Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

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Summary

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

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Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

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Abstract

A avaliação de vacinas de subunidade moderno revela que a geração de anticorpos neutralizantes é importante mas não suficiente para a seleção de adjuvante. Portanto, adjuvantes com capacidades imuno-estimulatórios humorais e celulares que são capazes de promover respostas de linfócitos (CTL) T citotóxicas são urgentemente necessárias. Assim, fiel, monitoramento de adjuvante que induzir Cruz-ferragem e posteriormente aumentar a geração de CTL representa um passo crucial no desenvolvimento de vacinas. Aqui apresentamos um pedido de um método que usa SIINFEKL específicos (OT-eu) células T para monitorar a Cruz-apresentação do modelo do antígeno ovalbumina (OVA) na vivo na presença de candidatos de diferentes adjuvantes. Este método representa um teste rápido para selecionar adjuvantes com os melhores recursos de cruz-ferragem. A proliferação de CD8+ T células é a indicação mais valiosa da Cruz-ferragem e também é considerado como um correlato de cruz-apresentação induzida por adjuvante. Esta característica pode ser avaliada em diferentes órgãos imunes como linfonodos e baço. A extensão da geração CTL também pode ser monitorizada, conferindo-lhe insights sobre a natureza de um local (drenagem do linfonodo principalmente) ou uma resposta sistêmica (distante dos gânglios linfáticos e/ou baço). Ainda mais esta técnica permite várias modificações para testes de drogas que podem inibir a percursos específicos da Cruz-apresentação e também oferece a possibilidade de ser usado em diferentes cepas de ratos geneticamente modificados e convencionais. Em resumo, o aplicativo que apresentamos aqui será útil para laboratórios de vacina em indústria ou do meio académico que desenvolvem ou modificar adjuvantes químicos para pesquisa de vacina e desenvolvimento.

Introduction

Linfócitos T citotóxicos (CTL) induzindo vacinas são principais intervenções terapêuticas que foram desenvolvidas para lutar contra certos tipos de câncer1. CTL são também importantes para vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares2. Além disso, o CTL são dentre os mecanismos de defesa imune alguns funcionalmente ativos em populações de risco tais como neonatos3,4 , quem também dependem de CTL para combate de infecções início vida5. A este respeito, as vacinas contra o vírus sincicial respiratório (VSR) que foram desenvolvidas com um adjuvante que não eliciam respostas CTL (alume) resultaram em um completo fracasso da vacina levando a sérias complicações com infecções em lactentes de6. Estes efeitos negativos da vacinação podem ser revertidos por um CD8+ de resposta de células T7. Nós demonstramos anteriormente que as principais citocinas (interferons do tipo I) eliciadas algum estimulador de agonistas de genes (picada) de interferon são essenciais para as respostas CTL geradas por estes adjuvantes8, em parte, medindo-se a proliferação de OT-I T pilhas após vacinação e usando estes resultados como uma medida de CTL induzindo capacidades observadas em estendem de horários de vacinação9. A medição da proliferação de OT-eu CD8+ T em um rato de destinatário tipo selvagem (WT) C57BL/6 células por carboxyfluorescein grufo tintura de éster (CFSE) diluição é uma robusta estimativa da capacidade do adjuvante de uma vacina para gerar Cruz-ferragem de SIINFEKL, (o peptídeo imuno-dominante da ovalbumina, óvulos). Variações desta técnica são amplamente utilizadas para a avaliação da proliferação de OT-eu CD8+ e OT-II CD4+ T células. Por exemplo, ela tem sido usada na ausência de citocinas selecionadas (ratos KO) ou para medir a eficácia da vacina após retirada de antigénios em animais WT. Criámos um protocolo curto (4 dias experimento) em que após a transferência passiva de OT CFSE-manchado-eu CD8+ T cells, uma imunização (s.c.) subcutânea, consistindo de uma dose de 50 µ g de OVA livre de endotoxinas suplementado com adjuvantes de teste é administrado (Figura 1). O acompanhamento dos resultados 48 h após a vacinação fornece uma confiável prova da capacidade do adjuvante para gerar respostas CTL. Por esta estratégia, é possível avaliar a potência da resposta imune local no nó de linfa drena após a imunização, bem como a extensão da resposta, medindo-se a atividade CTL no baço (ou distante dos gânglios linfáticos).

