उच् च कव ट्रा द्वारा निगरानी की गई चूहों में ठहराव से प्रेरित गहरी नस घनास्त्रता

Immunology and Infection

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Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक ठहराव मॉडल का उपयोग कर शिरापरक घनास्त्रता प्राप्त करने के लिए चरणों का वर्णन करता है । इसके अलावा, हम समय के साथ थक्का गठन और संकल्प को मापने के लिए एक गैर इनवेसिव विधि का उपयोग कर रहे हैं ।

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

शिरापरक घनास्त्रता एक आम आबादी का 1-2% प्रभावित हालत है, ५०० में 1 की वार्षिक घटना के साथ । शिरापरक घनास्त्रता फुफ्फुसीय आवेश या परिणाम के बाद थ्रोम्बोटिक सिंड्रोम के माध्यम से मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जीर्ण पैर दर्द की विशेषता, सूजन, और अल्सर, या जीर्ण फेफड़े के महत्वपूर्ण जीर्ण श्वसन में जिसके परिणामस्वरूप उच्च रक्तचाप में समझौता. यह रोधगलन और कोरोनरी स्ट्रोक के बाद सबसे आम हृदय रोग है और सभी चिकित्सा विषयों के लिए एक नैदानिक चुनौती है, क्योंकि यह इस तरह के कैंसर के रूप में अन्य विकारों के पाठ्यक्रम जटिल कर सकते हैं, प्रणालीगत रोग, शल्य चिकित्सा, और प्रमुख आघात.

प्रयोगात्मक मॉडल इन तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं । ठहराव मॉडल सुसंगत थक्का आकार और थक्का की एक quantifiable राशि लाती है । तथापि, यह व्यवस्थित अवर वेना कावा के पक्ष शाखाओं ligate करने के लिए थक्का आकार और किसी भी गलत डेटा व्याख्या में परिवर्तनशीलता से बचने के लिए आवश्यक है । हमने ट्रा का उपयोग करके थक्का आकार मापने के लिए एक गैर इनवेसिव तकनीक विकसित की है । इस तकनीक का प्रयोग, हम एक ही जानवर में समय के साथ थक्का विकास और संकल्प का आकलन कर सकते हैं । इस दृष्टिकोण के प्रतिस्थापन, कमी, और अनुसंधान में पशुओं के शोधन के सिद्धांत के साथ संगत शिरापरक घनास्त्रता के ठहराव के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को सीमित करता है । हमने यह दर्शाया है कि थक्का का वजन और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण थक्का आकार का स् ट्रा से प्राप् त माप के साथ सहसंबंधी करता है । इसलिए, वर्तमान अध्ययन कैसे अवर वेना कावा ठहराव मॉडल का उपयोग कर चूहों में गहरी नस घनास्त्रता प्रेरित करने के लिए और उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर इसे मॉनिटर करने के लिए कैसे का वर्णन करता है ।

Introduction

शिरापरक thromboembolism (VTE), जो गहरी शिरापरक घनास्त्रता (DVT) और फुफ्फुसीय आवेश शामिल है, रोधगलन और स्ट्रोक के बाद हृदय मृत्यु का तीसरा प्रमुख कारण है । यह एक आम की आबादी के 1-2% को प्रभावित करने की स्थिति है, 1 की वार्षिक घटना के साथ५००1 में । VTE के लिए नेतृत्व कर सकते हैं: 1) फुफ्फुसीय आवेश के माध्यम से मृत्यु; 2) के बाद थ्रोम्बोटिक सिंड्रोम, जीर्ण पैर दर्द, सूजन, और अल्सर की विशेषता; या 3) क्रोनिक फेफड़े के उच्च रक्तचाप महत्वपूर्ण जीर्ण श्वसन समझौता में जिसके परिणामस्वरूप । VTE एक बहु कारक रोग है और रक्त के प्रवाह के ठहराव से परिणाम हो सकता है, पोत दीवारों को नुकसान, और/या hypercoagulable जमावट और fibrinolytic प्रणालियों के बीच संतुलन के विघटन के कारण राज्यों, के रूप में यह एक सौ साल पहले से अधिक वर्णित किया गया है Virchow द्वारा और Virchow के त्रय के रूप में जाना जाता है ।

