Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

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Genetics

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Summary

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

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Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

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Abstract

Aneuploidía embrionaria es la principal causa genética de la infertilidad en los seres humanos. La mayoría de estos eventos se origina durante la meiosis femenina, y aunque se correlacionó positivamente con la edad materna, edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Por lo tanto, variantes genéticas podrían explicar la segregación incorrecta de cromosomas durante la ovogénesis. Dado que el acceso a ovocitos humanos es limitado para fines de investigación, se desarrollaron una serie de ensayos para estudiar la función del gen humano durante meiosis utilizando ovocitos de ratón. En primer lugar, el ARN mensajero (ARNm) del gen y la variante del gen de interés son microinyectados en ovocitos de ratón arresté a profase. Después de permitir tiempo para la expresión, ovocitos son liberados sincrónicamente en maduración meiótica para completar la meiosis I. Por marcado el ARNm con una secuencia de un reportero fluorescente, como la proteína verde fluorescente (Gfp), la localización de la proteína humana puede ser evaluada además de las alteraciones fenotípicas. Por ejemplo, ganancia o pérdida de función puede investigarse mediante el establecimiento de las condiciones experimentales que el producto génico para corregir errores meiotic. Aunque este sistema es ventajoso en la investigación de la función de la proteína humana durante la Oogénesis, adecuada interpretación de los resultados debe realizarse teniendo en cuenta que no es expresión de la proteína en los niveles endógenos y, a menos que controla (es decir, golpeado hacia fuera o hacia abajo), murinos homólogos también están presentes en el sistema.

Introduction

La infertilidad es una condición que afecta a 10-15% de la población humana de la edad reproductiva 1, de los cuales casi la mitad busca tratamiento médico 2. Aunque la etiología de la infertilidad es diversa y en muchos casos multifactoriales, la anormalidad genética más común en los seres humanos es aneuploidía embrionaria 3. Aneuploidía se define como la desviación (ganancia o pérdida) del número correcto de cromosomas en una célula. El fenómeno de la aneuploidía de los embriones humanos es común y aumenta con la edad maternal avanzada 4,5. Cuatro ensayos controlados aleatorios han destacado el beneficio de seleccionar embriones sólo cromosómicamente normales (euploides) para la transferencia uterina porque esta estrategia dio lugar a la creciente implantación de tarifas, tasas de aborto espontáneo y un tiempo más corto para lograr embarazo 6,7,8,9. Por lo tanto, entender la etiología de la aneuploidía humana puede tener implicaciones importantes en la reproducción asistida.

Aunque las pruebas genéticas preimplantacional de aneuploidías están beneficiosa en tratamientos de la infertilidad, todavía carece de una comprensión profunda de cómo originan aneuploidías. Es ampliamente aceptado que existe una correlación positiva de aneuploidías meióticas (originados durante la producción de gametos) y la edad materna, sin embargo, algunas tasas de aneuploidía embrionaria presente las mujeres que se desvían de la tasa media para su edad determinada 4. Estos casos sugieren que la edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Otros factores pueden jugar un papel en el aumento del riesgo de aneuploidía embrionaria, como variantes genéticas.

Un aspecto clave de investigar la posible contribución de una variante del gen a aneuploidía durante la meiosis del ovocito es diseñar un sistema para evaluar rápidamente la función del gen meiótica. Debido a las limitaciones éticas y acceso limitado, no es práctico para llevar a cabo estos experimentos con óvulos humanos. Estas cuestiones pueden eludirse mediante el uso de ovocitos de ratón, y aquí una serie de ensayos para evaluar la función humana del gene durante la meiosis se describen. Por microinjecting el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la variante del gen de interés, la localización de la proteína humana en el óvulo de ratón puede ser visualizada y utilizada para determinar si los resultados de la expresión ectópica de la proteína humana de tipo salvaje y mutada en cualquier alteraciones fenotípicas que podrían conducir a aneuploide. Estos fenotipos incluyen el aumento de microtúbulos que se adhieren a la incorrecta a hermana cinetocoro y la incapacidad para apoyar la alineación del cromosoma en metafase de la meiosis I. importante, este protocolo puede utilizarse para investigar tanto ganancia como pérdida de la función variantes genéticas mediante el establecimiento de condiciones experimentales específicas a eventos clave en la meiosis del ovocito como eje de alineación de edificio y el cromosoma 10.

