A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Cancer Research

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Summary

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

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Bolgioni, A. F., Vittoria, M. A., Ganem, N. J. Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel. J. Vis. Exp. (135), e57383, doi:10.3791/57383 (2018).

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Abstract

Proyección de imagen de células vivas es una técnica poderosa que puede utilizarse para visualizar directamente los fenómenos biológicos en las células durante largos períodos de tiempo. En la última década, nuevas e innovadoras tecnologías han mejorado grandemente la utilidad de las imágenes de células vivas. Las células pueden mantenerse ahora en foco y continuamente reflejada durante varios días mientras se mantuvo en 37 °C y 5% CO2 condiciones de cultivo celular. Por otra parte, múltiples campos de vista representando a diferentes condiciones experimentales puede ser adquirido al mismo tiempo, proporcionando así datos experimentales de alto rendimiento. Proyección de imagen de células vivas ofrece una considerable ventaja sobre la proyección de imagen fija-cell por lo que permite la visualización directa y la cuantificación temporal de eventos celulares dinámicos. Imágenes de células vivas también pueden identificar la variación en el comportamiento de las células que de lo contrario habría sido perdido usando análisis basado en la población. Aquí, describimos protocolos imágenes de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel. Demostrar métodos para visualizar si mitotically detuvieron mueren células de mitosis o slip en interfase. También describimos cómo el sistema de indicadores (FUCCI) ciclo de celular ubiquitinación base fluorescente puede utilizarse para evaluar la fracción de células de la interfase de deslizamiento mitótico que son capaces de volver a entrar en el ciclo celular. Finalmente, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para identificar eventos de ruptura del envoltorio nuclear.

Introduction

Drogas anti-mitotic han sido utilizadas en los regímenes quimioterapéuticos de varios tipos de tumores sólidos y a menudo muestran gran eficacia1,2,3. Mecánico, estos fármacos interrumpir progresión mitótica normal y promover la detención mitótica en proliferar rápidamente las células cancerosas. Sin embargo, el destino de la célula en respuesta a la detención mitótica es muy variable: mientras que una fracción de las células sufre la muerte celular de mitosis, otros salida de mitosis y regresar a la interfase como células tetraploides (un proceso llamado mitosis deslizamiento)4, 5,6,7,8. Estas células de interfase pueden ejecutar apoptosis, someterse a detención del ciclo celular permanente o incluso volver a entrar en el ciclo celular4,5,6,7,8,9 ,10,11. Células que evaden muerte mitótica de la célula por deslizamiento en la interfase, sólo para volver a entrar en el ciclo celular después del retiro de la droga, por lo tanto pueden contribuir a la re-aparición de poblaciones de la célula de cáncer. Por otra parte, células que resbalón de mitosis son tetraploides y tetraploidy se conoce para promover la inestabilidad del cromosoma que lleva el tumor recaen12,13,14,15. Definir los factores que controlan el destino de la célula en respuesta a los tratamientos con fármacos anti-mitotic, por tanto, es fundamental para optimizar la terapéutica actual.

En este protocolo, se describen métodos para observar directamente y estudiar el destino de las células que sufren detención mitótica prolongada en respuesta a la drogas anti-mitotic paclitaxel. Paclitaxel es un establecido terapéutico en la clínica y ha demostrado ser altamente eficaz en muchos tipos de tumores, los de mama, ovarios y pulmones16,17,18,19, incluidos 20. Paclitaxel, que es un alcaloide de la planta de la corteza del árbol tejo, estabiliza microtúbulos y así previene su dinamismo21,22. Mientras que la amortiguación de la dinámica de los microtúbulos por paclitaxel no afecta la progresión del ciclo celular de los G1 a G2, la droga conduce a la activación sostenida del puesto de control de ensamblaje del huso durante la mitosis por obstaculizar accesorio de cinetocoro-microtúbulo (revisado en profundidad aquí23,24)25. Como consecuencia, se previene la inicio de la anafase en células tratadas con paclitaxel y resultado en una prolongada detención mitótica.

Este protocolo primero describe enfoques para identificar las células mitotic en experimentos de proyección de imagen de células vivas. Puede visualizarse la mitosis en células en cultivo de tejido adherente debido a dos cambios biológicos de la célula sensible. En primer lugar, los cromosomas se convierten en altamente condensados inmediatamente antes de la ruptura de la envoltura nuclear. Mientras que a menudo detectables por microscopia de contraste de fases estándar, condensación del cromosoma puede ser detectado más claramente utilizando fluorescente etiquetas etiqueta los cromosomas (por ejemplo proteínas de histona marcada con fluorescencia). En segundo lugar, mitóticas las células también pueden identificarse por los dramáticos cambios morfológicos que resultan del redondeo de las células.