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Protocol

Todos os mouses utilizados neste estudo foram do fundo C57BL/6. Todos os animais foram mantidos em condições isentos de organismos patogénicos. Todos os experimentos foram realizados de acordo com a normativa da lei alemã de proteção animal (TierSchG BGBl. EU S 1105; 25.05.1998) e foram aprovados pela Comissão Baixa Saxônia a ética de experimentos do Animal e do escritório de estado (Baixa Saxônia estado escritório de defesa do consumidor e da segurança alimentar), sob o número de autorização de 33,4-42502-04-13/1281 e 162280.

1. CFSE coloração de OT-eu T células e transferência adoptiva

Nota: OT-os ratos são animais transgenicamente gerados que expressam um receptor de células T (TCR) com α fixo e cadeias β que juntos reconhecem o peptídeo imuno-dominante de óvulos, SIINFEKL10,11. Como resultado, estes ratos têm um número consideravelmente elevado de SIINFEKL específicos CD8+ T células (97%)12 quando comparado com ratos normais ou óvulos vacinados (≤ 1%)13.

  1. Isolamento de CD8 rastreável+ T células de OT-eu camundongos expressando o alelo específico dos linfócitos T Thy1um (Thy1.1):
    1. Eutanásia em OT 6-9 semanas de idade-eu ratos por inalação de CO2 , seguido por deslocamento cervical14. Dissecar o baço e linfonodos principais (pares inguinais, axilares e cervicais), cortando a pele com uma tesoura cirúrgica, destacando a pele do corpo com a ajuda do alicate cirúrgico e pinça e colocá-los em placas de Petri (15 x 60 mm) cada um contendo um 100 µm poro malha cup para libertação de moagem e células de tecidos.
    2. Manter os pratos de petri (cada um com uma malha Copa) em 3-5 mL de meio RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 50 µ g/mL) mantido no gelo.
    3. Triture os órgãos com a ajuda de um êmbolo da seringa ou um instrumento similar de estéril (corte prévia não é necessária) e recolher a suspensão única célula resultante em tubos de centrífuga de 15 mL.
    4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Lavar as células em 10 mL de PBS frio por centrifugação e lisar as hemácias do baço, re-suspendendo a pelota em 1 mL/baço do cloreto de amônio buffer (buffer de ACK, comercialmente disponível). Incube as celulas por 1,5 min no gelo e posteriormente lavar as células com 10 mL de PBS frio por centrifugação (como feito antes).
    5. Ressuspender o sedimento no mesmo tubo em 1 mL de PBS (pH 7,2) contendo 5% fetal soro bovino para isolamento magnético.
  2. Para isolamento magnético, proceder à seleção negativa de CD8+ T células usando um kit de isolamento magnético de acordo com as instruções do fabricante ou publicado protocolos15.
  3. Para executar o CFSE coloração, primeiro contar o número de CD8+ T células obtidas a partir de OT-eu ratos usando um contador de célula automatizada (contador de partículas). Mancha de 1-5 x 107 células/mL em um volume de 1-5 mL com 5 µM CFSE em PBS por 7 min a 37 ° C, protegido da luz em um tubo falcon de 15 ml.
  4. Saciar a coloração CFSE adicionando o mesmo volume (1:1) de soro fetal bovino para as células e incube-os adicional 7 min a 37 ° C, protegido da luz. As células com 10 mL de PBS lave duas vezes.
  5. Conte as células usando um contador automatizado de células. Defina o número de células com 3-5 x 107 células/mL de PBS para injetar o 3-5 x 106 células/rato em 100 µ l por via intravenosa (IV) através da veia da cauda.
  6. Para executar a cauda veia injeções, imobilize os ratos em protecções adequadas. Aquecer a área traseira e a cauda dos ratos deve ser injetado por meio de uma lâmpada de luz vermelha, colocada entre 20 a 25 cm.... os ratos para 1-3 min permitir que a cauda veia vasodilatação.
    Nota: Isso ajuda a deteção de veia de facilidade e administração da suspensão celular.
  7. Certifique-se (com a mão colocada entre os ratos e a lâmpada) que não é demasiado quente para os ratos e quando as veias da cauda são claramente visíveis, dirijam-se à injeção. Injete as células na veia de cauda lateral ou dorsal utilizando uma seringa de 1mL com uma agulha de calibre 2516.

