급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

Medicine

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Summary

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

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Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

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Abstract

현대 소 단위 백신의 평가의 중화 항 체 생성은 중요 하지만 보조 선택에 대 한 충분 한 보여준다. 따라서, 세포 독성 T 세포 (CTL) 응답을 홍보할 수 있는 체액과 세포 면역 물질로 기능 adjuvants 절실히 필요 합니다. 따라서, 크로스 못쓰게 유도 하 고 이후 CTL 세대 강화 보조 후보자의 충실 한 모니터링 백신 개발에 중요 한 단계를 나타냅니다. 여기에 우리는 SIINFEKL 전용을 사용 하는 방법에 대 한 응용 프로그램을 제시 (OT-나)는 크로스-프레 젠 테이 션 모델 항 ovalbumin (OVA)는 비보에 다른 보조 후보자의 존재를 모니터링 하는 T 세포. 이 메서드는 adjuvants 최고의 크로스 못쓰게 기능을 선택 하는 빠른 테스트를 나타냅니다. CD8 확산+ T 세포 간 못쓰게의 가장 중요 한 표시 이며 그것은 또한 보조 유도 크로스-프레 젠 테이 션의 상관으로 간주 된다. 이 기능은 림프절과 비장 같은 다른 면역 기관에 평가할 수 있습니다. CTL의 정도 모니터링할 수 있습니다, 따라서 로컬의 특성에 통찰력을 주는 (주로 림프절 배수) 또는 조직의 반응 (먼 파선 또는 비장). 이 기술은 더 또한 종래와 유전자 변형 쥐의 다른 긴장에 사용 될 가능성을 제공 하 고 특정 크로스-프레 젠 테이 션 경로 억제할 수 있는 약물 테스트에 대 한 여러 수정 수 있습니다. 요약 하자면, 우리는 여기에 제시 하는 응용 프로그램 개발 하거나 백신 연구와 개발에 대 한 화학 adjuvants 수정 업계 또는 학계에서 백신 연구소에 대 한 유용할 것 이다.

Introduction

세포 독성 T 세포 (CTL) 유도 하는 백신은 주요 치료 개입 싸움 암1의 특정 유형을 위해 개발 되었습니다. CTL은 또한 세포내 병원 체2에 대 한 예방 백신에 대 한 중요 합니다. 또한, CTL 누구 또한 초기 생활 감염5에 대처 하기 위해 CTL에 따라 신생아3,4 등 위험 인구에 기능적으로 활성 몇 면역 방어 메커니즘 중 하나입니다. 이와 관련, 백신 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 CTL 응답 (졸업생)을 유도 하지 않는 한 보조 제와 함께 개발 된 유아6에 감염 시 심각한 합병증에 지도 하는 백신의 완전 한 실패 귀착되는. 예방 접종의 이러한 부정적인 효과 CD8에 의해 반전 될 수 있다+ T 세포 응답7. 우리는 이전 인터페론 유전자 (스 팅) 주 작동 근의 어떤 자극에 의해 elicited (유형 I interferons) 주요 cytokines의 확산을 측정 하 여 일부 이러한 adjuvants8에 의해 생성 된 CTL 응답 필수적입니다 증명 하고있다 오티-예방 접종 및 기능을 유도 하는 CTL의 관찰에서 이러한 결과 사용 하 여 확장 예방 접종 일정9후 나 T 세포. OT의 확산의 측정-난 CD8+ T 세포는 야생 타입 (WT) C57BL/6 받는 사람 마우스 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 염료 희석은 생성 하는 백신의 보조 능력의 강력한 추정 크로스-SIINFEKL, (ovalbumin, OVA의 면역 지배 펩타이드)의 프라이 밍 이 기술은 OT의 확산의 평가 위해 널리 이용 된다-내가 CD8+ 및 OT II CD4+ T 세포. 예를 들어 그것은 WT 동물에서 항 원 리콜 후 백신 효능을 측정 하거나 선택한 cytokines (코 쥐)의 부재에 사용 되었습니다. CFSE 스테인드 OT의 수동 전송 후 짧은 프로토콜 (실험 4 일)는 고안-난 CD8+ T 세포, 50의 1 개의 복용량의 구성 된 피하 (사우스 캐롤라이나) 면역 테스트 adjuvants 보충도 없는 OVA의 µ g 관리 (그림 1)입니다. 예방 접종 후 48 h 결과의 후속 CTL 응답을 생성 하는 보조의 용량의 신뢰할 수 있는 증거를 제공 한다. 이 전략에 의해 비장 (또는 먼 림프절) CTL 활동을 측정 하 여 응답의 범위 뿐만 아니라 예방 접종 후 배출 림프 노드의 로컬 면역 반응의 힘을 평가 가능 하다.