Este protocolo entonces demostrará cómo utilizar enfoques imágenes de células vivas para seguir los destinos de las células experimentan prolongada detención mitótica. Las células en mitosis son sometidos a uno de tres destinos distintos. En primer lugar, las células pueden sufrir muerte celular durante la mitosis. Este fenómeno es fácilmente visualizado por microscopia ligera, como muerte de las células se observan a encogimiento, ampolla o ruptura. En segundo lugar, las células pueden tomar la salida de mitosis y retorno a interfase sin segregación cromosómica o citocinesis, un proceso denominado deslizamiento mitotic. La decondensation de los cromosomas o el aplanamiento de la célula mitótica fácilmente identifica este proceso. Las células de mitosis que muestran también a menudo núcleos irregulares, múltiples lóbulos y con frecuencia albergan varios micronúcleos5. En tercer lugar, las células en mitosis pueden iniciar anafase y proceder a través de la mitosis después de un largo retraso. Mientras que es infrecuente en concentraciones más altas de la droga, este comportamiento sugiere que las células detenidas pueden haber satisfecho el puesto de control de ensamblaje del huso, o que el puesto de control de ensamblaje del huso está parcialmente debilitado o defectuoso. Inicio de la anafase se puede visualizar por segregación cromosómica y citocinesis posterior usando proyección de imagen de células vivas.

También se describen métodos de células vivas para rastrear el destino de las células que evadir la muerte mitótica de la célula que experimenta mitotic deslizamiento. Las células que sufren mitosis deslizamiento mueren en la interfase posterior, desencadenan una durable detención de ciclo celular G1 o volver a entran en el ciclo celular para iniciar una nueva ronda de división celular4. Se describirá el enfoque utilizando el sistema de (indicador de ciclo de celular ubiquitinación base fluorescente) FUCCI para determinar la fracción de células que volver a entrar en el ciclo celular tras deslizamiento mitotic. FUCCI permite la visualización directa de la transición de G1/s y puede utilizarse en conjunción con largo plazo células vivas imágenes tanto en vivocomo en vitro 26,27. El sistema FUCCI aprovecha de dos proteínas fluorescencia de etiquetado, formas truncadas de hCdt1 (licencia de cromatina y replicación del DNA factor 1) y hGeminin, cuyos niveles oscilan en función de posición de ciclo celular. hCdt1 (unida a una proteína fluorescente roja) está presente en altos niveles en fase G1 donde actúa para licencia de ADN para la replicación, pero es ubiquitinated por el E3 ubiquitina ligasa SCFSkp2 y degradada durante las fases de /M2S/G para evitar la replicación de ADN26. Por el contrario, hGeminin (unida a una proteína fluorescente verde), es un inhibidor de la hCdt1 cuya cima de niveles durante S/G2/m, pero es ubiquitinated por el E3 ubiquitina ligasa APCCdh1 y degrada al final de la mitosis y a lo largo de G1 26. en consecuencia, FUCCI ofrece una lectura directa de la fluorescencia de la fase del ciclo celular, como las células exhiben fluorescencia roja durante la fluorescencia verde y1 G durante S/G2/M. El sistema FUCCI representa un avance significativo sobre otros enfoques (por ejemplo, tinción de bromodeoxiuridina) para identificar las células proliferativas, porque no requiere la fijación de la célula y permite la proyección de imagen de célula sin necesidad de adicional farmacológica tratamientos para sincronizar poblaciones celulares. Aunque no discutido en este protocolo, también se han desarrollado sensores adicionales de células vivas para visualizar la progresión del ciclo celular, incluyendo un sensor de helicasa B para G128, ADN ligasa-RFP29 y PCDNA-GFP30 sensores para la fase S y el reciente FUCCI-4 sensor, que detecta todas las etapas del ciclo celular31.

Por último, se describirá un método por imágenes de células vivas para detectar ruptura de la envoltura nuclear. Estudios recientes han revelado que los sobres nucleares de las células cancerosas son inestables y propensos a estallar, lo que permite que el contenido del nucleoplasia y citoplasma a intermix. Este fenómeno, llamado ruptura nuclear, puede promover daños al ADN y estimulación de la respuesta inmune innata32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. mientras que las causas de la ruptura nuclear permanecen incompletamente caracterizadas, se conoce que las deformaciones en la estructura nuclear se correlacionan con una mayor incidencia de ruptura nuclear42. Un conocido efecto del tratamiento con paclitaxel es la generación de estructuras nucleares sorprendentemente anormales tras la mitosis; así, se describen un método usando células vivas la proyección de imagen para cuantificar ruptura nuclear, explorando también si paclitaxel tratamiento aumenta la frecuencia de eventos de ruptura nuclear. Ruptura nuclear puede detectarse la salida observada de una proteína fluorescente blanco nuclear en el citoplasma (por ejemplo un dímero de tándem repetición de RFP fusionado a una señal de localización nuclear, TDRFP-NLS). Esta fuga es claramente visible por el ojo, que permite la simple cuantificación de eventos de ruptura.