2. imunização (Endo-free OVA + adjuvante)

  1. Coloque os ratos transplantados com OT-eu células (etapa 1.7, Figura 1) em uma câmara de anestesia e administrar isoflurano em oxigênio por uma máquina de anestesia14.
  2. Quando o mouse está dormindo sob anestesia, tirá-lo da câmara e raspar o pelo do mouse sobre a área sobre o glúteo superficial (laterais, parte inferior das costas), usando uma máquina de corte de cabelo elétrico, a fim de realizar uma injeção limpa com uma boa visão da área de aplicação.
  3. Injete 50 µ l da vacina, s.c. na área depilada, usando uma agulha de calibre 25.

3. isolamento de linfócitos e mancha para análise de citometria de fluxo

  1. Isolamento de linfócitos e splenocytes
    1. Abater os ratos vacinados por inalação de CO2 seguida por deslocamento cervical.
    2. Extraia o distantes e drenagem dos linfonodos e baço e colocá-los em separado placas de Petri contendo 100 µm poro malha copos para libertação de moagem e células de tecidos. Siga os passos 1.1.2 através de 1.1.3.
    3. Decante o sobrenadante após centrifugação e ressuspender as pelotas de célula no mesmo volume de remanescente PBS (aprox. 100 µ l).
  2. Coloração para análise de citometria de fluxo
    1. Num tubo de centrífuga de 15 mL prepare uma mistura de mestre que contém os anticorpos coloração nas concentrações descritos na tabela 1, assim, produzindo uma mistura concentrada de coloração de 2x. Prepare-se volume suficiente do mestre mix ter 100 µ l por amostra. Misture as células e a mestre mistura 1:1 e incubar é a 4° C por 30 min.
      Nota: O volume final de coloração por exemplo deve ser 200 µ l (100 µ l de célula pelota + 100 µ l do mix de mestre de anticorpo).
    2. Lave as células duas vezes por centrifugação, conforme descrito em 1.1.3, adicionar 10 mL de PBS, duas vezes.
    3. Ressuspender as células coradas em 0,5-1 mL de PBS para a aquisição e a suspensão de transferência para tubos de citômetro de fluxo. Sempre manter as amostras no gelo e protegido da luz.