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Protocol

1. molecular clonación

  1. Obtener completa secuencia de codificación del gen de interés y el plásmido en vitro transcripción (pIVT) vector11.
    Nota: Clones de cDNA de larga duración están comercialmente disponibles de distintos proveedores o pueden generarse mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El Centro Nacional de recursos en línea de información de biotecnología (NCBI) proporciona secuencias de genes de transcripción de los nucleótidos y expresó secuencia etiquetada bases de datos (EST). Para facilitar la proteína visualización y análisis de niveles de expresión, fusión a la proteína verde fluorescente (Gfp) u otra etiqueta fluorescente adecuado se pueden desear en la estrategia de clonación.
  2. Utilizando una estrategia de clonación validada, inserte la secuencia de codificación del gene de interés de la región de clonación múltiple de pIVT. Una descripción detallada de la clonación molecular y los pasos requeridos han sido previamente descritas 12.
    Nota: Si un producto de gene-fusion es que se generen, asegúrese de que la clonación es en el marco de lectura apropiado.
  3. La secuencia de la construcción usando las cartillas de la globina para asegurar la inserción génica correcta fusión en el marco adecuada y que no fueron creadas polimerasa inducida por las mutaciones de punto.
    Nota: Si no hay equipo de secuenciación del ADN Sanger, muchas empresas ofrecen bajo costo opciones de secuenciación de ADN.
  4. Mutagenize ADN si generar polimorfismos de nucleótido único (SNPs) o inserciones/deleciones (INDELS). Mutagénesis de DNA se describe en pasos 1.5-1.7 a continuación. Para construcciones de tipo salvaje, continúe con el paso de linearización 1.7.
  5. Diseño de cartillas de mutagénesis y completar la reacción de PCR de mutagénesis para generar mutante construir según el protocolo del fabricante. PCR mediada mutagénesis sitio-dirigida ha sido previamente descrito 13. Además, muchas empresas ofrecen kits de mutagénesis sitio-dirigida que incluyen protocolos.
  6. Transformar ADN mutagenized anfitrión bacteriano. Aislar y purificar plásmidos.
    Nota: Muchas compañías hacen kits que pueden utilizarse para aislar y purificar DNA plasmídico fácilmente. Seguir protocolo de fabricantes en consecuencia. Si se utiliza una cepa bacteriana gram-negativa como e. coli, se recomienda utilizar un kit que elimina las endotoxinas.
  7. La secuencia de la DNA aislada de transformantes bacterianos usando estándar secuenciación del ADN Sanger para confirmar la introducción de los SNP o INDEL deseados.
  8. Alinear los productos finales con una enzima de la restricción digestión de la DNA purificada.
    Nota: El vector pIVT contiene múltiples enzimas solo corte sitios listados en el mapa del plásmido Addgene 14.
  9. Asegúrese de que el producto es lineal a través de electroforesis en gel de agarosa. La metodología de electroforesis en gel de agarosa ha sido previamente definido 14.
    Nota: Para todos los pasos restantes, utilizar puntas de pipeta de barrera (filtro) y materiales libres de Rnasa para asegurar producción estable, de alta calidad RNA.
  10. Purificar el producto digerido utilizando un protocolo de limpieza de ADN o kit validado y eluir en 30 μl de agua libre de DNasa/Rnasa.
    Nota: Vuelta de matriz de sílice se recomiendan kits de columna de alta calidad, purificado de ADN. Seguir protocolo de fabricantes en consecuencia.
  11. In vitro transcribir DNA utilizando T7 polimerasa siguiendo el protocolo del fabricante.
  12. Purificar y eluir el RNA en 30 μl de agua libre de DNasa/Rnasa utilizando un kit de purificación de ácidos nucleicos basada en la columna de giro matriz de sílice siguiendo el protocolo del fabricante.
  13. Realizar la desnaturalización electroforesis del gel de agarosa usando formaldehído para confirmar el tamaño de producto final de RNA. Ver siguientes pasos 1.13 1.22 14. (Figura 1).
  14. Preparar gel calentando 1 g agarosa en 72 mL de agua hasta que se disuelva, luego enfriar a 60 ° C.
  15. Preparar 10 X MOPS funcionamiento tampón añadiendo 0,4 M MOPS (pH 7.0), acetato de sodio de 0.1 M y EDTA de 0.01 M.
  16. Añadir 10 mL de 10 X MOPS funcionamiento tampón y 18 mL de formaldehído al 37% (12,3 M) a la solución de agarosa refrescado.
  17. Casta el gel vertiendo la solución de agarosa en un recipiente de formación de gel. Utilice un peine grande para dar cabida a 10 μl. Después de gel ha establecido y es firme al tacto, retire suavemente el peine.
  18. Montar el gel en la Cuba de electroforesis, y añadir suficiente buffer corriente 1 X MOPS asegurando el gel está completamente cubierto.
  19. Preparar la muestra de RNA mediante la adición de 1 μg de ARN de 0,5 volúmenes de X de tinte de carga que contiene formaldehído.
  20. Añadir bromuro de etidio a la solución de RNA en una concentración de 10 μg/mL.
  21. Desnaturalizar la solución de la muestra de RNA a 70 ° C durante 5 minutos.
  22. Con estéril, extremidades de filtro de 10 μl, 5 μl del marcador de peso molecular de la carga y 5 μl de ARN de muestras en pocillos separados del gel y electrophorese a 5 V/cm hasta que el tinte ha migrado por lo menos dos tercios de la longitud del gel.
  23. Visualizar el ARN en el gel un iluminador de trans UV. Asegúrese de que el ARN es la talla correcta por comparación con el marcador de peso molecular.
  24. Para medir la concentración y la pureza del ARN, transferencia de 1,2 μl de ARN purificado utilizando estéril 10 μl puntas de filtro en un espectrofotómetro UV.
    Nota que el RNA de alta calidad debe tener proporciones de absorbancia de A260/280 (1.8-2.2) y 260/230 (> 1,7) respectivamente.
  25. Usando 10 μl puntas de filtro, alícuotas del RNA purificado restantes en estéril 0,5 μl los tubos de centrífuga (3-5 μl/tubo). Almacenar los tubos a-80 ° C hasta que esté listo para la microinyección.
    Nota: Una concentración de final de la inyección de 500 ng/μl es un óptimo punto de partida. Se recomienda diluir RNA 1:2 en Rnasa free H20 antes de la microinyección para reducir la viscosidad de RNA en pipeta de microinyección.