Este protocolo requiere un microscopio de epifluorescencia de campo amplio que está equipado con una etapa codificado y software de enfoque automático. La etapa codificada permite movimiento automatizado exacto definido coordenadas X-Y, mientras que software de enfoque automático mantiene las células en el foco para la duración del período de proyección de imagen. Además, este protocolo requiere equipo para mantener humedecían de las células a 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Esto puede lograrse utilizando el microscopio todo dentro de una temperatura y atmósfera controlada gabinete o utilizando dispositivos de etapa superior que localmente mantiene la temperatura y el medio ambiente. El objetivo de contraste de fase utilizado en este protocolo es un fluor plan 10 x con una apertura numérica de 0.30. Sin embargo, objetivos X 20 también están suficientes para identificar las células redondeadas interfase mitótica y aplanado en un solo plano focal. En caso de fase-ponga en contraste proyección de imagen (como se describe en este método), la cubierta puede ser vidrio o plástico. Si se utiliza el microscopio de interferencia diferencial contraste (DIC), es imprescindible utilizar una cubierta de cristal para evitar la despolarización de la luz.

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Protocol

Este protocolo se centra en el uso de la no-transformado y cromosómico estable retiniana pigmentada epitelial (RPE-1) línea celular para experimentos de células vivas. Sin embargo, este protocolo adaptable a cualquier línea celular adherente que las condiciones de cultivo celular se ajustan según sea necesario. Todos los procedimientos deben adherir a regulaciones y directrices éticas y de bioseguridad institucional.

1. preparación de las células de proyección de imagen de células vivas

  1. Utilizar las células de RPE-1 pasaje recién descongelada y principios expresando humano histona que H2B unida a una proteína fluorescente (e.g. H2B-GFP), o el sistema FUCCI (un protocolo detallado en cómo generar células FUCCI-expresión puede encontrarse en la referencia45) para evaluar el destino de la célula mitótica.
    1. Para medir la frecuencia de ruptura nuclear, uso de las células de RPE-1 expresando GFP H2B y un dímero de tándem de proteína fluorescente rojo fundido a una señal de localización nuclear simple (TDRFP-NLS).
      Nota: Las construcciones de tres proteínas fluorescentes verdes fusionan junto a una señal de localización nuclear solo (GFP3- NLS) también han sido utilizados para demostrar la ruptura (como en la referencia42).
    2. Mantener las células en las placas de cultivo de tejidos de 10 cm en el medio de crecimiento apropiado. Las células RPE-1 se mantienen en el rojo de fenol libre, modificado Eagle medio/nutrientes mezcla F-12 de Dulbecco (DMEM:F12) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL.
  2. Aspirar el medio de las células, lavar el plato de cultivo de tejidos con 10 mL de temperatura ambiente estéril, tampón fosfato salino (PBS) para eliminar el medio restante y luego aspirar el PBS.
    1. Añadir 2 mL de 0.25% tripsina con ácido etilendiaminotetracético (EDTA) a las células e incubar a 37 ° C por 3 min o hasta que la mayoría de las células ha separado de la placa.
      Nota: No guarde las células en tripsina más tiempo del necesario.
  3. Añadir 10 mL de medio completo para recoger las células trypsinized con un stripette serológica de 10 mL y dispensar en un tubo cónico de 15 mL.
    1. Sedimenten las células por centrifugación a 180 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
  4. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento y luego bien Resuspender el precipitado en 10 mL de medio fresco transfiriendo suavemente del medio hacia arriba y hacia abajo en el stripette serológica.
  5. Utilizar un hemocitómetro o célula automatizada máquina de conteo para contar células46.
    1. Diluir las células en un tubo cónico nuevo a 30.000 células/mL de medio completo.
    2. 30.000 RPE células-1 (volumen de 1 mL) por pocillo de cristal bien 12 fondo (#1.5 espesor) plato para lograr la densidad celular necesaria al día siguiente (30 – 50% confluente) la proyección de imagen de la placa.
      Nota: Siempre manejar la placa con guantes y tenga cuidado de no tocar el fondo de cristal.
  6. Permitir a las células a crecer en una incubadora de cultivo de tejidos de 37 ° C hasta que totalmente fijen y aplanan en la placa de imagen con fondo de cristal. Mientras que las células pueden colocar en tan sólo 4 h, se recomienda que las células no tratadas con medicamentos y reflejadas hasta el día siguiente.
  7. Añadir el paclitaxel (disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO)) a la concentración final deseada en el medio completo y mezcla bien.
    1. Preparar el medio completo con un volumen igual de DMSO solo para usar como un control.
    2. Caliente el medio que contiene droga o DMSO a 37 ° C antes de agregar a las células. Esto evitará el deriva focal debido a un cambio repentino de temperatura.
    3. Añadir 1 mL de medio que contiene paclitaxel o DMSO solamente a pocillos individuales del plato de imagen 12-bien.