4. fluxo Cytometry

  1. Sempre pré-filtre as amostras de células usando filtros de 70-100 µm.
  2. Prepare a coloração única compensação controles para o fluorophores detalhadas na tabela 1 (grânulos ou células).
    Nota: Compensação deve ser executada no citômetro ou análise software17,18,19 e aplicada a todas as amostras.
  3. Siga a estratégia associada representada na Figura 2. Brevemente, populações de portão na altura de avançar dispersão vs área de dispersão para a frente (Figura 2A) e novamente dispersão lateral ampla vs área de dispersão lateral (SSA, Figura 2B) a fim de excluir parelhas.
  4. Portão a população de Figura 2B plotando BV 650 (autofluorescência) vs FITC (CFSE) a fim de discriminar o verdadeiro CFSE manchado células de altas autofluorescente de células. Incluem grânulos ou células coradas com anticorpos conjugados a BV 650 em controles de compensação. Este enredo (Figura 2), da BV 650 vs FITC é usado para portão OT-eu CFSE manchado células.
  5. Portão da população de C da Figura 2 para a Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) a fim de distinguir células derivadas de doador vs ratos destinatários.
    Nota: Células derivadas de OT-eu ratos doadores são Thy1.1+ (CD90.1), (WT C57BL/6, destinatários) derivado de ratos células são Thy1.2+ (CD90.2) (Figura 2D). Alguns laboratórios têm OT-eu ratos em um fundo de Thy1.2 e WT (C57BL/6) em um Thy1.1. Neste caso você tem que usar um anticorpo contra Thy1.2 para OT-eu celular gating.
  6. Re-portão CD8+ células de Thy1.1+ população plotando-a em um portão constituído por 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figura 2E).
  7. Exibir a população fechada na Figura 2E usando um display de histograma do CD8+ células mostrando CFSE (FITC, canal 530/15 - laser azul-), portão a população proliferada, incluindo intensidades de 102 até o nível onde populações a indivisa de controle são (intensidades 10 ~5, dependendo a eficácia do CFSE mancha e a configuração da tensão com o citômetro de fluxo) (Figura 2F).
  8. Que uma porta adicional (não mostrado na Figura 2) plotagem FITC vs L/D marcador (450/20 canal, laser UV) a fim de avaliar as células mortas, em paralelo à avaliação de proliferação.
  9. Adquira pelo menos 5000 eventos para os controles de compensação e 10,000 eventos (portão E, Figura 2) das amostras em um citômetro de fluxo. Executar o citômetro de fluxo médio ou baixo (não excedam as taxas de fluxo de 20.000 eventos/s).

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Representative Results

Para testar os tratamentos utilizando uma combinação diferente de adjuvantes (ADJ1 e ADJ2), avaliamos a capacidade de geração de CTL medindo-se a proliferação de OT enviaram transferido-eu CD8+ T células por citometria de fluxo (Figura 2). Por isso, nós anteriormente manchadas de células isoladas da drenagem dos gânglios linfáticos e baço (tabela 1). Medindo-se a proliferação de CD8+ T células nos linfonodos e baço, fomos capazes de confirmar uma maior capacidade de geração de CTL de ADJ2 nas drenagem dos gânglios linfáticos (Figura 3) quando comparado a ADJ1, óvulos sozinhos ou controle de PBS. Em contraste, temos observado que ADJ2 não foi capaz de gerar uma resposta CTL em um compartimento sistêmico (baço), Considerando que ADJ1 estava apresentando altos níveis de proliferação por esplênica CD8+ T as células, não só em comparação aos controles (PBS e óvulos) mas também superior para ADJ1. Dissecando a ação de ADJ2 usando este ensaio de proliferação rápida na vivo , podemos confirmar sua ação forte como um local, mas não um gerador CTL sistêmico. Além disso, ADJ1 ambos no local da injeção (drenagem dos gânglios linfáticos) atua também como sistemicamente com um aumento OT-eu proliferação no baço. Os resultados obtidos nos permitem caracterizar a atividade do adjuvante e sua extensão, exemplificado pelos efeitos observados de ADJ2 (local) e ADJ1 (sistêmica).