2. cinetocoro-microtúbulo accesorio ensayo

  1. Ovocitos se dividen en grupos iguales para la microinyección.
    Nota: Recolección de ovocitos, transferencia, microinyección y maduración meiótica se ha descrito en detalle en JoVE previamente 15.
  2. Microinject un grupo con el mRNA experimental y el otro tipo con el control de peso y PBS o Gfp mRNA.
    Nota: 500 ng/μl es la concentración de inyección recomendado comenzar con 10. Un picoinjector puede utilizarse para controlar la cantidad de inyección. Se recomienda un volumen de inyección de 5-10 pL 15.
  3. Con una mano o boca operado el aparato pipeteo donde el vidrio pipeta apertura es ligeramente más grande que el diámetro de un oocito (100-150 μm), con transferencia de ovocitos en una gota de 100 μl de medio de cultivo libre de milrinona en una placa Petri cubierto en aceite mineral calidad de embrión e incubar ovocitos de 7 h a 37 ° C en 5% C02 para permitir la suficiente maduración metafase de la meiosis I (se reunieron) 15.
  4. Después de la incubación, usando el mismo aparato de pipeta como la anterior, transferencia de ovocitos en una placa de cultivo de órgano del centro de pozo que contiene 700 μl de medio de colección previamente enfriada medio esencial mínimo (MEM) en el centro bien y 500 μl de H20 en el anillo exterior y Coloque el plato en hielo durante 7 minutos.
    Nota: Se recomienda enfriado previamente medios MEM y centro bien platos de cultura órgano a-20 ° C durante al menos 20 minutos antes del tratamiento de los ovocitos.
  5. Fijar los ovocitos mediante la transferencia utilizando el aparato de la pipeta en un pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL de 2% paraformaldehído en 1 X PBS por 20 min a temperatura ambiente.
  6. Usando la misma pipeta aparato, transfiera los ovocitos en otro pozo en una placa de punto conteniendo 400 μL solución bloqueo (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3) y tienda a 4 ° C hasta que esté listo para proceso de inmunotinción.
    Nota: para el almacenamiento de ovocitos a 4 º C, vidrio de cubierta placa punto con parafilm para evitar la evaporación.
  7. Utilizando el mismo aparato de pipetas, ovocitos transferencia a un nuevo pozo en un lugar que contenga solución de permeabilización 400 μL (PBS BSA 0,3% 0,1% TritonX-100 + 0.02% NaN3) de la placa e incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos ovocitos transferencia rápida a través de tres gotas de 400 μL solución para quitar cualquier detergente residual de bloqueo.
    Nota: Una placa de vidrio claro 9-bien spot funciona bien para mover grupos a través de múltiples tratamientos en un mismo plato (pasos de 2.4-2.5).
  8. Realizar los procedimientos de inmunocitoquímica restantes en una cámara humidificada, protegidos de la luz a temperatura ambiente. Uso un recipiente de plástico de tamaño mediano forrado con toallas de papel húmedo y cubra con papel de aluminio.
  9. Usando el aparato de la pipeta, transfiera los ovocitos a 30 μL bloqueando la solución en la tapa de una placa de 96 pocillos y un lugar dentro de la cámara humidificada durante 10 minutos.
    Nota: Las gotas se colocan en la sangría circular sobre la placa.
