Identificazione di prodotti farmaceutici per l'ambiente acquatico, mediante HPLC-ESI-Q-TOF-MS ed eliminazione di eritromicina attraverso la degradazione indotta da foto

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Summary

Vi presentiamo un protocollo per l'analisi non mirati utilizzando tempo di spettrometria di massa di volo come un perfetto strumento per identificare prodotti farmaceutici nelle acque. Dimostriamo l'applicazione dell'irradiazione UV per la loro eliminazione. Analisi che coinvolgono irradiazione, composto isolamento, identificazione e modellazione cinetica dei profili di degradazione sono illustrata.

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Voigt, M., Savelsberg, C., Jaeger, M. Identification of Pharmaceuticals in The Aquatic Environment Using HPLC-ESI-Q-TOF-MS and Elimination of Erythromycin Through Photo-Induced Degradation. J. Vis. Exp. (138), e57434, doi:10.3791/57434 (2018).

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Abstract

Monitoraggio prodotti farmaceutici in tutto il ciclo dell'acqua sta diventando sempre più importante per l'ambiente acquatico e, infine, per la salute umana. Mirate e analisi non mirati sono mezzi odierni di scelta. Anche se solitamente condotto con l'aiuto di analisi mirate di un triplo quadrupolo spettrometro di massa può essere più sensibile, possono essere identificati soli composti precedentemente selezionati. L'analisi non mirati più potente viene eseguita attraverso il tempo di volo esteso di spettrometri di massa (TOF-MS) da un analizzatore di massa a quadrupolo (Q), come utilizzato in questo studio. Preceduta da estrazione in fase solida e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), l'approccio non-mirato permette di rilevare tutte le sostanze ionizzabili con elevata sensibilità e selettività. È possibile sfruttare al massimo lo strumento Q-TOF-MS, esperimenti di spettrometria di massa tandem (MS/MS) accelerano e facilitano l'identificazione, mentre un metodo mirato di MS migliora la sensibilità ma si basa su norme di riferimento per l'identificazione. L'identificazione di quattro prodotti farmaceutici da acqua di fiume del Reno è dimostrato. Il fiume Reno proviene Tomasee, Grigioni, Svizzera e sfocia nel mare del Nord, vicino a ansa del sud, i Paesi Bassi. La sua lunghezza ammonta a 1232,7 km. Dal momento che è interesse primario per eliminare efficacemente prodotti farmaceutici dal ciclo dell'acqua, l'irradiazione UV-C di effetto è dimostrato su scala di laboratorio. Questo metodo consente la rapida degradazione dei prodotti farmaceutici, che exemplarily è indicato per l'antibiotico macrolide eritromicina. Utilizzando il suddetto metodo di HPLC-Q-TOF-MS, diagrammi di concentrazione-tempo sono ottenuti per la droga del genitore e dei loro prodotti di fotodegradazione. Dopo aver stabilito le equazioni per le reazioni sequenziale di primo ordine, raccordo computazionale permette la determinazione dei parametri cinetici, che potrebbe aiutare a prevedere tempi di irradiazione e le condizioni quando potenzialmente considerato come quarta tappa all'interno trattamento delle acque reflue.

Introduction

Prodotti farmaceutici sono trovati regolarmente in ambiente acquatico1,2,3,4,5. Una fonte importante sono gli effluenti da acque reflue trattamento piante (WWTP)6,7,8,9. L'avvenimento di prodotti farmaceutici nel lungo tutto il ciclo dell'acqua è stato studiato esemplarmente nel bacino del fiume Turia10. Tra gli altri, gli antibiotici rappresentano una particolare classe di pericolosa delle droghe, dal momento che spesso passano la fase biologica di depurazione invariato e può causare resistenze batteriche nell'ambiente11,12,13 . I macrolidi costituiscono una classe di farmaci antibiotici che vengono applicati sia in medicina umana sia nella medicina veterinaria. Loro rappresentanti sono stati trovati in concentrazione fino a 1 µ g/L in effluenti14,15,16,17,18,19. Uno di loro è eritromicina (Ery)20,21. Nelle acque, eritromicina è spesso accompagnata da anhydroerythromycin A (Ery A - H2O), un disidratare22,23. Eliminazione dell'acqua da eritromicina è dovuto instabilità acida. Il rapporto di eritromicina vs anhydroerythromycin dipende il pH24,25,26,27.

