استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

المتغيرات الجينية المرتبطة بأمراض الإنسان تبدأ لتصبح كشف، تزداد أهمية وضع نظم لتقييم سرعة الأهمية البيولوجية لتلك المتغيرات التي تم تحديدها. ويصف هذا البروتوكول الأساليب لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الإناث الأول باستخدام بويضات الماوس.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هو انيوبلويدي الجنينية الوراثية السبب الرئيسي للعقم لدى البشر. تنشأ معظم هذه الأحداث أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، وأن كان ارتباطاً إيجابيا بسن الأمهات، العمر وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. ولذلك، قد حساب المتغيرات الجينات للعزل الصبغي غير صحيحة أثناء تكون البويضات. نظراً لأن الحصول على بويضات بشرية محدودة لأغراض البحوث، وضعت سلسلة من الاختبارات لدراسة الجينات البشرية الدالة أثناء الانقسام الاختزالي الأول باستخدام الماوس بويضات. أولاً، يتم ميكروينجيكتيد رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) الجينات والجينات البديل من الفائدة في الطور الأول-اعتقلت الماوس بويضات. بعد السماح بوقت للتعبير، تطلق بويضات شكل متزامن في نضوج هو استكمال الانقسام الاختزالي أنا. يمكن تقييم تعريب البروتين البشري بعلامات مرناً مع تسلسل مراسل الفلورية، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، بالإضافة إلى التعديلات المظهرية. على سبيل المثال، اكتساب أو فقدان وظيفة يمكن أن يحقق بتهيئة الظروف التجريبية التي تشكل تحديا للمنتج الجيني لإصلاح الأخطاء هو. على الرغم من أن هذا النظام مفيد في التحقيق وظيفة البروتين البشري أثناء تكون البويضات، ينبغي الاضطلاع بالتفسير الملائم للنتائج نظراً لأن تعبير البروتين ليس على المستويات المحلية، وإذا لم تسيطر على (أي طرقت بها أو لأسفل)، homologs موريني موجودة أيضا في النظام.

Introduction

العقم هو حالة تؤثر على 10-15% السكان في سن الإنجاب 1، منها قرابة نصف التماس العلاج الطبي 2. على الرغم من أن مسببات العقم متنوعة وفي كثير من الحالات المتعددة العوامل، التشوهات الوراثية الأكثر شيوعاً في البشر هو انيوبلويدي الجنينية 3. انيوبلويدي يعرف بأنه الانحراف (الربح أو الخسارة) للعدد الصحيح من الكروموسومات في خلية. ظاهرة انيوبلويدي في الأجنة البشرية أمر شائع، ويزداد مع تقدم السن الأمهات 4،5. وقد أبرزت أربع تجارب معشاة الاستفادة من اختيار الأجنة (يوبلويد) فقط تشروموسومالي العادية لنقل الرحم لأن هذه الاستراتيجية أدت إلى غرس زيادة معدلات ومعدلات الإجهاض أقل ووقت أقصر تحقيق الحمل 6،7،،من89. ولذلك، فهم مسببات انيوبلويدي البشرية يمكن لها آثار هامة في المساعدة على الإنجاب.

وبالرغم من أن زرع قبل الاختبارات الجينية أنيوبلويديس مفيد في علاج العقم، تزال مفتقدة فهم دقيق للطريقة التي تنشأ بها أنيوبلويديس. من المقبول على نطاق واسع أن هناك علاقة متبادلة إيجابية هو أنيوبلويديس (نشأت أثناء إنتاج مشيج) وسن الأمهات، غير أن بعض النساء معدلات انيوبلويدي الجنينية الحالية التي تحيد عن معدل متوسط ل سن معين على 4. هذه الحالات تشير إلى أن السن وحدها ليست دائماً التنبؤية لخطر توليد جنين أنيوبلويد. عوامل أخرى قد تلعب دوراً في زيادة خطر انيوبلويدي الجنينية، مثل المتغيرات الجينات.

أحد جوانب رئيسية للتحقيق في إمكانية مساهمة متغير الجيني إلى انيوبلويدي أثناء الانقسام الاختزالي البويضيه تصميم نظام لتقييم سرعة وظيفة الجينات هو. بسبب القيود الأخلاقية ووصول محدود، ومن غير العملي لإجراء هذه التجارب باستخدام البويضات البشرية. هذه المسائل يمكن التحايل عليها باستخدام الماوس بويضات، وهنا سلسلة من الاختبارات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي الأول وصف. قبل ميكروينجيكتينج الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) الترميز للبديل الجينات للفائدة، يمكن تصور تعريب البروتين البشري في البيض الماوس وتستخدم لتحديد إذا كان التعبير حمل خارج الرحم من البروتين البشري البرية من نوع وتحور ينتج أي التعديلات المظهرية التي يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي. تعمل هذه تشمل زيادة في microtubules التي تعلقها على غير لائق للأخت كينيتوتشوري وعدم القدرة على دعم المحاذاة كروموسوم في الطورية للانقسام الاختزالي أولاً الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في اكتساب وفقدان وظيفة المتغيرات الجينية بتهيئة ظروف تجريبية محددة لتحدي الأحداث الرئيسية في الانقسام الاختزالي البويضيه مثل مغزل محاذاة المبنى وكروموسوم 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي

  1. الحصول على كامل طول التسلسل ترميز الجينات للفائدة وناقلات بلازميد النسخ في المختبر (بيفت)11.
    ملاحظة: استنساخ كامل طول كدنا المتوفرة تجارياً من مختلف البائعين أو يمكن أن تتولد عن طريق النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR). المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (نكبي) الموارد على الإنترنت يوفر نسخة تسلسل جينات من النوكليوتيدات وأعربت عن تسلسل المعلمة (EST) قواعد البيانات. وتيسيرا للبروتين قد رغبت التصور والتحليل لمستويات التعبير، والانصهار للبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو علامة نيون مناسبة أخرى في استراتيجية الاستنساخ.
  2. استخدام استراتيجية استنساخ تم التحقق من صحتها، إدراج الترميز تسلسل جين الفائدة في منطقة بيفت الاستنساخ لأغراض متعددة. وصف مفصل للاستنساخ الجزيئي والخطوات المطلوبة قد سبق وصف 12.
    ملاحظة: إذا كان يتم إنشاء منتج الجين-الانصهار، تأكد من أن استنساخ في إطار القراءة الصحيحة.
  3. تسلسل بناء استخدام جلوبين كبسولة تفجير لضمان الإدراج الجين الصحيح والسليم في إطار الانصهار، والتي تم إنشاؤها لا الطفرات المستحثة بوليميراز.
    ملاحظة: إذا لم يتوفر معدات تسلسل "الحمض النووي سانجر"، العديد من الشركات تقدم خيارات تسلسل الحمض النووي منخفضة التكلفة.
  4. موتاجينيزي الحمض النووي إذا إنشاء مجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة (بطانات) أو عمليات الإدراج/الحذف (إينديلس). ويرد وصف الطفرات الحمض النووي في خطوات 1.5-1.7 أدناه. لثوابت البرية من نوع، الانتقال إلى الخطوة استخطاط 1.7.
  5. تصميم كبسولة تفجير الطفرات وإتمام تفاعل PCR الطفرات لتوليد بنية متحولة للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. وقد بكر بوساطة الطفرات الموجهة من الموقع هو موضح سابقا 13. بالإضافة إلى ذلك، تقدم العديد من شركات مجموعات الموقع الموجه الطفرات التي تشمل البروتوكولات.
  6. تحويل الحمض النووي موتاجينيزيد إلى المضيف البكتيرية. عزل وتنقية بلازميد.
    ملاحظة: جعل العديد من الشركات مجموعات التي يمكن استخدامها بسهولة لعزل وتنقية بلازميد الحمض النووي. متابعة بروتوكول الشركات المصنعة وفقا لذلك. إذا كان استخدام سلالة البكتيريا سلبية الغرام مثل كولاي، من المستحسن استخدام مجموعة أدوات إزالة endotoxins.
  7. تسلسل الحمض النووي معزولة من ترانسفورمانتس البكتيرية باستخدام تسلسل "الحمض النووي سانجر" القياسية للتأكد من إدخال SNP المطلوب أو إينديل.
  8. لينيريزي المنتجات النهائية باستخدام واحد تقييد إنزيم هضم الحمض النووي المنقي.
    ملاحظة: يتضمن ناقلات بيفت إنزيم واحد عدة قطع المواقع المدرجة في خريطة بلازميد في أدجيني 14.
  9. التأكد من أن المنتج الخطية عن طريق [اغروس] هلام التفريد. المنهجية [اغروس] هلام التفريد قد سبق تعريف 14.
    ملاحظة: جميع الخطوات المتبقية، استخدام نصائح بيبيت الحاجز (التصفية) والمواد الخالية من رناسي لضمان إنتاج مستقرة وعالية الجودة الجيش الملكي النيبالي.
  10. تنقية المنتج هضمها باستخدام بروتوكول تنظيف الحمض النووي أو مجموعة تم التحقق من صحتها، والوتي في المياه خالية من رناسي/الدناز 30 ميليلتر.
    ملاحظة: تدور السليكا-مصفوفة مجموعات تستند إلى عمود ويوصي بجودة عالية، وتنقية الحمض النووي. متابعة بروتوكول الشركات المصنعة وفقا لذلك.
  11. في المختبر نسخ الحمض النووي استخدام بوليميريز T7 يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  12. تنقية والوتي الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر من الماء مجاناً رناسي/الدناز استخدام حمض النووي القائم على عمود تدور السليكا-مصفوفة تنقية عدة بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  13. أداء يشوه [اغروس] هلام التفريد استخدام الفورمالدهايد للتأكد من حجم المنتج النهائي الجيش الملكي النيبالي. راجع الخطوات 1.13-1.22 14أدناه. (الشكل 1).
  14. تحضير هلام بتدفئة [اغروس] ز 1 في 72 مل الماء حتى يذوب، ثم تبرد إلى 60 درجة مئوية.
  15. إعداد X 10 "اجتماعات" تشغيل المخزن المؤقت عن طريق إضافة والمماسح 0.4 متر (pH 7.0) وخلات الصوديوم 0.1 M 0.01 M يدتا.
  16. أضف 10 مل من 10 اجتماعات X تشغيل المخزن المؤقت، ومل 18 من 37% فورمالدهيد (12.3 M) في حل يبرد [اغروس].
  17. الطبقة الهلام بصب الحل [اغروس] إلى حاوية تكوين هلام. استخدام مشط كبيرة بما يكفي لاستيعاب 10 ميليلتر. بعد أن وضعت جل وحازم للمس، إزالة بلطف المشط.
  18. تجميع الجل في خزان التفريد، وإضافة ما يكفي 1 X اجتماعات تشغيل المخزن المؤقت، وضمان الجل مغطى تماما.
  19. إعداد عينات الحمض النووي الريبي بإضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لوحدات التخزين X 0.5 صبغ التحميل الذي يحتوي على الفورمالديهايد.
  20. إضافة اثيديوم بروميد إلى حل الجيش الملكي النيبالي بتركيز 10 ميكروغرام/مل.
  21. تؤذي الحمض النووي الريبي عينة الحل عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  22. استخدام العقيمة، 10 نصائح تصفية ميليلتر، تحميل 5 ميليلتر علامة الوزن الجزيئي و 5 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي sample(s) في آبار منفصلة من الجل واليكتروفوريسي في 5 الخامس/سم حتى الصبغ تم ترحيلها على الأقل ثلثي طول الهلام.
  23. تصور الجيش الملكي النيبالي في الهلام على إضاءة عبر الأشعة فوق البنفسجية. ضمان الجيش الملكي النيبالي هو الحجم الصحيح بمقارنة لعلامة الوزن الجزيئي.
  24. لقياس تركيز والنقاء من الجيش الملكي النيبالي، نقل 1.2 ميليلتر لتنقية الحمض النووي الريبي استخدام معقم 10 ميليلتر تصفية نصائح على الأشعة فوق البنفسجية--جهاز المطياف الضوئي.
    علما أن الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة يجب أن يكون امتصاص نسب من A260/280 (1.8-2.2) و 260/230 (> 1.7) على التوالي.
  25. استخدام 10 نصائح تصفية ميليلتر، الكوة الجيش الملكي النيبالي المنقي المتبقية في أنابيب الطرد المركزي ميليلتر 0.5 العقيمة (3-5 ميليلتر/أنبوب). تخزين أنابيب في-80 درجة مئوية حتى جاهزة ل microinjection.
    ملاحظة: تركيز حقن نهائي من 500 نانوغرام/ميليلتر نقطة انطلاق أمثل. من المستحسن أن تضعف الجيش الملكي النيبالي 1:2 في رناسي مجاناً ح20 قبل microinjection لتقليل الحساسية للجيش النيبالي الملكي في microinjection ماصة.