क्योंकि ज्यादातर मामलों में यह मानव DVT नमूने प्राप्त करने के लिए असंभव है, शोधकर्ताओं ने DVT के प्रायोगिक पशु मॉडल विकसित किया है. चूहा2, माउस3, खरगोश4, सुअर5, डॉग6, और गैर मानव रहनुमा7 सहित कई जानवरों का इस्तेमाल किया गया है । चूहों आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और सबसे अक्सर इस्तेमाल किया जानवर DVT अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं । हालांकि, सभी जानवरों के रूप में, चूहों में सहज DVT मनाया जाता है । इस प्रकार, नस दीवार के भौतिक या रासायनिक परिवर्तन चूहों में घनास्त्रता बनाने के लिए उपयोग किया जाता है । हम पहले घाट क्लोराइड मॉडल का इस्तेमाल किया है अवर वेना कावा (IVC) चूहों के8,9,10में घनास्त्रता प्रेरित । इस मॉडल की मज़बूती से मिनटों के भीतर पूर्णावरोधक थ्रोम्बी उत्पादन का लाभ है और तीव्र DVT के दौरान एंटी-कौयगुलांट और एंटी-प्लेटलेट दवाओं की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है । इस प्रकार, तीव्र और जीर्ण DVT का अध्ययन करने के लिए, ठहराव मॉडल अधिक उपयुक्त है । इस मॉडल में, थक्का गठन IVC, DVT विकास के लिए Virchow के त्रय में कारकों में से एक में रक्त के प्रवाह की पूरी रुकावट से प्रेरित है । इस मॉडल के लिए DVT गठन और संकल्प है, जो एक फायदा है FeCl3 मॉडल11की तुलना में अध्ययन किया जा सकता है ।

हम एक गैर इनवेसिव विधि थक्का गठन और संकल्प का पालन करने के लिए समय पर एक माइक्रो इमेजिंग उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड प्रणाली12का उपयोग कर विकसित किया है । हम पहले से दिखा दिया है कि अल्ट्रासाउंड द्वारा शिरापरक घनास्त्रता की माप थ्रोम्बी रोग के साथ इष्ट को संबद्ध करता है । हम दो बाद के अध्ययनों में पुष्टि की है कि अल्ट्रासाउंड के साथ थक्का वजन और थक्का क्षेत्र quantified histochemistry9,10से सहसंबंधी के साथ प्राप्त की माप । इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमें पता चला है कि उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड चूहों में गहरी शिरापरक घनास्त्रता के गठन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है12. यह भी एक गैर इनवेसिव रास्ते में थक्का संकल्प यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहाँ, हम ठहराव-प्रेरित घनास्त्रता माउस मॉडल का उपयोग कर थक्का गठन की अनुमति प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे और कैसे थक्का गठन उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर समय के साथ गैर इनवेसिव निगरानी की जा सकती है.

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं मैकगिल विश्वविद्यालय मॉंट्रियल, QC, कनाडा के संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी आवश्यक उपकरण तालिका I में सूचीबद्ध है ।