Chimicamente, i macrolidi contengono un lattone di macrocylic a quale zucchero vari moiety sono collegate, ad es., desosamine, cladinose o mycaminose. Poiché i macrolidi sono modificati chimicamente naturali prodotti da processi di fermentazione, spesso presenti come miscele. La specie chiamati A, B, C, ecc., differiscono per i sostituenti di zucchero. Le molecole di zucchero e la loro posizione presso il lattone sono responsabili per il modo di azione dei macrolidi28,29. Al fine di ridurre al minimo il pericolo per l'ambiente, è auspicabile per mineralizzare completamente i prodotti farmaceutici prima di entrare in ambiente acquatico27,30,31,32.

La prima parte di questo studio si occupa con la rilevazione di prodotti farmaceutici in acque di superficie, che è importante per il monitoraggio di effluenti sia in acque aperte. Per cercare una varietà di sostanze non identificate nella gamma microgrammi in diverse matrici, non mirati di analisi è il metodo di scelta20,33,34,35. In particolare, ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) electrospray ionizzazione quadrupolo tempo volo della spettrometria di massa (HPLC-ESI-Q-TOF-MS) è stato dimostrato di straordinario valore per la sua specificità e sensibilità. Dopo l'identificazione della sostanza, sensibilità può ulteriormente essere esteso utilizzando il MS mirata approccio con il quadrupolo operati in selezionare la modalità e l'energia di collisione all'interno della cella di collisione impostato su zero. Quindi, gli ioni arrivano non frammentato al rivelatore TOF.

Il secondo obiettivo di questo lavoro è l'eliminazione dell'eritromicina. Per l'eliminazione dei prodotti farmaceutici, vengono utilizzati i processi cosiddetti di ossidazione avanzata (AOP), ad es., iniziato da irradiazione con UV luce36,37,38. Essenziale per la degradazione è la formazione di radicali ossidrili dall'acqua di VUV / irradiazione UVC seguenti EQ. 1.

H2O + hν(< 200 nm) → H2O * → H. + . OH (1)

I radicali ossidrili possiedono un potenziale di ossidazione alta di 2,8 V, che contribuisce positivamente alla degradazione delle sostanze36,37.

Qui, la degradazione dell'eritromicina usando vuoto irradiazione UV/UVC in acqua è descritto tenendo conto le influenze del pH. La formazione di prodotti ancora più pericolosi è creduta per essere uno svantaggio dell'utilizzo di AOP39,40. Pertanto, è importante irradiare fino a completa mineralizzazione dei prodotti farmaceutici. Per meglio valutare il tempo di irraggiamento, il modello cinetico della reazione, le costanti di velocità di reazione e le emivite sono determinate sia per la droga iniziale e per la sua photodegradates. A questo scopo, grafico di concentrazione-tempo (c-t) sono stati ricavati dalle misurazioni di HPLC-ESI-Q-TOF-MS e rispetto ai modelli di cinetica chimica utilizzando MATLAB. La cinetica della degradazione proceduto secondo il primo ordine, e il photodegradates sono stati descritti come prodotti intermedi di una reazione di follow-up consecutivi o successivi27,41.

Protocol

1. preparazione del campione: Estrazione in fase solida

  1. Raccogliere circa 1 L di acqua per la preparazione dei campioni.
  2. Filtrare il campione sopra un filtro di banda blu con un diametro dei pori di 2 µm per rimuovere le particelle grossolane.
  3. Equilibrare la cartuccia SPE con 3 mL di metanolo e 3 mL di acqua ultrapura.
  4. Applicare il filtrato (1 L) sulla cartuccia SPE e aumentare la velocità di flusso usando un vuoto moderato, ad es., una pompa a membrana.
    Nota: Diverse cartucce SPE possono essere eseguite in parallelo.
  5. Lavare il campione con 3 mL di acqua ultrapura.
  6. Eluire gli analiti dal sorbato di cartuccia con 3 mL di metanolo.
  7. Concentrare l'eluato 3ml a secco utilizzando un evaporatore rotante.
  8. Disciogliere il residuo in 1 mL di acqua ultrapura.
  9. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa e memorizzarli in un flaconcino per l'analisi di HPLC-ESI-Q-TOF-MS non mirati.