2. configuración del microscopio para obtener imágenes de células vivas

  1. Limpiar el fondo de cristal del proyección de imagen plato con limpiador óptico para eliminar las huellas dactilares o polvo que pueda interferir con la proyección de imagen. Utilice limpiador óptico suficiente para mojar la superficie de vidrio entero.
  2. Coloque el plato de fondo de cristal de la platina del microscopio en la proyección de imagen adaptador de plato, retire la tapa de plástico del plato y cubrir el plato con una cámara con tope de cristal. Asegúrese de que la cámara tiene una válvula para permitir un flujo constante de aire de 5% CO2.
    Nota: Para humidificar el 5% CO2, el gas es atravesado tubo insertado en una cubierta de baño de agua estéril. Esto permite que el gas a ser equilibrados a 95% de humedad.
  3. Inicio/calibrar la etapa codificada usando el programa de software que controla el microscopio. Esto garantizar precisas coordenadas X-Y y evitará el deriva focal.
  4. Centrarse en las células usando la óptica de contraste de fase y efectuar iluminación de Kohler (descrita en detalle en referencia47) para enfocar la luz y contraste óptimos.
  5. Utilice software de adquisición para determinar los tiempos de exposición óptima para luz blanca y todos los canales fluorescentes se utiliza (las exposiciones que dan 75% saturación de píxeles de la cámara son ideales, siempre que esta cantidad de luz que no sea tóxica para las células).
    1. Utilice software de adquisición para seleccionar varios, sin traslapo campos de vista de cada pozo para la proyección de imagen. Seleccione imagen regiones donde las células se han adherido a la parte inferior de cristal y son entre 50% y 70% confluente. Evite áreas de células agrupadas, ya que esto dificultará el análisis subsecuente.
      Nota: Es importante que no superpuestos campos de vista de cada pozo para evitar el seguimiento de las células del mismo dos veces. Si las células son altamente móviles, puede ser necesario adquirir varias imágenes irradian hacia fuera desde un punto central y coser nuevamente juntos para hacer un gran campo de visión.
  6. Activar la función de enfoque automático del microscopio para asegurar que todos los puntos se mantienen en foco para la duración del experimento.
  7. Para evaluar el destino de la célula mitótica, configure el software de imágenes para recoger imágenes de cada campo seleccionado de la vista cada 10 minutos hasta 96 h. imperturbable mitosis dura 20-40 min, y así intervalos de 10 minutos le proporcionará suficiente muestreo para identificar cuando las células se dividen. Para identificar ruptura nuclear, que es un evento transitorio, adquirir imágenes cada 5 minutos.
    Nota: Asegúrese de que el ordenador el software de adquisición de imagen de conducción tiene actualización automática, protectores de pantalla y modos de ahorro de energía desactivados, como estos a menudo pueden interferir con la adquisición de imágenes sobre experimentos de largo.
  8. Iniciar el experimento de la proyección de imagen. Confirmar periódicamente que adquisición de la imagen se ejecuta sin problemas en el transcurso del video.

3. vídeo análisis para identificar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

  1. Confirman que las células imagen saludables en el transcurso del proyección de imagen experimento. Las células del control tratadas con DMSO deben ser viable y activamente proliferante.
    Nota: Si las células presentan signos de estrés, no cuantificar el video y en lugar de otro centrarse en optimizar la proyección de imagen de las condiciones de48. Signos de estrés la proyección de imagen incluyen blebbing/muriendo células, células que no conecte, transmitido en la placa y las células que muestran un bajo índice mitótico o mitosis prolongada. Posibles fuentes de estrés incluyen las fluctuaciones de temperatura o el CO2 niveles dentro de la proyección de imagen de cámara o fototoxicidad48.
  2. Cuando un campo de visión entero con un 10 X o 20 X objetivo de imágenes, cientos de células individuales pueden estar presentes. Por lo tanto, para ayudar con la cuantificación, divida el campo de visión en cuadrantes más pequeños utilizando herramientas de software disponibles. Puntuación de células dentro de cada cuadrante por separado (como se describe en pasos 3.3.1–3.6.2).
  3. Al analizar el vídeo, la pista cada celda de una vista combinada con contraste de fase o imágenes fluorescentes. Utilizar herramientas de análisis de software para crear la vista combinada.
    1. Desde el comienzo del vídeo, identificar una célula sola interfase y seguir su evolución a través del ciclo de la célula usando la óptica de la fase. Para el seguimiento de una sola célula, observe la celda de cuadro a cuadro por ojo. Identificar las células de la interfase debido a su morfología aplanada (como cuotas por contraste de fase) y su falta de condensación del ADN (según lo determinado por H2B-GFP) (figura 1A).
  4. Identificar las células que entran en mitosis por la observación de células redondeo (usando la óptica de contraste de fase) o condensación de cromosomas (con H2B-GFP) (figura 1A-C). Ambos condensación de redondeo y el cromosoma de la célula se visualizan fácilmente por el ojo.
    1. Anotar la hora en que la célula entra en mitosis. Continuar el seguimiento de la célula hasta llegar a su destino (anafase como paso 3.5, muerte de las células de mitosis como en el paso 3.6.1 o deslizamiento mitótico como en el paso 3.6.2).
  5. Células del control eficiente deben alinear sus cromosomas y entrar en anafase dentro de 1 h (figura 1). Visualizar la anafase por óptica de contraste de fase, la célula comienza a pellizcar en dos o mediante la visualización de los cromosomas moviéndose hacia los polos marcados con H2B-GFP (figura 1A). Anotar el tiempo cuando la célula experimenta la anafase.
  6. Por el contrario, las células tratadas con paclitaxel serán siendo redondeadas con cromosomas condensados durante varias horas (3-40 h) (figura 1B-D).
    1. Identificar células mitotically detenidos que sufren muerte celular.
      Nota: Las células que mueren durante la mitosis se visualizan por microscopia de contraste de fase, como las células de la ampolla, encogimiento, ruptura (figura 1B). Si la proyección de imagen H2B-GFP, los cromosomas también se fragmentan durante la muerte celular.
    2. Identificar células mitotically detenidos que sufren deslizamiento celular.
      Nota: Las células que sufren mitosis deslizamiento se observan por microscopia de contraste de fase, como aplanar nuevamente en interfase y decondense cromosomas sin sufrir anafase (figura 1). Las células que sufren mitosis deslizamiento dan lugar a grandes células tetraploides que son a menudo multinucleada (figura 1).
  7. Continuar seguimiento de células desde el campo de vista original. Una vez que se realiza un seguimiento un completo campo de visión, mueva a un campo de visión independiente adquirido el mismo bien y continuar el seguimiento de las células.

4. vídeo análisis para identificar la celda destino tras deslizamiento mitótico

  1. Evaluar el destino de la célula tras deslizamiento mitotic (como se describe en el paso 3.6.2) utilizando células RPE-1 expresando el sistema FUCCI. Además de proyección de imagen de contraste de fase, es necesario adquirir fluorescencia roja (indicativa de la fase de1 G) e imágenes de fluorescencia verde (indicativo de S/G2/m)).
    1. Seguimiento de las células de RPE FUCCI-1 como se describe en el paso 3.3 a 3.7.
      1. Para confirmar que funciona correctamente el sistema FUCCI, validar que el control de las células de expresión alternativa de las proteínas fluorescentes rojas y verdes adecuadamente desde el análisis de los datos de imágenes de células vivas. Las células del control deben transición de exhibiendo fluorescencia roja totalmente nuclear a exhibir fluorescencia verde totalmente nuclear durante la interfase como un avance de las células de G1 a fase S. Las células deben continuar exhibiendo fluorescencia verde a lo largo de la realización de la mitosis. Inmediatamente después de la mitosis, las células una vez más deben exhibir fluorescencia roja completamente durante la interfase.
        Nota: Si bien existen métodos para cuantificar las intensidades de fluorescencia de RFP y GFP del sistema en las células usando rastros fluorescentes49FUCCI, esto a menudo no es necesario el cambio del color de la fluorescencia es sólida y visible por el ojo.
  2. Identificar células en mitosis mediante microscopía de contraste de fase y seguirlos hasta que experimentan mitotic deslizamiento, como se indica en 3.4 y 3.6.2. Células que resbalón de mitosis y en interfase cambiará de exhibiendo fluorescencia verde durante la mitosis para fluorescencia roja fase G1 (figura 2A- C).
    1. Seguimiento de estas deslizó las células mediante contraste de fase y epifluorescente imágenes por ojo para evaluar su destino celular (Figura 2D).
      1. Identificar células que volver a entran en el ciclo celular. Estas células se identifican por el cambio de rojo a verde en la expresión de fluorescencia usando el sistema FUCCI que indica la transición de G1/s (figura 2A).
      2. Identificar las células que sufren detención de ciclo celular G1 . Estas células se identifican por la expresión de fluorescencia roja que persiste por > 24 h (figura 2B).
      3. Identificar las células que mueren en la interfase. Estas células se identifican por célula de ruptura/blebbing/contracción usando proyección de imagen de contraste de fase (figura 2).

