie est connu pour favoriser l’instabilité chromosomique qui alimente la tumeur rechutent12,13,14,15. Il est donc essentiel d’optimiser la thérapeutique actuelle de définir les facteurs qui contrôlent le destin cellulaire en réponse aux traitements médicamenteux anti mitotique.

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour directement observer et étudier le sort des cellules subissant prolongée arrêt mitotique en réponse au paclitaxel drogue anti mitotique. Le paclitaxel est un établi thérapeutique à la clinique et s’est avéré très efficace dans de nombreux types de tumeurs, y compris ceux du sein, ovaires et les poumons16,17,18,19, 20. Paclitaxel, qui est un alcaloïde de la plante provenant de l’écorce de l’if, stabilise les microtubules et empêche donc leur dynamicité21,22. Tandis que l’amortissement de la dynamique des microtubules par paclitaxel n’affecte pas la progression du cycle cellulaire de G1 G2, le médicament mène à une activation soutenue du point de contrôle assemblage du fuseau pendant la mitose en empêchant pièce jointe microtubules kinétochores (revu en profondeur ici23,24)25. En conséquence, apparition de l’anaphase est empêchée dans les cellules traitées au paclitaxel et entraîne un arrêt mitotique prolongé.

Ce protocole décrit tout d’abord des approches afin d’identifier les cellules mitotiques dans des expériences d’imagerie de cellules vivantes. La mitose peut être visualisée dans les cellules adhérentes de vitroplants en raison de deux changements biologiques cellulaire notable. Tout d’abord, chromosomes deviennent très condensées immédiatement avant la rupture de l’enveloppe nucléaire. Alors que souvent détectables par microscopie à contraste de phase standard, condensation des chromosomes peut être détectée de plus clairement à l’aide de fluorescent tags cette étiquette de chromosomes (par exemple des protéines histones fluorescent marqué). Deuxièmement, mitotiques des cellules peuvent également être identifiés par les changements morphologiques dramatiques qui résultent de l’arrondi de la cellule.

Ce protocole sera alors démontrer comment utiliser des méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour suivre le destin de l’expérience prolongée arrêt mitotique des cellules. Arrêté lors de la mitose des cellules subissent un des trois moires distincts. Tout d’abord, les cellules peuvent subir la mort cellulaire au cours de la mitose. Ce phénomène est facilement visualisé au microscope photonique, comme les cellules mourantes sont observées à rétrécir, cloque ou rupture. En second lieu, les cellules peuvent sortir de la mitose et retour retour à interphase sans ségrégation des chromosomes ou cytocinèse, un processus appelé glissement mitotique. La décondensation des chromosomes et/ou l’aplatissement de la mitose cellulaire facilement identifie ce processus. Les cellules qui glissent de mitose présentent aussi souvent des noyaux irréguliers, polylobé et hébergent fréquemment plusieurs micronoyaux5. En troisième lieu, arrêtés lors de la mitose des cellules peuvent initier l’anaphase et procéder par mitose, après un long délai. Bien que rare à des concentrations plus élevées, ce comportement suggère que les cellules arrêtées peuvent ont convaincu le poste de contrôle de l’Assemblée du fuseau, ou que le point de contrôle de l’Assemblée de broche est partiellement affaibli ou défectueux. Apparition de l’anaphase peut être visualisée par la ségrégation des chromosomes et la cytokinèse ultérieure en utilisant l’imagerie de cellules vivantes.

Méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour suivre le destin des cellules qui se soustraire à la mort cellulaire mitotique en subissant le glissement mitotique seront également décrits. Cellules qui subissent une mitose glissement soit mourir dans l’interphase ultérieur, déclenchent un arrêt du cycle cellulaire de1 G durable ou réintègre le cycle cellulaire pour lancer un nouveau cycle de division cellulaire4. On décrira une approche utilisant le système de FUCCI (indicateur de cycle de cellules fluorescentes axée sur l’ubiquitination) afin de déterminer la fraction des cellules qui réintègre le cycle cellulaire suite à glissement mitotique. FUCCI permet la visualisation directe de la transition / s1G et peut être utilisé en conjonction avec à long terme vivent-imagerie cellulaire in vitro et in vivo26,27. Le système FUCCI profite de deux protéines fluorescent étiquetés, formes tronquées de hCdt1 (licences de la chromatine et la réplication de l’ADN facteur 1) et hGeminin, dont les niveaux oscillent selon position du cycle cellulaire. hCdt1 (fusionné à une protéine fluorescente rouge) est présente à des niveaux élevés au cours de la phase1 de G où il agit pour la réplication d’ADN, mais est ubiquitinée par l’ubiquitine ligase E3 EFCSkp2 et dégradée phases S/G2/m afin d’éviter re-réplication de l’ADN,26. Par contre, hGeminin (fusionné à une protéine fluorescente verte), est un inhibiteur de la hCdt1 dont le sommet niveaux pendant S/G2/m, mais est ubiquitinée par l’ubiquitine ligase E3 APCCdh1 et dégradé à la fin de la mitose et tout au long de G1 26. en conséquence, FUCCI offre une lecture de fluorescence directe de la phase du cycle cellulaire, les cellules présentent une fluorescence rouge au cours de la fluorescence de1 et vert G pendant S/G2/m. Le système FUCCI est une avancée significative sur les autres modes (par ex. bromodéoxyuridine coloration) pour identifier les cellules prolifératives, car elle ne nécessite pas de fixation de la cellule et permet pour l’imagerie de la cellule unique sans la nécessité d’autre pharmacologique traitements de synchroniser des populations cellulaires. Bien que non mentionné dans le présent protocole, des capteurs supplémentaires de cellules vivantes ont été élaborés afin de visualiser la progression du cycle cellulaire, dont un capteur helicase B pour G128, DNA ligase-DP29 et capteurs30 PCDNA-GFP pour la phase S et le capteur de FUCCI-4 récent, qui détecte tous les stades du cycle cellulaire31.

Enfin, une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour détecter la rupture de l’enveloppe nucléaire est décrites. Des études récentes ont révélé que les enveloppes nucléaires des cellules cancéreuses sont instable et sujette à craquer, permettant ainsi le contenu du nucléoplasme et cytoplasme de mélanger. Ce phénomène, appelé rupture nucléaire, peut favoriser des lésions de l’ADN et la stimulation de la réponse immunitaire innée32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. les causes de rupture nucléaire restent incomplètement caractérisées, mais on sait que les déformations de la structure nucléaire sont en corrélation avec une augmentation de l’incidence de rupture nucléaire42. Un effet bien connu de traitement de paclitaxel est la génération de structures nucléaires remarquablement anormales après la mitose ; par conséquent, une méthode utilisant l’imagerie de cellules vivantes pour quantifier la rupture nucléaire sera décrite, tout en explorant si traitement de paclitaxel augmente la fréquence des phénomènes de rupture nucléaire. Rupture nucléaire peut être détectée par les fuites observées d’une protéine fluorescente nucléaires ciblées dans le cytoplasme (p. ex. un dimère de tandem repeat de DP fusionné à un signal de localisation nucléaire, TDRFP-NLS). Cette fuite est distinctement visible par le œil, ce qui permet un dosage simple des événements de rupture.

Ce protocole requiert un microscope à épifluorescence widefield qui est équipé d’une scène encodée et logiciel de mise au point automatique. La scène codée permet un mouvement automatisé précis pour la définition des coordonnées X-Y, autofocus logiciel conservant les cellules en bref pour la durée de la période d’imagerie. En outre, ce protocole requiert des équipements à maintenir les cellules à 37 ° C avec humidifiée 5 % CO2 atmosphère. Ceci peut être réalisé en plaçant le microscope ensemble dans une température et d’atmosphère contrôlée enceinte, ou en utilisant des appareils de scène-haut que localement maintient la température et l’environnement. L’objectif de contraste de phase utilisé dans le présent protocole est un fluor plan 10 x avec une ouverture numérique de 0,30. Cependant, 20 X objectifs sont également suffisants pour identifier les deux cellules en interphase arrondie de mitotiques et aplati en un seul plan focal. Si vous effectuez le contraste de phase d’imagerie (comme décrit dans cette méthode), la couverture peut être soit de verre ou de plastique. Si la microscopie en contraste (DIC) d’interférence différentielle est utilisé, il est impératif d’utiliser un couvercle en verre pour prévenir une dépolarisation de la lumière.

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Protocol

Ce protocole porte sur l’utilisation de la non transformées et stable sur le plan chromosomique rétine pigmentée épithéliales (pre-1) lignée cellulaire pour des expériences d’imagerie de cellules vivantes. Toutefois, le présent protocole peut être adapté à n’importe quelle ligne de cellules adhérentes tant que les conditions de culture cellulaire sont ajustées selon les besoins. Institutionnel sur la biosécurité et les directives éthiques et les règlements doivent respecter toutes les procédures.