1. Murine (C57BL/6J) IVC ठहराव प्रोटोकॉल

  1. सर्जरी की तैयारी
    नोट: यह एक अस्तित्व सर्जरी है और इसलिए, उचित अपूतित तकनीक के लिए हर समय का पालन किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करना भी शामिल है कि सभी सामग्री हाथ में हैं, सफाई और उपकरणों की नसबंदी से पहले और उपयोग के बीच, और सभी बाँझ सामग्री के लिए काम कर सतह पर एक बाँझ क्षेत्र निर्दिष्ट.
    1. आटोक्लेव द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों और सामग्री को निष्फल । एक गिलास मनका नसबंदी जानवरों के बीच साधन सुझावों को निष्फल करने के लिए पर्याप्त है, अगर एक से अधिक प्रक्रिया एक समय में किया जा रहा है ।
    2. Anesthetize 8-10 सप्ताह पुराने C57Bl/१००% ऑक्सीजन और २.५% isoflurane के मिश्रण के साथ 6 पुरुष चूहों ।
      नोट: आवश्यक के रूप में ऑक्सीजन और isoflurane के प्रवाह को समायोजित करें ।
    3. संदंश के साथ पैर की उंगलियों के बीच पशु का रियर पंजा चुटकी द्वारा anesthetization की पुष्टि करें । चुटकी से कोई प्रतिक्रिया नहीं पशु anesthetized है इंगित करता है ।
    4. प्रशासन धीमी गति से जारी एनाल्जेसिक (buprenorphine) के माध्यम से चमड़े के नीचे इंजेक्शन । चूहों 1 शरीर के वजन के प्रति किलो एनाल्जेसिक के एक मिलीग्राम की एक खुराक दे (1 मिलीग्राम/
    5. इस प्रक्रिया की अवधि के लिए कोई corneal सुखाना सुनिश्चित करने के लिए पशु की दोनों आंखों पर आंख मरहम प्लेस ।
    6. प्रशासन ०.२-०.५ शरीर के वजन के 10 ग्राम प्रति isotonic तरल पदार्थ की मिलीलीटर ।
    7. शल्य चिकित्सा टेप का उपयोग कर सर्जरी की मेज पर जगह में पशु ठीक । पेट को बेनकाब करने के लिए पशु को लापरवाह स्थिति में रखें । हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक हीटिंग पैड पर सर्जरी प्रदर्शन ।
    8. एक हेयर रिमूवल क्रीम के आवेदन के द्वारा माउस के पेट से बाल निकालें 1-2 min. अगर आवश्यक हो तो, धुंध और आसुत जल के साथ पेट के क्षेत्र को साफ करें ।
    9. वैकल्पिक रूप से, एक छोटे से बिजली के रेजर के साथ शेविंग द्वारा पेट से बालों को हटा दें ।
    10. किसी भी चीरा बनाने से पहले पेट को Baxedin (Chlorhexidine Gluconate बीपी सॉल्यूशन) के साथ निष्फल करें । धुंध के साथ हल्के से इथेनॉल लागू करने के लिए अत्यधिक गर्मी शराब के वाष्पीकरण की वजह से नुकसान से बचने के ।
  2. अवर वेना कावा (IVC) का एक्सपोजर
    1. सर्जिकल कैंची का प्रयोग, एक laparotomy उदर गुहा खोलने के लिए प्रदर्शन करते हैं ।
      1. पेट के निचले हिस्से में संदंश के साथ त्वचा लिफ्ट और एक ऊर्ध्वाधर चीरा लीनिया अल्बा के दोनों ओर के समानांतर बनाते हैं । लीनिया अल्बा के बाईं या दाईं ओर पहला चीरा, ऑपरेटर के हाथ पर निर्भर करता है बनाओ । चीरा अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में सहायता करने के लिए midline से दूर किया जाता है पर बाद में ।
      2. पेट के शीर्ष पर एक दूसरे, क्षैतिज चीरा बनाओ ।
        नोट: पेट में प्रवेश करने पर, पेशियां "तंबू" और फिर शल्य कैंची के साथ प्रवेश करने के लिए उदर अंगों को किसी भी नुकसान को रोकने चाहिए ।
      3. जानवर की पेट की मांसपेशी परत पर ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज चीरा दोहराएं । पेट में प्रवेश के दौरान पेशियां तम्बू सुनिश्चित करें ताकि नीचे अंगों को नुकसान न हो ।
        चेतावनी: चीरा लगाने के रूप में इतना नहीं के रूप में उन्हें पंचर करने के लिए जब आंतों और अन्य आंतरिक अंगों से दूर त्वचा और मांसपेशी लिफ्ट ।
    2. उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए चीरा से त्वचा और मांसपेशी दूर गुना ।
    3. धुंध लागू करें, isotonic समाधान के साथ गीला, घाव खोलने के पक्षों के लिए और आंतों externalize । आंतों के externalization की सहायता करने के लिए पेट के दोनों किनारों पर दबाव लागू करें । आंत ले जाने के लिए एक कपास टिप applicator के साथ कोमल आंदोलनों का प्रयोग करें । isotonic समाधान में धुंध सोख और यह बाह्य आंतों पर जगह है ।
      1. धुंध पूर्व ऊतक पर नियुक्ति से पहले गीला हो जाना चाहिए ।
    4. किसी भी पेरिटोनियल वसा अलग हटो, और गुर्दे और श्रोणि नसों के बीच IVC बेनकाब ।
    5. स्पष्ट पक्ष शाखाओं की एक प्रारंभिक पहचान बनाओ । एक ओर शाखा छोटे, लेकिन महत्वपूर्ण नस कि शाखाओं IVC से दूर, गुर्दे और श्रोणि नसों के बीच के रूप में दिखाई देगा । Vasculature चूहों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं. चूहों IVC के एक या दोनों किनारों पर मौजूद पक्ष शाखाओं हो सकता है ।
  3. साइड शाखाओं की बंधाव
    नोट: यदि पक्ष शाखाओं मौजूद हैं, तो हर एक के लिए निंनलिखित प्रक्रिया का पालन किया है । यदि मौजूद नहीं है, तो चरण 4 के लिए आगे बढ़ें: IVC के अंतर्गत प्रारंभिक सीवन स्थान । IVC की बंधाव साइट तुरंत बाईं गुर्दे की नस का बाहर हो जाएगा, पक्ष शाखाओं की उपस्थिति की परवाह किए बिना ।
    1. पक्ष शाखा के प्रत्येक पक्ष पर कुंद विच्छेदन प्रदर्शन । कुंद विच्छेदन बार के कोमल दबाव के साथ कुंद संदंश खोलने की प्रक्रिया है, ताकि आसपास के जहाजों को नुकसान पहुंचाए बिना प्रावरणी के माध्यम से तोड़ने के लिए ।
      सावधानी: puncturing से बचें या नस को नुकसान पहुंचाए ।
    2. शाखा लिफ्ट और नस के नीचे 6-0 रेशम सीवन के एक वर्ग के पास । हमेशा ध्यान रखना जब उठाने या जहाजों को ले जाने । यह जहाजों के आसपास वसा हड़पने के लिए सबसे अच्छा है, अंयथा पोत हानिकारक का खतरा है ।