  10. Etiqueta de centrómeros y huso, usando el aparato de la pipeta, transfiera los ovocitos a 30 μL solución que contienen el antígeno anti-centromérico (ACA, cresta) de bloqueo (1:30) y tubulina acetilada anti (1: 1000) e incubar durante al menos 1 h.
  11. Enjuague los ovocitos mediante la transferencia a través de gotas tres 30 μl de bloquear la solución durante 10 minutos.
  12. Usando el aparato de la pipeta, transferencia de ovocitos a 30 μl de la gota de solución de bloqueo con anticuerpos secundarios gratuitos a los anticuerpos utilizados anteriormente (anti-human IgG 1: 200, anti-mouse IgG 1: 200) e incubar durante 1 h.
  13. Repita los pasos de enjuague 10 minutos 3, en 30 μL solución de bloqueo como se describe en el paso 2.11.
  14. Transfiera los ovocitos, usando el aparato de la pipeta, en 3-5 μl de DAPI que contiene medio de montaje (5,9 μg/μl) sobre un portaobjetos de vidrio.
  15. Coloque 4 gotas pequeñas (tamaño de una cabeza de alfiler) de vaselina en las esquinas del cubreobjetos para evitar la trituración de los ovocitos.
  16. Suavemente Coloque el lado de jalea de petróleo cubre-objetos hacia abajo en la diapositiva.
  17. Sello de cubreobjetos los bordes con clara esmalte de uñas y dejar para secar durante 5 minutos.
  18. Almacenar diapositivas a 4 ° C, protegido de la luz, hasta el procesamiento mediante microscopía confocal.
    Nota: Asegúrese que el índice de refracción del medio de montaje y cubreobjetos, partidos los objetivos del microscopio utilizados. Montaje recomendado materiales han sido previamente descritas 15.
  19. Ovocitos con un objetivo de x 40-63 en un microscopio confocal, capturando pequeños pasos de la imagen (≤ 1 μm) en el plano z, optimizado para la objetivo de trabajo y la imagen toda la región del huso en metafase.
    Nota: Asegúrese de que a la imagen de los 3 canales basados en anticuerpos secundarios utilizados en el paso 2.11. Imagen promedio de ≥ 4 y un zoom de 3 es ideal para la resolución adecuada. Un tamaño de paso de 1 μm proporciona la visualización clara de los microtúbulos y los cinetocoros en ovocitos de ratón. El procedimiento para la captura de la imagen variará de un microscopio para microscopio. Por favor consulte la guía de usuario confocal de fabricantes para pasos específicos sobre cómo configurar opciones de microscopio.
  20. Identificar el estado del accesorio de cinetocoro-microtúbulo usando proyección de imagen software siguiendo pasos 2.21-2.23 abajo.
    Nota: Los pasos siguientes describen este procedimiento utilizando el software descargable gratis imagen J (NIH), sin embargo, puede utilizarse software de tratamiento de imágenes alternativo. Estado de conexión tipos previamente han sido definido 16 .
  21. Abre la imagen arrastrando el archivo en la barra de herramientas imagen J.
  22. En la serie de z-abierta, hacer todos los canales visible (ADN, cinetocoro y huso) haciendo clic en "combinar canales", disponible en el menú "imagen", en la pestaña "color" del sub.
  23. Usando la palanca en la parte inferior de la imagen, pasar cada rodaja z y determinar accesorio de microtúbulos del cinetocoro. Accesorio detallada descripciones han sido previamente descrito 16