2-فحص المرفقات كينيتوتشوري-ميكروتوبولي

  1. تقسيم بويضات إلى مجموعات متساوية ل microinjection.
    ملاحظة: جمع البويضات، ونقل، و microinjection وهو نضوج قد وصفت بالتفصيل في جوف مسبقاً 15.
  2. ميكروينجيكت مجموعة واحدة مع التجريبية مرناً والأفرقة الأخرى مع التحكم بالوزن وبرنامج تلفزيوني أو بروتينات فلورية خضراء مرناً.
    ملاحظة: 500 نانوغرام/ميليلتر هو تركيز حقن الموصى بها للبدء مع 10. يمكن استخدام بيكوينجيكتور للتحكم في كميات حقن. ويوصي بحقن حجم رر 5-10 15.
  3. باستخدام اليد أو الفم جهاز بيبيتينج تعمل فيها الزجاج "الماصة؛" فتح قليلاً أكبر من القطر من البويضات (100-150 ميكرومتر)، نقل بويضات إلى قطره 100 ميليلتر من مستنبت خالية من ميلرينوني في طبق بتري المشمولة في الجنين نوعية الزيوت المعدنية واحتضان بويضات ح 7 في 37 درجة مئوية في 5% C02 للسماح بالنضج الكافي الطورية الانقسام الاختزالي أنا (اجتمع أنا) 15.
  4. بعد الحضانة، استخدام أجهزة ماصة نفس النحو الوارد أعلاه، نقل بويضات إلى طبق ثقافة كذلك مركز جهاز الذي يحتوي على 700 ميليلتر من الوسائط الأساسية الدنيا مبردة مسبقاً (MEM) جمع المتوسطة في مركز جيد و 500 ميليلتر ح20 في خارج الحلبة و ضع الطبق على الجليد لمدة 7 دقائق.
    ملاحظة: من المستحسن للبرد قبل وسائل الإعلام الفنزويلية ومركز جيد الجهاز ثقافة الأطباق في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل معالجة بويضات.
  5. إصلاح بويضات بتحويلها باستخدام الأجهزة الماصة في بئر صفيحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر من بارافورمالدهيد 2% في 1 برنامج تلفزيوني X لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدام نفس "الماصة؛" جهاز، نقل بويضات إلى بئر أخرى على لوحة موضعية التي تحتوي على 400 ميليلتر حل حظر (0.01 ٪ توين-20 + 0.02 ٪ نان3+ برنامج تلفزيوني + 0.3% جيش صرب البوسنة) ومخزن في 4 درجات مئوية حتى جاهزة عملية إيمونوستينينج.
    ملاحظة: لتخزين بويضات عند 4 درجة مئوية، الزجاج غطاء لوحة بقعة مع بارافيلم لمنع التبخر.
  7. باستخدام نفس الجهاز ماصة، بويضات نقل إلى بئر جديد على بقعة لوحة تتضمن حل permeabilization 400 ميليلتر (برنامج تلفزيوني جيش صرب البوسنة 0.3% 0.1% 100 تريتونكس + 0.02% نان3) واحتضان في درجة حرارة الغرفة 20 دقيقة لنقل بويضات بسرعة خلال ثلاثة قطرات من 400 ميليلتر عرقلة حل لإزالة أي بقايا المنظفات.
    ملاحظة: صفيحة بقعة زجاج الشفاف 9-جيدا يعمل جيدا لنقل مجموعات من خلال معالجات متعددة على طبق واحد (الخطوات 2.4-2.5).
  8. تنفيذ الإجراءات immunocytochemistry المتبقية في دائرة هوميديفيد، محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة. استخدام حاوية بلاستيكية متوسطة الحجم مبطنة بمناشف ورقية رطبة وتغطي برقائق الألومنيوم.
  9. استخدام جهاز ماصة، نقل بويضات إلى 30 ميليلتر عرقلة الحل على غطاء لوحة 96-جيدا والمكان داخل قاعة هوميديفيد لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: توضع قطرات في إيندينشنز دائرية على اللوحة.
  10. لتسمية centromeres والدوران، استخدام أجهزة ماصة، ونقل بويضات إلى 30 ميليلتر عرقلة الحل الذي يحتوي على مستضد المضادة سينتروميريك (هيئة مكافحة الفساد، كريست) (01:30) ومكافحة أسيتيلاتيد توبولين (1: 1000) واحتضانها ح 1 على الأقل.
  11. شطف بويضات بنقل عن طريق قطرات ثلاث 30 ميليلتر من عرقلة الحل لكل 10 دقيقة.
  12. استخدام جهاز ماصة، نقل بويضات إلى ميليلتر 30 قطره من عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مجانية للأجسام المضادة المستخدمة أعلاه (الإنسان المضادة مفتش 1: 200, 1: 200 مفتش المضادة الماوس) واحتضانها ح 1.
  13. كرر الخطوات 3، الشطف 10-مين في 30 ميليلتر عرقلة الحل كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  14. نقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة، إلى 3-5 ميليلتر تصاعد DAPI تحتوي على المتوسط (5.9 ميكروغرام/ميليلتر) على شريحة الميكروسكوب زجاجية.
  15. وضع 4 قطرات صغيرة (حجم رأس دبوس) هلام البترول على زوايا بكشف الغطاء لمنع سحق بويضات.
  16. بلطف ضع الجانب فازلين كشف الغطاء إلى أسفل على الشريحة.
  17. ختم ساترة الحواف مع مسح طلاء الأظافر والسماح لتجف لمدة 5 دقائق.
  18. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، حتى التجهيز عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل].
    ملاحظة: تأكد من الانكسار من مباريات المتوسطة المتصاعدة، وساترة، مجهر أهداف يجري استخدامها. ووصف تصاعد الموصى بها سابقا كانت المواد 15.
  19. صورة بويضات استخدام هدفا x 40-63 في مجهر [كنفوكل]، التقاط الخطوات الصغيرة (≤ 1 ميكرومتر) في z-الطائرة، الأمثل للعمل والهدف، وصورة المنطقة بأسرها المغزل الطورية.
    ملاحظة: تأكد من الصورة في كل القنوات 3 استناداً إلى الأجسام المضادة الثانوية المحددة المستخدمة في الخطوة 2.11. صورة المتوسط ≥ 4 وتكبير 3 تعتبر مثالية للقرار الملائم. ويوفر حجم خطوة 1 ميكرومتر التصور الواضح ميكروتوبوليس وكينيتوتشوريس في بويضات الماوس. سوف تختلف إجراءات لالتقاط الصور من المجهر للمجهر. يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم [كنفوكل] مصنعين لخطوات محددة حول كيفية تكوين إعدادات المجهر.
  20. تحديد حالة مرفق ميكروتوبولي kinetochore برامج التصوير عقب 2.21-2.23 الخطوات أدناه باستخدام.
    ملاحظة: تصف الخطوات التالية هذا الإجراء باستخدام برنامج للتحميل مجاناً ي الصورة (المعاهد الوطنية للصحة)، ومع ذلك، يمكن استخدام برامج التصوير البديل. تعريف مركز المرفقات أنواع سابقا كانت 16 .
  21. فتح الصورة عن طريق سحب الملف إلى شريط الأدوات "صورة ياء".
  22. في سلسلة ض فتح، جعل جميع قنوات مرئية (الحمض النووي كينيتوتشوري والمغزل) بواسطة النقر فوق "دمج القنوات"، المتوفرة في القائمة المنسدلة "الصورة"، ضمن علامة التبويب الفرعية "اللون".
  23. استخدام تبديل في الجزء السفلي من الصورة، التحرك من خلال كل شريحة ض وتحديد مرفق ميكروتوبولي kinetochore. ووصف مفصل مرفق الأوصاف كانت سابقا 16

