急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

Medicine

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Summary

標準的な免疫学的技術のアプリケーションをご紹介 (CFSE 染色 OT-私増殖) 急速に補助を介した細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の生成をモニターするつもり体内。CTL 容量の高速推定、がん治療用ワクチンと同様に、細胞内の病原体に対する予防ワクチンの開発に役立つ。

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Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

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Abstract

モダンなサブユニット ワクチンの評価では、中和抗体の生成は重要ですがアジュバントの選択は不十分であることを明らかにします。したがって、細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の反応を促進することができる体液性および細胞免疫促進機能を備えたアジュバントが急務します。したがって、忠実な監視クロスプライミングを誘導し、その CTL 世代を強化補助候補者のワクチンの開発の重要なステップを表します。ここで提案する SIINFEKL 固有を使用するメソッドのアプリケーション (OT-私) T 細胞モデル抗原卵白アルブミン (OVA) は、生体内で異なる補助候補の存在下でのクロス プレゼンテーションを監視します。このメソッドは、最高のクロス プライミング機能を備えたアジュバントを選択する急速なテストを表します。CD8 の増殖+ T 細胞クロスプライミングの最も貴重な徴候、また、アジュバント クロス プレゼンテーションの相互関係として考えています。この機能は、リンパ節や脾臓のようなさまざまな免疫器官で評価できます。CTL 世代の範囲も監視できます、それによりローカルの性質に洞察を与えて (主にリンパ節をドレイン) または全身性反応 (遠くのリンパ節や脾臓)。さらにこの手法も従来型と遺伝子組み換えマウスの系統に使用される可能性を提供していますクロス プレゼンテーションの特定の経路を阻害することができます薬をテストするための複数の変更をことができます。要約すると、ここで紹介するアプリケーションは業界や学界でワクチンの研究所で、開発または化学のアジュバント ワクチンの研究と開発のための変更のため役に立つでしょう。

Introduction

細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) を誘導するワクチンは、がん1の特定の種類を戦うために開発されているキーの治療です。CTL はまた細胞内病原体2に対する予防ワクチンのため重要です。また、CTL は、初期の生活の感染症5と戦うための CTL はまた決まる人新生児3,4などリスク集団の機能的アクティブないくつかの免疫防御機構の 1 つです。この点では、CTL 応答 (ミョウバン) は発生しませんするアジュバント開発された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) に対するワクチンは乳児6感染症時に重篤な合併症につながるワクチンの完全な失敗に終わった。予防接種のこれらの負の影響は CD8 によって反転できます+ T 細胞応答7。我々 は以前、インターフェロン遺伝子 (スティング) 作動薬のいくつかの刺激によって誘発される (タイプ I のインターフェロン) 主なサイトカインの増殖を測定することによって部分的にこれらのアジェバントの8、によって生成された CTL 応答のため不可欠であることを示しています。OT-T 細胞ワクチン接種と CTL 誘導機能の測定で観測されたこれらの結果を使用して拡張予防接種スケジュール9後。OT の拡散の測定-私は CD8+ T 細胞の野生型 (WT) C57BL/6 受信者マウス carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) 色素希釈が生成するワクチンのアジュバントの機能の推定SIINFEKL (OVA 卵白アルブミンの免疫支配的なペプチド) のクロス プライミング。この手法のバリエーションが広く OT の増殖の評価-私は CD8+と OT II CD4+ T 細胞。たとえば、それはいない選択したサイトカイン (KO マウス)、あるいは WT 動物抗原リコール後ワクチンの有効性を測定するために使用されています。CFSE 染色 OT の受身伝達後、短いプロトコル (4 日間実験) を考案-私は CD8+ T 細胞、50 の 1 つの線量から成る皮下皮下接種試験アジュバントを添加したエンドトキシン OVA の μ g を投与(図 1)。フォロー アップの結果ワクチン接種後 48 時間は、CTL 応答を生成するアジュバントの能力の信頼性の高い証拠を提供します。この戦略によって脾臓 (または遠隔リンパ節) に CTL 活性を測定することによって応答の範囲と同様、予防接種後排出リンパ節における局所免疫応答の効力を評価することが可能です。

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Protocol

本研究で使用されるすべてのマウスは、C57BL/6 背景からあった。すべての動物は、病原体フリーの条件の下で保たれました。(TierSchG BGBl ドイツの動物保護法の規範に従ってすべての実験が行われました。私 S 1105;25.05.1998) 許可番号 33.4-42502-04-13/1281 と 162280 の下で動物実験の倫理および州のオフィス (低いザクセン州事務所の消費者保護、食の安全) 低いザクセン州委員会によって承認されました。