3. cromosoma alineación desafío ensayo

  1. Usando el aparato de pipeta como se describe en el paso 2.3, transferencia de ovocitos en una gota de 100 μl de medio de cultivo libre de milrinona en aceite e incubar ovocitos de 7 h permitir la suficiente maduración metafase de la meiosis I (se reunieron) como se describió anteriormente en el paso 2.3 17 .
    Nota: Los procedimientos de colección, la microinyección y la maduración de ovocitos se perfilaron previamente 15. Consulte el Protocolo adjunto en pasos 2.1-2.2 para controles y concentraciones de microinyección de RNA.
  2. Utilizando el mismo aparato de pipetas, transferencia de ovocitos a una cultura de centro bien órgano plato que contenga medio de cultivo 700 μl que contiene monastrol [100 μm] en el centro bien y 400 μL H20 en el anillo circundante e incuban a 37 ° C durante 2 h.
  3. Enjuague monastrol por transferencia de ovocitos, usando el aparato de pipeta como anteriormente, a través de tres gotas de 100 μl de medio de cultivo CZB y entonces transfiera los ovocitos a una placa de cultivo de órgano centro-pozo nuevo con 700 μl de medio de cultivo + MG132 [5 μm] 3 h en el centro anillo. Añadir 400 μL de H20 en el anillo exterior.
  4. Fijar los ovocitos mediante la transferencia, usando el aparato de la pipeta, en un pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL 2% paraformaldehído en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.
  5. Después de la fijación, transfiera los ovocitos, usando el aparato de la pipeta, en un nuevo pozo de una placa de punto de cristal que contiene 400 μL solución de bloqueo y almacenar a 4 ° C hasta procesan para la inmunotinción.
    Nota: para el almacenamiento de ovocitos a 4 º C, vidrio de cubierta placa punto con parafilm para evitar la evaporación.
  6. Permeabilizar y ovocitos mediante inmunocitoquímica la etiqueta como se describe en pasos 2.6-2.16.
  7. Ovocitos con un objetivo de x 40-63 en un microscopio confocal, capturando la imagen < pasos de 1 μm en el plano z para toda la región del huso en la metafase de la imagen.
  8. Para identificar la alineación del cromosoma estado abrir archivos de imagen utilizando el software de imágenes.
    Nota: Los pasos siguientes describen este procedimiento utilizando el software descargable gratis imagen J (NIH), sin embargo, puede utilizarse software de tratamiento de imágenes alternativo.
  9. Arrastre la imagen en panel de control de imagen J.
  10. En la serie de z-abierta, use la herramienta de punto (disponible haciendo clic en el icono de punto en la barra de control de imagen J) para marcar puntos al final de cada polo del huso en sus respectivas divisiones z Coloque la herramienta sobre el polo del huso en la imagen y haciendo clic en la imagen. Pulsar Comando + t en el teclado para agregar estos puntos a la región de manager de interés (ROI).
  11. Determinar las coordenadas específicas para cada una de las posiciones que se encuentra en paso 3.10 resaltando el punto específico en el administrador de ROI y clic en el botón de la medida. Esto le proporcionará resultados de una tabla que contiene x y y coordenadas de cada punto. Estos serán los puntos de X1, Y1 y X1, Y2, respectivamente.
  12. A continuación, determinar la coordenada verdadera Z. Esto se hace multiplicando el número de corte de la rodaja z específico en la z-pila en que fue identificado el polo del huso (es decir, segmento #2 de 6) que cada punto individual está en el espesor de la pila (es decir, 1 μm) (ejemplo: corte 2 x 1 μm = 2). Estos serán los puntos Z1 y Z2 respectivamente.
  13. Determinar la longitud del huso usando la ecuación del teorema de Pitágoras (a2 + b2 = c2) usando previamente definida x, y, z coordenadas de pasos 3.11-3.13. Para cada huso es igual a la longitud final:
    √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)
  14. Determinar el midzone del huso. Esto se calcula como la mitad de la longitud del huso. Con la herramienta de línea de J de la imagen, haciendo clic en el icono de la línea en la barra de herramientas imagen J, trace una línea que es de un polo del huso el midzone del huso. La longitud se mostrará en la barra de herramientas imagen J.
  15. Determinar estado de alineación del cromosoma cromosoma distancia el midzone del huso usando la herramienta de medición de la línea de evaluación. Con la herramienta de línea disponible haciendo clic en el icono de la línea en la barra de herramientas imagen J, trazar una línea desde el midzone del huso a los cromosomas. La longitud se mostrará en la barra de herramientas imagen J. Superior a 4 μm del midzone del huso de los cromosomas se consideran no alineados 18.

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Representative Results

Después en vitro transcripción RNA de alta calidad tendrá una relación A260/A280 de (1.8-2.2) y un ≥1.7 de relación A260/A230 medido usando un espectrofotómetro. La imagen en la figura 1 muestra la migración de in vitro-produce el RNA en un gel de agarosa desnaturalización después de electroforesis. Una banda que es manchada en patrón o muestra que tiene múltiples bandas de tamaño puede indicar contaminación o degradación de la muestra. Alternativamente, pueden indicar múltiples bandas que el mRNA no es completamente desnaturalizado, o el plásmido partido no era completamente lineal. El mRNA se ejecutará más grande de lo previsto debido a la cola de poli-adenylated construida en pIVT, que permite la expresión estable de mRNA in vitro. Después de la microinyección se recomienda para volúmenes de inyección uniforme y niveles de expresión mediante microscopia fluorescente. La imagen en la figura 2 muestra profase-arresté ovocitos inyectados uniformemente con Gfp. Técnica de microinyección constante es fundamental para este protocolo. Software de análisis de imagen, como la J imagen, puede utilizarse para validar los niveles de expresión para garantizar la uniformidad y el dominio de la técnica. Tenga en cuenta que al hacer la proyección de imagen para ambos ensayos se puede obtener información de localización subcelular. Para todos los experimentos de microinyección evaluaron los efectos de una variante del gen, el gen de tipo salvaje debe ser inyectado en un subconjunto de los ovocitos para servir como un control. Esto permite al control de los posibles fenotipos de la sobreexpresión del gen humano en un ovocito de ratón. PBS, o Gfp para construcciones fluoróforo, deberá también ser inyectado en un subgrupo de los ovocitos control para fenotipos inducida por microinyección. Para construcciones sin una etiqueta fluorescente, Gfp mRNA puede ser co-inyección para microinyección suficiente. Si conjuntamente inyectar simultáneamente dos o más construcciones Asegúrese de aumentar la concentración de mRNA que la solución final contiene 500 ng/μl de cada mRNA.