3-الكروموسوم المحاذاة التحدي الإنزيم

  1. استخدام جهاز ماصة، كما هو موضح في الخطوة 2، 3، نقل بويضات إلى قطره 100 ميليلتر من مستنبت خالية من ميلرينوني تحت النفط واحتضان بويضات ح 7 للسماح للنضج الكافي الطورية للانقسام الاختزالي أنا (اجتمع أنا) كما تم وصفه سابقا في الخطوة 2، 3 17 .
    ملاحظة: إجراءات جمع و microinjection ونضوج البويضات وعرضت سابقا 15. الرجوع إلى بروتوكول مرفق المقايسة في خطوات 2.1-2.2 للضوابط وتركيزات microinjection الجيش الملكي النيبالي.
  2. باستخدام نفس جهاز ماصة، نقل بويضات لثقافة جهاز جيدا مركز صحن تحتوي على 700 ميليلتر الثقافة المتوسطة المحتوية على موناسترول [100 ميكرومتر] في مركز ميليلتر جيدا و 400 ح20 في الحلقة المحيطة واحتضانها في 37 درجة مئوية ح 2.
  3. شطف من موناسترول بنقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة أعلاه، عن طريق ثلاث قطرات من 100 ميليلتر كزب الثقافة المتوسطة، ومن ثم نقل بويضات لطبق ثقافة كذلك مركز جهاز جديد الذي يحتوي على 700 ميليلتر الثقافة المتوسطة + MG132 [5 ميكرومتر] ح 3 في المركز خاتم. إضافة 400 ميليلتر ح20 إلى خارج الحلبة.
  4. إصلاح بويضات بتحويلها، باستخدام أجهزة ماصة، في بئر صفيحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر 2% بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد التثبيت، نقل بويضات، استخدام أجهزة ماصة، في بئر جديدة للوحة بقعة الزجاج الشفاف الذي يحتوي على 400 ميليلتر عرقلة الحل ومخزن في 4 درجات مئوية حتى المجهزة إيمونوستينينج.
    ملاحظة: لتخزين بويضات عند 4 درجة مئوية، الزجاج غطاء لوحة بقعة مع بارافيلم لمنع التبخر.
  6. بيرميبيليزي، وتسمية بويضات عبر إيمونوسيتوتشيميستري كما هو موضح في الخطوات 2.6 2.16.
  7. بويضات استخدام هدفا x 40-63 في مجهر [كنفوكل]، والتقاط صورة < 1 ميكرومتر الخطوات في z-الطائرة مع التأكد من الصورة في المنطقة بأسرها من المغزل الطورية.
  8. لتحديد محاذاة كروموسوم فتح مركز ملفات الصور باستخدام برامج التصوير.
    ملاحظة: تصف الخطوات التالية هذا الإجراء باستخدام برنامج للتحميل مجاناً ي الصورة (المعاهد الوطنية للصحة)، ومع ذلك، يمكن استخدام برامج التصوير البديل.
  9. اسحب الصورة إلى لوحة التحكم صورة ياء.
  10. في سلسلة ض فتح، استخدم أداة نقطة (المتوفرة بالنقر فوق أيقونة الأداة إلى نقطة في شريط التحكم ي الصورة) لوضع علامة نقطة في نهاية كل القطب المغزل في على كل شريحة z بوضع الأداة فوق القطب المغزل في الصورة والنقر على الصورة. إضافة هذه النقاط إلى منطقة مدير مصلحة (ROI) بالضغط على Command + t على لوحة المفاتيح.
  11. تحديد الإحداثيات المحددة لكل من المواقع التي حددتها في الخطوة 3، 10 تسليط الضوء على نقطة معينة في إدارة عائدات الاستثمار والنقر على زر الإجراء. هذا وسوف توفر نتائج التي تحتوي على الجدول x و y إحداثيات لكل نقطة. سوف تكون هذه النقاط X1, Y1, و X1، Y2، على التوالي.
