Tiefe Venenthrombose, induziert durch Stauung in den Mäusen durch Hochfrequenz-Sonographie überwacht

Immunology and Infection

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Venenthrombose mit einem Stasis-Modell zu erhalten. Darüber hinaus verwenden wir eine nicht-invasive Methode um thrombusbildung und Auflösung im Laufe der Zeit zu messen.

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

Venenthrombose ist eine häufige Erkrankung, die Auswirkungen auf 1-2 % der Bevölkerung, mit einer jährlichen Inzidenz von 1 in 500. Venenthrombose führt zum Tod durch Lungenembolie oder Ergebnisse in der Post-thrombotischen Syndrom, gekennzeichnet durch chronische Beinschmerzen, Schwellungen und Geschwüre oder Chronische pulmonale Hypertonie, was zu erheblichen chronischen Atemwegserkrankungen Kompromiss. Dies ist die häufigste kardiovaskuläre Erkrankung nach Myokardinfarkt und ischämischen Schlaganfall und ist eine klinische Herausforderung für alle medizinischen Disziplinen, wie es den Kurs von anderen Erkrankungen wie Krebs, systemische Erkrankung, Operation und schweres Trauma erschweren kann.

Experimentelle Modelle sind notwendig, um diese Mechanismen zu untersuchen. Die Stasis-Modell induziert konsistente Thrombus Größe und eine messbare Menge des Thrombus. Allerdings ist es notwendig, systematisch verbinden Seitenäste der minderwertigen Vena Cava Variabilität in den Thrombus Größen und jede fehlerhafte Dateninterpretation zu vermeiden. Wir haben eine nicht-invasive Technik zur Messung der Thrombus Größe mittels Ultraschall entwickelt. Mit dieser Technik können wir Thrombus Entwicklung und Auflösung im Laufe der Zeit in der selben Tier bewerten. Diese Vorgehensweise schränkt die Anzahl der Mäuse für die Quantifizierung der Venenthrombose Einklang mit dem Grundsatz der Ersatz, Abbau und Veredelung von Tieren in der Forschung erforderlich. Wir haben bewiesen, dass Thromben Gewicht und histologischen Untersuchung des Thrombus Größe korrelieren mit Messung mit Ultraschall erhalten. Daher beschreibt die aktuelle Studie induzieren tiefe Venenthrombose bei Mäusen mit dem minderwertigen Vena Cava-Stasis-Modell und wie es mittels Hochfrequenz Ultraschall überwacht.

Introduction

Venöse Thromboembolien (VTE), die tiefe Venenthrombose (DVT) und Lungenembolie besteht, ist die dritthäufigste Ursache von Herz-Kreislauf-Tod nach Herzinfarkt und Schlaganfall. Es ist eine häufige Erkrankung, die Auswirkungen auf 1-2 % der Bevölkerung, mit einer jährlichen Inzidenz von 1 in 500-1. VTE-Risiko kann zu führen: 1) Tod durch Lungenembolie; (2) Post-thrombotischen Syndrom, gekennzeichnet durch chronische Beinschmerzen, Schwellungen und Geschwüre; oder 3) Chronische pulmonale Hypertonie, was zu erheblichen chronischen Atemwegserkrankungen Kompromiss. VTE ist eine multifaktorielle Erkrankung und kann aus der Stasis des Blutflusses, Schäden an Gefäßwänden und/oder Hypercoagulable Staaten aufgrund einer Störung des Gleichgewichts zwischen der Koagulation und die fibrinolytische Systeme führen, wie es vor über hundert Jahren beschrieben wurde von Virchow und ist bekannt als die Virchow-Trias.

Da in den meisten Fällen unmöglich, Humanproben TVT erhalten ist, haben Forscher experimentelle Tiermodelle der DVT entwickelt. Mehrere Tiere einschließlich Ratte2, Maus3, Kaninchen4, Schwein5, Hund6und nicht-menschlichen Primaten7 wurden verwendet. Mäuse können gentechnisch verändert und sind die am häufigsten verwendeten Tiere DVT zu studieren. Wie bei allen Tieren ist spontane DVT jedoch nicht bei Mäusen beobachtet. So werden physikalische oder chemische Veränderungen der Vene Wand zur Thrombose bei Mäusen zu erstellen. Wir haben zuvor das Eisenchlorid Modell verwendet, um Thrombose in der minderwertigen Vena Cava (IVC) Mäuse8,9,10induzieren. Dieses Modell hat den Vorteil, zuverlässig produzieren okklusive Thromben innerhalb von Minuten und kann verwendet werden, um die Rolle der Antigerinnungsmittel und Anti-Thrombozyten Drogen während akuter TVT untersuchen. Es ist jedoch ein terminal Verfahren. So, um akute und chronische DVT zu untersuchen, ist die Stasis-Modell besser geeignet. In diesem Modell wird durch die vollständige Unterbrechung des Blutflusses in der IVC, einer der Faktoren im Virchow Trias für DVT Entwicklung thrombusbildung induziert. Dieses Modell lässt sich studieren, DVT-Bildung und Auflösung, die ein Vorteil im Vergleich zu den FeCl3 Modell11ist.

Wir haben eine nicht-invasive Methode zur thrombusbildung und Auflösung im Laufe der Zeit mit einem Micro-Imaging Hochfrequenz-Ultraschall-System12folgen entwickelt. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Messung der venösen Thrombose mit Ultraschall positiv korreliert mit Thromben pathologisch erhalten. Wir haben in zwei weiteren Studien bestätigt, dass Messungen mit Ultraschall korrelieren mit Thromben Gewicht und Thrombus durch Histochemie9,10quantifiziert. Noch wichtiger ist, haben wir gezeigt, dass hochfrequente Ultraschall verwendet werden kann, um die Bildung von tiefen Venenthrombose in Mäusen12zu überwachen. Es kann auch zur Auflösung des Thrombus in eine nicht-invasive Weise quantifizieren.

Hier beschreiben wir das Protokoll so dass thrombusbildung mit der Stasis-induzierte Thrombose-Maus-Modell und wie thrombusbildung nicht-invasiv im Laufe der Zeit mittels Hochfrequenz Ultraschall überwacht werden kann.

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Protocol

Alle Verfahren wurden von der institutionellen Animal Care Ausschuss der McGill Universität Montréal, QC, Kanada genehmigt. Alle notwendigen Einrichtungen, ist in Tabelle aufgeführt ich.

(1) Murine (C57BL/6J) IVC Stasis Protokoll

  1. OP-Vorbereitung
    Hinweis: Dies ist eine Operation, überleben und korrekte aseptische Technik muss daher stets befolgt werden. Dabei sicherstellen, dass alle Materialien zur Verfügung stehen, reinigen und Sterilisieren Instrumente vor und zwischen den Einsatz und Benennung eines sterilen Bereichs auf der Arbeitsfläche für alle sterilen Material.
    1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Materialien von Autoklaven. Ein Glas Bead Sterilisator ist ausreichend, Sterilisieren Instrument Tipps zwischen den Tieren, wenn mehrere Verfahren gleichzeitig durchgeführt wird.
    2. 8-10 Wochen alte C57Bl/6 männliche Mäuse mit einer Mischung aus 100 % Sauerstoff und 2,5 % Isofluran zu betäuben.
      Hinweis: Stellen Sie den Fluss von Sauerstoff und Isofluran als notwendig.
    3. Anesthetization durch die hintere Pfote des Tieres zwischen den Zehen mit Zangen kneifen zu bestätigen. Keine Antwort von der Klemme gibt an, dass das Tier betäubt ist.
    4. Verabreichen Sie langsame Freisetzung Analgetikum (Buprenorphin) durch subkutane Injektion. Geben Sie Mäuse eine Dosis von 1 mg pro 1 kg Körpergewicht (1 mg/kg) Schmerzmittel.
    5. Platzieren Sie Augensalbe auf beiden Augen des Tieres keine Hornhaut Austrocknung für die Dauer des Verfahrens sicherzustellen.
    6. Verabreichen Sie 0,2 - 0,5 mL isotonischer Flüssigkeit pro 10 g Körpergewicht subkutan.
    7. Fixieren Sie das Tier auf dem OP-Tisch mit chirurgischen Klebeband. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Bauch zu entlarven. Operieren Sie auf ein Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern.
    8. Entfernen Sie Haare aus dem Bauch der Maus durch Anwendung einer Haarentfernung Creme für ca. 1-2 min. Wischen Bauchbereich reinigen mit Gaze und destilliertem Wasser, wenn nötig.
    9. Alternativ entfernen Sie die Haare aus dem Bauch durch die Rasur mit einem kleinen elektrischen Rasierapparat.
    10. Den Bauch mit Baxedin (Chlorhexidin Gluconat BP Lösung) vor der Herstellung Einschnitte zu sterilisieren. Gelten Sie Ethanol leicht mit Gaze, übermäßiger Hitze Verlust durch die Verdunstung des Alkohols zu vermeiden.
  2. Belichtung der unteren Hohlvene (IVC)
    1. Führen Sie chirurgische Scheren verwenden, eine Laparotomie um die Bauchhöhle zu öffnen.
      1. Heben Sie Haut mit einer Pinzette am Unterbauch und machen einen vertikalen Schnitt parallel zu beiden Seiten der Linea Alba. Den erste Schnitt zu machen, nach links oder rechts von der Linea Alba, abhängig von der Händigkeit des Betreibers. Der Schnitt erfolgt, bei der Ultraschall-Bildgebung weiter Weg von der Mittellinie.
      2. Machen Sie einen zweiten, horizontalen Einschnitt an der Spitze des Bauches.
        Hinweis: Nach dem Eindringen in die Bauchhöhle, die Muskulatur "Zelt" und dann Drang mit chirurgische Scheren zu Schäden an der Bauchorgane zu vermeiden.
      3. Wiederholen Sie die vertikale und horizontale Einschnitte auf dem Bauchmuskel-Layer des Tieres. Achten Sie darauf, die Muskulatur Zelt beim Eindringen in die Bauchhöhle um nicht unter die Organe zu schädigen.
        Achtung: Heben Sie Haut und Muskel vom Darm und anderen inneren Organe beim Einschnitte um ihnen Punktion nicht zu machen.
    2. Falten Sie die Haut und Muskel vom Einschnitt in die Bauchhöhle aussetzen.
    3. Gaze, befeuchtet mit Isotone Lösung, um die Seiten der Wunde Öffnung wenden und den Darm zu externalisieren. Druck auf beiden Seiten des Bauches, die Externalisierung des Darms zu unterstützen. Verwenden Sie sanfte Bewegungen mit einem Baumwolle Spitze Applikator, um den Darm zu bewegen. Einweichen Sie Gaze in isotonische Lösung und legen Sie es über das externalisierte Darm.
      1. Gaze sollte bereits vor der Platzierung auf Gewebe befeuchtet werden.
    4. Bewegen Sie peritonealen Fett beiseite zu, und setzen Sie die IVC zwischen den Nieren- und Beckenkamm Adern.
    5. Machen Sie einen ersten Ermittlung des offensichtlichen Seitenäste. Einem Seitenast erscheint als kleiner, aber bedeutende Ader, die Weg von der IVC, zwischen den Nieren und den Beckenkamm Zweige Venen. Gefäßsystem variieren stark zwischen Mäusen. Mäuse haben Seitenäste vorhanden auf einer oder beiden Seiten von der IVC.
  3. Unterbindung der Seitenäste
    Hinweis: Wenn Seitenäste vorhanden sind, wird das folgende Verfahren jeweils gefolgt. Falls nicht vorhanden, fahren Sie mit Schritt 4: erste Naht Platzierung unter der IVC. Die Ligatur-Website von der IVC werden unmittelbar distal der linken renal Vene, unabhängig vom Vorhandensein von seitenästen.
    1. Durchführen Sie stumpfe Dissektion auf jeder Seite des Ortsverbandes Seite. Stumpfe Dissektion ist der Prozess wiederholt stumpfen Pinzette mit sanftem Druck, um die Faszie durchbrechen, ohne Beschädigung der umgebenden Gefäße zu öffnen.
      Vorsicht: Punktion oder die Vene zu beschädigen zu vermeiden.
    2. Heben Sie den Zweig und übergeben Sie einen Abschnitt von 6-0 Seide Naht unterhalb der Vene. Immer Vorsicht beim Heben oder bewegen Schiffe. Es empfiehlt sich, das Fett um die Schiffe zu packen, sonst besteht die Gefahr einer Beschädigung des Schiffes.
    3. Mit Naht Pinzette, machen Sie eine chirurgische Ligatur um den Seitenzweig mit standard chirurgische Knoten binden Technik. Vollständige Unterbindung erfolgt um zu 100 % Okklusion der Vene zu gewährleisten. Verwenden Sie mindestens drei binden wirft, um sicherzustellen, dass die Verbindung sicher ist.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 für alle verbleibenden Seitenäste.
  4. Dissektion der bauchschlagader von der IVC
    1. Führen Sie stumpfe Dissektion um die IVC unmittelbar distal von der linken renal Vene. Der bauchschlagader ist die IVC über Faszien befestigt, daher führen erste stumpfe Dissektion um die IVC und Bauchaorta.
      Achtung: Vermeiden Sie punktieren oder die Vene zu beschädigen. Bruch oder Punktion entweder Schiff nicht. Dies ist der wichtigste Teil des Verfahrens, mit dem höchsten Risiko für Schiff Schaden.
    2. Weiterhin üben Sie sanften Druck über stumpfe Dissektion, bis eine klare Fenster zwischen der Aorta und IVC vorgenommen wird.
  5. Naht-Platzierung und IVC-Ligatur
    1. Übergeben Sie einen Abschnitt von 6-0 Seide Naht unter dem IVC und Bauchaorta.
    2. Suchen Sie die Naht durch das Fenster zwischen der IVC und Aorta erstellt. Verwenden Sie Zange ziehen die Naht und Fädeln Sie ihn zwischen die Bauchaorta und IVC. Fädeln Sie den Faden durch sorgfältig, versuchte, nicht zu ziehen/Punktion der IVC und Bauchaorta.
    3. Machen Sie eine chirurgische Verbindung rund um die IVC mit Naht-Zange, ein total Verschluss der Vene zu gewährleisten. Wieder stellen der Ligatur unmittelbar distal von der linken renal Vene.
    4. Machen Sie drei Naht wirft der Ligatur zu sichern.
      Hinweis: Es ist auch möglich, die Naht unterhalb der IVC und Aorta vor der Trennung der beiden als eine Alternative zu übergeben. 7-0 Prolene Fäden können alternativ zur Unterbindung von den Seitentrieben und die IVC verwendet werden.
  6. Wundverschluss und postoperative Pflege
    1. Vergewissern Sie sich, der bauchschlagader ununterbrochene gelassen worden ist und dass alle Seitenäste ligiert worden. Die IVC erscheint dilatative distal von der Ligatur-Website und kein Blut fließen wird sichtbar sein.
    2. Legen Sie alle peritonealen Fett und den Darm wieder in die Bauchhöhle.
    3. Schließen Sie die Wunde mit Naht Zange und 6-0 Seide Naht. Verwenden Sie eine laufende Naht (einfach kontinuierliche) und sicherzustellen Sie, dass die Naht nicht zu eng sein wird. Eine enge Naht wird brechen, wenn das Tier wacht auf und bewegt sich in seinem Käfig.
      1. Alternativ können Sie die PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon oder Edelstahl-Clips für Wundverschluss.
    4. Naht die Schicht der Bauchmuskel zunächst mit entsprechenden Naht Technik zu binden.
    5. Wiederholen Sie die Nahttechnik für die Haut und überprüfen Sie Wundverschluss ausreicht.
      Hinweis: Wenn die gleichen Faden Nadel und Faden für mehrere Tiere verwenden, Sterilisieren Sie sowohl in 70 % igem Ethanol vor jedem Gebrauch.
    6. Entfernen Sie das Tier aus betäubende Gas und legen Sie sie in einem Inkubator 34 ° C für mindestens 30 Minuten.
    7. Auch hier verabreichen Sie 0,2 - 0,5 mL isotonischer Flüssigkeit pro 10 g Körpergewicht subkutan. Flüssigkeiten können in folgenden Tagen eingeräumt präoperative Körpergewicht bei Bedarf.
    8. Überwachen Sie das Tier bis zur Genesung zu gewährleisten erfolgreich operiert und die allgemeine Gesundheit des Tieres zu beurteilen.
      Vorsicht: Eine leichte Buckliger Haltung für ein invasives Verfahren wie diesem erwarten, aber das Tier verhält sich normalerweise schon 30 Minuten nach der Operation.
    9. Legen Sie das Tier in seinem eigenen Käfig, und stellen Sie es nicht mit anderen Tieren bis vollständig erholt.
    10. Neu verwalten Sie Analgetikum täglich für bis zu 48 h op.
    11. Legen Sie Lebensmittel auf dem Boden des Käfigs für die tierischen While in Genesung. Andere besondere Vorsicht ist in der Regel nicht erforderlich.
    12. Prüfen der Wundstelle für Rötung, Schwellung, oder Entlastung und andere Anzeichen einer Infektion.
    13. Entfernen Sie ggf. Fäden nach 7-10 Tagen.
    14. Euthanasie sofort durchführen, wenn eine Operation nicht erfolgreich ist (z. B. bedeutende Schiff Schäden und/oder Blut Verlust) oder Tier nicht mit Post-operative Betreuung verbessert. Sterbehilfe ist in der Regel in 48 h op durchgeführt. Verwenden Sie für längere Experimente 7-0 Prolene um zu verbinden Seitenäste und die IVC und 5-0 Vicryl Nähte um den Bauchraum zu schließen.
      1. Durchführen Sie Euthanasie durch Anesthetization des Tieres in eine Induktion wie zuvor beschrieben, außer bei 5 % Isofluran. Es folgt durch ersticken mit 100 % CO2 während betäubt.
      2. Führen Sie nach Bestätigung der Euthanasie durch Ersticken (Verlust von Herzschlag und keine Atmung) durch zervikale Dislokation um komplette Euthanasie zu gewährleisten.

(2) Hochfrequenz-Ultraschall-Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll wird von der Lady Davis Institut Nagetier Phänotypisierung Kern SOP für Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung angepasst. Dieses Protokoll wird 24 Stunden nach der Operation durchgeführt, aber kann schneller erfolgen, solange das Tier gut auf die Operation reagiert. Das Protokoll kann jederzeit an gesunden Mäusen durchgeführt werden und ist oft getan, vor und nach der Operation zu vergleichen.

  1. Vorbereitung der Tiere
    1. Legen Sie das Tier in eine Induktion Kammer und Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung aus 100 % Sauerstoff und 2,5 % Isofluran zu.
    2. Herzfrequenz und temperaturmonitor einschalten. Stellung Wärmelampe über Tisch Tier warm zu halten während der Prozedur.
    3. Nehmen Sie das Tier aus der Induktion Kammer und Auge Gleitmittel um Hornhaut Austrocknung zu verhindern. Positionieren Sie das Tier auf die Analyseplattform und kleben Sie die Narkose Rohr zu Mund/Nase des Tieres.
    4. Warmen Ultraschall gel auf 37 ° C und legen Sie das Gel auf den Bauch des Tieres. Das Ultraschallgel wird erwärmt, mit einem Wasser-Heizung-System, dass Pumpen Warmwasser durch Spulen, die um die Gel-Flasche gewickelt sind.
    5. Für Messungen der Herzfrequenz (falls erforderlich) die 4 Elektroden die Analyseplattform Elektrodengel aufsetzen und die Pfoten des Tieres auf die Plattform/Elektroden mit chirurgischen Klebeband befestigen. Legen Sie das Tier in Rückenlage für die Bildgebung von der IVC. Die Ultraschall-imaging-System umfasst eine Analyseplattform, die wird erwärmt und Elektroden zur Überwachung des Tieres enthält.
    6. Für Temperaturmessungen Elektrodengel auf Thermometer und Einfügen in den Enddarm des Tieres.
    7. Passen Sie Wärmelampe und Isofluran als notwendig, um sicherzustellen, dass Tier ist komfortabel und hat eine Atmung zwischen 30-70 Bpm wird bei 37 ° c gehalten
    8. Falls erforderlich, Bauch des Tieres zu rasieren oder Haare mit Enthaarungscreme entfernen. Bewerben Sie sich für 1 bis 2 Minuten und wischen Sie mit Gaze und destilliertem Wasser reinigen.
      Hinweis: Zu viel Haar kann die Qualität der Bilder beeinflussen.
    9. Platzieren Sie Gaze unter oder auf die Seite des Tieres überschüssige Ultraschallgel zu fangen.
  2. Bildgebung der IVC und Thrombus
    1. Schalten Sie die imaging-Software und beginnen Sie eine neue Studie.
    2. Wählen Sie eine geeignete Scanhead für die Bildgebung. Die hier verwendete Scanhead ist für die Bauchorgane (Frequenz: 35 MHz, Brennweite: 12,8 mm).
    3. Erfassen Sie alle relevanten Informationen über das Tier. Dazu gehören Tier ID, Geschlecht, Gewicht, Geburtsdatum, Stamm.
    4. Senken Sie die Scanhead nach unten, bis er das Ultraschallgel auf das Tier berührt.
    5. Starten Sie die Scanhead-Sonde um 2-D-Bildgebung des Tieres zu beginnen. In diesem Modus werden Bilder als zweidimensional in unterschiedlichen Graustufen dargestellt.
    6. Suchen Sie die IVC und bauchschlagader durch Bewegen der Maus-Plattform innerhalb des x- bzw. y-Ebene, während der Bewegung auch die Scanhead durch die Z-Ebene.
      Hinweis: Blut Schiffe mit ihren weißen Mauern und das Blut im Inneren erscheint fast schwarz. Bauchschlagader wird intensiv Pulsieren und haben dickere Wände, während der IVC haben dünnere Wände und Kompresse/erweitern leicht auf das Bild-wenn die Scanhead nach oben verschoben und nach unten. Die Ligatur-Website werden offensichtlich, da die Vene geweitet wird und die Vene Wand wird zu einem Punkt kommen. Jede Thrombus innerhalb gebildet werden solide unter Ultraschall-Bildgebung und wird nicht leicht komprimieren, wie die Wand der Vene. Die Vene wird erst oberhalb der Ligatur komprimieren, wo kein Thrombus gebildet wird.
    7. Bei der Ortung Zentrieren der IVC und die Ligatur-Seite Sie sie auf den Mittelpunkt des Ultraschalls, um die genaueste Bild zu erreichen.
      1. Wenn das Bild zu dunkel ist, um klar zu sehen, stellen das Gel und entfernen eventuell vorhandene Luftbläschen mit einem Baumwolle Spitze Applikator.
      2. Falls erforderlich, Scanhead 45° nach links oder rechts kippen und Nachjustieren der Tieren-Plattform um die Vene klar zu sehen. Dies geschieht wenn gibt es Interferenzen mit der Scanhead. In diesem Szenario muss die Vene in einem Seite-Winkel um die Naht zu vermeiden abgebildet werden.
        Hinweis: Bildstörungen verursacht in den meisten Fällen durch dunkle Flecken der Haut auf dem Tier, schlechte Wunde Naht Platzierung oder Luftblasen in das Ultraschallgel.
    8. Mit der Software machen Sie Fotos von jedem gewünschten Strukturen und machen Sie Messungen Messung Werkzeug. Gemeinsamen Messungen umfassen Querschnittsfläche von den Thrombus oder Breite des Standortes Ligatur.
    9. Ändern Sie die bildgebenden Modus auf Pulswelle Doppler, Blut Durchflussmessungen zu machen. Dieser Modus ermöglicht die Darstellung der vaskulären Blutfluss und die Messung der Strömungsgeschwindigkeit, unter anderen Variablen.
    10. Kippen Sie die Analyseplattform um das hintere Ende des Tieres zu senken.
    11. Ändern Sie die Winkelstellung der Scanhead, so dass sie das Gel in einem Winkel von etwa 30° vom hinteren Ende des Tieres in Verbindung setzen wird.
    12. Positionieren Sie die Tier-Plattform und Scanhead. Die IVC und Ligatur zu verlagern, wenn nötig.
    13. Machen Sie Blut fließen Messungen rund um die Ligatur-Website zu bestätigen Stase und nehmen alle gewünschten Bilder. Gemeinsamen Messungen des Blutflusses enthalten Durchschnittsgeschwindigkeit, Peak Velocity oder mittlere Geschwindigkeit.
    14. Speichern Sie Messungen oder Aufnahmen.
  3. Clean-Up und Tier Erholung
    1. Erhöhen der Scanhead zur Ausgangsposition und tierischen Plattform in die Ausgangsposition zu positionieren.
    2. Entfernen Sie überschüssiges Gel aus dem Tier mit Gaze. Tun Sie dies sanft, so dass die Wunde Naht nicht gebrochen werden.
    3. Entfernen Sie das Thermometer aus dem Tier Rektum und nehmen Sie das Tier von der Plattform zu.
    4. Legen Sie das Tier in seinem Käfig und ein 34 ° C Inkubator.
    5. Überwachen Sie das Tier bis zur Genesung. Das Verfahren ist sehr kleine und nicht-invasiv. Das Tier wird schnell aufwachen. Weiterhin Tier in den folgenden Tagen gemäß Abschnitt 1.6 dieses Protokolls.
    6. Reinigen Sie die tierische Plattform mit Gaze und Desinfektionsmittel.
    7. Wischen Sie die Scanhead mit Gaze und destilliertem Wasser reinigen.
      Vorsicht: Reinigen der Scanhead sehr vorsichtig und nur mit destilliertem Wasser.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2 für das nächste Tier.
      1. Wenn fertig mit allen Themen, stellen Sie sicher, dass alle Bilder und Aufnahmen gespeichert wurden. Dann schalten Sie alle Geräte und Software.

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Representative Results

Stase Venenthrombose Modell

In die Stasis-Modell Mäusen werden betäubt, und ein Schnitt gemacht, der unteren Hohlvene (IVC) verfügbar zu machen. Der Schnitt erfolgt auf der linken oder rechten Seite der Maus anstelle einer Mittellinie Laparotomie in einer Weise, die nicht mit der Ultraschallsonde stören würde. Die Abdominal-Muskeln und der Haut sind Falten zurück zu entlarven die IVC (Abbildung 1). Erstens sind Seitenäste mit einer 6-0 Seide Naht (Abbildung 2) ligiert. Dann die IVC wird aus der Aorta durch stumpfe Dissektion getrennt und die Seide wird um die IVC (Abb. 3A-C) gelegt. Die IVC ist mit einer 6-0 Seide Naht ligiert. Dilatation der IVC unterhalb der Ligatur-Website ist ein Hinweis auf erfolgreiche Unterbrechung des Blutflusses (Abbildung 3D). Schließlich sind die Bauchhöhle und die Haut wieder in kontinuierlicher Weise (Abbildung 3E) vernäht.

Überwachung der thrombusbildung mit Ultraschall

Wie wir bereits gezeigt haben, kann hochfrequente Ultraschall, die gewöhnlich zum venösen Thrombose im klinischen Umfeld zu bewerten, um thrombusbildung und Auflösung im Laufe der Zeit in einer experimentellen Mausmodell zu messen verwendet werden. Wir verwendeten eine Hochfrequenz Micro-Imaging System12. Vor der Ligation kann in der Längsrichtung Ansicht der IVC identifiziert werden. Nach Unterbindung der Vene kann der Erfolg des Verfahrens visualisiert werden. Die PW-Doppler-Modus lässt sich bestimmen, Blut Strömungsgeschwindigkeit vor (34,8 mm/s) und nach (5,6 mm/s) der Ligatur. Da Thromben Dichter als fließt sind Blut, wir könnten den gebildeten Thrombus innerhalb der IVC mit Sonographie, 24 Stunden nach der Ligatur (Abb. 4A) zu schätzen wissen. Ultraschall ermöglicht eine Quantifizierung der Geschwindigkeit des Blutflusses in den Gefäßen mit Farbdoppler. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, können wir den Fluss in die Vene vor der Ligation Messen und schätzen die Unterbrechung des Durchflusses nach der Ligatur, wenn der Thrombus gebildet wird. Daten aus unserem Labor zeigen eine durchschnittliche Thrombus Größe von 4,85 ± 0,22 mm2 bei 24 Stunden und 5,05 ± 0,47 mm2 48 Stunden (Mittelwert ± SEM).

Figure 1
Abbildung 1: Stasis-Modell: Verfahren der minderwertigen Vena Cava aussetzen. (A) Maus Haare aus dem Bauch ist mit Enthaarungscreme entfernt. (B) ein ersten Schnitt erfolgt auf der linken Seite des Bauches und eine zweite ventralen ein (C) von links nach rechts. (D) ein nassen steriler Blick wird verwendet, um den Darm exteriorize und der unteren Hohlvene (IVC) und Seitenast (SB). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Stasis-Modell: Verfahren zum Verbinden der Seitenast. (A) Ausstellung der IVC und SB (B) Platzierung der Naht Seide unterhalb der SB. (C) Ligation von SB LRV: linke renal Vene. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Stasis-Modell: Verfahren zum Verbinden der minderwertigen Vena Cava. (A-B) Stumpfe Dissektion der Aorta die IVC getrennt. (C) Platzierung der Naht Seide unterhalb der IVC. (D) Ligatur der die IVC. Dilatation der IVC wird beobachtet. (E) die Abdominal-Muskeln und Haut sind separat geschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Überwachung der thrombusbildung mit Ultraschall-Bildgebung. (A) repräsentative Ultraschall Bilder vor, unmittelbar nach 24 Stunden nach der Unterbindung der IVC. (B) die Vertreter Bilder von Blut fließen Geschwindigkeit dargestellt durch Farbdoppler mit Farbverarbeitung. Das Ausmaß der farbcodierten Blut fließen reicht von rot bis gelb, hoch, um low-Flow darzustellen. In der aufgespaltenen Tiere ist das Fehlen der Strömung durch die Abwesenheit von Farbe dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte für erfolgreiche venöse thrombusbildung mit dem Stase-Modell. Induktion einer Beinvenenthrombose ist eine größere Herausforderung in alten Mäusen durch die Anhäufung von Fett rund um die minderwertige Vena Cava und Aorta. Idealerweise sollte Mäuse durchläuft diese Prozedur 8 - 10 Wochen alt sein. Große Sorgfalt sollte nicht induzieren endothelschäden in der IVC während der stumpfe Dissektion und Ligatur. Darüber hinaus ist es entscheidend, das Tier in einem Inkubator 34 ° C für mindestens 30 Minuten nach der Operation zu halten und um es in der Gesellschaft von anderen Tier nur nach vollständiger Genesung zurück. Wenn die Operation richtig gemacht haben, Verhalten sich die Tiere bemerkenswert gut während der postoperativen Betreuung. Sie weisen keine ernsthaften Nebenwirkungen wie Lähmungen, Paresen oder Inkontinenz. Sie können unmittelbar nach der Operation reduzierte Bewegung und leicht gebeugt Haltung aufweisen, aber das ist nicht oft gesehen, solange das Schmerzmittel effektiv ist und richtig operiert.