5. vídeo análisis para identificar la frecuencia de la ruptura de la envoltura Nuclear

  1. Usar las células RPE-1 expresando GFP H2B y TDRFP-NLS para evaluar ruptura de la envoltura nuclear. Además de proyección de imagen de contraste de fase, adquirir imágenes de fluorescencia verde (FITC) y fluorescencia roja (TRITC). Adquirir imágenes cada 5 minutos para visualizar la ruptura.
    Nota: Es crítico para generar líneas de células en que el NLS TDRFP se importa eficientemente en el núcleo con fluorescencia citoplasmática mínimo.
  2. Imagen de células como se describe en el paso 3.3 a 3.4. La señal de fluorescencia TDRFP NLS y H2B-GFP Co deben localizar durante la interfase. En la mitosis (como visualizado por célula redondeo usando condensación óptica o cromosoma de la fase de H2B-GFP), la envoltura nuclear se descomponen y la señal de TDRFP-NLS se citoplasmática (Figura 3A). Después de la mitosis, la envoltura nuclear se reforma en las células hijas y la señal TDRFP-NLS será nuclear.
  3. Seguimiento de las células hijas a lo largo de la interfase posterior por proyección de imagen de células vivas. Identificar eventos de ruptura nuclear mediante la observación de una explosión transitoria de NLS de TDRFP nuclear localizada en el citoplasma circundante. Dentro de minutos, se reparará la envoltura nuclear y el TDRFP-NLS se agrupamiento al núcleo (Figura 3A).
    Nota: A menudo, el ADN nuclear, como visualizar por H2B-GFP, se verá que sobresalga fuera del sitio de ruptura como una pequeña ampolla.
  4. Anotar la fracción de núcleos que se someten a un evento de ruptura durante la interfase. Para conseguir a esta fracción, contar el número de células que sufren un evento de ruptura sobre el número total de células realiza un seguimiento.

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Representative Results

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, las células de RPE-1 expresando GFP H2B fueron tratadas con un control anti-mitotic o vehículo (DMSO) y analizadas por proyección de imagen de células vivas. El análisis reveló que 100% de las células del EPR-1 control mitóticas iniciado anafase un promedio de 22 minutos después de entrar en mitosis (figura 1A, 1D). Por el contrario, las células de RPE-1 tratadas con paclitaxel exhibieron una profunda detención mitótica dura varias horas (figura 1). Proyección de imagen reveló que 48% de estas células mitotically detenidos sufrieron muerte mitótica de la célula (figura 1B, 1E), mientras que el restante 52% experimentó el deslizamiento mitótico (figura 1, 1E).

Para determinar el destino de las células de RPE-1 que sufrió deslizamiento mitótico, las células RPE-1 expresando el sistema FUCCI fueron tratadas con cualquier dosis bajas 50 nM paclitaxel, dosis alta 5 μm paclitaxel, o vehículo control (DMSO) y analizadas por la proyección de imagen de células vivas a largo plazo. Los datos revelaron que de las células de RPE-1 que sufrió deslizamiento mitótico después del tratamiento con paclitaxel de nM 50, 22% murieron en el subsiguiente ciclo celular (figura 2, 2D), 72% inducida por detención del ciclo celular (figura 2B, 2D), y sólo el 5% volvió a entrar la fase S (figura 2A, 2D). Por el contrario, de las células de RPE-1 tratadas con altas dosis 5 μm paclitaxel que sufrió deslizamiento mitotic, 35% murieron en el subsiguiente ciclo celular, 65% inducida por detención del ciclo celular, y no volver a entrar en fase S (Figura 2D).

Curiosamente, bajas dosis de paclitaxel tratamiento promueve la ruptura de la envoltura nuclear en células de RPE-1 después de la mitosis. Terminada la mitótica células hijas fueron rastreadas y anotó para cualquier evento de ruptura nuclear, revela que sólo un ~ 4% de control de las células de la hija (tratados con DMSO) RPE-1 rotos, mientras que ~ 23% de las células hija tratadas con paclitaxel nM 10 exhibieron ruptura ( Figura 3A, 3B).

