诱导小鼠横向主动脉狭窄的闭合胸模型

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Medicine

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Summary

在这里, 我们提出一个横向主动脉收缩 (TAC) 通过侧开胸手术的协议。该技术是一种微创, 闭合胸部手术的过程, 旨在模拟压力超负荷和心力衰竭的小鼠使用标准的 TAC 实验室设置。

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Eichhorn, L., Weisheit, C. K., Gestrich, C., Peukert, K., Duerr, G. D., Ayub, M. A., Erdfelder, F., Stöckigt, F. A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice. J. Vis. Exp. (134), e57397, doi:10.3791/57397 (2018).

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Abstract

心肌肥厚和心力衰竭的研究往往是基于交谘会诱发的压力超负荷小鼠模型。标准程序是执行部分开胸术, 以可视化的横向主动脉弓。然而, 开胸模型切开术引起的手术创伤改变了肋骨解剖后的呼吸生理学, 胸部闭合后左不连接。为了防止这种情况, 我们通过侧开胸手术建立了一种微创, 闭合的胸部方法。在这里, 我们通过 2nd肋间空间接近主动脉弓, 而不进入胸腔, 使小鼠的外伤损伤恢复得更少。我们使用标准的实验室设置进行这项手术, 开放的胸腔交咨程序具有同等存活率。除了维持生理呼吸模式, 由于封闭的胸部方法, 小鼠似乎受益于显示快速恢复, 因为较少侵入技术似乎有助于快速愈合过程和减少免疫应答后的反应。

Introduction

老鼠模型经常被用来模仿人类疾病1。横向主动脉收缩 (TAC) 用于诱发压力超负荷和左心室肥厚2。用洛克曼et 等方法对小鼠开胸交模型进行了验证。3和手术过程由 DeAlmeida et . 详细描述。4. 与腹主动脉收缩相比, 横向主动脉的带状比较有利, 因为循环的较大部分可以补偿后者程序2的负面影响。

横向主动脉的带状导致上升主动脉和头臂大动脉动脉的动脉压力增加, 但通过远端血管(即左颈总动脉, 左锁骨下侧) 留下足够的器官灌注。动脉和降主动脉)。这导致心脏后负荷增加和心脏壁压力增高。由于纤维加厚5, 壁面应力随后减小。心脏血流动力学的慢性变化导致左心室适应不良和扩张。这样, 交咨会创造一个可重现的心肌肥厚模型, 最终导致心力衰竭。

DeAlmeide et . 所述的 TAC 标准程序。4通过部分上开胸手术, 通过肋骨或胸骨的解剖, 进入纵隔以及胸腔, 接近主动脉弓。这样可以很好地看到主弓及其侧支。不幸的是, 解剖肋骨不能重新附加, 使他们自由浮动, 从而改变呼吸动力学。

因此, 我们通过 2nd肋间空间的侧向手术方法, 建立了一种微创的主动脉拱闭合胸法。这个模型最大的优点是能够在没有切割肋骨的情况下执行 TAC。手术创伤仅限于皮肤切口和肋间肌解剖。这一程序减少了创伤本身, 有助于保持足够的胸部稳定。

在这里, 我们描述了一个详细的分步程序, 以执行 TAC 手术在小鼠没有执行总或上开胸。高频多普勒用于确保 TAC 的成功, 如前所述6,7

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Protocol

这项议定书得到了动物实验 LANUV 雷克林豪森 (#84-02.04.2016 A374) 的伦理委员会的批准。一般情况下, 这一程序是对成年老鼠 > 10 周的年龄。然而, 也有可能对年轻的动物进行这种手术。手术工具必须在使用前消毒, 所有步骤都要在无菌条件下进行。

1. 麻醉和插管的诱导

  1. 注射丁丙诺啡0.1 µg/克体重腹腔减轻疼痛。在手术后的三天内, 每8小时重复腹腔注射0.1 毫克/千克丁丙诺啡。
  2. 对于感应, 把鼠标放到一个麻醉感应箱, 它连接到蒸发器设置为3.0 体积% 的异氟醚, 氧气流量为1升/分。
  3. 通过诱导触觉刺激来确保深麻醉。
    注: 如果麻醉感应失败或麻醉不够深, 则增加异氟醚的体积% 高达5%。
  4. 捏紧鼠标的尾部, 以确保反射性缺失。在完全没有反射的情况下, 称鼠标为最佳通风机设置 (见 1.12)。
  5. 将鼠标移动到温度控制的操作表中, 在整个过程中保持体温37摄氏度。
  6. 将鼠标的鼻子放在与麻醉感应箱相连的塑料锥中, 以保持麻醉。
  7. 用尼龙缝合固定小鼠上门牙。用胶带把四肢缠在一起。
  8. 用镊子的尖端对后爪施加压力, 以确保再次有足够的麻醉。在缺乏撤退反射继续以以下步骤。
    注: 如果麻醉感应失败或麻醉不够深, 等待退出反射, 则增加异氟醚的体积%。
  9. 在角膜上放置无菌眼润滑剂, 以防止麻醉下的干燥。
  10. 润滑直肠探头以避免直肠外伤。插入直肠温度探头, 以确保核心温度为37摄氏度。
  11. 根据制造商的指示, 脱毛喉部和上胸脱毛膏。1分钟后擦掉奶油。如有必要, 请重复此步骤直到成功。
    注: 使用棉尖拭子, 以防出血。
  12. 用70% 乙醇清洁脱毛区。然后将聚维酮碘用于局部皮肤消毒3次, 至少3分钟。
  13. 调整呼吸机设置的生理参数。将呼吸速率设置为 150/分钟, 潮汐容积为8-10 µL/克体重 (体重)。
  14. 戴上一双新的无菌手套。将鼠标放在手术显微镜下, 将不育的 fenestrated 悬垂在老鼠身上。
  15. 将下颌下方3毫米的中线切开至 2nd肋。确定颌下腺的中线和结缔组织。然后用角度髋关节钳轻轻地用两个钳在中线上直接划分腺体, 并探讨气管肌。
  16. 用髋关节钳轻轻拉准气管肌肉, 使气管轻柔地准备。
  17. 用镊子拉舌, 使喉部伸直, 以方便插管, 并轻轻插入气管内的插管套管 (外径1.2 毫米)。通过对气管内导管的直接可视化和检查是否正确的胸部运动来确认插管。
  18. 在插管后将异氟醚浓度调整为2% 异氟醚, 流量为1.0 升/分和 100% O2
    注: 如果呼吸运动不停止或老鼠开始移动, 首先增加呼吸率高达 180/分钟。如有必要, 将异氟醚浓度增加到 3.5%, 直到鼠标停止呼吸。评估漏油或不充分填充蒸发器是最常见的问题。
  19. 或者, 按照以下子步骤中的建议执行插管。
    1. 将鼠标放置在一个位于一个角的表上。
    2. 用胶带把老鼠的四肢缠在一起, 把头倾斜。
    3. 将冷光源直接放在喉上方的皮肤上。
    4. 用钳子轻轻地拉舌, 使声带形象化。
    5. 通过声带插入四套管 (24 克) 的塑料管, 并将塑料管连接到通风机设置。
    6. 将呼吸机连接到套管, 通过 synchrone 胸部运动确认插管。
      注: 如果呼吸运动不停止或老鼠开始移动, 首先增加呼吸率高达180每分钟。如有必要, 将异氟醚浓度增加到 3.5%, 直到鼠标停止呼吸。评估漏油或不充分的蒸发器作为最可能的问题。

2. 术前多普勒测量

  1. 用镊子轻轻拉结缔组织, 使颈动脉与气管分开。
  2. 将20兆赫多普勒探针的尖端放置在右侧和左颈动脉的一些无菌超声凝胶上, 其角度小于45°。
  3. 慢慢旋转探头, 将其移动到侧面和内侧以找到多普勒信号, 并倾斜探头以优化信号。
  4. 使用多普勒软件来显示和存储在计算机上的右、左颈总动脉流速。

3. 开胸术

  1. 使用一组不育的手套为每个单独的老鼠, 以防止手术部位感染。
  2. 用剪刀将皮肤切口向下扩展到 2nd肋间空间。
  3. 通过计数肋骨, 然后用髋关节钳直接穿透这个空间, 识别 2nd肋间空间。
    注意: 1st肋位于锁骨下, 因此不可见, 因为在第一个可见肋 ( 2 和肋) 和 3rd肋之间发现2个nd肋间空间。
  4. 在镊子提示的帮助下打开 2nd肋间空间, 然后插入拉钩。
  5. 用附在手术台上的橡皮筋调整拉钩, 以清楚地看到胸腺。
  6. 在出血的情况下使用棉尖, 并按下表面血管2分钟。

4. 横向主动脉的带状

  1. 调整放大倍数为 200%, 以确定中线和结缔组织。然后用角钳轻轻地分割胸腺。清除脂肪组织, 直到主弓可以清楚地看到。
  2. 在头臂大动脉动脉和左颈总动脉之间的横向主动脉下, 准备一条有角栓钳的隧道 (参见图 1)。在精钳的帮助下, 保持6.0 缝合的末端, 并通过主弓下的螺纹。
  3. 从拱的另一侧拿起第二个钳的螺纹。
  4. 切下一个3毫米长的一块27克长度, 使用针作为一个间隔, 用于交结扎的小鼠体重在 19-25 克体重和26克针作为一个间隔为小鼠 > 25 克体重。
  5. 小心地将间隔平行于横向主动脉。
  6. 准备一个松散的双结在间隔, 并确保最佳放置间隔与主动脉平行。然后绑第一个投掷, 并迅速执行第二次相反投掷。立即卸下间隔。
  7. 要执行假鼠控制, 遵循相同的协议, 省略结扎的主动脉。
  8. 用6.0 聚丙烯缝合线关闭 2nd肋间空间。结扎时要特别注意锁骨下血管。
  9. 在连续缝合模式下用6.0 聚丙烯缝合缝合皮肤。

5. 确认成功结扎横主动脉

  1. 将20兆赫多普勒探针放在颈部两侧的45°角上, 如2节。
  2. 记录每一侧的流速。
    注意: 成功的 TAC 可以通过多普勒流速来验证, 如图 2所示。在右侧和左颈动脉之间的流速比为 4-10 通常保证足够的 TAC (参见图 2)。

6. 心脏收获

  1. 根据步骤1.2 诱导麻醉。和1.3。
  2. 将鼠标放置在安乐死室中, 调整二氧化碳流速, 以取代体积/分钟的 10-30%。
  3. 把老鼠盯在手术台上。用剪刀打开腹部, 用套管从下腔静脉中收获血液, 进一步分析。
  4. 用强力剪刀切开隔膜和胸骨骨, 取出心脏。
  5. 在重心脏之前, 取出所有的动脉和结缔组织。
  6. 将右心室和隔膜从左心室分开, 并对两个样本进行权衡。
  7. 在液氮中冷冻两个组织样本。

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Representative Results

成功的交谘会保证压力超负荷和左心室肥厚的诱导。通过多普勒流速测量可以实现对压力过载的特别验证, 如图 2所示。虽然术前血流速度在两个颈动脉中均相等, 但交咨会由于左心室和主动脉升高的压力而导致右颈动脉增加的血流速, 同时导致狭窄后血流速度减弱。左颈动脉。

通过计算 C57BL/6J 雄性小鼠在3、6、21天手术后的心脏重量/体重比值 (硬件/身体重量比), 验证了 TAC 及其产生的肥厚的有效性。与非带状小鼠相比, 在6天的手术后 (4.78 0.18 vs7.66±1.43 毫克/克, p < 0.0001), TAC 鼠的硬件/体重比显著增加。这个比率在21天以后是几乎恒定的 (4.8 0.11 vs7.81 @ 0.65 毫克/g, p < 0.0001) (参见图 3)。生存率主要取决于手术内出血: 通过常规的实践可以将其减少到5% 岁以下。21天后的生存率主要取决于基因型。对于不患有功能性心脏病的小鼠, 存活率达 > 85%。生存率在被提出的 C57BL/6J 老鼠在21天以后共计到88%。

在气管插管麻醉中测量收缩压和心功能, 并用1.4 法国压力电导导管8进行了说明。9心率 (HR) 对左心室收缩率有显著影响。21天后, 主动脉带状和非主动脉带状小鼠 (p = 0.1456) 心率 (HR) 无差异 (参见图 4A)。主动脉的恒定的带 (p = < 0.0001) 被证明由增加的收缩血压在21天以后测量 (参见图 4B)。

正如文献中所讨论的, C57BL/6J 小鼠在交咨后, 通常被称为发育异常肥厚和收缩功能障碍10 。发现左心室直径增加, 在压力体积测量中也有显著意义。端收缩容积从16.25 µL (1.935 µL) 增加到23.31 µL (1.617µL)。此更改很重要 (p = 0.0131) (请参见图 4C)。端舒张容积从25.81 µl (1.852 µl) 增加到31.24 µl (1.093 µl)。此更改很重要 (p = 0.0268) (请参见图 4D)。

对 Bonferroni 的posthoc测试进行了单向方差分析, 以比较 TAC 和假组。在压力容积测量的情况下, 使用与韦尔奇校正的未配对 t 检验进行组比较。所有的数据都被显示为平均的电子扫描电镜 (误差条)。

Figure 1
图 1: 通过2和肋间空间200% 放大的手术方法. 这张照片是用手术显微镜拍摄的, 在头臂大动脉动脉和左颈总动脉之间用一根线显示主动脉弓。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 来自颈动脉的典型脉冲波多普勒成像 (假与 TAC 小鼠)。A)在交咨前左颈动脉的脉冲波多普勒成像。B)在交咨前右颈动脉的脉冲波多普勒成像。C)图像 ofPulsed 多普勒在交咨后左颈动脉。与图2A 相比, 血流速度降低。D)在交谘会后右颈动脉的脉冲波多普勒。与图2B 相比, 血流速度增加。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 心脏重量/体重比.心肌肥厚是由于交谘会所致。这表明, 心脏重量/体重比显著增加。无主动脉束的小鼠 (i. e. 假鼠; 白条) 在3、6、21天后与 TAC 操作小鼠 (黑条) 进行比较。交咨会后6天心脏重量/体重比在 tac 小鼠中显著增加。这种效果只有在21天后才略微发音。意义被设置为 p = < 0.05。ns = 不显著;p < 0.0001。数据显示为均值的 SEM (误差条)。n = 每组 6-9。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 在手术后21天内通过 pressure–volume 导管测量的血流动力学参数 (C57BL/6J): A)心跳/分钟 (bpm)。两组的 HR 均无差异, 表明在侵入性测量过程中可比麻醉。B)右颈总动脉收缩压。21天后的腹膜炎显著增加表明主动脉弓的恒定收缩。C)最终收缩容积 (ESV) 在21天后显著增加 (p = 0.0131), 并显示由于 TAC 诱导心室扩张而增加的后负荷。D) 舒张末期容积 (ESV) 增加 (p = 0. 0268)。意义被设置为 p = < 0.05。ns = 不显著;* p < 0.05;p < 0.0001。数据显示为均值电子扫描电镜 (误差条);n = 每组 8-13。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

交咨会引起高血压的快速发作不同于因主动脉狭窄或高血压而导致的临床相关肥厚。然而, 使用小动物模型诱发心力衰竭有许多优点, 因此, 许多调查员选择了11。这个闭合的胸部模型改进已经现有的手术技术的模型诱导小鼠横向主动脉收缩4

最关键的一步是在主动脉弓下的通道。在主动脉周围缝合太紧可能会导致血液流向肾脏等重要器官的致命减少。根据哈根-泊肃叶定律, 流主要依赖于半径。因此, 在我们的协议中使用了一些重量适应的间隔。这个过程使这个模型更加普遍地适用, 特别是关于非常年轻或老老鼠, 取决于各自的实验设置。

外科外伤本身会诱发免疫应答, 应降至绝对最低限度, 以防止扭曲的效果。快速恢复和高存活率是强制性的, 特别是在复杂的动物模型中。从历史上看, 与人的开胸术不同, 小鼠的肋骨笼在 TAC 手术后不会恢复。因此, 恢复生理呼吸运动是有限的, 因为自由浮动肋骨, 没有重新连接到胸骨。

对于 TAC 的微创技术也被其他人使用12,13。在这两种模型中, 主动脉弓通过中线切口和上部分胸骨到达。虽然这两种模型的侵入性比开放的胸部模型, 外科医生必须删除肋骨或胸骨部分, 以达到主动脉。我们相信保持整个肋骨的生理机能有助于更快的康复。因此, 该协议改进已经存在的协议, 并帮助减少手术创伤本身。

由于更顶端的手术通路, 在手术后的肺部恶性通货膨胀, 以防止肺不张或 pneumothoraces, 如有时被描述为4,14, 是不需要的。这种通路可防止肺部的气压伤, 这可以通过夹着呼气管引起的肺不张在现有的模型中打开。该协议还包括个性化的生理通气策略。这是诱人的推测, 一个单独适应通气有助于减少呼吸机相关的并发症, 如气压伤。采用重量调整通气策略, 以避免通气本身15对系统性细胞因子产生的影响。

总之, 这些技术代表了一种替代性和改进的模型, 诱导心肌肥厚的小鼠。

尽管通过避免开胸术减少了外伤, 但本刊物并没有显示出治疗炎症的优越性。不幸的是 , 动物保护法规定的限制不允许我们与最小的侵入谘会同时进行开放式胸腔交咨 , 以进行比较 , 因为这种微创模式已经建立多年。因此, 这些声明是基于我们集团以前的经验。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢很多 Frede 和 Susanne 舒尔茨的技术援助。这项研究没有得到任何资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pressure-volume catheter Millar Instruments, USA SPR-839
Mouse ventilator Harvard Apparatus GmbH, Germany Minivent - TYPE 845
Mouse ventilator Harvard Apparatus GmbH, Germany Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844
Vaporizer Dräger Medical AG&CO.KG, Germany 19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number  D-877-2010)
Microscope  Leica Microsystems, Germany MZ 7.5
Light source  Schott AG, Germany KL 1500 LCD
6-0 Prolene Ethicon, USA Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c suture for surgery
Seraflex Serag Wiessner, Germany USP 5/0 schwarz;  IC108000  suture for constriction
Homoeothermic Controlled Operating Tables Harvard Apparatus GmbH, Germany Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233
Flexible Rectal Probe Harvard Apparatus GmbH, Germany 1.6 mm OD; 55-7021
Doppler Signal Visualisation Instrument Indus Instruments, USA Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module
Arruga Intracapsular Forceps Altomed, UK A5400
Doppler Probe Indus Instruments, USA 20MHz Tubing-mounted Probe
Jaffe Lid Retractor Altomed, UK A3513

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References

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