El ensayo de frío estable microtúbulos proporciona una valiosa herramienta para evaluar el estado del accesorio de cinetocoros a microtúbulos. Figura 3 es una z-proyección de una imagen de microscopio confocal de una metafase I ovocito. Este ovocito se sometió a tratamiento de frío medios para despolimerizar los microtúbulos que habían no Unidos a cinetocoros. Ovocitos que han sido tratados por un tiempo suficiente contiene fibras de microtúbulos no Unidas a los cromosomas (resultados demasiado cortos en muchas fibras) o falta de fibras todos juntos (resultados demasiados en ninguna estructura del huso) y es recomiendan que estos ovocitos no utilizar en el análisis. En metafase de la meiosis es común para ovocitos contenga cinetocoros lateralmente Unidas o separadas, por lo tanto se recomienda utilizar un grupo control en el estudio de cualquier accesorio. En promedio, tipo salvaje ovocitos contienen 5-10% de los cinetocoros en la voluntad de MI no todavía ser estable Unido 19. Es fundamental que todos los ovocitos en el mismo escenario para el análisis de estado de conexión cinetocoro-microtúbulo. Para asegurar que experimental y grupos de control maduro con escalas similares es recomienda para evaluar la cinética del ciclo celular. Para realizar este ensayo, un subconjunto de ovocitos experimentales y de control debe ser madurado y visualizado vivo en time-lapse Microcopia. El uso de milrinona permite ovocitos para que se sincronice en profase de la meiosis I, tal que la liberación en los medios de comunicación falta de milrinona con permite la reanudación de la meiosis en el mismo tiempo 20. Ovocitos de control y grupos experimentales deben sacar un cuerpo polar, indicativo de alcanzar metafase de meiosis II (Met II), en momentos similares. Si no hay microscopio de células vivas, ovocitos pueden ser madurados para Met I (7 h) y se reunió II (16 h), fijado y teñido para detectar ADN y microtúbulos como se describió anteriormente. En el Met I y II se reunió un huso bipolar, en forma de barril debe ser visible. En ovocitos de control, los cromosomas deben estar alineados en la placa de metafase. La alineación de los cromosomas se diferencia en grupos experimentales según variante afecta, sin embargo, los cromosomas deben ser condensados y Unidos a microtúbulos con la mayoría de los cromosomas, situado en el eje. Un número similar de ovocitos debe han llegado a la meiosis II en el control y grupos experimentales. Para reducir las dificultades accesorio para determinar estado es aconsejable ovocitos mediante pequeños pasos en el plano z, la proyección de imagen optimizado para el objetivo específico de trabajo. Análisis implicará ver z-rebanadas individualmente y en configuración combinada para determinar que poste que une los microtúbulos emanan. Figura 3B muestra ejemplos de accesorios anormales cinetocoro-microtúbulo. Es un bivalente en que sólo una hermana par de kinetochore se une a un microtúbulos del huso, definido como un no accesorio. A continuación, un accesorio de la syntelic se muestra en que ambos hermana pares cinetocoro se unen al mismo polo del huso. Por último, un accesorio de la merotelic se muestra en que una hermana cinetocoro está conectado a ambos polos del huso, mientras que la otra hermana cinetocoro del par está conectado a un polo del huso solo.

Las imágenes en la figura 4 ilustran el ADN esperado progresiva y configuraciones de husillo mientras uno se mueve a través de los pasos de la prueba de desafío de alineación de cromosoma. En este ensayo es importante que diferentes grupos experimentales progresan a través de la meiosis con cinética similar. Como se describe anteriormente es recomendar a completar análisis de cinética del ciclo celular antes de realizar el ensayo de desafío. En este ensayo, se evaluó la habilidad de ovocitos con éxito corregir los accesorios anormales cinetocoro-microtúbulo. Para probar esto, los ovocitos son madurados primero a Met I para permitir archivos adjuntos cinetocoro-microtúbulo a establecerse. A continuación, ovocitos se incuban en monastrol y quinesina 5 (EG5) inhibidor, que se derrumba el huso bipolar en un huso monopolar 21. La generación de un huso monopolar induce los accesorios incorrectos microtúbulo-cinetocoro de 100%. El inhibidor de la monastrol entonces se lavan hacia fuera para permitir la recuperación. Durante el período de recuperación los ovocitos regeneran un huso bipolar e intentan corregir los accesorios de microtúbulos. Adición de inhibidor de la proteasoma MG132 previene el inicio de la anafase. Como un control, un pequeño subconjunto de ovocitos de cada grupo experimental se puede fijar en cada etapa del Protocolo (me, monastrol Tratado, Met recuperación de correos) para todos los grupos responden a los tratamientos y en la misma medida. Metafase I ovocitos deben contener un huso bipolar en forma de barril con los cromosomas alineados en la placa de metafase. Ovocitos tratados con monastrol deben contener un huso monopolar con cromosomas orientados alrededor del poste único. Ovocitos recuperados una vez más deben contener un huso bipolar en forma de barril. Alineación del cromosoma se define como cualquier cromosomas más de 4 μM del huso como 22. Es útil para ovocitos para detectar ADN y cinetocoros para establecer si ambos cinetocoros están fuera de esta zona central como esto puede ser difícil de determinar utilizando sólo la detección de ADN de la mancha.

Figure 1
Figura 1. Denaturingagarose electroforesis de ARN de. Tamaño y la calidad del RNA pueden ser evaluadas mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalización. Un desnaturalización gel se recomienda para prevenir la formación de la estructura secundaria. Carril 1 contiene un marcador de peso molecular de RNA. Carril 2 es una muestra de RNA. Tenga en cuenta que el ARN se ejecutará mayor de lo calculado debido a la cola polyA incorporado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Validación de microinyección de ovocitos. Microscopía fluorescente puede utilizarse para validar la expresión y microinyección de ovocitos exitosa. Ovocitos arresté profase microinyectados con Gfp se muestran después de la expresión de la construcción. Esta imagen fue obtenida usando el EVOS de Invitrogen FL Auto sistema equipado con cubo de luz de GFP de imagen. Barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Evaluación de los accesorios del cinetocoro-microtúbulo. (A) A representante z-proyección de un tratamiento de frío se reunió I ovocito. Huso (verde), cinetocoros (rojo) y ADN (azul) se muestran. El cuadro indica la región del zoom óptico. Puntas de flecha indican finales en archivos adjuntos de cinetocoros a microtúbulos de un bivalente solo. Barra de escala es 10 μm para huso, cinetocoro, ADN y combinar canales. Barra de escala para el zoom óptico es de 5 μm. (B) ejemplos de tipos de archivos adjuntos de cinetocoro-microtúbulo, anómalo en ovocitos de ratón. Las flechas indican los sitios de conexión cinetocoro-microtúbulo. Barra de escala es 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Análisis de cromosoma alineación reto. Diagrama de flujo del procedimiento con representante z-proyecciones de ovocitos en cada paso. Primero se maduraron ovocitos metafase de la meiosis I (se cumplen), luego se transfiere a un plato nuevo que contiene monastrol por 2 h para inducir la formación de huso monopolar. Ovocitos próximos pueden recuperarse en medio de maduración con un inhibidor de la proteasoma (MG132) para prevenir el inicio de la anafase durante 3 horas. Una vez recuperados los ovocitos son fijos, etiquetados para huso (verde), cinetocoros (rojo) y ADN (azul) y reflejados a través de microscopía confocal para determinar el estado de alineación. Las líneas indican la longitud del huso (40 μm) y del huso midzone (20 μm) se determinó usando la ecuación del teorema de Pitágoras. Las flechas indican posiciones de herramienta de punto en cada polo. Cualquier cinetocoros > 4 μm desde el midzone del huso se consideran no alineados. Asterisco indica cromosoma no alineado (5,6 μm de midzone). Barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Debido a la rápida y creciente identificación de variantes genéticas humanas asociadas con la enfermedad, es esencial que se establezcan sistemas para evaluar su significado biológico. Comprender la función de la proteína en meiosis humana plantea desafíos particulares porque son preciosos ovocitos humanos y espermatozoides humanos y raros no son susceptibles de manipulación genética. Ovocitos de ratón son un sistema mamífero modelo valioso para la evaluación de genes humanos meiótica función 10,23. Este modelo omite las vaguedades de utilizar óvulos humanos mientras que proporciona una fuente fácilmente disponible de ovocitos bajo costo y manipulables que sufren meiosis similar a las células germinales humanas mientras que siendo útil para la comprensión de variantes genéticas cómo puede afectar la mujer fertilidad.

Estos métodos emplean la expresión ectópica de la proteína humana en ovocitos de ratón mediante microinyección, es fundamental establecer primero una concentración de control, de tipo RNA que no altera la maduración meiótica. Se recomienda que la cinética de maduración meiótica son monitoreados (degradación de la envoltura nuclear, protuberancia del cuerpo polar) en ovocitos de control para establecer parámetros de línea de base y evaluación morfología del huso y los cromosomas. Además, asegurar volúmenes de microinyección uniforme es fundamental para comparar grupos. Incluyendo una etiqueta fluorescente en el gen de interés puede simplificar este reto técnico. Técnicas para dominar la microinyección de ovocitos han sido previamente demostrado 15. Visualización de ovocitos inyectados bajo un microscopio de fluorescencia o determinar la expresión de proteínas por western blot son también herramientas valiosas para confirmar concentraciones de inyección constante.