  12. القادم, تحديد الإحداثيات الحقيقية Z. ويتم هذا عن طريق ضرب عدد z-شريحة محددة في z-بنية تخزين العناصر التي تم تحديد القطب المغزل شريحة (أي شريحة #2 6) موجود في كل نقطة الفردية بسمك المكدس (أي 1 ميكرومتر) (مثال: شريحة 2 × 1 ميكرومتر = 2). وسوف تكون هذه النقاط Z1 و Z2 على التوالي.
  13. تحديد طول عمود الدوران باستخدام معادلة مبرهنة فيثاغورس (2 + ب2 = ج2) استخدام المعرفة مسبقاً x و y و z الإحداثيات من الخطوات 3.11 3.13. لكل محور الدوران طول النهائي يساوي:
    √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)
  14. تحديد ميدزوني المغزل. ويحسب هذا كنصف طول محور الدوران. باستخدام أداة الخط في "صورة ياء"، بالنقر على أيقونة الخط في شريط الأدوات "صورة ياء"، رسم خط من أحد المغزل القطب ميدزوني المغزل. سيتم عرض الطول "ي صورة" من شريط الأدوات.
  15. تحديد حالة محاذاة كروموسوم بتقدير المسافة كروموسوم من ميدزوني شوكي باستخدام أداة قياس الخط. باستخدام أداة الخط المتوفرة بالنقر على أيقونة الخط في شريط الأدوات "صورة ي"، رسم خط من ميدزوني شوكي على الكروموسوم. سيتم عرض الطول "ي صورة" من شريط الأدوات. وتعتبر الكروموسومات أكبر من 4 ميكرون من ميدزوني شوكي محازى 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد في المختبر سيكون النسخ عالية الجودة الجيش الملكي النيبالي نسبة A260/A280 (1.8-2-2) و ≥1.7 نسبة A260/A230 عندما تقاس باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتظهر الصورة في الشكل 1 الهجرة في المختبر-إنتاج الحمض النووي الريبي على [اغروس] هلام يشوه بعد التفريد. يمكن أن تشير إلى فرقة التي ملطخ في نمط أو نموذج يحتوي على عدة نطاقات الحجم تلوث أو تدهور للعينة. وبدلاً من ذلك، قد يشير إلى نطاقات متعددة أن مرناً هو ليس تماما التشويه والتحريف، أو لا كان خطيا بلازميد البداية تماما. سيتم تشغيل مرناً أكبر مما كان متوقعا بسبب ذيل بولي-أدينيلاتيد في صلب بيفت، الذي يتيح التعبير مستقرة من مرناً في المختبر. بعد microinjection من المستحسن لضمان حقن موحدة أحجام ومستويات التعبير عن طريق الفحص المجهري نيون. وتظهر الصورة في الشكل 2 الطور الأول-اعتقلت بويضات حقن موحد مع التجارة والنقل. تقنية microinjection متسقة أمر حاسم لهذا البروتوكول. يمكن استخدام البرنامج تحليل الصور، مثل "صورة ياء"، للتحقق من مستويات التعبير لضمان الاتساق وإتقانها لهذه التقنية. لاحظ أنه يمكن الحصول على المعلومات التعريب سوبسيلولار حين القيام التصوير لكلا فحوصات. ينبغي لجميع التجارب microinjection تقييم آثار متغير الجيني، حقن الجينات البرية من نوع مجموعة فرعية بويضات ليكون بمثابة عنصر تحكم. هذا يسمح أحد للتحكم لتعمل overexpression المحتملة من الجينات البشرية في البويضات ماوس. برنامج تلفزيوني، أو بروتينات فلورية خضراء لثوابت المسماة فلوروفوري، ينبغي أن يكون حقنت أيضا مجموعة فرعية بويضات لعنصر التحكم لتعمل microinjection المستحثة. لثوابت دون علامة نيون، يمكن أن يكون مرناً بروتينات فلورية خضراء حقن المشترك لضمان microinjection كافية. إذا اشتركت بالحقن بنيات اثنين أو أكثر في نفس الوقت يجب التأكد من زيادة تركيز مرناً مثل أن يتضمن الحل النهائي 500 نانوغرام/ميليلتر من كل مرناً.