2. metodo HPLC-ESI-Q-TOF-MS per l'analisi mirata e Non mirati e MS/MS

  1. Trasferire il flaconcino l'autocampionatore HPLC-ESI-Q-TOF-MS.
  2. Impostare tutti i parametri rilevanti (tabella 1) per l'HPLC-ESI-Q-TOF-MS.
    Nota: Se viene utilizzata un'energia di collisione finiti, cioè., collisione energia (CE) ≠ 0, ioni devono essere frammentati. Questa modalità corrisponde al metodo mirato MS/MS.
  3. Avviare la misurazione.
  4. Analizzare i cromatogrammi risultante e spettri di massa.

3. esperimenti di irradiazione UV

  1. Sciogliere il composto Antibiotico, ad es., eritromicina (750 mg/L), in acqua ultrapura a 20mg/L di concentrazione finale.
  2. Riempire il photoreactor 1 L, avvolto in carta stagnola, con 750 mL di soluzione.
  3. Introdurre la lampada da 15 W di potenza nel reattore.
  4. Applicare l'agitatore magnetico a 500 giri/min.
  5. Regolare il valore di pH al valore desiderato 3-4, 6-7 o 8-9 di aggiunta goccia a goccia di HCl (0,1 M) o NH3 (0,1 M) se necessario. pH 6-7 è utilizzato come esempio.
  6. Prendere 2 mL della soluzione di reazione come campione al tempo 0 utilizzando una siringa e trasferirlo in un flaconcino di vetro da 2 mL.
  7. Accendere la lampada UV e tenere traccia del tempo rotazione.
    Nota: I tempi di irradiazione di 10 min sono spesso sufficienti. Se si desidera la completezza della fotoreazione, una seconda serie di esperimento potrebbe essere necessario essere registrato utilizzando i risultati della prima serie.
    Attenzione: Irradiazione UV può portare a cecità.
  8. Prelevare un campione di 2 mL dalla soluzione ogni 30 s durante i primi 5 min. Poi, prendere un campione ogni 60 s fino alla fine dell'esperimento. Trasferire i campioni in fiale da 2 mL.
  9. Conservare i flaconcini fino all'analisi di HPLC-ESI-Q-TOF-MS a-4 ° C.
  10. Analizzare i 16 campioni utilizzando tecniche HPLC-ESI-Q-TOF-MS con i metodi descritti nel passaggio 2.

4. analisi cinetica

  1. Preparare un software adatto come la curva-montaggio toolbox di MATLAB R2016b.
  2. Adattarsi all'area di massa vs dati di tempo della degradazione indotta da foto dell'antibiotico genitore composto secondo la cinetica di primo ordine, Vedi EQ. 242,43
    Equation 1(2)
    La concentrazione Equation 2 si riferisce alla concentrazione iniziale del reagente A, c alla concentrazione reale sopra il tempo di reazione t con il tasso costante k1 dalla prima fase di reazione A B.
  3. Adattarsi all'area di massa contro le curve di tempo della degradates con EQ. 3 e 4, come essi possono essere descritti come prodotti intermedi di una reazione consecutiva o successiva di follow-up, cioè., modello del prodotto B o C secondo la reazione A → b → C → D.
    Equation 3(3)
    Equation 4(4)
    Le concentrazioni cB e cC si riferiscono a degli intermedi B e C; e k2,k3 per le corrispondenti costanti di tasso B a C, C a D.
  4. Utilizzare EQ. 5 per adattarle ai dati, se il tempo di irraggiamento non era sufficiente per osservare il degrado di un prodotto fotografico. Questo degradate può essere trattata come prodotto finale D con la concentrazione CD ottenere costanti di velocità.
    Equation 6(5)
    1. Calcolare la concentrazione di B con EQ. 6 invece di EQ. 3, se la reazione termina con B. Se C è il prodotto finale, è possibile calcolare la concentrazione di C secondo EQ. 7 invece di EQ. 4.
      Equation 7(6)
      Equation 8(7)
  5. Utilizzare EQ. 8 per la determinazione delle emivite t1/2.
    Equation 10(8)