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Protocol

이 연구에 사용 된 모든 마우스 C57BL/6 배경에서 했다. 모든 동물 병원 체 자유로운 조건에서 유지 했다. 모든 실험은 (TierSchG BGBl 독일 동물 보호 법률의 규범에 따르면 수행 했다. 내가 S 1105; 25.05.1998) 허가 번호 33.4-42502-04-13/1281 및 162280에서 색 소니의 낮은 위원회 동물 실험의 윤리 및 국가 사무실 (낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전)에 의해 승인 했다.

1. CFSE OT의 얼룩-나 T 세포와 입양 전송

참고: OT-난 마우스 transgenically 생성된 동물 고정된 α와 β 사슬 함께 OVA의 면역 지배 펩 티 드를 인식 하는 T 세포 수용 체 (TCR)를 표현 하는 SIINFEKL10,11. 결과적으로, 이러한 마우스 수가 상당히 높은 SIINFEKL 전용 CD8+ T 세포 (97%)12 13정상 또는 OVA-예방 접종을 마우스 (≤ 1%) 비해.

  1. 추적 CD8의 절연 OT에서+ T 세포-나 쥐 T 림프 구 특정은 Thy1는 (Thy1.1) 대립 유전자 표현:
    1. 6-9 주 된 OT를 안락사-나 CO2 흡입에 의해 쥐 뒤에 자 궁 경부 전위14. 피부 외과 플라이어 집게의 도움으로 몸에서 피부를 분리 수술가 위로 절단 하 여 비장 및 주요 림프절 (사 타 구니, 겨드랑이, 자 궁 경부 쌍만) 해 부 고에 넣어 접시 (60 x 15 m m) 각각 포함 하는 100 µ m 기 공 메쉬 컵 조직 연 삭 및 셀 릴리스에 대 한.
    2. 얼음에 있는 완전 한 RPMI 매체 (RPMI 1640, 10 %v / v, FCS 100 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스)의 3-5 ml 접시 (각각 하나의 메쉬 컵)를 유지 합니다.
    3. 주사기 나 비슷한 무 균 악기의 도움으로 장기 매 시 (사전 절단 불필요) 15 mL 원심 분리기 튜브에 결과 단일 세포 현 탁 액을 수집.
    4. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 원심 분리에 의해 차가운 PBS의 10 mL에 세포를 세척 하 고 다시 염화 암모늄 버퍼 (ACK 버퍼, 상용)의 1 mL/비장에 펠 릿을 일시 중단 하 여 비장에서 적혈구를 lyse. 얼음에 1.5 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 이후 원심 분리 (으로 이전)에 의해 차가운 PBS의 10 mL로 세포를 씻어.
    5. 다시 1 ml의 PBS (pH 7.2) 포함 5% 태아 둔감 한 혈 청 자석 절연에 대 한 같은 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  2. 마그네틱 격리를 수행 하려면 CD8의 부정적인 선택을 진행+ T 제조업체 지침에 따라 자기 절연 키트를 사용 하 여 셀 또는 프로토콜15게시.
  3. CFSE 얼룩을 수행 하려면 먼저 CD8 수 계산+ T 세포 OT에서 얻은-난 자동된 셀 카운터 (입자 카운터)를 사용 하 여 마우스. 1-5 107 셀/mL 15 ml 송 골 매 관에 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 7 분 5 µ M PBS에 CFSE와 1-5 mL의 볼륨에 배 얼룩.
  4. CFSE는 세포를 소 태아 혈 청의 같은 볼륨 (1:1)를 추가 하 여 얼룩을 냉각 하 고 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 추가적인 7 분에 대 한 그들을 품 어. PBS의 10 mL와 함께 셀을 두 번 세척.
  5. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 3-5 100 µ L에 106 셀/마우스 배를 정 맥 주사 3-5 107 셀/mL PBS의 배을 셀 수 설정 (i.v.) 꼬리 정 맥을 통해.
  6. 꼬리 정 맥 주사를 수행 하려면 적절 한 restrainers에 마우스를 고정. 다시 영역 및 쥐 꼬리 정 맥 혈관 확장을 허용 하도록 1-3 분 거리 20 ~ 25 cm 사이 붉은 빛 램프를 사용 하 여 주입에 쥐의 꼬리를 따뜻한.
    참고:이 쉽게 정 맥 검색 및 세포 현 탁 액의 관리에 도움이 됩니다.
  7. (손으로 쥐와 램프 사이 배치) 확인 그것 너무 쥐에 대 한 뜨거운 고 꼬리 정 맥 명확 하 게 표시 될 때, 주입은. 셀 25 게이지 바늘161 mL 주사기를 사용 하 여 측면 또는 지 느 러 미 꼬리 정 맥에 주사.