مقايسة microtubule الباردة-مستقر يوفر أداة قيمة لتقييم حالة مرفق من كينيتوتشوريس إلى ميكروتوبوليس. الرقم 3 z-إسقاط صورة مجهر [كنفوكل] الطورية أنا البويضات. هذه البويضات تعرض لمعاملة الوسائط الباردة ديبوليميريزي جميع ميكروتوبوليس التي كانت لا تعلق على كينيتوتشوريس. بويضات التي عولجت عدم كفاية وقت سوف تحتوي على ألياف microtubule غير مرفقة بالكروموسومات (النتائج قصيرة جداً في عدد كبير جداً من الألياف) أو نقص الألياف معا (النتائج وقتاً طويلاً في أي هيكل المغزل)، ويوصي هذه بويضات عدم استخدامها في التحليل. في الطورية للانقسام الاختزالي أنا الشائع لبويضات لاحتواء كينيتوتشوريس فاتحة أو جانبياً المرفقة، ولذا من المستحسن أن تستخدم مجموعة مراقبة في أي دراسة المرفق. في المتوسط، سوف تحتوي على 5-10% كينيتوتشوريس في إرادة مي لا بويضات البرية من نوع بعد المرفقة [ستبلى] 19. من الضروري أن تكون جميع بويضات في المرحلة نفسها لتحليل وضع مرفق كينيتوتشوري-ميكروتوبولي. لضمان أن التجريبية والتحكم في مجموعات ناضجة مع جداول زمنية مماثلة من التوصية لتقييم حركية دورة الخلية. لإجراء هذا الفحص، ينبغي أن نضجت وتصور يعيش تحت ميكروكوبي الوقت الفاصل بين مجموعة فرعية من عنصر التحكم وبويضات التجريبية. يسمح استخدام milrinone بويضات ليتم مزامنتها في الطور الأول من الانقسام الاختزالي الأول، مثل أن يسمح الإصدار إلى وسائل الإعلام التي تفتقر إلى ميلرينوني مع استئناف الانقسام الاختزالي في الوقت نفسه 20. وينبغي أن قذف بويضات من السيطرة والمجموعات التجريبية هيئة القطبية، يدل على التوصل إلى الطورية للانقسام الاختزالي الثاني (الثاني)، اجتمع في نقاط زمنية مماثلة. إذا لم يتوفر مجهرية تعيش الخلية، يمكن نضجت بويضات ليلتقي أنا (ح 7) واجتمع الثاني (ح 16)، ثابتة، والملون للكشف عن الحمض النووي وميكروتوبوليس كما تم وصفه سابقا. الأول و "الثاني التقى" في Met يجب أن تكون مغزل على شكل برميل، القطبين مرئية. بويضات التحكم، يجب أن تكون محاذاة الكروموسومات لوحة الطورية. محاذاة الكروموسومات سوف تختلف في المجموعات التجريبية حسب متغير يؤثر، ومع ذلك، ينبغي مكثف الكروموسومات وتعلق على ميكروتوبوليس مع أغلبية الكروموسومات يقع على محور الدوران. أن وصلت إلى عدد مماثل من بويضات الانقسام الاختزالي الثاني في السيطرة والمجموعات التجريبية. للحد من الصعوبات في تحديد مرفق التصوير بويضات استخدام خطوات صغيرة في z-الطائرة، الأمثل حالة من المستحسن للعامل والهدف المحدد. تحليل ستشمل عرض z-الشرائح فردية وفي إعدادات مدمجة لتحديد أي قطب أن تعلق microtubules تنبع من. ويوضح الشكل 3B أمثلة من المرفقات ميكروتوبولي kinetochore غير طبيعي. سيظهر هو موعدا في أخت واحدة فقط التي يتم إرفاق زوج kinetochore إلى microtubule شوكي، تعرف لا مرفق. بعد ذلك، يظهر ملحق سينتيليك المرفقة في أي أخت كلا أزواج kinetochore القطب المغزل نفسه. وأخيراً، يظهر ملحق ميروتيليك في أخت واحدة التي يتم إرفاق kinetochore إلى كلا القطبين المغزل بينما الشقيقة الأخرى kinetochore زوج موصولة إلى قطب واحد مغزل.

توضيح الصور في الشكل 4 التدريجي المتوقع من الحمض النووي وتكوينات المغزل كالتحركات واحدة من خلال خطوات المقايسة التحدي المحاذاة كروموسوم. في هذا التحليل، من الأهمية بمكان أن تقدم مجموعات تجريبية مختلفة من خلال الانقسام الاختزالي مع حركية مماثلة. كما هو موضح سابقا أنها توصي لإكمال دورة الخلية الحركية تحاليل قبل إجراء الفحص التحدي. في هذا الفحص، يتم تقييم قدرة بويضات لتصحيح المرفقات غير طبيعي كينيتوتشوري-ميكروتوبولي بنجاح. لاختبار هذا، نضجت بويضات هي أولاً أن يلتقي الأول للسماح بالمرفقات ميكروتوبولي kinetochore التي ستنشأ. وبعد ذلك، هي المحتضنة بويضات في موناسترول، ومثبط Kinesin 5 (EG5)، التي تقوم بطي المغزل القطبين إلى مغزل أحادي القطب 21. الحث على توليد المغزل أحادي القطب المرفقات kinetochore microtubule غير صحيحة 100%. مثبط موناسترول ثم يغتسل للسماح للانتعاش. خلال فترة الانتعاش بويضات تجديد مغزل قطبين ومحاولة تصحيح المرفقات microtubule. إضافة مثبطات بروتوزوم MG132 يمنع ظهور طور الصعود. كعنصر تحكم، مجموعة فرعية صغيرة من بويضات من كل مجموعة تجريبية يمكن أن تكون ثابتة في كل مرحلة من مراحل البروتوكول (اجتمع الأول، موناسترول معاملة، مرحلة ما بعد الإنعاش) التأكد من جميع الفئات وتستجيب للعلاجات، و بنفس القدر. الطورية أنا بويضات ينبغي أن تحتوي على محور دوران قطبين على شكل البرميل بالكروموسومات الانحياز في لوحة الطورية. ينبغي أن تحتوي على بويضات تعامل مع موناسترول مغزل أحادي القطب بالكروموسومات الموجهة حول قطب واحد. ينبغي أن تتضمن بويضات تم استردادها مرة أخرى محور دوران قطبين على شكل برميل. يعرف المحاذاة كروموسوم الكروموسومات أي أكثر من 4 ميكرومترات من المغزل ميدزوني 22. فإنه من المفيد أن وصمة عار بويضات للكشف عن الحمض النووي وكينيتوتشوريس تحديد إذا كان كلا كينيتوتشوريس تقع خارج هذه المنطقة المركزية كهذا يمكن أن يكون من الصعب تحديد استخدام فقط الكشف عن الحمض النووي.