Representative Results

Come risultato l'estrazione in fase solida, un giallastro a soluzione verde scuro è stata ottenuta in tutti i casi, che hanno indicato la presenza di clorofilla-contenere sostanze (Figura 1). Prodotti farmaceutici contenuti in questo campione di acqua non porterebbe a colorazione visibile poiché la loro concentrazione e loro assorbanza generalmente sarebbe troppo basso. Invece, l'avvenimento dei prodotti farmaceutici dovrà essere analizzati mediante HPLC e spettrometria di massa ad alta risoluzione.

In analisi non mirati, un HPLC-ESI-Q-TOF-MS è stato utilizzato a causa della sua eccezionale accuratezza di massa che permette di ottenere la massa accurata per ogni composto ionico. Il cromatogramma massa-rilevata di analisi eseguite è stato rappresentato come un cromatogramma di picco base (BPC), che Visualizza il picco più intenso di ogni spettro di massa registrate nel corso della separazione cromatografica. Nell'esempio illustrato nella Figura 2 presenta la BPC di un campione di acqua dal fiume Reno.

La BPC conteneva più di venti-cinque cime che riflettono valori differenti m/z, quindi diversi composti, di cui sette sono stati contrassegnati in BPC. Poiché le sostanze erano sconosciuti a priori, il primo passo per la loro identificazione consiste solitamente di derivazione la formula molecolare. Questo si realizza attraverso massa accurata e isotopica modello fornito tramite la rilevazione di TOF, sebbene il modello isotopico non può essere osservato in tutti i casi a causa di concentrazioni di campione basso in campioni ambientali. Con l'aiuto del database pubblico, come i prodotti farmaceutici nell'ambiente da agenzia ambiente tedesco (UBA), contenenti circa 630 composti, un'identificazione preliminare di un piccolo gruppo di candidati è spesso successo. Per una prova finale, confronto agli standard di riferimento disponibili in commercio devono essere eseguito o modelli di frammentazione MS/MS possono essere considerati (Figura 3).

In questo lavoro, confronto agli standard rispetto al tempo di ritenzione hanno rappresentato per l'identificazione dei prodotti farmaceutici che molto spesso si trovano in acque di superficie tedesche. Queste sostanze includono metoprolol, un β-bloccanti, carbamazepina, un analgesico e l'antibiotico macrolide eritromicina A e suoi derivati anhydroerythromycin che r. eritromicina serve come esempio ulteriormente studiato in questo studio. Il campione di fiume Rhine studiato aveva un pH 7.6 e una temperatura media di 16,5 ° C. A questo pH, anhydroerythromycin anche dovrebbe essere presente nel campione di acqua. Per l'analisi dettagliata, i cromatogrammi di ioni estratti (EIC) di campione sono stati confrontati con gli standard di riferimento (Figura 4).

Il confronto mostra buon accordo tra il tempo di ritenzione per metoprolol, carbamazepina e anhydroerythromycin e gli analiti osservati. L'EIC dell'anhydroerythromycin di standard di riferimento visualizzato due picchi, quindi due composti dove disidratazione era avvenuto presso due siti distinti dell'eritromicina. Eppure, solo un anhydroerythromycin isomero è stato identificato nell'esempio fiume Rhine. Eritromicina stessa era soltanto presente in tracce. Di conseguenza, non potrebbe essere ottenuto spettro MS/MS. Le masse accurate per l'antibiotico e suo disidratare sono indicate nella tabella 2. Utilizzando EIC, così tempo di valore e ritenzione di m/z, metoprololo, carbamazepin, eritromicina e anhydroerythromycin potrebbe essere identificati nel campione river Rhine.