Debido a errores en la segregación cromosómica en oocitos mamíferos son la principal causa de aneuploidía embrionaria y embarazo pérdida5, análisis de archivos adjuntos de cinetocoro-microtúbulo proporcionan una herramienta valiosa para evaluar si un gen de interés afecta a segregación cromosómica (es decir los accesorios incorrectos causan segregación errónea). Una exposición de 10 minutos a media fría es suficiente para despolimerizar los microtúbulos que no han hecho un accesorio de cinetocoro-microtúbulo, permitiendo visualización de adjuntos estables mediante microscopía confocal 24. Para este análisis, es importante para no enfriar demasiado los ovocitos como esto conduce al despolimerización de los microtúbulos estables. Además, optimización de procedimientos de tinción es clave para la visualización de las estructuras cinetocoros y microtúbulos. Para asegurar la resolución de imagen adecuada para el análisis, pasos pequeños (≤ 1 μm) en el plano z con un 40 x x-63 objetivo debería ser capturado, y obtener imágenes a través de la estructura del huso entero para todos los accesorios son visibles. Tenga en cuenta que es común tener suelto los cinetocoros durante la prometafase de la meiosis 25.

El ensayo de desafío de cromosoma alineación es útil para la evaluación de variantes de la ganancia o pérdida de función. Variantes de ganancia de función pueden ser difíciles de evaluar porque los ovocitos de ratón de las mujeres jóvenes tienen niveles bajos de aneuploidía. Este análisis supera este obstáculo mediante la generación de una situación en la que el ovocito debe corregir los accesorios cinetocoro-microtúbulo incorrectas inducida experimentalmente. Establecimiento de un punto de tiempo en que los ovocitos control contienen cromosomas desalineados 1-2 después de recuperación proporciona un escenario cuantificable para determinar si un mutante proporciona alineación mayor eficiencia (es decir, mejor alineación de las capacidades que proteger euploidy). Para la cuantificación de desalineación del cromosoma, un protocolo previamente establecido en que los cromosomas superiores a 4 μm de huso midzone se caracterizan como no alineado puede ser usado 18.

Para estudiar la pérdida de función variantes, condiciones experimentales adicionales son necesarias debido a lo endógeno homólogo dentro del sistema de estudio. Una forma de aliviar este problema es utilizar o generar un modelo de ratón knockout de la variante de interés. La llegada del cajón para verduras/Cas9 sistema podría proporcionar una forma rápida para generar estos agujeros ciegos 26. Alternativamente, si un modelo de golpe de gracia no es una opción, podrían emplearse técnicas clásicas de precipitación como co inyección de oligonucleótidos antisentido morfolino o small RNAs interferentes. Sin embargo, atención al diseño de la secuencia es necesaria para evitar cualquier posible interferencia con la variante microinyectada en estudio. Por ejemplo, el oligonucleótido morfolino podría ser diseñado para enlazar a la región 5' no traducida (5' UTR) del gene del ratón que no está incluido en la variante del mRNA humano introducida por microinyección. Si usa interferir pequeño RNAs uno podrían atacar una región no homóloga secuencia o introducir silenciosas mutaciones puntuales en el gen humano que sería evadir dirigida a. Sin embargo, tener la copia de la proteína endógena sigue presente en la expresión de la variante puede ser informativo como muchas variantes se encuentran en el estado heterocigoto en el genoma humano.

Finalmente, aunque no se describe en este protocolo, evaluación de aneuploidía del cromosoma puede ser fácilmente evaluada en huevos II se reunieron como el ensayo final en la tubería para el análisis de la variante humana. Una descripción detallada de este en situ cromosoma difundir protocolo descrito previamente 15. Brevemente, ovocitos microinyectados son madurados en vitro hasta llegar a la etapa II se reunieron, después de un tratamiento con un agente del huso despolimerizantes meiótico antes de la fijación. Cinetocoro y cromosoma de tinción como se describe aquí permite evaluación del contenido de cromosomas.

Mientras que los ovocitos de ratón proporcionan una herramienta valiosa para el estudio de las proteínas críticas para la meiosis femenina algunas limitaciones a la existencia del modelo. La sobreexpresión de proteínas puede perturbar la maduración meiótica y, por tanto, no puede existir una concentración de RNA que no induce un fenotipo. Además, el homólogo del ratón endógeno puede interferir con la localización de la proteína humana exógena. Generación de modelos de ratón knockout proporciona una solución a este problema; sin embargo, esto no puede ser factible en todas las situaciones. Un enfoque alternativo sería agotar la proteína de ratón mediante la inyección conjunta de ARNi o morfolino oligonucleótidos diseñaron para no actuar el exógeno RNA y la proteína. Por último, es importante tener en cuenta que mientras muchas proteínas son homólogas entre humano y el ratón, pueden existir diferencias, lleva a diferencias en la localización y la función que podría impedir que este tipo de análisis entre especies. Como herramientas de manipulación genética como genoma Cas9 edición27 convertido en más barato y más común-lugar, este protocolo puede evolucionar en la fabricación de líneas de ratón knock-in, humanizado en lugar de depender de microinyección.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la sociedad americana de medicina reproductiva y de la Charles y Johanna Busch Memorial Fund en Rutgers, Universidad Estatal de NJ a K.S. A.L.N. fue apoyado por una subvención de la I.N.S. (F31 HD0989597).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

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References

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