1. préparation des cellules pour l’imagerie de cellules vivantes

  1. Utiliser les cellules de pre-1 passage fraîchement décongelées et précoce exprimant humaine histone que H2B fondue à une protéine fluorescente (p. ex. H2B-GFP) ou le système FUCCI (un protocole détaillé sur la façon de générer des cellules exprimant FUCCI peut être trouvé dans référence45) pour évaluer le destin cellulaire mitotique.
    1. Pour mesurer la fréquence de rupture nucléaire, utiliser les cellules RPE-1 exprimant les H2B-GFP et un dimère de tandem de la protéine fluorescente rouge, fusionné à un signal de localisation nucléaire unique (TDRFP-NLS).
      Remarque : Des constructions de trois protéines fluorescentes vertes fusionnés en tandem pour un signal de localisation nucléaire unique (GFP3- NLS) ont également été utilisés pour démontrer la rupture (comme référence42).
    2. Maintenir les cellules sur des plaques de culture de tissus de 10 cm dans le milieu de culture approprié. PRE-1 cellules sont maintenues en absorbant du rouge de phénol, Modified Eagle Medium/nutriments mélange F-12 de Dulbecco (DMEM:F12) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
  2. Aspirer la moyenne des cellules, laver le plat de culture tissulaire avec 10 mL de stérile, température ambiante tampon phosphate salin (PBS) à éliminer le milieu restant et puis aspirer le PBS.
    1. Ajouter 2 mL de 0,25 % trypsine avec acide tétraacétique (EDTA) aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min ou jusqu'à ce que la majorité des cellules ont détaché de la plaque.
      Remarque : Ne gardez pas les cellules en trypsine plus longtemps que nécessaire.
  3. Ajouter 10 mL de milieu complet pour recueillir les cellules trypsinisés avec un stripette sérologique de 10 mL et verser dans un tube conique de 15 mL.
    1. Les cellules de granule par centrifugation à 180 x g pendant 3 min à température ambiante.
  4. Aspirer le surnageant, en veillant à ne pas perturber la pastille et ensuite soigneusement Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu frais en pipettant doucement également le milieu verticalement dans le stripette sérologique.
  5. Utilisez un hémocytomètre ou une cellule automatisée compteuse pour compter les cellules46.
    1. Diluer les cellules dans un nouveau tube conique à 30 000 cellules/mL de milieu complet.
    2. Plaque de pre-1 30 000 cellules (volume de 1 mL) par puits d’un verre de 12 puits à fond (épaisseur 1.5) imagerie plat pour atteindre la densité cellulaire requise le lendemain (confluent de 30 – 50 %).
      NOTE : Toujours gérer la plaque avec des gants et attention à ne pas toucher le fond en verre.
  6. Permettre aux cellules de croître dans un incubateur à 37 ° C culture de tissus, jusqu'à ce qu’ils entièrement attachent et aplatissent sur la plaque d’imagerie à fond de verre. Alors que les cellules peuvent attacher dedans aussi peu que 4 h, il est recommandé que les cellules ne sont pas traités avec des médicaments et imagés jusqu’au lendemain.
  7. Ajouter paclitaxel (dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)) à la concentration finale souhaitée en milieu complet et mélanger soigneusement.
    1. Préparer le milieu complet avec un volume égal de DMSO seul à l’utiliser comme un contrôle.
    2. Chauffer le milieu contenant la drogue ou le DMSO à 37 ° C avant d’ajouter aux cellules. Ceci empêchera la focale dérive due à un changement soudain de température.
    3. Ajouter 1 mL de milieu contenant du paclitaxel ou seul pour les puits individuels du plat d’imagerie 12 puits de DMSO.