Figure 1
Figura 1: A linha do tempo do ensaio. A linha do tempo do ensaio representa a inicial OT-célula T transferir no dia 0, a vacinação s.c. no dia 1 e o baço de amostragem e drenagem dos gânglios linfáticos 2 dias depois. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: diagrama de fluxo da estratégia associada seguido para medir a proliferação de CD8+ T células (OT-eu, Thy1.1+) por citometria de fluxo. Duas amostras são representadas em diferentes cores (vermelho e luz azul) para uma melhor visualização. A-B. Células individuais são discriminadas de parelhas sucessivamente nas duas primeiras portas por conspirar para diante-dispersão-altura vs área para diante-dispersão e lado-dispersão-largura vs área lateral-dispersão. C. células bloqueadas em B são exibidas por suas intensidades de fluorescência do canal BV 650 (fluorescência auto) plotadas contra sua intensidade CFSE (onde diming indica divisões/proliferação de células) no canal 530/30 YG. Este portal permite a seleção de células positivas de verdade CFSE por discriminar aqueles que têm fluorescência auto alta. M. células positivas CFSE foram bloqueadas com sua intensidade de fluorescência de alta de Pe-Cy7 (Thy1.1, marcador para OT-I pilhas) vs sua intensidade APC (CD8). E. BV 450 (CD4), plotados contra APC (CD8) para anteriormente fechado Thy1.1 células positivas para selecionar com precisão CD8+ T células. F. anteriormente fechado CD8+ as células são plotadas em um histograma contra a intensidade CFSE para portão finalmente a população proliferada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: adjuvante conduzido geração CTL. A capacidade de eliciar respostas CTL locais ou sistêmicas é retratada por 2 tratamentos diferentes adjuvantes (ADJ1 e ADJ2) ao longo do antígeno e controles de PBS. A proliferação de OT enviaram transferido-eu T células é examinado no nó de linfa drenando (inguinal, para a exemplificado subcutânea (s.c.)) e no baço, como indicado nas linhas figura. A proliferação das células é medida em todos os tratamentos (colunas) a fim de comparar com precisão na medida da resposta imune em seu local (nó de linfa drena) ou gama sistêmica (baço) de ação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Corantes - anticorpos Clone Fluoróforo/canal-filtro Concentração de 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1:750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 R 1:280
DDS RM4-5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (de acordo com o protocolo CFSE-mancha)
DCM (morto marcador de célula) - -/ U.V. - 450/50 UV 1: 500

Tabela 1: anticorpo citológicas por citometria de fluxo. Clones de anticorpo conjugado fluoróforo usado e recomendado coloração concentrações (2x).

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Discussion

Vacinas modernas são idealmente composedof antígeno purificado e adjuvantes, com a possível adição de um sistema de entrega como lipossomas, vírus-como partículas, nanopartículas ou vetores ao vivo. Um aspecto fundamental durante a criação de uma vacina é escolher o certo adjuvante de acordo com as necessidades clínicas. Parte do escopo poderia envolver favorecendo um humoral vs. resposta imune celular (ou ambos), a eleição de um local contra uma resposta imune sistêmica (ou ambos) e o tipo de memória que a vacina deve gerar na população-alvo. Um aspecto crucial da avaliação adjuvante é rapidamente determinar sua capacidade de gerar CTL. Apresentamos aqui um método baseado em técnicas já conhecidas, para determinar rapidamente as características do CTL resposta na vivo em um modelo do rato medindo OT-eu T CD8 proliferação de células. Este método permite a previsão da potência da resposta imune eliciada adjuvantes (proliferação de OT-eu T células) em apenas 4 dias de trabalho. Este método ainda mais facilita a comparação entre as ações de adjuvantes em termos de resposta imune (local vs sistêmica) e sua ação eficaz. Aqui, mostramos um exemplo sobre como imunização com tratamentos diferentes adjuvantes (ADJ1 vs ADJ2) afetará a resposta imune. A ação do ADJ2 foi restrita a área local de administração, onde ele ativa a resposta imune nos linfonodos drenante, Considerando que a ação do ADJ1 com a mesma dose foi mais difundida, gerando uma resposta CTL ambos na mas nível local e sistêmica com menos potência do que ADJ2 nos drenagem dos gânglios linfáticos.