    3. टांका संदंश का प्रयोग, मानक सर्जिकल गांठ बांधने तकनीक का उपयोग कर पक्ष शाखा के आसपास एक शल्य बंधाव बनाते हैं । पूर्ण बंधाव नस के १००% रोड़ा सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है । बंधाव सुरक्षित है सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन बांधने फेंकता का उपयोग करें ।
    4. किसी भी शेष पक्ष शाखाओं के लिए १.३ चरण दोहराएँ ।
  4. IVC से उदर महाधमनी का विच्छेदन
    1. तुरंत छोड़ दिया गुर्दे की नस से बाहर IVC के आसपास कुंद विच्छेदन प्रदर्शन । उदर महाधमनी प्रावरणी के माध्यम से IVC से जुड़ा हुआ है, इसलिए IVC और उदर महाधमनी दोनों के आसपास प्रारंभिक कुंद विच्छेदन करते हैं ।
      चेतावनी: puncturing से बचें या नस को नुकसान पहुँचाए । टूटना या पंचर या तो पोत मत करो । इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है, पोत क्षति के लिए सबसे अधिक जोखिम के साथ ।
    2. एक स्पष्ट खिड़की महाधमनी और IVC के बीच किया जाता है जब तक कुंद विच्छेदन के माध्यम से कोमल दबाव लागू करने के लिए जारी रखें ।
  5. टांका प्लेसमेंट और IVC बंधाव
    1. IVC और उदर महाधमनी के नीचे 6-0 रेशम सीवन के एक अनुभाग दर्रा ।
    2. IVC और महाधमनी के बीच बनाई गई विंडो के माध्यम से सीवन की स्थिति जानें । सीवन खींचने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे उदर महाधमनी और IVC के बीच धागा । IVC और पेट महाधमनी को खींचने के लिए नहीं की कोशिश कर रहा है, ध्यान से सीवन धागा ।
    3. सीवन संदंश के साथ IVC के आसपास एक शल्य बंधाव बनाने, नस की कुल रोड़ा सुनिश्चित करने । फिर, बंधाव तुरंत छोड़ दिया गुर्दे की नस से बाहर कर ।
    4. तीन टांका बंधाव को सुरक्षित करने के लिए फेंकता है बनाओ ।
      नोट: यह भी IVC और महाधमनी के नीचे सीवन पारित करने के लिए एक वैकल्पिक विकल्प के रूप में दो अलग करने से पहले संभव है । वैकल्पिक रूप से, 7-0 Prolene टांके पक्ष शाखाओं और IVC के बंधाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. घाव बंद करने और पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल
    1. सत्यापित करें कि उदर महाधमनी अबाधित छोड़ दिया गया है और सभी पक्ष शाखाओं ligated किया गया है । IVC बंधाव साइट से बाहर फैली हुई दिखाई देगा और कोई रक्त प्रवाह दिखाई देगा ।
    2. उदर गुहा में सभी पेरिटोनियल वसा और आंतों को वापस रखें ।
    3. टांका संदंश और 6-0 रेशम सीवन का उपयोग घाव बंद करें । एक चल टांका (सरल निरंतर) का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करना है कि सीवन भी तंग नहीं किया जाएगा । एक तंग टांका टूटना होगा जब जानवर जाग और उसके पिंजरे के आसपास घूमती है ।
      1. वैकल्पिक रूप से, घाव बंद करने के लिए पीडीएस, Ethilon, Vicryl, Dexon या स्टेनलेस स्टील क्लिप्स का उपयोग करें ।
    4. पहले उचित सीवन तकनीक बांधने का उपयोग कर पेट की मांसपेशी की परत टांका ।
    5. त्वचा के लिए दोहराने सीवन तकनीक और पुष्टि घाव बंद करने के लिए पर्याप्त है ।
      नोट: एक ही टांका सुई और कई जानवरों के लिए धागा का उपयोग कर, प्रत्येक उपयोग करने से पहले ७०% इथेनॉल में दोनों को निष्फल ।
    6. संवेदनाहारी गैस से पशु निकालें और उंहें एक ३४ डिग्री सेल्सियस में कम से 30 मिनट के लिए मशीनी जगह है ।
    7. फिर, प्रशासन ०.२-०.५ शरीर के वजन के 10 ग्राम प्रति isotonic तरल पदार्थ की मिलीलीटर चमड़े के नीचे । तरल पदार्थ को निंनलिखित दिनों में दिया जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो पूर्व-ऑपरेटिव शरीर का वजन बनाए रखें ।
    8. सफल सर्जरी सुनिश्चित करने और पशु के समग्र स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए वसूली तक पशु की निगरानी ।
      सावधानी: इस तरह के रूप में एक इनवेसिव प्रक्रिया के लिए एक मामूली कूबड़ मुद्रा की उंमीद है, लेकिन पशु सामांय रूप से 30 मिनट के बाद आपरेशन के रूप में जल्दी व्यवहार करेंगे ।
    9. अपने स्वयं के पिंजरे में पशु प्लेस और यह पूरी तरह से बरामद जब तक अन्य जानवरों के साथ जगह नहीं है ।
    10. फिर से ४८ एच postop के लिए दैनिक एनाल्जेसिक प्रशासन ।
    11. जबकि वसूली में पशु के लिए पिंजरे के फर्श पर भोजन प्लेस । आम तौर पर अन्य विशेष देखभाल की जरूरत नहीं है ।
    12. लालिमा, सूजन, या छुट्टी और संक्रमण के किसी भी अंय लक्षण के लिए घाव साइट की जांच करें ।
    13. यदि आवश्यक हो, 7-10 दिनों के बाद टांके निकालें ।
    14. इच्छामृत्यु तुरंत करें यदि शल्य चिकित्सा असफल है (जैसे, महत्वपूर्ण पोत क्षति और/या खून की कमी) या जानवर के बाद ऑपरेटिव देखभाल के साथ सुधार नहीं करता है । इच्छामृत्यु आम तौर पर ४८ ज postop में किया जाता है । अब प्रयोगों के लिए, ligate पक्ष शाखाओं और IVC और 5-0 Vicryl टांके के लिए उदर गुहा बंद करने के लिए 7-0 Prolene का उपयोग करें ।
      1. एक प्रेरण में पशु के anesthetization द्वारा इच्छामृत्यु प्रदर्शन के रूप में पहले वर्णित है, 5% isoflurane पर छोड़कर । यह १००% सह के साथ asphyxiation द्वारा पीछा किया जाता है2 जबकि anesthetized ।
      2. asphyxiation द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि के बाद (दिल की धड़कन और कोई सांस लेने की हानि), पूरी इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए ग्रीवा विस्थापन प्रदर्शन ।

2. उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड प्रोटोकॉल

नोट: यह प्रोटोकॉल लेडी डेविस संस्थान से अनुकूलित उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए Phenotyping कोर शराबी है । इस प्रोटोकॉल बाहर किया जाता है 24 घंटे के बाद ऑपरेटिव, लेकिन जब तक जानवर अच्छी तरह से शल्य चिकित्सा के लिए जवाब है के रूप में लंबे समय तक कर सकते हैं । प्रोटोकॉल स्वस्थ चूहों पर किसी भी समय किया जा सकता है और अक्सर पहले और सर्जरी के बाद तुलना करने के लिए ऐसा किया जाता है ।

  1. पशु की तैयारी
    1. एक प्रेरण कक्ष में पशु प्लेस और १००% ऑक्सीजन और २.५% isoflurane का एक मिश्रण के साथ पशु anesthetize ।
    2. हृदय गति और तापमान मॉनिटर पर बारी । स्थिति गर्मी दीपक तालिका के ऊपर प्रक्रिया के दौरान पशु गर्म रखने के लिए ।
    3. प्रेरण कक्ष से पशु निकालें और नेत्र स्नेहक लागू करने के लिए corneal सुखाना को रोकने के । विश्लेषण मंच पर पशु की स्थिति और संवेदनाहारी ट्यूब जानवर के मुंह को चिपका/
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म अल्ट्रासाउंड जेल और पशु के पेट पर जेल जगह है । अल्ट्रासाउंड जेल एक पानी की हीटिंग प्रणाली का उपयोग कर गर्म है कि कुंडल के माध्यम से गर्म पानी पंप है कि जेल की बोतल के आसपास लिपटे हैं ।
    5. हृदय की दर माप के लिए (यदि आवश्यक हो), विश्लेषण मंच के 4 इलेक्ट्रोड पर इलेक्ट्रोड जेल डाल दिया और शल्य चिकित्सा टेप के साथ मंच/इलेक्ट्रोड के लिए पशु के पंजे को ठीक. IVC के इमेजिंग के लिए एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस । अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली एक विश्लेषण मंच है कि गर्म है शामिल है और पशु की निगरानी के लिए इलेक्ट्रोड शामिल हैं ।
    6. तापमान माप के लिए, थर्मामीटर पर इलेक्ट्रोड जेल डाल दिया और जानवर के मलाशय में डालें ।
    7. गर्मी दीपक और isoflurane कि पशु आरामदायक है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें, 30-70 bpm के बीच एक श्वसन है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा है ।
    8. यदि आवश्यक हो, पशु के पेट दाढ़ी या बालों को हटाने क्रीम के साथ बालों को हटाने । 1-2 मिनट के लिए लागू करें और धुंध और आसुत जल के साथ साफ पोंछ ।
      नोट: बहुत ज्यादा बाल छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं ।
    9. किसी भी अतिरिक्त अल्ट्रासाउंड जेल को पकड़ने के लिए या पशु की ओर के तहत धुंध प्लेस ।
  2. इमेजिंग IVC और थक्का
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर चालू करें और एक नए अध्ययन शुरू करते हैं ।
    2. इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त scanhead का चयन करें । यहां इस्तेमाल किया scanhead उदर अंगों (आवृत्ति: ३५ मेगाहर्ट्ज, फोकल लंबाई: १२.८ मिमी) के लिए है ।
    3. पशु के बारे में कोई भी प्रासंगिक जानकारी रिकॉर्ड । इसमें एनिमल आइडी, सेक्स, वजन, जन्मतिथि, तनाव आदिशामिल हो सकते हैं ।
    4. कम scanhead नीचे जब तक यह पशु पर अल्ट्रासाउंड जेल छू रहा है ।
    5. पशु के 2-डी इमेजिंग शुरू करने के लिए scanhead जांच शुरू करो । इस मोड में, छवियों के रूप में प्रस्तुत कर रहे है दो आयामी ग्रे के रंगों में बदलती ।
    6. z-विमान के माध्यम से भी scanhead चलती है, जबकि x-और/या y-विमान भर में माउस प्लेटफॉर्म ले जाकर IVC और उदर महाधमनी का पता लगाएँ ।