Figure 1
رقم 1. ديناتورينجاجاروسي هلام التفريد من الحمض النووي الريبي. ويمكن تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي، وحجم بالتفريد على [اغروس] هلام يشوه. هلام يشوه يوصي بمنع تشكيل هيكل الثانوية. لين 1 يحتوي على علامة وزن الجزيئي الجيش الملكي النيبالي. 2 لين عينة من الحمض النووي الريبي. لاحظ أن الجيش الملكي النيبالي سيتم تشغيل أكبر من حسابه بسبب ذيل بوليا المدمج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. التحقق من صحة microinjection البويضيه. مجهر فلوري يمكن استخدامها للتحقق من صحة microinjection البويضيه ناجحة والتعبير. يتم إظهار الطور الأول-اعتقلت بويضات ميكروينجيكتيد مع بروتينات فلورية خضراء بعد التعبير بين عشية وضحاها بناء. هذه الصورة تم الحصول عليها باستخدام السيارات فلوريدا أفوس [اينفيتروجن] نظام مجهزة بالتجارة والنقل الخفيفة المكعب التصوير. شريط الحجم هو 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. تقييم المرفقات كينيتوتشوري-ميكروتوبولي- (A) A الممثل z-الإسقاط من البرد-تعامل اجتمعت أنا البويضات. يتم عرض محور الدوران (الأخضر)، كينيتوتشوريس (أحمر)، والحمض النووي (أزرق). المربع يشير إلى منطقة التكبير/التصغير البصري. رؤوس الأسهم تدل على نهاية في المرفقات من كينيتوتشوريس إلى ميكروتوبوليس موعدا واحد. شريط مقياس من 10 ميكرون المغزل، كينيتوتشوري، والحمض النووي، ودمج القنوات. هو مقياس بار لتكبير بصري 5 ميكرومتر. (ب) أمثلة على أنواع المرفقات ميكروتوبولي kinetochore غير طبيعي في بويضات الماوس. تشير الأسهم إلى مواقع الحجز كينيتوتشوري-ميكروتوبولي. هو مقياس بار 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. كروموسوم المحاذاة التحدي المقايسة. الرسم البياني للإجراء مع الممثل z-الإسقاطات من بويضات في كل خطوة. أولاً هي نضجت بويضات الطورية للانقسام الاختزالي أنا (اجتمع أنا)، ثم نقل إلى طبق جديد يحتوي على موناسترول ح 2 للحث على تشكيل محور دوران أحادي القطب. بويضات المقبل يسمح باسترداد في نضوج المتوسطة وتستكمل مع مثبط بروتوزوم (MG132) لمنع ظهور طور الصعود ح 3. بويضات تم استردادها مرة ثابتة والمسمى المغزل (الأخضر)، كينيتوتشوريس (أحمر)، والحمض النووي (أزرق) وتصويرها عبر الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد حالة المحاذاة. خطوط تشير إلى طول عمود الدوران (40 ميكرومتر) والدوران ميدزوني (20 ميكرومتر) تحدد باستخدام معادلة مبرهنة فيثاغورس. تشير الأسهم إلى مواقف أداة نقطة في كل من القطب. أي كينيتوتشوريس > 4 ميكرومتر من ميدزوني شوكي تعتبر غير محاذي. تشير العلامة النجمية إلى محازى كروموسوم (5.6 ميكرون من ميدزوني). شريط مقياس هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب تحديد المتغيرات الجينية البشرية المرتبطة بالمرض السريع والمتزايد، من الضروري أن يتم إنشاء نظم لتقييم أهميتها البيولوجية. فهم وظيفة البروتين في الانقسام الاختزالي البشرية يطرح تحديات خاصة نظراً لأن بويضات بشرية ثمينة والحيوانات المنوية نادرة والبشرية ليست قابلة للتلاعب بالجينات. بويضات الماوس نظام نموذج الثدييات قيماً لتقييم وظيفة الجينات البشرية هو 10،23. يتجاوز هذا النموذج المشار لاستخدام البويضات البشرية مع توفير مصدر متاحة بسهولة من بويضات منخفضة التكلفة، مانيبولابل التي يخضع لها الانقسام الاختزالي مشابهة للخلايا الجرثومية البشرية بينما يجري مفيدة لفهم المتغيرات الجينية كيف قد تؤثر على الإناث الخصوبة.

نظراً لأن هذه الأساليب تستخدم التعبير حمل خارج الرحم من البروتين البشري في بويضات الماوس عبر microinjection، من الضروري أولاً وضع تركيز السيطرة، البرية من نوع الحمض النووي الريبي التي لا يغير من نضج هو. من المستحسن أن يتم نضج هو حركية في بويضات تحكم إنشاء معلمات خط الأساس، ومورفولوجيا المغزل وكروموسوم تقييم رصد (انهيار المغلف النووية، قذف الجسم القطبي). وبالإضافة إلى ذلك، ضمان كميات microinjection موحدة أمر حاسم للمقارنة بين المجموعات. بما في ذلك علامة مضيئة في الجينات لمصلحة يمكن تبسيط هذا التحدي التقني. تقنيات لإتقان microinjection البويضات قد أظهر سابقا 15. التصور لحقن بويضات تحت مجهر الأسفار أو تحديد التعبير البروتين عن طريق لطخة غربية أيضا أدوات قيمة لتأكيد تركيزات حقن متسقة.

نظراً للأخطاء في العزل الصبغي في بويضات الثدييات سببا رئيسيا انيوبلويدي الجنينية و فقدان الحمل5، تحليل المرفقات ميكروتوبولي kinetochore توفير أداة قيمة لتقييم ما إذا كان الجين للفائدة يؤثر على الفصل كروموسوم (أي مرفقات غير لائق سوف يسبب سوء العزل). تعرض لفترة 10 دقائق إلى وسائط مبردة غير كافية ديبوليميريزي ميكروتوبوليس التي لم تقم بملحق ميكروتوبولي kinetochore، السماح لتصور مرفقات مستقرة عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] 24. لهذا التحليل، من المهم عدم الإفراط البرد بويضات هذا سوف يؤدي إلى ديبوليميريزيشن ميكروتوبوليس مستقرة. وبالإضافة إلى ذلك، الأمثل لتلطيخ إجراءات مفتاح لتصور هياكل كينيتوتشوري وميكروتوبولي. لضمان دقة الصورة الكافية للتحليل، خطوات صغيرة (≤ 1 ميكرومتر) في z-الطائرة باستخدام حرف x x-63 40 ينبغي القبض على الهدف، والحصول على الصور من خلال هيكل محور الدوران الكامل لضمان كافة المرفقات مرئية. لاحظ أن من الشائع أن يكون فاتحة كينيتوتشوريس أثناء بروميتافاسي للانقسام الاختزالي أنا 25.