Per quanto riguarda l'ambiente acquatico, è importante evitare prodotti farmaceutici da passare attraverso impianti di trattamento delle acque reflue ed entrare nelle acque superficiali. Nella ricerca di un'eliminazione efficace, sono stati effettuati esperimenti di irradiazione UV-C a valori di pH diversi per eritromicina come esempio. Diagrammi di concentrazione-tempo (c-t) sono stati registrati utilizzando massa-area vs tempo trame derivato da EIC. La degradazione è stata descritta secondo l'equazione 2. Eritromicina è costituito da eritromicina A e B e anhydroerythromycin A, con due isomeri di quest'ultimo. Le curve di c-t di eritromicina A e loro si inserisce computazionale sono illustrate nella Figura 5. A pH 7, degradazione accelerata è stata osservata. Questo vale per tutti i quattro composti studiati, dati non indicati. Di conseguenza, degradazione indotta su foto di eritromicina dovrebbe avvenire intorno a pH neutro. Nel caso dell'esempio fiume Rhine, regolazione del pH non è stato richiesto.

Photodegradates dei prodotti farmaceutici sono stati anche identificati in tutti e tre i valori di pH. Una panoramica di questi photodegradates con le loro corrispondenti proposte di struttura è dato in tabella 3. Per l'analisi cinetica di photodegradates, il prodotto con m/z = 720 serve come un esempio. Photodegradates spesso può essere descritto come intermedi di reazione. Pertanto, i photodegradates sono stati descritti in termini di aconsecutive e la successiva reazione di follow-up. La decisione tra i tipi risultante di intermedi si basa sulla bontà del fit computato con software adatto, dove il coefficiente di determinazione (R2) e l'errore residuo di media-squared (RMSE) sono stati presi come i criteri. Dovuto al fatto che l'eritromicina è acido-instabile, degradates come si verificherebbe all'irradiazione erano presente prima dell'irradiazione. L'effetto risultante sulle equazioni 3 e 4 è stata una concentrazione iniziale finita. Quindi, un fattore è stato aggiunto per le equazioni. La figura 6 Mostra i dati sperimentali e si adatta calcolata secondo l'equazione 3 e 4.

Questo esempio di un intermedio ha dimostrato l'aumento di concentrazione con un aumento sigmoidale, seguito da un decadimento esponenziale. Questo è indicativo per un intermedio di reazione follow-up successivo. Un intermedio di reazione consecutivi non Mostra l'aumento sigmoidale. Parametri di qualità delle statistiche anche indicato l'accordo leggermente superiore di adattamento secondo il modello di reazione di follow-up successivi. Il coefficiente di determinazione R2 della reazione consecutiva era 0.9898 e così più basso di quello della reazione follow-up successiva essendo 0.9976. Di conseguenza, il photoproduct esaminati è stato interpretato come intermedio di una reazione di follow-up successiva. I valori di k ha provocato dal fit computazionale pure, l'emivita è stata calcolata l'equazione seguente 5. Tutti i pertinenti parametri cinetici sono raccolti nella tabella 3.

La degradazione più veloce è stata osservata a pH 7, seguita da pH 9, mentre la più lenta degradazione è stata trovata per pH 3 (Figura 5). Questa individuazione applicata anche per la formazione e la degradazione dei photoproducts. Tre photodegradates sono stati osservati. Loro valori m/z sono state 750.46 corrispondenti a Ery F, 720.45 a Ery C e 192.12 a DPEry192, uno zucchero ottenuta associato della struttura eritromicina (Figura 7). Nessuna degradazione della photoproduct potrebbe essere osservata per DPEry192 a pH 3 e 9 e per Ery F a pH 9. In questi casi, il tempo di irraggiamento non era sufficiente tempo per osservare il totale degrado del prodotto intermedio. Tuttavia, la costante di velocità di formazione potrebbe essere determinata usando l'equazione 5, che corrisponde ad un prodotto finale.

Figure 1
Figura 1 . Confronto dei campioni dal fiume Reno dopo SPE (a sinistra) e trattamento ultrapuro water(right). La colorazione verde è indicativa per sostanze contenenti clorofilla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . BPC di un campione di acqua dopo SPE misurato con HPLC-ESI-Q-TOF-MS. Tutti i cromatogrammi sono stati normalizzati per la vetta più alta. Illustrativi valori m/z sono contrassegnati come si ottiene il corrispondente spettro di MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Spettro della Q-TOF-MS di eritromicina A (in basso) e il MS/MS di ione m/z = 734.4689 (in alto). Gli spettri mostrano lo ione quasi-molecolare dell'eritromicina A con relativo modello isotopico e i frammenti a un'energia di collisione applicata di 30 eV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Normalizzato EIC di metoprololo (A), carbamazepina (B), eritromicina (C) A e (D) anhydroerythromycin A in un campione di fiume Rhine (blu) e in acqua ultrapura da composti di riferimento (rosso). I tempi di ritenzione dei composti di riferimento e di quelli dei prodotti farmaceutici del campione di acqua sono gli stessi. I rapporti segnale-rumore di metoprololo (A) e anhydroerythromycin (D) sono superiori a quelli della carbamazepina (B) e l'eritromicina (C), che indica che quest'ultimo era presente solo in tracce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Normalizzato curve di concentrazione-tempo di fotodegradazione di eritromicina A pH 3 (rosso), pH 7 (verde) e a pH 9 (blu). Soluzioni sono stati irradiati per 10 min. A pH 7, eritromicina è stato completamente rimosso dal campione. Le curve di concentrazione-tempo potrebbero essere descritto usando equazioni cinetiche del primo ordine. Le costanti cinetiche tasso erano 0.10 (pH 3), 0,59 (pH 7) e = 0.21 (pH 9). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 . Confronto delle misure delle curve concentrazione-tempo del photoprodegradates di eritromicina con m/z = 720 a pH 9 seguito equazioni 3 (A) e 4 (B). Bontà di adattamento della reazione consecutivi (A): R2 = 0.9898, RMSE = 4.645E + 04 e della successiva reazione di follow-up (B): R2 = 09976, RMSE = 2.366E + 04. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 . Struttura dell'eritromicina A, eritromicina B e anhydroerythromycin e loro prodotti di photdegradation. Questa figura è stata modificata da Voigt et al. 27. i prodotti sono stati formati dopo 10 min di irradiazione UVC e identificati mediante HPLC-Q-TOF-MS e MS/MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cromatografia liquida
Colonna: controfase C-18
Colonna: CoreShell colonna;
Colonna: dimensioni 50 x 2,1 mm, 2,6 granulometria μm
Temperatura della colonna 40 ° C
Volume di iniezione: 5 Μ l
Flusso: 0,3 mL/min
Fase mobile: R: solvente dell'acqua che contengono l'acido formico 0.1%
Solvente b: metanolo contenente acido formico 0.1%
Programma di gradiente:
Tempo/min 0 1 10 11.1 11.2 12
Solvente rapporto A:B 99: 1 70: 30 25: 75 1: 99 1: 99 99: 1
Spettrometria di massa
Fonte: Dual AJS ESI (modalità positiva)
Gas e origine
Temperatura del gas: 300 ° C
Essiccazione a Gas: 8.0 L/min
Nebulizzatore: 14 psig
Temperatura del Gas di guaina: 300 ° C
Flusso di Gas di guaina: 8 L/min
Intervallo di massa: 100 - 1000 m/z
Velocità di acquisizione: 1 spettro/s
Tempo di acquisizione: 1000 ms/spectrum
Transitorio / spettro 10014
Per metodo mirato MS.
Energia di collisione (CE): 0 eV
Preferito massa - tabella 734.4685
Per MS/MS (in genere in modalità auto MS/MS)
Energia di collisione (CE): 30 eV
Soglia assoluta 3000 conta
Soglia relativa 0,01%
Intervallo di massa: 100 - 100 m/z
Velocità di acquisizione: 1 spettro/s
Tempo di acquisizione: 1000 ms/spectrum
Transitorio / spettro 9964
Per metodo mirato MS/MS.
Preferito massa - tabella 734.4685

Tabella 1. Condizioni e parametri utilizzati per l'analisi di HPLC-ESI-Q-TOF-MS di farmaci in matrici di acqua. Si consiglia di introdurre un risciacquo passo tra le esecuzioni cromatografiche tramite esecuzione di un esempio di pura acqua ultrapura tra due analisi o estendere la fase di esecuzione del metodo cromatografico per eluire tutte le sostanze.

Table 2
Tabella 2. Prodotti farmaceutici riscontrate nel campione Rhine river con il loro tempo di ritenzione, teorico e osservato [M + H]+ e la loro struttura. La modalità di ESI è stata impostata al positivo, affinché [M + H]+-ioni sono stati rilevati. Il tempo di ritenzione può variare minimamente per motivi noti sperimentale usuale.

pH 3 pH 3 pH 7 pH 7 pH 7 pH 7 pH 7 pH 7 pH 9 pH 9 pH 9 pH 9
Prodotto k1 [min-1] t1/2 [min] (k1) k1 [min-1] k2 [min-1] k3 [min-1] t1/2 [min] (k1) t1/2 [min] (k2) t1/2 [min] (k3) k1 [min-1] k2 [min-1] t1/2 [min] (k1) t1/2 [min] (k2)
Ery A 0.1 6,81 0,59 - - 1.18 - - 0.21 - 3.37 -
Ery B 0.05 14.23 0,66 - - 1.04 - - 0.22 - 3.21 -
Ery A – H2Oa 0,11 6,53 0,59 - - 1.17 - - 0,19 - 3,72 -
Ery A – H2Ob 0.15 4.76 1.11 - - 0,63 - - 0.21 - 3,35 -
Ery F non osservata - 0.89 0.35 - 0.78 1.98 - 1.09* - 0,64 -
Ery C non determinato - 0,74 5,27 0.78 0.94 0.13 0.89 0,17 0.18 4,04 3,92
DPEry192 0.35* 1,97 non osservata - - - - - 0.30* - 2.34 -
* Nessun ulteriore degradazione osservato

Tabella 3. Costanti di velocità cinetica e corrispondente emivite del degrado dell'eritromicina e suoi photodegradates adattato da Voigt et al. 27 . Eritromicina è costituito da eritromicina A, eritromicina B e due forme di anhydroerythromycin. Tre photodegradates sono stati osservati. Ci si riferisce come Ery F, Ery C e DEry192.

Discussion

L'esempio di un'analisi non mirati, presentata in questo rapporto ha dimostrato l'identificazione di farmaci nelle acque superficiali mediante HPLC-ESI-Q-TOF-MS, MS/MS e confronto con gli standard di riferimento come la prova finale. La forza dell'analisi non mirati utilizzando TOF-MS è basata sulla rilevazione di tutti gli ioni presenti in un momento determinato ritenzione e l'alta accuratezza di massa che conduce alla previsione della formula molecolare sperimentale. In alternativa ad uno spettrometro di massa TOF, l'applicazione di una trappola ionica orbitale è stato descritto per analisi dei contaminanti in acqua44. Il pronostico di formula molecolare è stato utilizzato come punto di partenza per selezionare rapidamente gli standard di riferimento. L'applicazione del metodo MS mirato dello strumento Q-TOF-MS ha permesso l'individuazione di specifici composti, poiché solo pre-selezionati gli ioni passano il filtro quadrupolo. In generale un'analisi mirata viene eseguita utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadrupolo anche in acqua analisi45. Per compensare la deviazione dalla massa teorica a causa di imperfezioni strumentale, potrebbe essere eseguito un confronto cromatografico con una norma di riferimento. Il metodo mirato di MS/MS può anche essere scelto per l'analisi di identificazione. Qui, gli ioni vengono selezionati, frammentato e loro frammenti rilevati. Poiché MS/MS è meno sensibile del MS, la concentrazione dei prodotti farmaceutici nei campioni studiati acqua era troppo bassa per produrre frammenti significativi. Tuttavia, se vengono rilevati frammenti, composti possono essere identificati con maggiore fiducia. La sensibilità insufficiente potrebbe essere superata concentrando un più grande volume di campione di acqua iniziale. Inoltre, la misurazione deve essere effettuata appena possibile dopo il campionamento a causa di potenziali biodegradazione46,47,48,49. In caso contrario, i campioni devono essere conservati a-20 ° C per escludere composto degradazione o reazione.

A volte gli stessi valori m/z appaiono a volte di conservazione diversi. Questo può essere dovuto a che gli isomeri richiedono diverse tecniche analitiche. Può anche accadere che nessun composti potrebbero essere rilevati a tutti, che non necessariamente dimostrare loro assenza. Potrebbero non solo gli ioni di forma o si presentano sotto il limite di rilevazione. Il tipo di acqua esercita anche un'influenza sulla presenza di prodotti farmaceutici. Prodotti farmaceutici raramente immettere acqua di sorgente e delle acque sotterranee rispetto alla depurazione delle acque e degli effluenti da acque reflue trattamento piante48,50,51,52,53.

Per gli esperimenti di degradazione, la sorgente di irradiazione dovrebbe essere caratterizzata in anticipo, poiché il cambiamento continuo del fotone o tasso di fluenza del fotone della lampada contribuisce significativamente al degrado e il meccanismo di degradazione. Per tentativi iniziali, una lampada VUV/UVC, probabilmente una lampada a mercurio a bassa pressione è sufficiente. In generale, l'aggiunta di perossido di idrogeno, H2O2, accelera la degradazione27,36,37,54. Quando una lampada differente, ad es., una lampada UVA, viene utilizzato, deve essere garantita la formazione di radicali ossidrili, ad es., attraverso l'aggiunta di biossido di titanio 23,24,30, 31. per molti composti, ad esempio eritromicina, radicali OH anziché foto-reattività di farmaceutica stessa27sono le specie che induce degradazione.

Per la determinazione dei parametri cinetici, l'area dei segnali nei cromatogrammi massa rilevata, che rappresenta la concentrazione, è funzione del tempo di irradiazione. Per contenere i dati, si consiglia di utilizzare un software adatto. Qui, lo strumento di montaggio di curva di MATLAB è stato usato, che ha permesso per calcolare rapidamente i dati con le corrette equazioni in forma. La cinetica degli intermedi è determinata da equazioni più complesse. I parametri di qualità per i più allenati, vale a dire., R2 e RMSE, prontamente sono stati ottenuti anche.

Questo studio ha dimostrato l'analisi dell'acqua di fiume per rilevare ed identificare inquinanti farmaceutici e la fotodegradazione di eritromicina in acqua ultrapura. Nelle acque dell'ambiente, come l'acqua di superficie, le velocità di degradazione differenti e costanti di velocità sarebbero ottenute a causa di sostanze, quali umici che assorbe luce. Secondo l'esperienza degli autori, degrado spesso avviene più lentamente, ma a volte alle tariffe comparabili41,56.

Il problema a livello mondiale di prodotti farmaceutici, soprattutto antibiotici, in ambiente acquatico e i rischi risultanti ancora continuano a crescere1. Grazie alla varietà e diversità dei prodotti chimici, metaboliti e degradates, non mirati analisi diventerà l'arma analitico più importante per la loro scoperta nel ambiente57. Per l'effettiva eliminazione, romanzo fasi negli impianti di depurazione dovrà essere progettato basato sui processi di ossidazione avanzata, quali irradiazione UV potrebbe essere parte di.

Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Melanie Voigt è grato per uno stipendio da Promotionskolleg della Niederrhein University of Applied Sciences. Gli autori ringraziano la loro istituzione per ulteriore sostegno finanziario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol for liquid chromatography LiChrosolv Merck 1060181000
formic acid Fluka 94318
HCl Riedel-de Haen
NH3 Riedel-de Haen
Simplicity 185 Water Purification System EMD Millipore for producing MilliQ-water
Erythromycin BioChemica AppliChem A2275,0005
Filter Rotilabo-filter, Typ 113A Roth AP78.1
SPE-Cartridges Oasis HLB 3cc (60mg) Waters WAT094226
BAKER SPE-12G J.T. Baker
membrane pump PC3001 VarioPro  Vacuubrand
rotary evaporator; Laborota 4000 efficient Heidolph Instruments
syringe, 2 mL Terumo
Nylon Syringe Filters Target2 Thermo Scientific 10301345
C-18 CoreShell column 50 mm x 2.1 mm dimensions, 2.6 μm particle size Thermo Scientific
HPLC 1200 Agilent
ESI-Q-ToF-MS 6530 Agilent
photoreactor, UV Labor Reactor System 3 Peschl Utraviolet GmbH
VUV/UVC-lamp, TNN 15/32, 15 W Heraeus
pH-meter, pHenomenal pH 1100L vwr 662-1657
magnetic stirrer Heidolph Instruments
MassHunter Workstation B.06.00 Agilent
MATLAB R2016b Mathworks

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