      नोट: रक्त वाहिकाओं उनकी दीवारों सफेद और लगभग काले रंग के अंदर रक्त के साथ दिखाई देगा । उदर महाधमनी तीव्रता से धड़कना होगा और मोटा दीवारों है, जबकि IVC पतली दीवारों होगा और सेक/छवि स्क्रीन पर आसानी से विस्तार जब scanhead ऊपर और नीचे ले जाया जाता है । बंधाव साइट स्पष्ट हो जाएगा, जैसे नस फैली होगी और नस की दीवार एक बिंदु पर आ जाएगी । किसी भी अंदर गठित थक्का अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के तहत ठोस हो जाएगा और नस की दीवार की तरह आसानी से सेक नहीं होगा । नस बंधाव के ऊपर ही सेक होगी, जहाँ कोई थक्का नहीं बनता.
    7. IVC और बंधाव साइट का पता लगाने पर, उन्हें अल्ट्रासाउंड के फोकल प्वाइंट पर केंद्र, क्रम में सबसे सटीक छवि को प्राप्त करने के लिए ।
      1. यदि छवि भी स्पष्ट रूप से देखने के लिए अंधेरा है, जेल को समायोजित करने और एक कपास टिप applicator के साथ किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें ।
      2. यदि आवश्यक हो, scanhead ४५ ° झुकाव छोड़ दिया है या सही करने के लिए और पशु मंच नस स्पष्ट रूप से देखने के लिए समायोजित करें । यह किया जाता है अगर वहां scanhead के साथ हस्तक्षेप है । इस परिदृश्य में, शिरा टांका से बचने के लिए एक पक्ष कोण पर imaged किया जा करने के लिए की जरूरत है ।
        नोट: छवि हस्तक्षेप सबसे अधिक बार पशु पर त्वचा के काले धब्बे, गरीब घाव टांका प्लेसमेंट, या अल्ट्रासाउंड जेल में बुलबुले के कारण होता है ।
    8. सॉफ्टवेयर का प्रयोग, किसी भी वांछित संरचनाओं की तस्वीरें लेने के लिए और माप किसी भी माप उपकरण का उपयोग कर । सामांय माप थक्का या बंधाव साइट की चौड़ाई के पार अनुभागीय क्षेत्र शामिल हैं ।
    9. रक्त प्रवाह माप बनाने के लिए पल्स-वेव डॉपलर इमेजिंग मोड बदलें । इस विधा की अनुमति देता है संवहनी रक्त प्रवाह की इमेजिंग और प्रवाह वेग की माप, अन्य चर के बीच.
    10. पशु के पीछे अंत कम करने के लिए विश्लेषण मंच झुकाव ।
    11. scanhead का कोण/स्थिति बदलें ताकि यह जानवर के पीछे अंत से लगभग 30 डिग्री के एक कोण पर जेल से संपर्क करेंगे ।
    12. पशु मंच और scanhead की स्थिति । यदि आवश्यक हो, तो IVC और बंधाव को स्थानांतरित करें ।
    13. बंधाव साइट के आसपास रक्त प्रवाह माप करने के लिए ठहराव की पुष्टि करें और किसी भी इच्छित चित्र ले लो । रक्त प्रवाह के आम माप औसत वेग, पीक वेग, या औसत वेग शामिल हैं ।
    14. किसी भी माप या छवियों को बचा लिया ।
  3. साफ-सफाई और पशु वसूली
    1. प्रारंभिक स्थिति के लिए scanhead उठाएं और अपनी प्रारंभिक स्थिति के लिए पशु मंच की स्थिति, के रूप में अच्छी तरह से ।
    2. धुंध के साथ पशु से अतिरिक्त जेल निकालें । यह धीरे करो ताकि घाव सीवन टूटना नहीं होगा ।
    3. जानवर के मलाशय से थर्मामीटर निकालें और मंच से जानवर ले ।
    4. अपने पिंजरे में पशु प्लेस और एक ३४ डिग्री सेल्सियस मशीन ।
    5. वसूली तक पशु की निगरानी । प्रक्रिया बहुत छोटी और गैर इनवेसिव है । पशु जल्दी जाग जाएगा । इस प्रोटोकॉल की धारा १.६ के अनुसार निंनलिखित दिनों में पशु की निगरानी जारी रखें ।
    6. धुंध और विसंक्रमित के साथ पशु मंच साफ ।
    7. धुंध और आसुत जल के साथ साफ scanhead पोंछ ।
      सावधानी: scanhead को बहुत धीरे से साफ करें और केवल आसुत जल के साथ
    8. अगले जानवर के लिए चरण 2 दोहराएं ।
      1. सभी विषयों के साथ किया है, तो सत्यापित करें कि सभी छवियाँ और रिकॉर्डिंग सहेजे गए हैं । उसके बाद सभी उपकरण और सॉफ्टवेयर बंद कर दें ।