1. CFSE 染色 OT-私は T 細胞と養子の転送

注: OT-私マウス固定 α と β 鎖一緒に OVA の免疫支配的なペプチドを認識する T 細胞受容体 (TCR) を表す transgenically 生成された動物は、SIINFEKL10,11。その結果、これらのマウスはかなり高い SIINFEKL 固有 CD8 数を持っている+ T 細胞 (97%)12通常または OVA 接種マウス (≤ 1%)13と比較した場合。

  1. トレーサブルな CD8 の分離 OT から+ T 細胞-私 T リンパ球特定Thy1 (Thy1.1) の対立遺伝子を発現するマウス。
    1. 6-9 週齢の OT を安楽死させる-私 CO2吸入によるマウスに続いて頚部転位14。手術ペンチや鉗子の助けを借りて体から皮膚を切り離す手術のハサミで皮膚を切断することによって脾臓および主要なリンパ節 (鼠径部、腋窩、頸部ペアのみ) を分析し、各を含むペトリ皿 (60 x 15 mm) に配置、100 μ m 孔メッシュ カップ組織研削やセル リリース。
    2. 3-5 mL の完全 RPMI 培 (RPMI 1640 年 10 %v/v FCS、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 50 μ G/ml) 氷で保たれるペトリ皿 (それぞれ 1 つのメッシュ カップ) で維持されます。
    3. シリンジのプランジャーまたは同様の滅菌器の助けを借りて、臓器をマッシュ (前の切断は必要ありません) 15 mL 遠沈管の結果単一細胞懸濁液を収集し、。
    4. 4 ° C で 10 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。遠心分離で 10 mL の冷 PBS のセルを洗浄し、塩化アンモニウムのバッファー (ACK バッファー、市販) の 1 mL/脾臓にペレットを再懸濁による脾臓から赤血球を溶解させます。氷の上 1.5 分細胞をインキュベートし、その後 (前に、と) は遠心分離によって 10 ml の冷 PBS のセルを洗ってください。
    5. 再 1 ml の PBS (pH 7.2) 含む 5% ウシ胎児血清磁気分離のための同じ管でペレットを中断します。
  2. 磁気分離を実行する CD8 の負の淘汰に進みます+ T の製造元の指示に従って磁気分離キットを使用してセルまたはプロトコル15を公開します。
  3. CFSE 染色するには、まずカウント CD8 の数+ T OT から得られた細胞-私自動化された細胞カウンター (パーティクル カウンター) を使用してマウス。1-5 107セル/mL 37 ° C、15 ml の隼の管の光から保護で 7 分の 5 μ m CFSE PBS で 1-5 mL の量 x を染色します。
  4. 牛胎児血清の同じボリューム (1:1) をセルに追加することによって CFSE 染色を癒やす、光から保護されている 37 ° C でさらに 7 分間インキュベートするそれら。10 ml の PBS のセルを 2 回洗います。
  5. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。3-5 x の 100 μ L の 10 の6セル/マウスを静脈内に注入するために 3-5 x 107セル/mL の PBS のセル番号を設定 (静注) 尾静脈を介して。
  6. 尾静脈注射を実行するには、適切な restrainers でマウスを固定します。背部区域と尾静脈血管拡張を許可する 1 〜 3 分のマウスから 20 〜 25 cm の間置かれた赤い光ランプを使用して注入するマウスの尾を温めます。
    注: これは簡単静脈検出と細胞懸濁液の管理に役立ちます。
  7. (マウスとランプの間に置かれた手) でもマウスのホットし、尾静脈がはっきりと見える、インジェクションに進むではないです。25 ゲージ針161 mL 注射器を使用して水平または背の尾静脈にセルを挿入します。

2. 予防接種 (補助 + 遠藤無料 OVA)

  1. OT を移植されたマウスを置く-私は麻酔室で (ステップ 1.7、図 1) を細胞し、酸素のイソフルラン麻酔マシン14管理します。
  2. マウスを麻酔下で完全に眠っているとき、チャンバーから取り出すし、臀筋浅(外側腰部) にきれいな注入を行うために電気髪のナイフを使用して領域のマウスの毛皮を剃るアプリケーション領域の景色の良い。
  3. ワクチン、25 ゲージ針を使用して剃毛エリアでサウスカロライナの 50 μ L を注入します。

3 フローサイトメトリー解析のための汚損およびリンパ球の分離

  1. 脾細胞およびリンパ球の分離
    1. 頚部転位続いて CO2吸入ワクチン接種マウスを安楽死させます。
    2. 排水、遠くのリンパ節や脾臓を抽出し、100 μ m 孔メッシュ カップ組織研削と細胞のリリースを含む別のペトリ皿に配置します。1.1.2 1.1.3 からの手順に従います。
    3. 遠心分離後、上清をデカントし、再残骸 PBS の同じボリューム (約 100 μ L) の細胞ペレットを中断します。
  2. フローサイトメトリー解析のため染色
    1. 15 mL 遠心管中の表 1に示されている濃度で染色抗体を含むマスター ミックスを調製、染色ミックスを集中してこのように 2 倍を降伏します。サンプルあたり 100 μ L を持っているマスター ミックスの十分な量を準備します。セルと 1:1 のマスターの組合せをミックスし、4 の ° c で 30 分間インキュベートします。
      注: サンプルあたり最終染色巻 200 μ L (抗体のマスターの組合せの細胞ペレット 100 μ L の 100 μ L) をする必要があります。
    2. 1.1.3、10 mL の PBS を 2 回追加するで説明するよう 2 回遠心分離によって細胞を洗ってください。
    3. 0.5 - 1 染色細胞を再停止集録および流れの cytometer チューブへの転送停止用 mL の PBS。常に氷の上のサンプルを維持し、光から保護されています。

4. フローサイトメトリー

  1. 常に 70-100 μ m のフィルターを使用してセルのサンプルがプレフィルターです。
  2. 表 1 (ビーズまたは細胞) に詳細な fluorophores の単一の染色補正コントロールを準備します。
    注: 補償する必要がありますの cytometer または分析ソフトウェア17,18,19で実行し、すべてのサンプルに適用されます。
  3. 図 2にゲートの戦略に従います。前方散乱領域 (図 2 a)、もう一度広い側の散布面積 (SSA は、図 2 b) ダブレットを除外するために対側方散乱と前方散乱の高さで簡単にゲート集団。
  4. 門真 CFSE を差別するために BV 650 (自動蛍光) FITC (CFSE) 対をプロットすることによって図 2 bから人口は高自動蛍光細胞から細胞を染色しました。ビーズや補正コントロールに BV 650 に共役抗体で染色のセルが含まれます。OT を門に FITC 対 BV 650 のこのプロット (図 2) を使用-私 CFSE は細胞を染色します。
  5. 受信者マウス対ドナー由来細胞を区別するために Pe Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) を APC (CD8) 対の図 2 Cから人口をゲートします。
    注: セルに由来する OT-私 WT (C57BL/6、受信者) マウス由来細胞は Thy1.2+ (CD90.2) (図 2 D) に対し、ドナーのマウスは Thy1.1+ (CD90.1)。いくつかの研究所がある OT-私 Thy1.2 バック グラウンドで WT (C57BL/6)、Thy1.1 のマウス。この場合は OT の Thy1.2 抗体を使用する必要が-ゲート携帯ですね。
  6. CD8 を再ゲート+細胞 Thy1.1+人口 APC (CD8) 対 BV 450 (CD4) で構成されるゲートにプロットして (図 2 e)。
  7. CD8 のヒストグラム表示を使用して、2 e ゲート人口を表示+ CFSE (FITC、530/15 チャンネル - 青色レーザー-)、細胞増殖の人口門 10 から強度を含む2レベルまで、コントロール分裂していない人口は (強度 10 〜5、CFSE 染色と流れの cytometer の電圧設定の有効性に応じて) (図 2 f)。
  8. マーカーにする、(図 2 には表示されません) 付加ゲート プロット FITC 対 L/D (450/20 チャンネル、紫外レーザー) 増殖の評価に並列に死んだ細胞を評価するために。
  9. 補正コントロールのイベントの少なくとも 5000 と流れの cytometer でサンプルから 10.000 イベント (図 2E、ゲート) を取得します。低または中程度の流れの cytometer を実行 (20.000 イベント/秒の流量を超えない)。

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Representative Results

CTL の発電容量をに対して転送 OT の増殖を測定することによって評価我々 異なるアジュバント (その ADJ1 および ADJ2) の組み合わせを使用して治療法をテストするために-私は CD8+ T 細胞のフローサイトメトリー (図 2)。このため、以前ドレイン リンパ節および脾臓 (表 1) から分離された細胞を染色しました。CD8 の増殖を測定することによって+ T 細胞リンパ節および脾臓、その ADJ1、単独で OVA または PBS コントロールに比較するとドレイン リンパ節 (図 3) の ADJ2 の容量世代より高い CTL を確証することができました。対照的に、我々 が観察している+ T ない細胞その ADJ1 だった脾 CD8 による増殖の高いレベルを示すに対し、ADJ2 全身コンパートメント (脾臓) の CTL 応答を生成することができませんでしたが、また優れたコントロール (PBS と OVA) とだけ比較してその ADJ1。この生体内で急速増殖アッセイを用いた ADJ2 のアクションを解剖によってローカルが全身 CTL ジェネレーターではなく、強力なアクションを確認できます。また、その ADJ1 行為両方注入 (ドレイン リンパ節) のローカル ・ サイトで同様に全身増加 ot-私、脾臓で増殖します。得られた結果術後の活動やその範囲は、ADJ2 (ローカル) とその ADJ1 (全身) の観察された効果に代表されるを特徴付けることができます。

Figure 1
図 1: アッセイ タイムライン。アッセイ タイムラインを表す初期 OT-日 1、0、皮下接種日とサンプリング脾臓とリンパ節を 2 日後に排出で転送する T 細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ゲート戦略の流れ続く CD8 の増殖を測定する+ T 細胞 (OT-私は、Thy1.1+) フローサイトメトリー 。2 つのサンプルより良い可視化のための異なる色 (赤と水色) で表されます。A b単一のセルが最初の 2 つのゲートで引き続いてダブレットから前方の散布面積対前方散布高さとサイド散布周辺対側散布幅をプロットすることによって差別されます。C.その蛍光強度は、CFSE で彼らの強さ (薄暗くなることは細胞分裂/増殖を示す) 530/30 YG チャネルに対してプロットを BV 650 チャンネル (自動蛍光) のbゲートのセルが表示されます。この門を差別することは true CFSE 陽性細胞の選択が可能高自己蛍光を持つもの。D. CFSE 陽性細胞が Pe Cy7 の彼らの高い蛍光強度とゲート (Thy1.1、OT のマーカー-細胞)、APC 強度 (CD8) 対。E. BV 450 (CD4) 以前の APC (CD8) に対してプロット ゲート Thy1.1 陽性細胞 CD8 を正確に選択する+ T 細胞。F.以前ゲート CD8+細胞増殖の人口を最後にゲートに CFSE 強度に対するヒストグラムでプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 補助駆動 CTL 生成します。局所または全身の CTL 応答を引き出す能力 2 異なるアジュバント治療 (その ADJ1 と ADJ2) 抗原および PBS コントロールに沿って描かれています。本転送 OT の増殖-私は T 細胞を調査する (例示皮下皮下投与の鼠径) 排水のリンパ節、脾臓、図の行に示されています。細胞の増殖はそのローカル (ドレイン リンパ節) またはアクションの全身 (脾臓) 範囲で免疫応答の範囲を正確に比較するためにすべての関連する治療 (列) で測定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

染料 - 抗体 クローン 蛍光/チャンネル-フィルター 濃度 2 倍
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE Cy7 - 780/60 YG 1:750
CD8 53-6.7 APC - 670/14 R 1:280
CD4 RM4 5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (CFSE 染色プロトコル) によると
DCM (死んだ細胞のマーカー) - -/紫外線 - 450/50 UV 1: 500

表 1: フローサイトメトリー用抗体染色。蛍光標識抗体クローンは使用され、染色濃度 (2 倍) をお勧めします。

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Discussion

現代のワクチンは、理想的にしまいこむ精製抗原とアジュバント、リポソーム、ウイルス様粒子、ナノ粒子やライブのベクトルのような配信システムの可能な追加です。ワクチンを設計するときの重要な側面は、臨床医学のニーズによると右の補助を選択することです。範囲の一部は好む細胞性免疫応答 (またはその両方) と体液性、全身性免疫反応 (またはその両方)、対ローカルの選挙とターゲット人口のワクチンを生成する必要がありますメモリの種類を含むことができます。術後評価の 1 つの重要な側面は、急速に CTL を生成する能力を決定することです。ここで急速に OT を測定することによって CTL 応答の体内マウス モデルの機能を特定するための既に知られている手法に基づく方法を提案-私は CD8 T 細胞増殖。このメソッドは、アジュバントによって免疫応答能の予測 (OT の増殖-私は T 細胞) だけ 4 日間。このメソッドをさらにアジュバント免疫応答 (全身対ローカル) の観点からの操作とその効果的な行動の比較が容易になります。ここでは、異なるアジュバント治療 (その ADJ1 対 ADJ2) 予防接種、免疫応答に及ぼす影響について例を示した我々 持っています。同じ用量その ADJ1 のアクションがより広範な CTL 応答両方ローカルおよび全身のレベルがでを生成するのに対し、ADJ2 のアクションはドレイン リンパ節における免疫応答を活性化管理のローカル領域に制限でドレイン リンパ節の ADJ2 よりも効力は少ない。

アジュバントの CTL 容量の正常な評価のための重要なステップは、若い OT の選択-私 (CD8 T 細胞の源) として動物やエンドトキシン フリーの OVA の予防接種のための使用。OT 以来-私マウス、トランスジェニック動物を OVA ペプチドを mhc 分子 SIINFEKL を認識する cd8 陽性 T 細胞を生成して-私コンテキスト、その人工選択マウス TCR の増加ハイパー増殖 CD8 の出演+ T 細胞の20歳。腋窩のリンパ節の炎症は、高齢者の OT のより一般的な機能-私マウス。これを考慮に入れて、それは若い OT を使用する勧め-私動物可能な場合 (6 9 週齢動物) から細胞を分離することを避けるために器官 (リンパ節、脾臓) を拡大し、。CD8 T 細胞の増殖と肥大器官の使用は全体の分析に影響を与えるコントロールと治療の増殖の可能性が最も高い違いは得られないので。OVA タンパク質を用いたエンドトキシン エンドトキシン OVA21,22 (を参照するくださいと比較してより強力な免疫応答を引き起こすことができるの痕跡から生成される補助 CTL 発電容量の差別のような落とし穴材料および試薬)、内毒素が強力な免疫変調器自体 23以来。したがって、予防接種に使用される OVA 蛋白質はエンドトキシン フリーである必要があります。OVA のエンドトキシンの 20 または 50 μ g の使用は、アジュバントの皮下をテストするための適切な用量を 50 μ g にされている予防接種経路によって異なります。また、CFSE の高濃度の使用は24陽性細胞を殺すために文献で報告されている、アッセイの失敗の結果をも。

実験の再現性を高めるため、動物のストレスを軽減するためにいくつかの変更またはプロトコルで使用されるさまざまな技術の改良を実施されました。たとえば、ちょうど前後のマウスおよびない全体の動物の尻尾を加熱することによって動物の加熱を最小限に抑えるため、皮下注射を避けるために予防接種の前に動物を麻酔によるストレスを関連しました。麻酔不要です動物福祉規則皮下注射ですが我々 の経験によってストレス反応によって生じるばらつきを減少させることによって再現性が高まります。

このメソッドの大きな制限は、CFSE は細胞の膜を汚れ、以来その高輝度通常損なうこと細胞質からの信号の検出です。したがって、CTL の容量の確認が必要な場合、特定の分泌の試金25、および細胞内サイトカイン染色ではなく、IFN-γ の分泌が評価されるべき。

わずか 4 日間でアジュバントによって CTL 発電容量を推定する増殖の測定の使用必要試金の伝統的な CTL26より良い将来実験の場合、さらに時間の短縮という利点があります。その他の方法による確認が必要です。

、抗原として OVA に制限が、したがって OT の使用に-T 細胞、提示方法ここにより、増殖細胞の並べ替え後の異なるアジュバントに対するによる活性化の性質の研究。増殖の OT の異なるアジュバントによる代謝の署名の研究は、可能なアプリケーションの 1 つ-私は T 細胞とメモリー27の開発との関係。追加のセカンダリ上映はサイトカイン、フローサイトメトリーによる脱顆粒マーカーまたは生体内で CTL テスト8,を実行することによってその細胞傷害性容量の式などの刺激細胞の生物学的特性を評価できます。26,28。このアプリケーションは、マウスでその使用に制限をされて、以来、ヒト化マウス29,30,31に基づく利用の上映はヒトへの外挿を実行できます。

我々 はここで提示しているこのメソッドは細胞応答活性化剤の選択の最初のスクリーニングとして使用するのに十分な堅牢でも変更または増殖の T 細胞の詳細な分析を結合する十分な柔軟性。アジュバント CTL 発電容量のこの急速な生体内の評価は、要約すると、ワクチン研究所産学官の補助候補分子の作用のモードの高速特性に興味があるのための理想的なツールです。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

私たちの技術的な助手にお世話になっております: u. Bröder、h. Shkarlet 実験手順の中で私たちを助けた。この作品は、部分的 (UniVax、契約番号 601738、TRANSVAC2、契約番号730964) EU 補助金及びヘルムホルツ協会助成金 (ハイ-IDR) によって賄われていた。資金源に影響しなかった研究デザイン、原稿や文書の提出する決定の世代。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

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References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

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