مقايسة التحدي المحاذاة الكروموسوم مفيد لتقييم المتغيرات مكسب أو خسارة للدالة. يمكن أن يكون مكسب للدالة متغيرات يصعب تقدير لأن بويضات الماوس من الإناث الشباب لديهم مستويات منخفضة من انيوبلويدي. هذا التحليل ويتغلب على هذه العقبة عن طريق توليد حالة التي يجب تصحيح البويضات المرفقات المستحثة تجريبيا غير صحيحة كينيتوتشوري-ميكروتوبولي. إنشاء نقطة وقت التي تحتوي بويضات السيطرة على الكروموسومات المنحرفة 1-2 بعد الانتعاش يوفر سيناريو قابلة للقياس لتحديد ما إذا كانت متحولة يوفر محاذاة زيادة الكفاءة (أي تحسين المواءمة سوف قدرات حماية euploidy). للتحديد الكمي كروموسوم اختلالها، بروتوكول المحددة سابقا في الكروموسومات التي تزيد على 4 ميكرومترات من المغزل تتميز ميدزوني كما يمكن محازى يمكن استخدامها 18.

لدراسة المتغيرات خسارة للدالة، شروط تجريبية إضافية ضرورية بسبب homolog الذاتية داخل نظام الدراسة. طريقة واحدة للتخفيف من حدة هذه المشكلة هو استخدام أو إنشاء نموذج ماوس بالضربة قاضية للبديل الفائدة. ظهور نظام أكثر وضوحاً/Cas9 يمكن أن توفر طريقة سريعة لإنشاء مثل هذه الضربة القاضية 26. وبدلاً من ذلك، إذا كان نموذج خروج المغلوب ليس خياراً، يمكن استخدام تقنيات ضربة قاضية الكلاسيكية مثل الحقن المشترك النوكليوتيد morpholino العقاقير أو الكشف التدخل الصغيرة. ومع ذلك، مطلوب الاهتمام بتصميم التسلسل لتجنب أي تدخل محتمل مع الخيار ميكروينجيكتيد قيد الدراسة. على سبيل المثال، يمكن تصميم اليغنوكليوتيد morpholino لربط 5 'المنطقة غير مترجمة (5' UTR) من الجينات الماوس غير مضمنة في المتغير مرناً البشرية قدم عن طريق microinjection. إذا كان استخدام التدخل الصغيرة يمكن استهداف منطقة تسلسل غير المتجانسة الكشف واحد أو إدخال صامت الطفرات في الجينات البشرية التي سوف تهرب الاستهداف. ومع ذلك، بعد نسخ البروتين الذاتية لا تزال موجودة عند التعبير عن المتغير يمكن الزاخر بالمعلومات كما تم العثور على العديد من المتغيرات في حالة متخالف في الجينوم البشري.

أخيرا، على الرغم من عدم المبينة في هذا البروتوكول، كروموسوم انيوبلويدي التقييم يمكن سهولة تقييم في "الثاني التقى" البيض كالفحص النهائي في خط الأنابيب للتحليل البديل البشرية. وقد وصف وصفاً مفصلاً لهذا في الموقع كروموسوم نشر البروتوكول سابقا 15. بإيجاز، ميكروينجيكتيد بويضات نضجت في المختبر حتى تصل إلى مرحلة "الثاني التقى"، بعد العلاج مع وكيل ديبوليميريزينج شوكي هو قبل التثبيت. Kinetochore وتلطيخ الصبغي كما هو موضح هنا يسمح بتقييم لمحتوى الكروموسومات.

في حين توفر بويضات الماوس أداة قيمة لدراسة البروتينات الحاسمة للانقسام الاختزالي الإناث بعض القيود لوجود نموذج. Overexpression بروتينات يمكن التشويش هو نضوج وذلك بتركيز الحمض النووي الريبي قد لا توجد التي لا تحفز النمط الظاهري. وبالإضافة إلى ذلك، قد تتداخل homolog الماوس الذاتية مع تعريب بروتين البشري خارجية. توليد نماذج الماوس خروج المغلوب يوفر حلاً لهذه المشكلة؛ ومع ذلك، هذا قد لا تكون مجدية في كل الحالات. نهج بديل هو أن يستنفد البروتين الماوس بالحقن المشترك [رني] أو النوكليوتيد morpholino ترمي إلى الهدف لا خارجية الرنا والبروتين. وأخيراً، من المهم أن نلاحظ أنه في حين العديد من البروتينات المتجانسة بين الإنسان والفأر، قد توجد خلافات، مما يؤدي إلى اختلافات في التعريب والدالة التي يمكن أن يحول دون هذا النوع من التحليل عبر الأنواع. أدوات المعالجة الجينية مثل الجينوم Cas9 التحرير27 أصبحت أرخص وأكثر شيوعاً-المكان، يمكن أن تتطور هذا البروتوكول إلى جعل خطوط الماوس في ضرب، وأنسنة بدلاً من الاعتماد على microinjection.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

بتأييد هذا العمل "منحة بحثية" من "الجمعية الأمريكية" "الطب الإنجابي" وتشارلز وجوانا بوسكه الصندوق التذكاري في روتجرز، "جامعة الدولة في نيوجيرسي" "يماثل كانساس" تدعمها منحة من N.I.H. (F31 HD0989597).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99, (5), 1324-1331 (2013).
  2. Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22, (6), 1506-1512 (2007).
  3. Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. (2017).
  4. Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101, (3), 656-663 (2014).
  5. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2, (4), 280-291 (2001).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100, (3), 697-703 (2013).
  7. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100, (3), 624-630 (2013).
  8. Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5, (1), 24 (2012).
  9. Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107, (5), 1122-1129 (2017).
  10. Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. (2017).
  11. Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312, (1), 321-330 (2007).
  12. Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. (2017).
  13. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (8), 738-742 (2013).
  14. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. John Wiley & Sons, Inc. (2008).
  15. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
  16. Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, (6), 370-382 (2012).
  17. Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76, (11), 1094-1105 (2009).
  18. Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139, (11), 1947-1955 (2012).
  19. Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127, (Pt 23), 5066-5078 (2014).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178, (2), 393-402 (1996).
  21. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150, (5), 975-988 (2000).
  22. Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140, (18), 3719-3730 (2013).
  23. Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21, (8), 633-644 (2015).
  24. Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84, (1), 145-158 (1981).
  25. Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146, (1), 1-12 (1999).
  26. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, (4), 828-863 (2017).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics