Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Immunology and Infection

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Summary

Il presente protocollo descrive la procedura per ottenere la trombosi venosa utilizzando un modello di stasi. Inoltre, stiamo utilizzando un metodo non invasivo per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo.

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

La trombosi venosa è una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 500. Trombosi venosa profonda può condurre alla morte attraverso l'embolia polmonare o risultati nella sindrome post-trombotica, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione, o nell'ipertensione polmonare cronica conseguente significativo cronica delle vie respiratorie compromesso. Questa è la più comune malattia cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus ischemico ed è una sfida clinica per tutte le discipline mediche, come può complicare il corso di altre malattie come il cancro, la malattia sistematica, chirurgia e trauma principale.

Modelli sperimentali sono necessari per lo studio di questi meccanismi. Il modello di stasi induce embolo coerente dimensione e una quantità quantificabile dell'embolo. Tuttavia, è necessario sistematicamente lega i rami laterali della vena cava inferiore per evitare la variabilità nelle dimensioni dell'embolo e qualsiasi interpretazione di dati errati. Abbiamo sviluppato una tecnica non invasiva per misurare la dimensione dell'embolo usando l'ecografia. Utilizzando questa tecnica, che possiamo valutare lo sviluppo dell'embolo e risoluzione nel tempo dello stesso animale. Questo approccio limita il numero di topi necessaria per la quantificazione di coerenza con il principio di sostituzione, riduzione e perfezionamento degli animali nella ricerca di trombosi venosa. Abbiamo dimostrato che il peso dell'embolo e l'analisi istologica di embolo dimensione correlano con la misura ottenuta con l'ecografia. Pertanto, lo studio corrente descrive come indurre trombosi profonda della vena in topi utilizzando il modello di stasi della vena cava inferiore e come monitorare utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza.

Introduction

Tromboembolismo venoso (TEV), che è composto di trombosi venosa profonda (TVP) ed embolia polmonare, è la terza causa di morte cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus. È una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 5001. VTE può portare a: 1) morte attraverso embolia polmonare; 2) post-trombotica sindrome, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione; o 3) ipertensione polmonare cronica conseguente compromesso respiratorio cronico significativo. TEV è una malattia multi-fattoriale e può derivare da stasi del flusso sanguigno, danni alle pareti del vaso, e/o stati hypercoagulable a causa di una rottura dell'equilibrio tra la coagulazione e del sistema fibrinolitico, come è stata descritta più di cento anni fa di Virchow ed è noto come triade di Virchow.

Perché nella maggior parte dei casi è impossibile da ottenere campioni DVT umani, i ricercatori hanno sviluppato modelli sperimentali animali di DVT. Sono stati utilizzati diversi animali incluse ratto2del mouse3, coniglio4, maiale5, cane6e primate non umano7 . I topi possono essere geneticamente modificati e sono l'animale più frequentemente usato per studiare DVT. Tuttavia, come in tutti gli animali, DVT spontanea non è osservato nei topi. Pertanto, alterazioni fisiche o chimiche della parete venosa vengono utilizzate per creare trombosi nei topi. In precedenza abbiamo utilizzato il modello di cloruro ferrico per indurre trombosi nella vena cava inferiore (IVC) di topi8,9,10. Questo modello ha il vantaggio di produrre in modo affidabile gli emboli occlusivi pochi minuti e può essere utilizzato per indagare il ruolo dei farmaci anticoagulanti e antipiastrinici durante la TVP acuta. Tuttavia, è una procedura terminale. Così, per studiare la TVP acuta e cronica, il modello di stasi è più adatto. In questo modello, la formazione dell'embolo è indotta dall'interruzione completa del flusso di sangue nella VCI, uno dei fattori nella triade di Virchow per sviluppo di TVP. Questo modello può essere utilizzato per studiare la formazione di DVT e risoluzione, che è un vantaggio rispetto al FeCl3 modello11.

Abbiamo sviluppato un metodo non invasivo per seguire la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo utilizzando un sistema di micro-Imaging per applicazioni ad alta frequenza ultrasuoni12. Precedentemente abbiamo dimostrato che misura di trombosi venosa dall'ultrasuono correla favorevolmente con gli emboli ottenuti patologico. In due studi successivi abbiamo confermato che le misure ottenute con ultrasuoni in correlazione con l'embolo area quantificato di istochimica9,10e peso dell'embolo. Ancora più importante, abbiamo mostrato che l'ultrasuono ad alta frequenza può essere utilizzato per monitorare la formazione di trombosi venosa profonda in topi12. Può anche essere utilizzato per quantificare la risoluzione dell'embolo in modo non invasivo.

Qui, descriviamo il protocollo che consente la formazione di trombi utilizzando il modello murino di trombosi stasi-indotta e come formazione dell'embolo possa essere monitorata in modo non invasivo nel corso del tempo usando l'ultrasuono ad alta frequenza.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal istituzionale animale cura Comitato della McGill University Montreal, QC, Canada. Tutte le attrezzature necessarie sono elencata nella tabella I.

1. murino (C57BL/6J) IVC stasi protocollo

  1. Preparazione all'intervento
    Nota: Questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza e di conseguenza, un'adeguata tecnica asettica deve essere seguita in ogni momento. Questo include assicurandosi che tutti i materiali sono a portata di mano, la pulizia e sterilizzazione degli strumenti prima e tra uso e che designa una zona sterile sulla superficie di lavoro per tutto il materiale sterile.
    1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e materiali in autoclave. Uno sterilizzatore di perlina di vetro è sufficiente per sterilizzare suggerimenti strumento tra gli animali, se più di una procedura venga eseguita in una sola volta.
    2. Anestetizzare topi maschii C57Bl/6 di 8-10 settimane vecchio con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane.
      Nota: Regolare il flusso di ossigeno e isoflurano come necessario.
    3. Confermare amputate pizzicando la zampa posteriore dell'animale tra le dita dei piedi con il forcipe. Nessuna risposta dal pizzico indica che l'animale è anestetizzato.
    4. Somministrare analgesici a lento rilascio (buprenorfina) tramite iniezione sottocutanea. Dare ai topi una dose di 1 mg di analgesico per 1 kg di peso corporeo (1 mg/kg).
    5. Posto unguento oculare su entrambi gli occhi dell'animale affinché nessun dissecazione corneale per tutta la durata della procedura.
    6. Somministrare per via sottocutanea 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo.
    7. Fissare l'animale alla tabella chirurgia utilizzando nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per esporre l'addome. Eseguire un intervento chirurgico su un rilievo di riscaldamento per evitare l'ipotermia.
    8. Rimuovere i capelli dall'addome del mouse mediante applicazione di una crema depilatoria per 1-2 min. pulire l'area addominale pulire con garza e acqua distillata, se necessario.
    9. In alternativa, rimuovere i capelli dall'addome di rasatura con un rasoio elettrico piccolo.
    10. Sterilizzare l'addome con Baxedin (soluzione di clorexidina gluconato BP) prima di effettuare qualsiasi incisioni. Applicare etanolo leggermente con una garza per evitare eccessive perdite di calore causata dall'evaporazione dell'alcool.
  2. Esposizione della Vena Cava inferiore (IVC)
    1. Utilizzando le forbici chirurgiche, eseguire una laparotomia per aprire la cavità addominale.
      1. Sollevi la pelle con il forcipe al basso addome e praticare un'incisione verticale parallela su entrambi i lati della linea alba. Effettuare l'incisione prima a sinistra o a destra della linea alba, a seconda la manualità dell'operatore. L'incisione è fatta partire dal midline per assistere in ecografia più tardi.
      2. Fare un'incisione seconda, orizzontale nella parte superiore dell'addome.
        Nota: Al momento la penetrazione nell'addome, la muscolatura dovrebbe essere "tented" e poi penetrata con le forbici chirurgiche per evitare di danneggiare gli organi addominali.
      3. Ripetere le incisioni verticali e orizzontali su strato del muscolo addominale dell'animale. Essere sicuri di tenda la muscolatura durante la penetrazione nell'addome per non danneggiare gli organi sotto.
        Attenzione: Sollevare pelle e muscolo dall'intestino e altri organi interni quando fare incisioni per non forare loro.
    2. Piegare la pelle e muscolo da incisione per esporre la cavità addominale.
    3. Applicare garza, inumidito con soluzione isotonica, ai lati dell'apertura della ferita ed esternare l'intestino. Applicare pressione su entrambi i lati dell'addome per assistere l'esternalizzazione degli intestini. Utilizzare movimenti dolci con un cotton-fioc per spostare gli intestini. Immergere la garza in soluzione isotonica e posto sopra l'intestino esternalizzato.
      1. Garza deve essere pre-inumidito prima del posizionamento sul tessuto.
    4. Spostare da parte qualsiasi grasso peritoneale ed esporre il IVC fra le vene iliache e renali.
    5. Fare un'identificazione iniziale di rami laterali evidenti. Un ramo laterale apparirà come più piccolo, ma significativa vena che si dirama dalla IVC, tra renale e iliaca vene. Sistema vascolare può variare notevolmente fra i topi. Topi possono avere rami laterali presenti su uno o entrambi i lati del IVC.
  3. Legatura dei rami laterali
    Nota: Se rami laterali sono presenti, è seguita la seguente procedura per ciascuno di essi. Se non è presente, procedere al passaggio 4: posizionamento della sutura iniziale sotto il IVC. Il sito di legatura del IVC sarà immediatamente distale della vena renale sinistra, indipendentemente dalla presenza di rami laterali.
    1. Eseguire una dissezione smussa su ciascun lato del ramo laterale. Scollamento è il processo di apertura ripetutamente forcipe smussato con una leggera pressione, in modo da spezzare attraverso fascia senza danneggiare i vasi circostanti.
      Attenzione: Evitare forature o danneggiare la vena.
    2. Sollevare il ramo e passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto la vena. Fare sempre attenzione quando il sollevamento o lo spostamento di navi. Si consiglia di afferrare il grasso intorno ai vasi, altrimenti c'è il rischio di danneggiare la nave.
    3. Mezzo di sutura forcipe, fare una legatura chirurgica intorno al ramo laterale utilizzando il nodo chirurgico standard tecnica di legatura. Legatura completa è fatto per garantire 100% occlusione della vena. Utilizzare almeno tre tiri di legatura per fissare saldamente la legatura.
    4. Ripetere il passaggio 1.3 per qualsiasi restanti rami laterali.
  4. Dissezione dell'aorta addominale da IVC
    1. Eseguire una dissezione smussa intorno la IVC immediatamente distale dalla vena renale di sinistra. L'aorta addominale è collegato a IVC tramite fascia, pertanto eseguire iniziale dissezione smussa intorno alla IVC e l'aorta addominale.
      Attenzione: Evitare di perforatura o di danneggiare la vena. Non rompersi o puntura sia vaso. Questa è la parte più critica della procedura, con il più alto rischio di danno vascolare.
    2. Continuare ad applicare una leggera pressione tramite dissezione smussa fino a quando una finestra trasparente è fatta fra l'aorta e IVC.
  5. Posizionamento della sutura e legatura IVC
    1. Passare una sezione di 6-0 sutura seta sotto l'IVC e l'aorta addominale.
    2. Individuare la sutura attraverso la finestra creata tra l'IVC e l'aorta. Utilizzare pinze per tirare il filo di sutura e infilarla fra l'aorta addominale e IVC. Far passare la sutura attraverso con attenzione, cercando di non tirare/puntura la IVC e dell'aorta addominale.
    3. Fare una legatura chirurgica intorno IVC con il forcipe di sutura, garantendo una totale occlusione della vena. Ancora una volta, rendere la legatura immediatamente distale dalla vena renale di sinistra.
    4. Fare tre tiri di sutura per garantire la legatura.
      Nota: È anche possibile passare la sutura sotto l'IVC e l'aorta prima che separa i due come opzione alternativa. In alternativa, le suture 7-0 Prolene possono essere utilizzate per la legatura dei rami laterali e IVC.
  6. La chiusura della ferita e cure post-operatorie
    1. Verificare che l'aorta addominale è stato lasciato senza interruzioni e che tutti i rami laterali sono stati legati. L'IVC appare dilatato distale dal sito legatura e nessun sangue flusso sarà visibile.
    2. Posto tutto grasso peritoneale e intestini indietro nella cavità addominale.
    3. Chiudere la ferita con sutura forcipe e sutura seta 6-0. Utilizzare un suturare corrente (semplice continuo) e assicurarsi che la sutura non sarà troppo stretta. Una sutura stretta rompe quando l'animale si sveglia e si muove intorno la sua gabbia.
      1. In alternativa, è possibile utilizzare clip PDS, Vicryl, Vicryl, Dexon o in acciaio inox per la chiusura della ferita.
    4. Sutura lo strato del muscolo addominale prima mediante sutura appropriata tecnica di legatura.
    5. Ripetere la tecnica di sutura per la pelle e verificare la chiusura della ferita è sufficiente.
      Nota: Se si utilizza la stessa sutura ago e filo per più animali, sterilizzare sia in etanolo al 70% prima di ogni utilizzo.
    6. Rimuovere l'animale dal gas anestetico e metterli in un'incubatrice di 34 ° C per almeno 30 minuti.
    7. Ancora una volta, somministrare 0,2 - 0,5 mL di liquidi isotonici per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea. Fluidi possono essere dato nei giorni successivi per mantenere il peso corporeo pre-operatoria, se necessario.
    8. Monitorare l'animale fino al recupero per garantire il successo della chirurgia e valutare la salute generale dell'animale.
      Attenzione: Aspettatevi una lieve postura ricurva per una procedura invasiva come questo, ma l'animale si comporterà normalmente più presto post-operazione di 30 minuti.
    9. Mettere l'animale in una propria gabbia e non metterlo con gli altri animali fino a quando completamente recuperato.
    10. Ri-amministrare analgesico ogni giorno per fino a 48 h operata.
    11. Posto cibo sul pavimento della gabbia per l'animale mentre in recupero. Altra cura speciale non è generalmente necessario.
    12. Esaminare il sito della ferita per arrossamento, gonfiore, o scarico e altri segni di infezione.
    13. Se necessario, rimuovere le suture dopo 7-10 giorni.
    14. Eseguire immediatamente l'eutanasia se chirurgia ha esito negativo (ad esempio, significativi danni e/o sangue perdita del vaso) o animale non migliora con cure post-operatorie. L'eutanasia è generalmente effettuata a operata di 48 h. Per gli esperimenti più lunghi, è possibile utilizzare 7-0 Prolene per legare i rami laterali e VCI e suture di Vicryl 5-0 per chiudere la cavità addominale.
      1. Eseguire l'eutanasia amputate dell'animale in un'induzione come descritto in precedenza, tranne al 5% isoflurane. Questa è seguita da asfissia con 100% CO2 mentre anestetizzati.
      2. Dopo la conferma dell'eutanasia per asfissia (perdita del battito cardiaco e non respira), eseguire dislocazione cervicale per garantire completa eutanasia.

2. protocollo di ultrasuono ad alta frequenza di

Nota: Questo protocollo è adattato dalla signora Davis Institute roditore Phenotyping Core SOP per l'imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza. Questo protocollo viene effettuato post-operatorio 24 h, ma può essere fatto prima, purché l'animale sta rispondendo bene alla chirurgia. Il protocollo può essere effettuato in qualsiasi momento su topi sani ed è spesso fatto per confrontare prima e dopo la chirurgia.

  1. Preparazione dell'animale
    1. Metti l'animale in una camera di induzione e anestetizzare l'animale con una miscela di 100% ossigeno e 2,5% isoflurane.
    2. Accendere il monitor di temperatura e frequenza cardiaca. Lampada di calore posizione sopra tabella per tenere caldo animale durante la procedura.
    3. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e applicare il lubrificante di occhio per evitare disidratazione corneale. Posizionare l'animale sulla piattaforma di analisi e fissare il tubo anestetico per bocca/naso dell'animale.
    4. Ultrasuono caldo gel a 37 ° C e mettere il gel sull'addome dell'animale. Il gel per ultrasuoni è riscaldato mediante un sistema di riscaldamento dell'acqua che pompe caldo acqua attraverso le bobine che sono avvolti intorno alla bottiglia di gel.
    5. Per misure di frequenza cardiaca (se necessario), mettere gel per elettrodi 4 elettrodi della piattaforma di analisi e fissare le zampe dell'animale per il piattaforma/elettrodi con nastro chirurgico. Metti l'animale in posizione supina per l'imaging del IVC. Il sistema di imaging a ultrasuoni comprende una piattaforma di analisi che viene riscaldata e contiene gli elettrodi per il monitoraggio dell'animale.
    6. Per misure di temperatura, mettere il gel per elettrodi sul termometro e inserire nel retto dell'animale.
    7. Regolare la lampada di calore e isoflurano come necessario garantire quell'animale è confortevole, ha una respirazione tra 30-70 bpm ed è tenuto a 37 ° C.
    8. Se necessario, Radere l'addome dell'animale o Rimuovi i peli con la crema depilatoria. Applicare per 1-2 minuti e pulire con garza e acqua distillata.
      Nota: I capelli troppo possono influenzare la qualità delle immagini.
    9. Posizionare la garza sotto o al lato dell'animale per catturare qualsiasi gel per ultrasuoni in eccesso.
  2. L'IVC e l'embolo di imaging
    1. Attivare il software di imaging e avviare un nuovo studio.
    2. Selezionare un scanhead adeguato per l'imaging. Il scanhead usato qui è per gli organi addominali (frequenza: 35 MHz, lunghezza focale: 12,8 mm).
    3. Registrare tutte le informazioni pertinenti circa l'animale. Questo può includere animale ID, sesso, peso, data di nascita, ceppo, ecc.
    4. Abbassare il scanhead fino a quando non sta toccando il gel per ultrasuoni sull'animale.
    5. Avviare la sonda scanhead per iniziare 2-D imaging dell'animale. In questa modalità, le immagini sono presentate come due dimensioni, in varie tonalità di grigio.
    6. Individuare l'IVC e l'aorta addominale spostando la piattaforma del mouse durante la x - e/o y-aereo, mentre anche in movimento il scanhead attraverso il piano z.
      Nota: Sangue vasi apparirà con il loro bianco di pareti e il sangue all'interno quasi nero. Aorta addominale sarà pulsare intensamente e hanno pareti più spesse, mentre l'IVC sarà hanno pareti più sottili e comprimere/espandere facilmente l'immagine dello schermo quando il scanhead viene spostato e giù. Il sito di legatura sarà evidente, come la vena sarà essere dilatata e la parete venosa arriverà a un punto. Qualsiasi embolo formata all'interno sarà solido sotto l'imaging ad ultrasuoni e non comprimerà facilmente come fa la parete venosa. La vena comprimerà solo sopra la legatura, dove nessun embolo è formato.
    7. All'individuazione della IVC e il sito di legatura, centro loro il punto focale degli ultrasuoni, al fine di ottenere l'immagine più accurata.
      1. Se l'immagine è troppo buio per vedere chiaramente, regolare il gel e rimuovere eventuali bolle d'aria con un cotton-fioc.
      2. Se necessario, inclinare il scanhead 45° verso sinistra o verso destra e riadattare la piattaforma animale per vedere chiaramente la vena. Ciò avviene se c'è interferenza con il scanhead. In questo scenario, la vena deve essere imaged ad angolo lato per evitare la sutura.
        Nota: Immagine interferenza è spesso causato da macchie scure della pelle il posizionamento della sutura della ferita poveri, bolle nel gel ultrasuoni o degli animali.
    8. Utilizzando il software, prendere le foto di tutte le strutture desiderate e fare misurazioni utilizzando qualsiasi strumenti di misurazione. Misure comuni includono l'area della sezione trasversale dell'embolo o larghezza del sito legatura.
    9. Modificare la modalità di imaging Doppler onda di impulso di fare misure del flusso sanguigno. Questa modalità consente l'imaging del flusso sanguigno vascolare e la misura della velocità di flusso, tra altre variabili.
    10. Inclinare la piattaforma di analisi per abbassare l'estremità posteriore dell'animale.
    11. Modificare la posizione di angolo della scanhead in modo che metterà in contatto il gel con un angolo di circa 30° dalla parte posteriore dell'animale.
    12. Riposizionare la piattaforma animale e scanhead. Se necessario, riposizionare l'IVC e la legatura.
    13. Effettuare misure del flusso sanguigno intorno al sito di legatura per confermare lo stasis e prendere qualsiasi immagine desiderate. Misure comuni di flusso sanguigno includono velocità media, velocità di picco o velocità mediana.
    14. Salvare le misure o le immagini scattate.
  3. Recupero di clean-up e animale
    1. Sollevare il scanhead per posizione iniziale e riposizionare la piattaforma animale alla posizione iniziale, come pure.
    2. Rimuovere il gel in eccesso fuori l'animale con una garza. Farlo delicatamente in modo che la sutura della ferita non sarà essere rotto.
    3. Rimuovere il termometro dal retto dell'animale e l'animale fuori dalla piattaforma.
    4. Metti l'animale nella sua gabbia e un incubatore di 34 ° C.
    5. Monitorare l'animale fino al recupero. La procedura è molto minore e non invasivo. L'animale si sveglia rapidamente. Continuare il monitoraggio degli animali nei giorni seguenti conformemente al punto 1.6 del presente protocollo.
    6. Pulire la piattaforma animale con garza e disinfettante.
    7. Pulire il scanhead con garza e acqua distillata.
      Attenzione: Pulire il scanhead molto delicatamente e solo con acqua distillata.
    8. Ripetere il passaggio 2 per il prossimo animale.
      1. Se fatto con tutti i soggetti, verificare che tutte le immagini e le registrazioni sono state salvate. Quindi spegnere tutte le apparecchiature e software.

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Representative Results

Modello di trombosi venosa stasi

Nel modello di stasi, topi sono anestetizzati e un'incisione è fatta per esporre la vena cava inferiore (IVC). L'incisione è fatta sul lato sinistro o destro del mouse invece di una laparotomia mediana in un modo che non avrebbe interferito con la sonda di ultrasuono. I muscoli addominali e la pelle si piega indietro per esporre il IVC (Figura 1). In primo luogo, i rami laterali sono legati con una sutura in seta 6-0 (Figura 2). Quindi, l'IVC è separato dall'aorta da dissezione smussa e la seta è collocata intorno il IVC (Figura 3A-C). L'IVC è legato con una sutura in seta 6-0. Dilatazione del IVC sotto il sito di legatura è un'indicazione di successo interruzione del flusso sanguigno (Figura 3D). Infine, la cavità peritoneale e la pelle sono suturate indietro in modo continuo (Figura 3E).

Monitoraggio della formazione di trombi usando l'ecografia

Come abbiamo in precedenza dimostrato, ultrasuono ad alta frequenza, che viene comunemente utilizzato per valutare la trombosi venosa nelle regolazioni cliniche, può essere utilizzato per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo in un modello sperimentale murino. Abbiamo usato un sistema di micro-Imaging per applicazioni ad alta frequenza12. Prima della legatura, l'IVC può essere identificato nella vista longitudinale. Dopo la legatura della vena, il successo della procedura possa essere visualizzato. La modalità PW-Doppler può essere utilizzata per determinare la velocità del flusso sanguigno prima (34,8 mm/s) e dopo (5,6 mm/s) la legatura. Perché gli emboli sono più densi di che scorre sangue, abbiamo potuto apprezzare l'embolo formata all'interno il IVC usando l'ecografia, 24 ore dopo la legatura (Figura 4A). L'ecografia consente la quantificazione della velocità del flusso sanguigno nei vasi con color Doppler. Come mostrato in Figura 4B, possiamo misurare il flusso nella vena prima della legatura e apprezzare l'interruzione del flusso dopo la legatura, quando l'embolo è formato. Dati dal nostro show di laboratorio una dimensione media dell'embolo 4.85 ± 0,22 mm2 a 24 ore e 5,05 ± 0,47 mm2 a 48 ore (media ± SEM).

Figure 1
Figura 1. Modello di stasi: procedura per esporre la vena cava inferiore. (A) capelli del Mouse dall'addome viene rimosso utilizzando la crema depilatoria. (B) una prima incisione fatta sul lato sinistro dell'addome e una seconda ventrale (C) da sinistra a destra. (D) uno sguardo bagnato di sterile viene utilizzato per esternare gli intestini ed esporre la vena cava inferiore (IVC) e un ramo laterale (SB). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Modello di stasi: procedura per legare il ramo laterale. (A) esposizione della IVC e il posizionamento di SB. (B) della seta sutura sotto il SB. (C) Ligation della LRV SB.: vena renale di sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Modello di stasi: procedura per legare la vena cava inferiore. (A-B) Una dissezione smussa per separare il IVC dall'aorta. (C) il posizionamento della seta sutura sotto l'IVC. (D) legatura del IVC. Dilatazione del IVC è osservata. (E) i muscoli addominali e la pelle sono chiusi separatamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Monitoraggio della formazione di trombi usando la formazione immagine di ultrasuono. (A) ultrasuono rappresentanza immagini prima, immediatamente dopo e 24 ore dopo la legatura del IVC. (B) rappresentanti immagini di sangue velocità raffigurato da colore Doppler di flusso utilizzando l'elaborazione del colore. La scala delle gamme di flusso di sangue con codifica a colori dal rosso al giallo al raffigurano alta a basso flusso. Negli animali legati l'assenza di flusso è rappresentato dall'assenza di colore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono diversi passaggi critici per la formazione del trombo venoso successo utilizzando il modello di stasi. Induzione di trombosi della vena è più impegnativo in vecchi topi dovuta all'accumulo di grasso che circonda la vena cava inferiore e l'aorta. Idealmente, i topi sottoposti a questa procedura dovrebbero essere 8 - 10 settimane fa. Dovrebbe prestare molta attenzione a non indurre danno endoteliale nell'IVC durante la dissezione smussa e la legatura. Inoltre, è fondamentale per mantenere l'animale in un'incubatrice di 34 ° C per almeno 30 minuti dopo l'intervento chirurgico e a restituirlo alla compagnia di altri animali solo dopo il completo recupero. Quando l'intervento è fatto correttamente, gli animali si comportano molto bene durante la cura post-operatoria. Non si esibiscono gravi effetti collaterali quali zoppia, paresi o incontinenza. Essi possono esibire ridotto movimento e una postura leggermente ricurva subito dopo della chirurgia, ma questo non è visto spesso come l'analgesico è efficace e l'intervento chirurgico eseguito correttamente.

Il modello di stasi produce un grande embolo con misure riproducibili da un mouse a un altro. Come nell'uomo, l'anatomia del sistema venoso varia fra i topi e il problema dell'interruzione del ramo IVC è stato affrontato recentemente la stenosi e dei modelli di stasi di DVT13,14. Brandt et al hanno dimostrato che la formazione dell'embolo indotta dalla restrizione di flusso è stata evitata quando i rami laterali sono stati situati al < 1,5 mm del sito legatura IVC. Tuttavia, Formazione DVT indotta dalla restrizione di flusso nei topi non è stata colpita da lato ramo legatura13,15,16. È stato anche riferito che la variabilità dei rami laterali IVC nella razza del topo C57Bl6 ha un impatto importante sulla formazione dell'embolo indotta tramite la legatura completa della IVC14. Si è constatato che non legando lato rami risultati statisticamente più piccolo coagulo dimensioni rispetto ai controlli con rami laterali dei. Il nostro studio inoltre suggeriscono che la legatura del lato rami prodotti coerente trombi e la dimensione. Tuttavia, la variazione anatomica più frequente in C57Bl/6 è che la presenza di 2 indietro rami (98% dei topi)14. È stato dimostrato che interrompendo rami posteriore ha il maggiore impatto sulla dimensione del trombo. La presente metodologia non ha affrontato l'effetto dei rami posteriori, che può essere interrotta mediante una bassa temperatura cauterio penna14. Tuttavia, abbiamo dimostrato che la legatura del lato e IVC rami ha provocato la formazione dell'embolo coerente in C57Bl/6. Infine, come abbiamo dimostrato in precedenza, il sistema a ultrasuoni ad alta frequenza permette la misurazione precisa delle dimensioni dell'embolo e può essere utilizzato per gli studi a lungo termine e traslazionali di formazione dell'embolo e risoluzione12,13 ,15.

Uno dei principali svantaggi del modello stasi è l'ostruzione completa del flusso sanguigno, che riduce l'effetto massimo di agenti per via endovenosa amministrati sulla parete della vena e dell'embolo. Questo diventa un problema importante quando si vuole testare l'effetto di un agente farmacologico. Se l'effetto di un farmaco specifico deve essere testato, uno preferisce utilizzando il modello di stenosi13 o il modello elettrolitico17. Entrambi i modelli producono gli emboli in presenza di flusso sanguigno continuo, che permettono la sperimentazione di nuovi agenti anti-coagulanti per TVP profilassi e trattamento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal cuore e Stroke Foundation of Canada e da The Morris e Bella Fainman Family Foundation. Gli autori vorrei ringraziare Veronique Michaud per il suo aiuto tecnico con il sistema di imaging ad ultrasuoni VEVO770.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
Gaymar heater water pump TP500 MATVET Inc. #R-500305
Infra-red heating lamp electrimat inc. #1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope emkaTECHNOLOGIES
Sterile water From JGH

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References

  1. Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25, (1), 1-5 (2003).
  2. McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85, (6), 1018-1024 (2001).
  3. Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107, (6), 869-875 (2003).
  4. Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8, (3), 193-199 (1994).
  5. Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, (2), 256-263 (2003).
  6. Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41, (6), 1056-1064 (2000).
  7. Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31, (2), 309-324 (2000).
  8. Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121, (4), 692-699 (2013).
  9. Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127, (6), 769-777 (2016).
  10. Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2017).
  11. Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 556-562 (2012).
  12. Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10, (3), 447-452 (2012).
  13. Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56, (2), 145-152 (2014).
  14. Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13, (4), 660-664 (2015).
  15. Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. (2016).
  16. Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129, (16), 2291-2302 (2017).
  17. Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, (2), 366-375 (2010).

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