Die Stasis-Modell erzeugt einen großen Thrombus mit reproduzierbare Messungen von einer Maus zu einem anderen. Wie beim Menschen die Anatomie des Venensystems variiert zwischen Mäusen und die Frage der IVC Zweig Unterbrechung hat vor kurzem in der Stenose und die Stasis-Modelle der DVT13,14behandelt. Brandt Et Al. zeigten, dass thrombusbildung induziert durch Strömung Einschränkung verhindert worden, wenn an die Seitentrieben befanden < 1,5 mm des Standortes IVC-Ligatur. Jedoch war Seite Zweig Ligatur13,15,16DVT Bildung induziert durch Strömung Beschränkung bei Mäusen nicht betroffen. Es wurde auch berichtet, dass die Variabilität der IVC Seitenäste in C57Bl6 Maus Stamm einen wichtigen Einfluss auf thrombusbildung durch vollständige Unterbindung der IVC14induziert hat. Es wurde festgestellt, dass nicht Ligation Seite Ergebnisse statistisch kleiner Blutgerinnsel Größe im Vergleich zu Kontrollen mit aufgespaltenen Seitenäste verzweigt. Unsere Studie auch vorschlagen, dass Ligatur der Seite Niederlassungen produziert konsistent thrombusbildung und Größe. Die häufigste anatomische Variation in C57Bl/6 ist jedoch, dass das Vorhandensein von 2 zurück (98 % der Mäuse)14Niederlassungen. Es konnte gezeigt werden, dass die hinteren Zweige unterbrechen den größten Einfluss auf Thrombus Größe hat. Die vorliegende Methodik nicht eingegangen die Wirkung der hinteren Zweige, der eine niedrige Temperatur Cautery Pen14unterbrochen werden kann. Wir zeigen jedoch, dass Ligatur der IVC und Seite Filialen führte konsequent thrombusbildung in C57Bl/6. Schließlich, wie wir bereits gezeigt haben, die Hochfrequenz-Ultraschall-System ermöglicht die präzise Messung von Thromben Größe und eignet sich für langfristige und Translationale Studien der thrombusbildung und Auflösung12,13 ,15.

Ein großer Nachteil des Modells Stase ist die vollständige Obstruktion des Blutflusses, wodurch die maximale Wirkung von intravenös verabreichten Wirkstoffe an der Thrombus und Vene Wand reduziert. Dies wird ein wichtiges Thema, wenn man den Effekt eines pharmakologischen Wirkstoffs testen will. Wenn der Effekt von einem bestimmten Medikament werden getestet muss, würde man lieber mit der Stenose Modell13 oder elektrolytische Modell17. Beide Modelle produzieren Thromben in Anwesenheit von kontinuierlichen Blutfluss, die Erprobung von neuen Antikoagulans-Agenten für TVT-Prophylaxe und Therapie ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Herzen und Stroke Foundation of Canada und der Morris und Bella Fainman Family Foundation unterstützt. Die Autoren möchten Veronique Michaud für ihre technische Hilfe mit dem VEVO770 Ultraschall-imaging-System zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
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References

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