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Representative Results

ठहराव शिरापरक घनास्त्रता मॉडल

ठहराव मॉडल में, चूहों anesthetized हैं, और एक चीरा अवर वेना कावा (IVC) को बेनकाब करने के लिए किया जाता है. चीरा एक तरह से है कि अल्ट्रासाउंड की जांच के साथ हस्तक्षेप नहीं होता में एक midline laparotomy के बजाय माउस के बाईं या दाईं ओर किया जाता है । पेट की मांसपेशियों और त्वचा IVC (चित्रा 1) को बेनकाब करने के लिए वापस गुना कर रहे हैं. पहले, पक्ष शाखाओं 6-0 रेशम टांका (चित्रा 2) के साथ ligated हैं । फिर, IVC कुंद विच्छेदन द्वारा महाधमनी से अलग है और रेशम IVC (चित्र 3ए-सी) के आसपास रखा गया है । IVC एक 6-0 रेशम सीवन के साथ ligated है । बंधाव साइट के नीचे IVC के फैलाव रक्त प्रवाह के सफल व्यवधान का एक संकेत है (चित्रा 3 डी) । अंत में, पेरिटोनियल गुहा और त्वचा एक सतत तरीके से (चित्रा 3E) में वापस टांका रहे हैं ।

एक् ट्रा इस् तेमाल थक्का गठन की मॉनिटरिंग

जैसा कि हमने पहले दिखाया है, उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड, जो सामांयतः नैदानिक सेटिंग्स में शिरापरक घनास्त्रता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक प्रयोगात्मक murine मॉडल में समय पर थक्का गठन और संकल्प को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम एक उच्च आवृत्ति माइक्रो इमेजिंग प्रणाली12का इस्तेमाल किया । बंधाव से पहले, IVC को अनुदैर्ध्य दृश् य में पहचाना जा सकता है । नस की बंधाव के बाद, प्रक्रिया की सफलता visualized किया जा सकता है । पीडब्लू-डॉपलर मोड से पहले (३४.८ mm/s) और (५.६ mm/s) बंधाव के बाद रक्त प्रवाह वेग निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । क्योंकि थ्रोम्बी बहते रक्त से सघन होते हैं, हम बंधाव (चित्र 4a) के 24 घंटे बाद ट्रा, उपयोग IVC के अंदर गठित थक्का की सराहना कर सकते हैं । ट्रा रंग डॉपलर का उपयोग कर जहाजों में रक्त के प्रवाह के वेग के ठहराव के लिए अनुमति देता है । के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, हम बंधाव से पहले नस में प्रवाह को मापने और बंधाव के बाद प्रवाह की रुकावट की सराहना कर सकते हैं, जब थक्का का गठन किया है । हमारी प्रयोगशाला से डेटा ४.८५ ± ०.२२ मिमी2 की एक औसत थक्का आकार 24 घंटे और ५.०५ ± ०.४७ mm2 पर ४८ घंटे में दिखाने के लिए (± SEM) ।

Figure 1
चित्र 1. ठहराव मॉडल: प्रक्रिया अवर वेना कावा बेनकाब करने के लिए । (क) पेट से माउस के बालों को हेयर रिमूवल क्रीम का प्रयोग करके निकाला जाता है. (ख) एक पहला चीरा पेट के बायीं ओर और दूसरा ventral एक (C) बाएं से दाएं बनाया जाता है । (घ) एक गीली बाँझ निगाहें आंतों को exteriorize करने के लिए और अवर वेना कावा (IVC) और साइड ब्रांच (शादाब) को बेनकाब करने के लिए प्रयोग की जाती है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. ठहराव मॉडल: साइड शाखा ligate करने के लिए प्रक्रिया. (क) IVC और sb की प्रदर्शनी । (ख) sb के नीचे टांका रेशम का स्थान । (ग) बंधाव के एसबी. LRV: वाम गुर्दे नस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. ठहराव मॉडल: सामा को अवर वेना कावा ligate । (A-B) कुंद विच्छेदन महाधमनी से IVC अलग करने के लिए । (ग) IVC के नीचे सीवन रेशम की नियुक्ति । (घ) बंधाव का IVC । IVC का फैलाव मनाया जाता है । (ङ) उदर की मांसपेशियों और त्वचा को अलग से बंद कर दिया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग कर थक्का गठन की निगरानी । (क) प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियों से पहले, तुरंत बाद और 24 घंटे के IVC के बंधाव के बाद । (ख) रंग प्रसंस्करण का उपयोग रंग डॉपलर द्वारा चित्रित रक्त प्रवाह वेग के प्रतिनिधियों छवियों. रंग के पैमाने कोडित रक्त प्रवाह पर्वतमाला लाल से पीले करने के लिए कम प्रवाह के लिए उच्च चित्रित करने के लिए । ligated पशुओं में प्रवाह के अभाव रंग के अभाव के द्वारा दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वहां ठहराव मॉडल का उपयोग कर सफल शिरापरक थक्का गठन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । शिरा घनास्त्रता के प्रेरण अवर वेना कावा और महाधमनी आसपास वसा के संचय के कारण पुराने चूहों में अधिक चुनौतीपूर्ण है. आदर्श रूप में, इस प्रक्रिया के दौर से गुजर चूहों 8-10 सप्ताह पुराना होना चाहिए । महान देखभाल के लिए कुंद विच्छेदन और संयुक्ताक्षर के दौरान IVC में endothelial क्षति प्रेरित नहीं लिया जाना चाहिए । इसके अलावा, यह एक ३४ डिग्री सेल्सियस मशीन में सर्जरी के बाद कम से 30 मिनट के लिए पशु रखने के लिए महत्वपूर्ण है और यह केवल पूर्ण वसूली के बाद दूसरे जानवर की कंपनी के लिए वापस । जब सर्जरी सही ढंग से किया जाता है, जानवरों के बाद ऑपरेटिव देखभाल के दौरान अच्छी तरह से व्यवहार । वे ऐसे लंगड़ा, केवल पेशियों, या असंयम के रूप में कोई गंभीर साइड इफेक्ट प्रदर्शन । वे कम आंदोलन और एक थोड़ा कूबड़ा आसन तुरंत सर्जरी के बाद प्रदर्शन कर सकते हैं, लेकिन यह अक्सर के रूप में एनाल्जेसिक प्रभावी और सर्जरी ठीक से प्रदर्शन किया है लंबे समय के रूप में नहीं देखा है ।