Figure 1
Figura 1: destino de Mitotic de la célula en respuesta al tratamiento anti-mitotic. Las células de RPE-1 expresando estable H2B-GFP fueron tratadas con DMSO vehículo control (A) o 5 μm paclitaxel (B, C) y reflejada usando Time-lapse de contraste de fases y microscopía de epifluorescencia de campo amplio para evaluar el destino de la célula mitótica. Las células de la interfase (paneles de la izquierda) fueron seguidas al entrar mitosis (paneles de mediados) y hasta que inicia la anafase (A), experimentó la muerte de la célula mitótica (B) o se deslizó de mitosis a interfase (C). Las flechas blancas indican células orugas. (D) la cantidad de tiempo que el control de las células (tratados con DMSO) y células tratadas con anti-mitotic en mitosis, como cuantificados por proyección de imagen de células vivas (n = 100 células para cada condición). (E) la fracción de células (n = 100) que experimentó el anaphase, muerte celular mitótica o deslizamiento mitótico en células tratadas con DMSO o células tratadas con 5 μm paclitaxel. H:min. tiempo, barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: destino de las células que sufren mitosis deslizamiento. Las células de RPE-1 expresando estable el sistema FUCCI fueron tratadas con paclitaxel nM 50 o 5 μm paclitaxel y reflejada usando Time-lapse de contraste de fases y microscopía de fluorescencia de campo amplio para cuantificar destino celular tras deslizamiento mitotic. Las células fueron anotadas como volver a entrar el ciclo celular, según lo juzgado por un cambio de rojo a verde de la fluorescencia en el sistema FUCCI (A); arresto en la fase de1 G, según lo juzgado por fluorescencia roja persistente por > 24 h (B); o muertos durante la mitosis posterior, según lo juzgado por blebbing, ruptura celular (C). Las flechas blancas indican células orugas. (D) la fracción de células (n = 100) que experimentó cada destino. Barras de error representan el desvío estándar de la media de dos experimentos independientes. H:min. tiempo, barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: frecuencia de ruptura de la envoltura nuclear en células tratadas con paclitaxel. Las células de RPE-1 expresando estable TDRFP-NLS y H2B-GFP fueron tratadas con paclitaxel nM 10 o vehículo control (DMSO) y reflejada usando Time-lapse de contraste de fases y microscopía de epifluorescencia de campo amplio (A). Durante la mitosis (metafase/anafase) se rompe la envoltura nuclear y TDRFP-NLS se convierte citoplásmico. Después de la mitosis, la NLS TDRFP relocalizes al núcleo de las células de la interfase (la ruptura). Eventos de ruptura nuclear se identifican por la deslocalización de TDRFP-NLS del núcleo al citoplasma en las células de la interfase (ruptura), seguido por la relocalización de NLS TDRFP al núcleo después de la reparación de la envoltura nuclear (la ruptura). Las flechas blancas indican células orugas. (B) la fracción de células (n > 100 por condición) que muestran la ruptura de la envoltura nuclear tras mitosis en presencia de paclitaxel o vehículo de control. H:min. tiempo, barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El aspecto más crítico de las imágenes de células vivas a largo plazo es garantizar la salud de las células se va a examinar. Es esencial que las células de estar expuesto a estresores ambientales extraños mínima, como deficientes condiciones de temperatura, humedad y niveles de CO2 . También es importante limitar el fotoenvejecimiento de iluminación fluorescente de la excitación, como imagen de estrés es conocido por afectar la célula comportamiento50. Limitar el fotoenvejecimiento puede lograrse de múltiples maneras como detallado en otra parte48. En general, es mejor utilizar el menor tiempo de exposición necesario para producir una señal de fluorescencia suficientemente lo suficientemente brillante para seguir eficazmente las células, limitando así la fototoxicidad. Sin embargo, si las células son imagen sólo una vez cada 10-20 min, exposiciones prolongadas (que se acercan a la saturación de píxeles) suelen ser bien toleradas (aunque esto debe determinarse empíricamente para cada tipo de célula y fluoróforo). Porque imagen células son sensibles a las tensiones ambientales y proyección de imagen, es imprescindible que las células del control siempre son incluidas en los experimentos de proyección de imagen de células vivas y controladas para confirmar la proliferación normal.

Una limitación a la imagen a largo plazo de células vivas es que requiere de equipamiento un microscopio existente con una cámara ambiental que mantiene la temperatura y 5% CO2 ambiente humedecían o una cámara de etapa superior que también es capaz de apoyo a la temperatura adecuada y la atmósfera. Mientras que el flujo de CO2 es óptima, las células también pueden ser reflejadas hasta 48 h uso de CO2-medio independiente si humidificado de una cámara ambiental con 5% CO2 no está disponible. Sin embargo, muchos tipos de células son intolerantes de tal medio, y esto debe determinarse empíricamente mediante la medición de viabilidad y crecimiento de la célula. Superposición de las células con aceite mineral también puede utilizarse para evitar la evaporación del medio.

Una segunda limitación importante de este método es que sinos de la célula de seguimiento manualmente es muy laborioso y de mucho tiempo. Sin embargo, programas de seguimiento de la célula están disponibles y pueden ser optimizados para automatizar análisis de imagen51,52,53. Otra limitación con este método es que las células altamente móviles son a menudo difíciles de rastrear durante largos períodos de tiempo. Si esto plantea un problema importante, todo el bien puede ser reflejado y las imágenes cosidos juntos para formar un gran campo de visión. Muchos programas de software son compatibles con este método.