Passos críticos para a avaliação de sucesso da capacidade de um adjuvante CTL são a escolha do jovem OT-eu animais (como fonte de células T CD8) e o uso de óvulos de endotoxinas-livre para a imunização. Desde OT-os ratos são animais transgénicos gerados para produzir células T CD8 que reconhecem peptídeos óvulos SIINFEKL em um MHC-eu contexto, sua seleção artificial do mouse TCR aumenta as aparições de CD8 proliferativa hiper+ T células20 com a idade. Uma inflamação dos gânglios linfáticos axilares é, portanto, uma característica mais comum de OT envelhecido-eu ratos. Tendo isto em conta, é recomendável usar o jovem OT-eu animais quando possível (6-9-semana-velho animais) e evitar isolar células de qualquer ampliado órgãos (ou baço, dos gânglios linfáticos). O uso de órgãos alargados com pilhas proliferating T CD8 afetará o ensaio inteiro desde diferenças mais prováveis proliferação entre controles e tratamentos não serão obtidas. Uma armadilha similar para a discriminação da capacidade de geração de CTL adjuvante pôde ser gerada usando a proteína de óvulos com traços de Endotoxinas, que podem provocar uma resposta imune mais potente em comparação com livre de endotoxinas óvulos21,22 (ver Materiais e reagentes), uma vez que endotoxinas são imuno-moduladores forte por si 23. Portanto, a proteína de óvulos, usada para a imunização deve ser livre de endotoxinas. O uso de 20 ou 50 µ g de OVA livre de endotoxinas depende da rota de imunização, sendo 50 µ g uma dose apropriada para o teste subcutâneo de adjuvantes. Além disso, o uso de altas concentrações de CFSE tem sido relatado na literatura para matar as células coradas24 e também pode resultar em falha do ensaio.

Algumas modificações ou melhorias para diferentes técnicas utilizadas no protocolo foram implementadas para reduzir o estresse dos animais, para aumentar a reprodutibilidade dos experimentos. Por exemplo, para minimizar o aquecimento dos animais, aquecendo-se apenas pelas costas e a cauda de ratos e não o animal inteiro, ou para evitar injeção subcutânea relacionados ao estresse por anestesiar os animais antes da vacinação. A anestesia não é exigido pelas normas de bem-estar animal para uma injeção subcutânea, mas em nossa experiência, melhora a reprodutibilidade, diminuindo as variações introduzidas pela resposta ao estresse.

Uma grande limitação deste método é que desde que CFSE manchas da membrana das células, seu brilho elevado geralmente prejudica a detecção de sinais do citosol. Portanto, se a confirmação da capacidade do CTL é necessária, a secreção de IFN-γ deve ser avaliada por uma secreção específica de ensaio 25e não pela coloração de citocinas intracelulares.

O uso da medição da proliferação para estimar a capacidade de geração de lista de certificados confiáveis por adjuvantes em apenas 4 dias tem a vantagem de menor tempo necessário de CTL tradicional ensaios de26 e é uma boa perspectiva experimentar no caso onde mais é necessária a confirmação por outros métodos.

Embora tenha restringido a óvulos como um antígeno e, portanto, para o uso do OT-I T pilhas, o método apresentado aqui permite o estudo das propriedades da ativação induzida por diferentes adjuvantes após separação das células proliferadas. Uma das aplicações possíveis é o estudo das assinaturas metabólicas induzida por diferentes adjuvantes no OT proliferada-eu T células e suas relações com o desenvolvimento da memória27. Seleções secundárias adicionais poderiam avaliar as propriedades biológicas das células estimuladas, tais como a expressão de citocinas ou marcadores de degranulação por citometria de fluxo ou sua capacidade citotóxica realizando em vivo CTL testes8, 26 , 28. Desde que este aplicativo tem a limitação de seu uso em camundongos, extrapolações para os seres humanos podem ser executadas por explorar sessões com base em ratos humanizados29,30,31.

Esse método que apresentamos aqui é robusto o suficiente para ser usado como uma primeira triagem para a seleção de ativadores de resposta celular e também é flexível o suficiente para ser modificado ou acoplado a uma análise mais aprofundada das células proliferadas T. Em resumo, esta rápida avaliação in vivo da capacidade de geração de CTL adjuvante é uma ferramenta ideal para laboratórios de vacina na academia e da indústria que estão interessados em uma rápida caracterização do modo de ação de suas moléculas de candidato adjuvante.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Estamos em dívida com nossos assistentes técnicos: U. Bröder e H. Shkarlet, que nos ajudou durante procedimentos experimentais. Este trabalho foi parcialmente financiado por subvenções e da UE (contrato n º 601738, UniVax e TRANSVAC2, contraem n º 730964), uma subvenção de Helmholtz-gemeinschaft (HAI-IDR). As fontes de financiamento não influenciou a pesquisa concepção, geração do manuscrito ou decisão de enviá-lo para publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

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References

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