ठहराव मॉडल एक माउस से दूसरे करने के लिए reproducible आकार माप के साथ एक बड़ी थक्का पैदा करता है । मनुष्यों में के रूप में, शिरापरक प्रणाली की एनाटॉमी चूहों और IVC शाखा रुकावट के मुद्दे के बीच बदलता है हाल ही में एक प्रकार का रोग और DVT13,14के ठहराव मॉडल में संबोधित किया गया है । Brandt एट अल. दिखाया है कि थक्का गठन प्रवाह प्रतिबंध द्वारा प्रेरित रोका गया था जब पक्ष शाखाओं IVC बंधाव साइट की < 1.5 mm पर स्थित थे । हालांकि, चूहों में प्रवाह प्रतिबंध द्वारा प्रेरित DVT गठन साइड शाखा बंधाव13,15,16से प्रभावित नहीं था । यह भी बताया गया है कि C57Bl6 माउस तनाव में IVC पक्ष शाखाओं की परिवर्तनशीलता थक्का का पूरा बंधाव द्वारा प्रेरित गठन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है14IVC. यह पाया गया कि ligated पक्ष शाखाओं के साथ नियंत्रण की तुलना में सांख्यिकीय छोटे थक्का आकार में ligating पक्ष शाखाओं परिणाम नहीं है । हमारे अध्ययन भी सुझाव है कि पक्ष शाखाओं के बंधाव सुसंगत थक्का गठन और आकार का उत्पादन किया । हालांकि, C57Bl/6 में सबसे अक्सर संरचनात्मक भिंनता 2 वापस शाखाओं (चूहों का ९८%) की उपस्थिति है14। यह दर्शाया गया था कि दखल वापस शाखाओं थक्का आकार पर सबसे बड़ा प्रभाव पड़ता है । वर्तमान पद्धति पीठ शाखाओं के प्रभाव का पता नहीं था, जो एक कम तापमान दाग़ना कलम14का उपयोग कर बाधित किया जा सकता है । हालांकि, हमने यह दर्शाया कि IVC और साइड शाखाओं के बंधाव C57Bl में सुसंगत थक्का गठन के परिणामस्वरूप 6/ अंत में, जैसा कि हम पहले प्रदर्शन किया है, उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड प्रणाली थक्का आकार की सटीक माप की अनुमति देता है और थक्का गठन और संकल्प के दीर्घकालिक और शोधों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है12,13 ,15.

ठहराव मॉडल का एक प्रमुख नुकसान रक्त प्रवाह की पूरी रुकावट है, जो थक्का और नस की दीवार पर नसों में प्रशासित एजेंटों के अधिक से अधिक प्रभाव को कम कर देता है । यह एक महत्वपूर्ण मुद्दा बन जाता है जब एक औषधीय एजेंट के प्रभाव का परीक्षण करना चाहता है । एक विशिष्ट दवा के प्रभाव का परीक्षण करने की जरूरत है, तो एक एक प्रकार का रोग मॉडल13 या इलेक्ट्रोलाइटिक मॉडल17का उपयोग करना पसंद करेंगे । दोनों मॉडल सतत रक्त प्रवाह, जो DVT प्रोफिलैक्सिस और उपचार के लिए नए विरोधी कौयगुलांट एजेंटों के परीक्षण की अनुमति की उपस्थिति में थ्रोम्बी उत्पादन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

यह काम दिल और स्ट्रोक फाउंडेशन कनाडा और मॉरिस और बेला Fainman परिवार फाउंडेशन द्वारा से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक VEVO770 अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली के साथ उसे तकनीकी मदद के लिए Veronique Michaud शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
Gaymar heater water pump TP500 MATVET Inc. #R-500305
Infra-red heating lamp electrimat inc. #1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope emkaTECHNOLOGIES
Sterile water From JGH

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References

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