2. mise en place du Microscope pour l’imagerie de cellules vivantes

  1. Nettoyer le verre-fond du plat avec un nettoyant pour enlever toute traces de doigts ou de la poussière qui peut-être interférer avec l’imagerie optique d’imagerie. Nettoyeur optique suffisante permet de mouiller la surface de verre ensemble.
  2. Placer le plat de fond en verre sur la platine du microscope dans l’imagerie adaptateur plat, retirer le couvercle en plastique du plat et couvrir le plat avec une chambre de verre Garni. S’assurer que la chambre a une valve pour permettre un flux constant d’air composé de 5 % de CO2.
    Remarque : Pour humidifier le 5 % de CO2, le gaz est a coulé à travers tube inséré dans un boîtier de bain de l’eau stérile. Cela permet le transport du gaz deviennent équilibrés à 95 % d’humidité.
  3. Initié/calibrer la scène encodée à l’aide du logiciel contrôlant le microscope. Cela garantira exactes coordonnées X-Y et éviter la dérive focale.
  4. Mettre l’accent sur les cellules à l’aide d’optique à contraste de phase et d’effectuer des illumination de Kohler (décrite en détail dans la référence47) pour concentrer la lumière et offrent un contraste optimal.
  5. Logiciel d’acquisition permet de déterminer les temps d’exposition optimale pour la lumière blanche et tous les canaux fluorescentes utilisées (expositions que donner 75 % pixel saturation sur l’appareil photo sont idéales, pourvu que cette quantité de lumière n’est pas toxique pour les cellules).
    1. Logiciel d’acquisition permet de sélectionner plusieurs, sans chevauchement de champs de vision de chaque puits pour l’imagerie. Sélectionnez les régions d’imagerie où les cellules ont bien respecté le fond en verre et se situent entre 50 % et 70 % anastomosé. Éviter les zones de cellules regroupées, car cela rendra difficile une analyse ultérieure.
      Remarque : Il est important d’avoir de non-cumul champs de vision de chaque puits pour éviter les mêmes cellules de suivi deux fois. Si les cellules sont très mobiles, il peut être nécessaire d’acquérir plusieurs images rayonnant à partir d’un point central et piquer que leur retour ensemble pour faire un grand champ de vision.
  6. Activer la fonction de mise au point automatique du microscope pour s’assurer que tous les points sont maintenues en bref pendant la durée de l’expérience.
  7. Pour évaluer le destin cellulaire mitotique, définissez le logiciel d’imagerie pour recueillir des images de chaque champ de vue sélectionné toutes les 10 min jusqu'à 96 h. impressionnés mitose dure de 20 à 40 min, et donc des intervalles de 10 min fournira assez d’échantillonnage pour déterminer quand les cellules se divisent. Afin d’identifier la rupture nucléaire, qui est un événement transitoire, acquérir des images toutes les 5 min.
    Remarque : Assurez-vous que l’ordinateur le logiciel d’acquisition image de conduite a automatique-mise à jour, économiseurs d’écran et modes d’économies d’énergie désactivés, car ceux-ci peuvent souvent interférer avec acquisition d’images au fil de longues expériences.
  8. Lancer l’expérimentation d’imagerie. Vérifiez périodiquement que l’acquisition d’images tourne régulièrement au cours de la vidéo.

3. video analyse pour identifier les cellules sort en réponse au Paclitaxel

  1. Confirmer que les cellules imagés sont en bonne santé tout au long de l’expérience d’imagerie. Hématies traitées avec le DMSO doivent être viable et activement proliférantes.
    Remarque : Si les cellules présentent des signes de stress, ne pas quantifier la vidéo et plutôt se concentrer sur l’optimisation d’imagerie conditions48. Signes de stress d’imagerie incluent blebbing/mourir les cellules, les cellules qui ne parviennent pas à joindre/propagation sur la plaque et des cellules qui montrent un index mitotique faible et/ou prolongée de la mitose. Sources possibles de stress sont les fluctuations de température ou de niveaux de CO2 à l’intérieur de la chambre ou phototoxicité imagerie48.
  2. Lorsqu’un champ de vision complet avec 10 X ou 20 X, objectif de l’imagerie, des centaines de cellules individuelles peuvent être présents. Par conséquent, pour faciliter le dosage, diviser le champ de vision en quadrants plus petits à l’aide d’outils logiciels disponibles. Marquer des cellules dans chaque quadrant séparément (comme décrit dans les étapes 3.3.1–3.6.2).
  3. Lors de l’analyse de la vidéo, suivre chacune des cellules d’un affichage fusionné à l’aide de contraste de phase et/ou les images fluorescentes. Utiliser des outils logiciels d’analyse pour créer la vue fusionnée.
    1. Depuis le début de la vidéo, identifier une cellule unique interphase et suivre ses progrès dans le cycle cellulaire en utilisant des optiques de phase. Pour suivre une seule cellule, observer la cellule d’une image à l’image de le œil. Identifier les cellules interphasiques en raison de leur morphologie aplatie (telle qu’évaluée par contraste de phase) et leur manque de condensation de l’ADN (tel qu’évalué par H2B-GFP) (Figure 1 a).
  4. Identifier les cellules qui entrent dans la mitose par l’observation de cellules arrondi (en utilisant l’optique à contraste de phase) ou condensation chromosomique (à l’aide de H2B-GFP) (Figure 1 a-C). Les deux cellules arrondi et chromosome condensation sont facilement visualisées par oeil.
    1. Annoter le moment où la cellule entre mitose. Poursuivre le suivi de la cellule jusqu'à ce qu’il atteigne son sort (l’anaphase comme étape 3.5, la mort cellulaire de la mitose comme au point 3.6.1 ou glissement mitotique comme au point 3.6.2).
  5. Cellules de contrôle doivent efficacement aligner leurs chromosomes et entrez l’anaphase 1 h (Figure 1). Visualiser l’anaphase par optique à contraste de phase, comme la cellule commence à pincer en deux, ou par l’intermédiaire de visualisation des chromosomes se déplaçant vers le pôle étiqueté avec H2B-GFP (Figure 1 a). Annoter le temps quand la cellule subit l’anaphase.
  6. En revanche, les cellules traitées avec le paclitaxel restera arrondies avec des chromosomes condensés pendant plusieurs heures (3-40 h) (Figure 1 b-D).
    1. Identifier les cellules mitotiquement arrêté qui subissent la mort cellulaire.
      Remarque : Les cellules qui meurent au cours de la mitose sont visualisées par microscopie à contraste de phase, les cellules seront bleb, se rétrécir ou se rompre (Figure 1 b). Si l’imagerie H2B-GFP, les chromosomes seront également fragment durant la mort cellulaire.
    2. Identifier les cellules mitotiquement arrêté qui subissent les dérapages de la cellule.
      NOTE : Cellules qui subissent une mitose glissement sont observées par microscopie à contraste de phase, alors qu’ils s’aplatissent retour en interphase et acétylations chromosomes sans subir l’anaphase (Figure 1). Les cellules qui subissent une mitose glissement donnent naissance à grandes cellules tétraploïdes qui sont souvent multinucléée (Figure 1).
  7. Continuer le suivi des cellules du champ de vue original. Une fois un champ de vision complet est suivi, déplacer vers un champ de vision distincte acquis d’un même bien et continue de cellules de suivi.

4. vidéo analyse pour identifier la cellule sort suite glissement mitotique

  1. Évaluer le destin cellulaire suite à glissement mitotique (comme indiqué au point 3.6.2) à l’aide de cellules pre-1 exprimant le système FUCCI. En plus de l’imagerie de contraste de phase, il est nécessaire d’acquérir tant une fluorescence rouge (indicative de la phase1 G) et les images de fluorescence verte (indicatif du S/G2/m)).
    1. Suivre les cellules FUCCI RPE-1 tel que décrit à l’étape 3.3 à 3.7.
      1. Pour confirmer que le système FUCCI fonctionne correctement, de valider cette commande cellules remplaçante expression des protéines fluorescentes rouges et vertes convenablement de l’analyse des données d’imagerie de cellules vivantes. Les cellules de contrôle devraient transition de présentant une fluorescence rouge entièrement nucléaire à présent une fluorescence vert entièrement nucléaire pendant l’interphase comme cours de cellules G1 -phase S. Les cellules devraient continuer présentant une fluorescence verte tout au long de la fin de la mitose. Immédiatement après la mitose, les cellules doivent une fois de plus présenter une fluorescence rouge entièrement pendant l’interphase.
        Remarque : Les méthodes pour quantifier les DP et GFP intensités de fluorescence du système FUCCI dans des cellules individuelles à l’aide de traces fluorescentes49, cela n’est souvent pas nécessaire que le changement de couleur de fluorescence est robuste et visible par le œil.
  2. Identifier les cellules arrêtés lors de la mitose à l’aide de la microscopie à contraste de phase et suivez-les jusqu'à ce qu’ils subissent glissement mitotique, comme décrit dans 3.4 et 3.6.2. Cellules qui glisser hors de la mitose et du dos en interphase changera d’exposer une fluorescence verte au cours de la mitose à fluorescence rouge au cours de la phase de1 G (Figure 2 a- C).
    1. Enregistrer les a glissé de cellules à l’aide de contraste de phase et l’imagerie épifluorescente par œil pour évaluer leur sort de la cellule (Figure 2D).
      1. Identifier les cellules qui réintègre le cycle cellulaire. Ces cellules sont identifiées par le changement du rouge au vert dans l’expression de fluorescence en utilisant le système FUCCI qui indique la transition de G1/s (Figure 2 a).
      2. Identifier les cellules qui subissent l’arrêt du cycle cellulaire1 G. Ces cellules sont identifiées par l’expression de la fluorescence rouge qui persiste pendant > 24 h (Figure 2 b).
      3. Identifier les cellules qui meurent en interphase. Ces cellules sont identifiées par cellule rupture/blebbing/rétrécissement en utilisant l’imagerie de contraste de phase (Figure 2).

5. video analyse afin d’identifier la fréquence de Rupture de l’enveloppe nucléaire

  1. PRE-1 cellules exprimant H2B-GFP et TDRFP-NLS permet d’évaluer la rupture de l’enveloppe nucléaire. En plus de l’imagerie de contraste de phase, acquérir une fluorescence rouge (TRITC) tant les images de fluorescence verte (FITC). Acquisition d’images toutes les 5 min pour visualiser la rupture.
    Remarque : Il est essentiel de produire des lignées de cellules dans lesquelles la TDRFP-NLS est efficacement importée dans le noyau avec un minimum de fluorescence cytoplasmique.
  2. Cellules d’image tel que décrit à l’étape 3.3 par 3,4. Le signal de fluorescence TDRFP-NLS et H2B-GFP doivent localiser conjointement pendant l’interphase. Lors de la mitose (comme visualisées par cellule, arrondi à l’aide de phase optique et/ou chromosome condensation par H2B-GFP), l’enveloppe nucléaire se décomposera et le signal de TDRFP-NLS deviendra cytoplasmique (Figure 3 a). La mitose, l’enveloppe nucléaire de réformer dans les cellules de fille et le signal de TDRFP-NLS deviendra nucléaire.
  3. Suivi des cellules-filles tout au long de l’interphase ultérieur par imagerie de cellules vivantes. Identifier les événements nucléaires rupture en observant un éclat transitoire de TDRFP-NLS nucléaire localisée dans le cytoplasme environnant. En quelques minutes, l’enveloppe nucléaire sera réparé et la TDRFP-NLS va être relocalisée dans le noyau (Figure 3 a).
    NOTE : Souvent, l’ADN nucléaire, comme visualisés par H2B-GFP, on le verra à faire saillie à l’extérieur du lieu de la rupture comme une petite cloque.
  4. Le score de la fraction des noyaux qui subissent un événement de rupture au cours de l’interphase. Pour marquer cette fraction, compter le nombre de cellules subissant un événement de rupture sur le nombre total de cellules suivies.

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Representative Results

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, pre-1 cellules exprimant H2B-GFP ont été traités avec un contrôle anti mitotique ou véhicule (DMSO) et analysées par imagerie de cellules vivantes. L’analyse a révélé que 100 % des cellules mitotiques de pre-1 contrôle initié l’anaphase en moyenne 22 min après être entré dans la mitose (Figure 1 a, 1D). En revanche, pre-1 cellules traitées par paclitaxel ont montré un profond arrêt mitotique durant plusieurs heures (Figure 1). L’imagerie a révélé que 48 % de ces cellules arrêtées en mitose a subi une mort cellulaire mitotique (Figure 1 b, 1E), tandis que les autres 52 % ont subi une glissement mitotique (Figure 1, 1E).

Pour évaluer le devenir des cellules RPE-1 qui a subi le glissement mitotique, pre-1 cellules exprimant le système FUCCI ont été traités avec soit faible dose 50 nM paclitaxel, dose élevée 5 µM paclitaxel, ou véhicule de contrôle (DMSO) et analysée par imagerie de cellules vivantes à long terme. Les données ont montré que des cellules RPE-1 qui subit la mitose glissement après un traitement à 50 nM paclitaxel, 22 % sont morts dans le cycle subséquent de la cellule (Figure 2, 2D), 72 % provoquée par l’arrêt du cycle cellulaire (Figure 2 b, 2D), et seulement 5 % réadmises phase S (Figure 2 a, 2D). En revanche, des cellules RPE-1 recevant de fortes doses 5 µM paclitaxel qui subit la glissement mitotique, 35 % sont morts dans le cycle cellulaire ultérieur, 65 % provoquée par l’arrêt du cycle cellulaire, et aucun réadmises phase S (Figure 2D).

Fait intéressant, minidosés paclitaxel-traitement favorise la rupture de la membrane nucléaire pre-1 cellules après la mitose. Après la réalisation mitotique cellules-filles ont été suivis et ont marqué pour les événements de rupture nucléaire, révélant que seulement environ 4 % de contrôler des cellules-filles (imprégnées sur le DMSO) pre-1 s’est rompus, alors que ~ 23 % des cellules-filles traitées avec 10 nM paclitaxel rupture ( Figure 3 a, 3 b).

Figure 1
Figure 1 : destin cellulaire mitotique en réponse au traitement anti-mitotique. PRE-1 cellules exprimant de manière stable H2B-GFP ont été traités avec contrôle de véhicule de DMSO (A) ou 5 µM paclitaxel (B, C) et photographié à l’aide de Time-lapse à contraste de phase et microscopie à épifluorescence widefield d’évaluer le destin cellulaire mitotique. Cellules en interphase (panneaux de gauche) ont été suivis en entrant la mitose (panneaux de moyenne) et jusqu'à ce qu’ils ont initié l’anaphase (A), a subi une mort cellulaire mitotique (B) ou a glissé de la mitose en interphase (C). Flèches blanches indiquent les cellules sur chenilles. (D), la quantité de temps que le contrôle des cellules (DMSO traités) et les cellules traitées anti-mitotic passé lors de la mitose, comme quantifié par imagerie de cellules vivantes (n = 100 cellules pour chaque condition). (E), la fraction des cellules (n = 100) qui ont subi l’anaphase, mort cellulaire mitotique ou glissement mitose dans les cellules traitées DMSO ou les cellules traitées avec 5 µM paclitaxel. Temps, h:min. barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : sort des cellules subissant glissement mitotique. PRE-1 cellules exprimant de manière stable le système FUCCI ont été traités avec 50 nM paclitaxel ou 5 µM paclitaxel et photographié à l’aide de Time-lapse à contraste de phase et la microscopie de fluorescence widefield pour doser le destin cellulaire suite à glissement mitotique. Les cellules ont été marqués comme soit réintroduits dans le cycle cellulaire, à en juger par un changement de fluorescence rouge au vert dans le système FUCCI (A) ; arrêtant en phase1 G, si l'on en juge par la fluorescence rouge persistante pour > 24 h (B) ; ou de mourir lors de la mitose ultérieure, si l'on en juge par cellulaire blebbing/rupture (C). Flèches blanches indiquent les cellules sur chenilles. (D), la fraction des cellules (n = 100) qui a fait l’objet chaque sort. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de deux expériences indépendantes. Temps, h:min. barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : fréquence de rupture de la membrane nucléaire dans les cellules traitées paclitaxel. PRE-1 cellules exprimant de manière stable TDRFP-NLS et H2B-GFP ont été traitées avec 10 nM paclitaxel ou véhicule contrôler (DMSO) et photographié à l’aide de Time-lapse à contraste de phase et microscopie à épifluorescence widefield (A). Au cours de la mitose (métaphase/Anaphase), l’enveloppe nucléaire se décompose et TDRFP-NLS devient cytoplasmique. Après la mitose, la TDRFP-NLS relocalizes vers le noyau des cellules en interphase (avant Rupture). Événements de rupture nucléaires sont identifiés par la délocalisation de la TDRFP-NLS du noyau vers le cytoplasme de cellules en interphase (Rupture), suivie de la relocalisation du TDRFP-NLS vers le noyau après réparation de l’enveloppe nucléaire (après la Rupture). Flèches blanches indiquent les cellules sur chenilles. (B), la fraction des cellules (n > 100 par condition) qui indiquent l’enveloppe nucléaire rupture après la mitose en présence de paclitaxel ou véhicule de contrôle. Temps, h:min. barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’aspect le plus important de l’imagerie de cellules vivantes à long terme est d’assurer la santé des cellules étant imagé. Il est essentiel que les cellules soient exposés à minimales stresseurs environnementaux extérieurs, tels que des conditions non conformes aux normes concernant l’humidité, de température et/ou de CO2 niveaux. Il est également important de limiter le photovieillissement d’éclairage fluorescent d’excitation, comme l’imagerie stress est connu pour affecter la cellule comportement50. Limitant le photovieillissement peut être atteint de multiples façons comme indiqué ailleurs48. En général, il est préférable d’utiliser le temps d’exposition plus court nécessaire pour produire un signal de fluorescence assez suffisamment lumineux pour suivre efficacement les cellules, limitant ainsi la phototoxicité. Toutefois, si les cellules sont imagés qu’une fois toutes les 10 à 20 min, des expositions plus longues (qui approchent la saturation des pixels) sont généralement bien toléré (même si cela doit être déterminée empiriquement pour chaque type de fluorophore et cellule). Parce que les cellules imagés sont sensibles aux contraintes environnementales et d’imagerie, il est impératif que les hématies sont toujours inclus dans les expériences d’imagerie de cellules vivantes et surveillés pour confirmer la prolifération normale.

Une des limitations à l’imagerie de cellules vivantes à long terme sont qu’il faut équiper un microscope existant avec une chambre environnementale qui maintient la température et 5 % humidifiée atmosphère de CO2 , ou une chambre d’étape-haut qui est aussi capable de soutenir la bonne température et l’atmosphère. Tandis que le fluide de CO2 est optimale, cellules peuvent également être photographiées pendant plus de 48 h à l’aide de CO2-média indépendant si une chambre avec 5 % humidifiée CO2 n’est pas disponible. Cependant, plusieurs types de cellules sont intolérants de ce support, et cela doit être déterminée empiriquement en mesurant la viabilité et la croissance des cellules. Superposant les cellules avec l’huile minérale peut également servir pour éviter une évaporation moyenne.

Une autre limite importante de cette méthode est que suivi manuellement des destins cellulaires est extrêmement laborieux et beaucoup de temps. Toutefois, des programmes de suivi des cellules sont disponibles et peuvent être optimisées pour automatiser l’image analyse51,52,53. Une autre limitation de cette méthode est que les cellules hautement mobiles sont souvent difficiles à suivre sur de longues périodes de temps. Si cela pose un problème important, tout le bien peut être photographié et les images cousues ensemble pour former un grand champ de vision. De nombreux logiciels prend en charge cette méthode.

Autofluorescence est une autre contrainte qui doit être abordée avec ce protocole. Un milieu sans rouge de phénol réduit autofluorescence de fond au cours de l’imagerie de cellules vivantes. Il a également été démontré que deux vitamines trouves couramment dans le milieu de croissance, de riboflavine et de pyridoxal, peut diminuer la photostabilité des protéines fluorescentes. Ainsi, milieu dépourvu de ces vitamines permet également au cours de l’imagerie de fluorescence pour améliorer le signal bruit rations. Tandis que le fond en plastique plats coûtent moins cher et peut fournir des résultats de l’imagerie adéquates, ils produisent aussi une plus grande quantité d’autofluorescence qui affecte négativement les rapports signal sur bruit. En outre, des plats en plastique fond ont une plus grande variation d’épaisseur, qui peut perturber la fonction autofocus de nombreux microscopes. L’épaisseur du verre à fond plat d’imagerie dans le présent protocole est de 0,17 mm, ce qui est le verre idéal pour une utilisation avec des microscopes modernes.

Enfin, films à long terme qui englobe plusieurs champs de vision et l’acquisition de plusieurs canaux de fluorescence produisent des fichiers de données massifs (des dizaines de gigaoctets à téra-octets chacun, même), qui posent un problème pour le stockage des données et de sauvegarde. Pour minimiser ce problème, il est recommandé que toutes les images être acquis à l’aide de 2 x 2 ou 4x4 binning, fourni la perte qui en résulte dans la résolution est acceptable. Binning limite non seulement les temps d’exposition (c'est-à-dire les cellules exprimant de manière stable H2B-GFP ou le système FUCCI devraient avoir exposition inférieure à 500 ms), mais réduit aussi considérablement la taille des fichiers de données (une image numérique 2 x 2 est un quart la taille du fichier d’un image non expulsé).

Malgré ces limites, l’imagerie de cellules vivantes à long terme représente la meilleure méthode pour suivre les destins de cellules individuelles de populations entières, en particulier lorsque des destins cellulaires sont très hétérogènes. Comme plus de cellules vivantes de marqueurs fluorescents et capteurs deviennent disponibles, les cellules vivantes des approches d’imagerie sera élargi afin de visualiser et de quantifier plusieurs autres aspects de la biologie cellulaire. Par exemple, les cellules vivantes capteurs existent actuellement pour quantifier les foyers de dommages d’ADN, les niveaux de p53, position du cycle cellulaire et apoptose26,,du5455,56,57,58 . Ainsi, les expériences d’imagerie ont la capacité de révéler les propriétés cellulaires sous-jacentes qui déterminent comment et pourquoi unique cellules réagissent diversement aux agents chimiothérapeutiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

AFB, VMR et NJG voudrais remercier Ryan Quinton pour commentaires sur le manuscrit et Adrian Salic pour la construction de TDRFP-NLS. AFB et VMR sont financés par la subvention de formation en pharmacologie NIGM biomoléculaire 5T32GM008541. NJG est membre du Shamim et Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories et bénéficie de subventions de NIH GM117150 et CA-154531 la Karin Grunebaum Foundation, le programme de bourses de famille Smith, le programme des boursiers Searle et la recherche de mélanome Alliance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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