Autofluorescencia es otra limitante que debe abordarse con este protocolo. Medio libre de rojo de fenol reduce autofluorescence de fondo durante la proyección de imagen de células vivas. También se ha demostrado que dos vitaminas comúnmente en medio del crecimiento, la riboflavina y el piridoxal, puede disminuir la fotoestabilidad de las proteínas fluorescentes. Así, medio carente de estas vitaminas puede también utilizar durante proyección de imagen de fluorescencia para mejorar la señal de ruido raciones. Platos de plástico inferior son menos costosos y pueden proporcionar resultados adecuados de proyección de imagen, también producen una mayor cantidad de Autofluorescencia que afecte negativamente la relación señal a ruido. Además, platos de plástico inferior tienen mayor variación en grueso, que puede alterar la función de enfoque automático de muchos microscopios. El grueso del vidrio plato fondo imágenes de este protocolo es 0,17 mm, que es el vidrio ideal para su uso con microscopios modernos.

Por último, películas a largo plazo que abarca múltiples campos de vista y la adquisición de varios canales de fluorescencia producen archivos masivo de datos (decenas de gigabytes a terabytes cada uno), que plantean un problema para el almacenamiento de datos y back-up. Para mitigar este problema, se recomienda que todas las imágenes se adquirieron utilizando 2 x 2 o 4 x 4 binning, proporcionado la pérdida resultante en la resolución es aceptable. Binning no sólo limita los tiempos de exposición (es decir, las células estable H2B-GFP o el sistema FUCCI deben tener exposiciones de menos de 500 ms), pero también drásticamente reduce el tamaño de los archivos de datos (una imagen que es desechado 2 x 2 es un cuarto el tamaño del archivo de un no clasifica la imagen).

A pesar de estas limitaciones, imágenes de células vivas a largo plazo representa el mejor método para rastrear los sinos de la célula individual de poblaciones enteras, especialmente cuando los sinos de la célula son altamente heterogéneos. Medida que más marcadores fluorescentes de células vivas y sensores disponibles, células vivas enfoques la proyección de imagen se ampliará para visualizar y cuantificar varios aspectos de la biología celular. Por ejemplo, sensores de células vivas en la actualidad existen para cuantificar focos de daño de ADN, niveles de p53, posición de ciclo celular y apoptosis26,54,55,56,57,58 . Por lo tanto, experimentos de proyección de imagen tienen la capacidad para revelar las propiedades celulares subyacentes que determinan cómo y por qué las células responden variable a los agentes quimioterapéuticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

AFB, MAV y NJG gustaría agradecer Ryan Quinton para comentarios sobre el manuscrito y Adrian Salic para la construcción de TDRFP-NLS. AFB y MAV son financiados por la beca de formación NIGMS Biomolecular Farmacología 5T32GM008541. NJG es miembro de la Shamim Ashraf Dahod mama cáncer Research Laboratories y es apoyado por subvenciones de NIH GM117150 y CA-154531 la Karin Grunebaum Foundation, el programa de premios de la familia de Smith, el programa de eruditos de Searle y la investigación del Melanoma Alianza.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
phenol red-free, DMEM:F12 media Hyclone SH3027202
10% fetal bovine serum (FBS) Gibco 10438026
100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Gibco 15070063
PBS Gibco 10010049
0.25% Trypsin/EDTA Gemini 50-753-3104
12-well glass bottomed imaging dish Cellvis P12-1.5H-N
Paclitaxel TSZ Chem RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma NC0215085
Environmental Chamber In Vivo Scientific
5% CO2 Airgas Z03NI7432000201
15 mL Conical Tubes Fisherbrand 05-539-12
10 cm polystyrene tissue culture plates Falcon 08772E
10 mL Disposable Serological Pipette Fisherbrand 4488
5804R 15 amp Centrifuge Eppendorf 97007-370
1000 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
20 microliters Pipette Gilson Pipetman Classic
p1000 Pipette Tips Sharp p1126
p20 Pipette Tips Sharp P1121
RPE-1 Cells ATCC CRL-4000
Incubator Galaxy 170S Eppendorf CO17011005
Pipette Boy Integra 156401
Hemacytometer Fisher Scientific 0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging Micro Video Instruments, Inc. MEA53100
Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator Micro Video Instruments, Inc. 500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders Micro Video Instruments, Inc. 500-H31XYZE
Andor Digital Camera Micro Video Instruments, Inc. D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software Micro Video Instruments, Inc. MQS31000
SOLA LED Illuminator for Fluorescence Micro Video Instruments, Inc. SOLA-E
InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control Micro Video Instruments, Inc. Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece Micro Video Instruments, Inc. MEP59391
Ti-C System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret Micro Video Instruments, Inc. MEL56200
Te-C LWD Ph1 Module Micro Video Instruments, Inc. MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm Micro Video Instruments, Inc. MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective Micro Video Instruments, Inc. MRH48230

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