2. 예방접종 (보조 + OVA도 무료)

  1. OT와 이식 생쥐를 배치-마 취 챔버 (1.7, 그림 1단계) 세포와 산소에서 isoflurane 마 취 기계14에 의해 관리.
  2. 마우스 마 취에서 완전히 잠들 때, 약 실에서 그것을 꺼내와 gluteus superficialis (측면 허리)를 통해 깨끗 한 주사를 수행 하기 위해 전기 머리 트리밍 기계를 사용 하 여 영역에 마우스의 모피를 면도 와 응용 분야의 좋은 보기.
  3. 백신, 25 게이지 바늘을 사용 하 여 면도 영역에 사우스 캐롤라이나의 50 µ L을 주입.

3. 림프 톨 및 흐름 Cytometry 분석에 대 한 얼룩의 격리

  1. 림프 톨 및 splenocytes의 격리
    1. 뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 예방 접종된 마우스를 안락사.
    2. 배출 및 먼 림프절과 비장 추출 하 고 조직 연 삭 및 셀 출시 100 µ m 기 공 메쉬 컵 포함 된 별도 접시에 그들을 배치. 1.1.3 통해 1.1.2 단계.
    3. 원심 분리 후에 상쾌한 가만히 따르다와 다시 셀 펠 릿 잔해 PBS의 동일한 볼륨에 (약 100 µ L) 일시 중단.
  2. 교류 cytometry 분석에 대 한 얼룩
    1. 15 mL 원심 분리기 튜브에 표 1에 표시 된 농도에서 착 항 체를 포함 하는 마스터 믹스를 준비, 얼룩 믹스 집중 따라서 2 x 열매를 산출. 샘플 당 100 µ L를 마스터 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 셀 및 마스터 혼합 1:1 혼합 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
      참고: 샘플 당 최종 착 볼륨 200 µ L (항 체 마스터 믹스의 셀 릿 + 100 µ L의 100 µ L) 이어야 한다.
    2. 1.1.3, PBS의 10 mL를 두 번 추가에 설명 된 대로 셀 원심 분리에 의해 두 번 세척.
    3. 다시 0.5-1에 얼룩진된 셀 중단 수집 및 전송 중단 교류 cytometer 튜브에 대 한 PBS의 mL. 항상 얼음 샘플을 유지 하 고 빛 으로부터 보호.

4. Cytometry

  1. 항상 사전에 70-100 µ m 필터를 사용 하 여 셀 샘플 필터.
  2. 표 1 (구슬 또는 셀)에 대 한 자세한 fluorophores에 대 한 하나의 얼룩 보상 컨트롤을 준비 합니다.
    참고: 보상 한다 cytometer 또는 분석 소프트웨어17,,1819 에서 수행 되며 모든 샘플에 적용.
  3. 그림2 제어 전략을 따릅니다. 앞으로 피해 지역 (그림 2A), 그리고 다시 사이드 분산형 및 측면 분산형 영역 (특수, 그림 2B) 남자를 제외 하려면 넓은 대 앞으로 살포 높이에 짧게, 게이트 인구.
  4. 문 사실 CFSE 차별을 위해 BV 650 (자동-형광) FITC (CFSE) 대를 그려서 그림 2B 에서 인구 스테인드 높은 자동 형광 세포에서 세포. 구슬 또는 보상 컨트롤로 BV 650에 활용 된 항 체로 얼룩진 셀을 포함 합니다. 이 그림 (그림 2C) FITC 대 BV 650의 OT 게이트 하는 데 사용 됩니다-난 CFSE 셀 스테인드.
  5. 받는 사람 마우스 대 기증자에서 파생 된 세포를 구별 하기 위해 APC (CD8) 대 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-)에 대 한 그림 2 C 에서 인구를 게이트.
    참고: 셀 OT에서 파생 된-난 기증자 마우스는 Thy1.1+ (CD90.1), 반면 WT (C57BL/6, 받는 사람) 마우스 파생 셀 Thy1.2+ (CD90.2) (그림 2D). 일부 연구소는 OT-난 Thy1.2 배경과 WT (C57BL/6)는 Thy1.1에 있는 쥐. 오티에 대 한 Thy1.2에 대 한 항 체를 사용 해야 하는 경우에-게이팅 셀.
  6. 다시 CD8 게이트+ BV 450 (CD4)를 구성 하는 게이트에 APC (CD8) 대 그것을 그려서 Thy1.1+ 인구에서 세포 (그림 2E).
  7. 인구는 CD8의 막대 그래프 디스플레이 사용 하 여 그림 2E 에 문이 표시+ (FITC, 530/15 채널-블루 레이저-), CFSE를 보여주는 셀 게이트 증식된 인구 10에서 농도 포함 하 여 수준2 곳 전적인된 제어 (농도 10 ~5, CFSE 얼룩이 지 고 교류 cytometer에서 전압 설정의 효능에 따라)는 (그림 2F).
  8. 죽은 세포 확산 평가를 병행 평가 추가 게이트 (그림 2에에서는 표시 되지 않음) 플로팅 FITC 대 L/D 마커 (450/20 채널, UV 레이저)를 확인 합니다.
  9. 취득 보상 컨트롤에 대 한 적어도 5000 이벤트 및 교류 cytometer에서 샘플에서 10.000 이벤트 (게이트 E, 그림 2). 낮은 또는 중간 흐름에는 cytometer 실행 (20.000 이벤트/s의 유량을 초과 하지 않는).

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Representative Results

Adjuvants (ADJ1 및 ADJ2)의 다른 조합을 사용 하 여 치료를 테스트 하려면 우리 adoptively 전송된 OT의 확산을 측정 하 여 CTL 세대 용량 평가-내가 CD8 cytometry (그림 2)에 의해+ T 세포. 이 위해, 우리는 이전 배출 림프절과 비장 (표 1)에서 격리 된 셀 스테인드. CD8의 확산을 측정 하 여 림프절과 비장,+ T 세포는 CTL 세대 고용량 ADJ2의 배수 림프절 (그림 3)에 비교 될 때 ADJ1, OVA 혼자 또는 PBS 컨트롤 확증 수 있었습니다. 반면, 우리는 관찰 ADJ2 조직 (비장)에 CTL 응답을 생성 하지 못했습니다, 반면 ADJ1 비장 CD8에 의해 확산의 표시 높은 수준의+ T 세포, 하지만 하지만 또한 우수한 컨트롤 (PBS 및 OVA)에 비해 ADJ1 하. 이 급속 한 비보에 확산 분석 결과 사용 하 여 ADJ2의 행동을 해 부하 여 우리 로컬 하지만 조직의 CTL 생성기의 강력한 조치를 확인할 수 있습니다. 또한, ADJ1 역할을 모두 주입 (배수 림프 노드)의 로컬 사이트에서 뿐만 아니라 체계적으로 증가 OT와-나 비장에 확산. 얻은 결과 보조의 활동 및 그 정도, ADJ2 (로컬) 및 ADJ1 (조직)의 관찰 된 효과 의해 exemplified 하 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 분석 결과 일정. 분석 결과 일정 초기 OT를 나타냅니다-T 셀 전송 하루 하루 1, 0, 사우스 캐롤라이나 예방 접종 및 샘플링 비장 및 배출 림프절 2 일 후에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 제어 전략의 흐름도 측정 CD8의 확산을 따라+ T 세포 (OT-난 Thy1.1+) cytometry 여. 두 샘플 더 나은 시각화에 대 한 다양 한 색상 (빨간색과 밝은 파란색)에 표시 됩니다. A-b. 단일 세포는 앞으로-분산형-높이 앞으로 피해 지역 대와 측면-분산형 폭 사이드-분산형-지역 대를 그려서 처음 두 게이츠에 잇따라 남자에서 차별. C.b에서 문이 BV 650 채널 (자동 형광)의 그들의 CFSE 강도 (희미하게 나타냅니다 세포 분열/증식) 530/30 YG 채널에서에 대 한 플롯의 형광 강도 의해 표시 됩니다. 이 게이트 차별 하 여 진정한 CFSE 긍정적인 셀 선택을 허용 그 높은 자동 형광. D. CFSE 긍정적인 세포 Pe Cy7의 그들의 높은 형광 강도 문이 했다 (Thy1.1, 오티에 대 한 마커-난 세포) 그들의 APC 강도 (CD8) 대. E. BV 450 (CD4) APC (CD8)에 대 한 플롯에 대 한 이전 문이 정확 하 게 선택 CD8 Thy1.1 긍정적인 셀+ T 세포. F. 이전 문이 CD8+ 세포 증식된 인구를 마지막으로 게이트를 CFSE 강도 대 한 히스토그램에 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 보조 CTL 세대 구동. 로컬 또는 조직의 CTL 응답을 유도 하는 항 원 및 PBS 컨트롤에 따라 2 가지 보조 치료 (ADJ1 및 ADJ2)에 대 한 묘사 된다. Adoptively 전송된 OT의 확산-내가 T 세포 검사 (사 타 구니, exemplified 피하 (사우스 캐롤라이나) 관리에 대 한) 배출 림프 노드 및 비장을 그림 행에 표시 된 대로. 세포 증식 로컬 (배수 림프 노드) 또는 행동의 조직 (비장) 범위에 면역 반응의 정도 정확 하 게 비교 하기 위해서는 모든 관련 치료 (열) 단위로 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

염료-항 체 클론 Fluorophore/채널 필터 농도 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1:750
CD8 53-6.7 APC-670/14 R 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC-530/30 YG (CFSE 얼룩 프로토콜에 따라)
DCM (죽은 셀 표식) - -/ U.V.-450/50 UV 1: 500

표 1: cytometry에 대 한 항 체 stainings. Fluorophore 활용 된 항 체 클론 사용 하 고 농도 (2 배)을 얼룩이 지는 것이 좋습니다.

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Discussion

현대 백신은 이상적으로 composedof 정화 항 리, 바이러스 같은 입자, 나노 입자 또는 라이브 벡터 처럼 전달 시스템의 가능한 추가 adjuvants. 백신을 디자인할 때 중요 한 부분은 임상 필요에 따라 올바른 보조 제를 선택 하는. 범위에 속하는 체액 세포 면역 응답 (또는 둘 다) 대, 조직의 면역 반응 (또는 둘 다), 대 로컬의 선거 및 백신 대상 모집단에 생성 해야 하는 메모리의 종류를 선호 포함할 수 있었다. 보조 평가의 1 개의 중요 한 양상은 빠르게 CTL을 생성 하는 용량을 결정 하는. 우리 여기에 급속 하 게 OT를 측정 하 여는 CTL 응답에서 vivo에서 마우스 모델에서의 기능을 결정을 이미 알려진된 기술에 기반 하는 방법 제시-난 CD8 T 세포 확산. 이 방법은 수 adjuvants 여 elicited 면역 반응의 힘의 예측에 대 한 (OT의 확산-내가 T 셀)만 4 작업 일에. 이 방법은 더 이상 adjuvants 면역 반응 (전신 대 로컬) 측면에서 행동 및 그것의 효과적인 조치의 비교 용이. 여기, 우리가 어떻게 다른 보조 치료 (ADJ1 대 ADJ2) 면역 면역 반응에 영향을 미칠 것에 예를 보여주 있다. ADJ2의 작업은 동일한 복용량 ADJ1의 행동은 더 광범위 하 게, 응답을 생성 CTL 모두 로컬 및 조직 수준 하지만 반면 어디 배출 림프절에서 면역 반응을 활성화 하는 관리의 로컬 영역으로 제한 함께 배출 림프절에 ADJ2 보다 더 적은 힘.

보조의 CTL 용량의 성공적인 평가 위한 중요 한 단계는 젊은 오티의 선택-난 (CD8 T 세포의 소스로) 동물 및 예방 접종에 대 한 OVA도 무료 사용. OT 이후-난 마우스는 OVA 펩 티 드 SIINFEKL에는 MHC 인식 CD8 T 세포를 생산 하기 위해 생성 하는 유전자 변형 동물-나 맥락, 마우스 TCR의의 인공 선택 증가 하이퍼 증식 CD8의 모습+ T 세포 나이로20 . 겨드랑이 림프절의 염증은 이렇게 세 OT의 일반적인 기능-난 쥐. 계정에 이것을 복용, 그것은 젊은 오티를 사용 하 여 권장-난 동물 가능 하면 (6-9 주-오래 된 동물)에서 세포를 분리 하지 않으려면 확대 장기 (림프절의 비장 중 하나). CD8 T 세포 확산 확대 장기의 사용 때문에 가장 가능성이 차이 확산 컨트롤 및 치료는 얻을 수 없는 것 이다 전체 분석 결과 영향을 줍니다. 보조 CTL 세대 용량의 차별에 대 한 비슷한 함정이 없는 OVA21,22 (참조에 비해 더 강력한 면역 반응을 유도 수 있습니다.도의 OVA 단백질을 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 재료 및 시 약), 독 때문에 강한 면역-변조기 se 당 23. 따라서, OVA 단백질 면역에 대 한 사용도 무료 되어야 합니다. 도 없는 OVA의 20 또는 50 µ g 사용 하 여 접종 경로 되 50 µ g 피하 adjuvants의 테스트에 대 한 적절 한 복용량에 따라 달라 집니다. 또한, CFSE의 높은 농도 사용 하 여 스테인드 셀24 를 죽 일 문학에서 보고 되었다 고 분석 결과의 실패에 있는 결과 또한 할 수 있었다.

일부 수정 또는 프로토콜에 사용 되는 다른 기법 개선 실험의 재현성을 증가 하는 동물의 스트레스를 줄이기 위해 구현 되었습니다. 예를 들어 그냥 다시와 쥐와 하지 전체 동물의 꼬리를가 열 하 여 동물의 난방을 최소화 하거나 피하 주사를 피하기 위해 관련 스트레스 여 예방 접종 하기 전에 동물을 마비. 마 취 피하 주입에 대 한 하지만 우리의 경험, 동물 복지 규정에 의해 필요 하지 않습니다 그것은 스트레스 반응에 의해 소개 하는 변화를 감소 하 여 재현성을 향상 시킵니다.

이 방법의 큰 한계는 이후 CFSE는 세포의 막 얼룩, 높은 밝기 보통 손상는 cytosol에서 신호 검 이다. 따라서, CTL 용량 확인이 필요한 경우 IFN-γ의 분 비 평가 되어야 한다 특정 분 비 분석 결과 25, 그리고 세포내 cytokine 얼룩.

4 일만에 adjuvants에 의해 CTL 세대 용량을 추정 하는 확산의 측정의 사용의 장점이 짧은 시간 필요 보다 전통적인 CTL26 분석 실험 그리고 그것은 좋은 예비 실험 경우에서 어디에 추가 다른 방법으로 확인이 필요 합니다.

비록 항 원로 OVA로 제한 따라서 OT의 사용에-내가 T 세포, 제시 하는 방법 여기 증식된 셀의 정렬 후 다른 adjuvants에 의해 유도 된 활성화의 속성의 연구를 수 있습니다. 가능한 응용 프로그램 중 하나는 다른 adjuvants 증식된 오티에 의해 유도 된 변화 서명의 연구-나 T 세포와 메모리27의 발달을 가진 그것의 관계. 추가적인 보조 검사 자극된 세포 cytokines 또는 cytometry에 의해 degranulation 마커 또는 vivo에서 CTL 테스트8, 를 수행 하 여 그들의 세포 독성 용량 식 등의 생물 학적 속성 평가 수 있습니다. 26 , 28. 때문에이 응용 프로그램에 마우스 사용의 제한, 인 간에 게 extrapolations humanized 쥐29,,3031에 따라 착취 검 진에 의해 수행할 수 있습니다.

이 방법은 우리가 여기에 제시는 세포질 응답 활성의 선택에 대 한 첫 번째 검사로 사용 될 만큼 강력 하 고 또한 유연 수정 하거나 증식된 T 세포의 추가 분석을 결합입니다. 요약 하자면, 보조 CTL 세대 용량의이 급속 한 vivo에서 평가 그들의 보조 후보 분자의 행동의 모드의 빠른 특성에 관심이 있는 학계와 업계에서 백신 연구소에 대 한 이상적인 도구입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 우리의 기술 도우미에 게 빚을: 미국 형제와 H. Shkarlet, 실험 절차 동안 우리를 도운. 이 작품은 EU 보조금 (UniVax, 계약 번호 601738, 및 TRANSVAC2, 계약 번호 730964), 및 헬름홀츠 협회 부여 (하이-IDR)에 의해 부분적으로 투자 되었다. 자금 출처 조사에 영향을 주지 않았다 디자인, 원고 또는 게시를 위해 제출 하는 결정의 세대.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

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