Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Immunology and Infection

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Summary

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

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Balczon, R., Francis, M., Leavesley, S., Stevens, T. Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (137), e57447, doi:10.3791/57447 (2018).

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Abstract

Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.

Introduction

Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.

Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.

Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika13getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem14,15nachgewiesen.

Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.

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Protocol

Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren16zubereitet.

1. Generation von zytotoxischen Überstände

Hinweis: Hier verwenden wir zwei verschiedene Stämme von p. Aeruginosa: PA103, die verfügt über eine intakte Typ III-Sekretion in der Lage, die Exoenzymes ExoU und ExoT auf Zielzellen zu übertragen, während der Infektion und ∆PcrV, die einen Typ-III-Sekretion System fehlt und ist nicht in der Lage Exoenzymes auf Zielzellen nach Impfung zu übertragen.

  1. Bakterien auf Vogel-Bonner (VB) Agar-Platten17 Streifen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.
    1. Um Platten vorzubereiten, machen die folgenden Stammlösung (Vogel-Bonner Salze; 10 X Lager): 2 g MgSO4, 20 g Zitronensäure (freie Säure), 100 g K2PO4und 35 g NaH2PO4zu messen. 1 L und Autoklaven für 15 min mit langsamen Auspuff DdH2O hinzufügen.
    2. Platzieren Sie 7,5 g Agar in 450 mL DdH2O und Autoklaven wie oben beschrieben.
    3. Legen Sie nach Autoklavieren beide Lösungen in ein Wasserbad von 50 ° C abkühlen lassen.
    4. 50 mL der 10 X VB Salz Vorratslösung zu Agar hinzufügen.
    5. 400 µg/mL (für die Stämme von p. Aeruginosa verwendet wird) Carbenicillin hinzu und mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche.
    6. Platz 5 mL der VB-Agar-Lösung in einzelnen sterilen Kultur Gerichte erlauben das Agar zu festigen, und dann bei 4 ° C bis zum Tag der bakterielle Aussaat aufbewahren.
    7. Am Tag der bakterielle Aussaat wärmen Sie eine Platte auf 37 ° C vor und dann Streifen Sie Bakterien auf die Platte mit einer sterilen Schleife. Ort der Platte in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.
  2. PMVEC Reinheit überprüfen, indem Sie positive Färbung mit fluoreszierenden Griffonia Simplicifolia Lektine und negative Färbung mit fluoreszierenden Helix Pomatia Lektin (ein Marker für arterielle Endothelzellen). Aliquoten Zellen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
  3. Pflegen Sie für Experimente Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und wachsen Sie Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2. Verwenden Sie Zellen bei Passagen 5-15.
    1. Für die Erzeugung von zytotoxischen Überstände Platte 2 x 106 Zellen in einzelne 150 cm Gerichte und wachsen für 3-4 Tage bis Zusammenfluss erreicht ist. Verwenden Sie zwei Platten pro Experiment (siehe unten).
    2. Für die Analyse von zytotoxischen Überstände Platte 1 x 105 Zellen in einzelnen Vertiefungen eines 6-gut austeilen und für vier Tage, bis Zusammenfluss erreicht wird wachsen.
  4. Um überstand zu produzieren, eines der zwei 150 cm Gerichte des PMVECs aus Schritt 1.3.1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung waschen, trypsinize und dann zählen die Zellen (wir verwenden einen automatisierte Zelle Zähler und Folgen des Herstellers Protokoll; sehen Sie Tabelle der Materialien). Das andere Gericht des PMVECs mit Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) waschen und dann mit beiden Stamm von p. Aeruginosa bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 20:1 zu infizieren. Dies wird folgendermaßen erreicht:
    1. Für p. Aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 KBE/mL. Zur Vorbereitung dieser Verdünnung fügen Sie 1 mL HBSS eine 1 mL-Einweg-Küvette hinzu. Kratzen Sie genug Bakterien aus der Platte, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurde, bis ein OD-540 von 0,25 erreicht ist, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Im nächste Schritt wird eine Berechnung der wieviel Bakterien benötigt werden bieten.
    2. Sobald die Anzahl der PMVECs in der Kulturschale bestimmt ist (Schritt 1.4 oben), bestimmen die entsprechende Anzahl von Bakterien, die zweite, nicht trypsiniert Kulturschale mit der PMVECs hinzugefügt werden soll. Beispielsweise, wenn feststeht, dass der Kulturschale PMVECs 1,3 x 107 Zellen enthält, dann bereiten Sie 1,3 x 107 Zellen X 20 Bakterien/Zelle X 1 mL/2 x 108 KBE = 1,3 mL Bakterien.
    3. Verdünnen Sie die 1,3 mL Bakterien in HBSS zu einem Endvolumen von 20 mL, so dass die gesamte Oberfläche des einen 150 cm Schüssel kann mit Flüssigkeit bedeckt sein, dann fügen Sie die verdünnten Bakterien auf die Platte des PMVECs.
    4. Die PMVECs beimpft mit den Bakterien bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 4-5 Std. bis Lücken zu sehen in der Zelle monomolekularen Film bilden, wenn die Platte mikroskopisch beobachtet wird (siehe Abbildung 1 für die richtige Ebene der Spaltbildung) inkubieren.
    5. Den überstand zu sammeln, dann Zentrifugieren für 10 min bei 2.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge, zelltrümmer zu entfernen.
      Hinweis: Jede Tischplatte Zentrifuge in der Lage, erzeugen ausreichend g zwingen, pellet-unlysed Zellen und großzellige Fragmente können für diesen Schritt verwendet werden.
    6. Gießen Sie den überstand in eine Spritze, die einen 0,2 µm-Filter angebracht zu seinem Ende, dann den Überstand durch den Filter zu entfernen Bakterien übergeben hat.
    7. Verwenden Sie ein Aliquot des sterilen Überstands Zytotoxizität zu testen (siehe 2.1) und den Rest des Überstands bei-80 ° C zur späteren Verwendung einfrieren.

2. Analyse der zytotoxischen Überstände

  1. Zytotoxizität Assay
    1. PMVECs in 6-Wohlen Teller bis Zusammenfluss wachsen. Wash-Brunnen hinzufügen, einmal mit HBSS, dann 1,5 mL Filter sterilisiert überstand (gesammelt von entweder geimpft PA103 oder ∆PcrV Zellen) individuelle Vertiefungen. Geben Sie sterile HBSS in einem anderen als Negativkontrolle.
    2. Legen Sie die Platte in den CO-2 -Inkubator für 21-24 h, dann Zelle Tötung/Zytotoxizität zu beobachten (siehe nächster Schritt). Überstände, die Zytotoxizität für weitere Experimente zeigen, und verwerfen Sie die Zelle Tötung nicht angezeigt werden.
    3. Quantifizierung der Zelle Tötung
      1. Maßnahme Laktat-Dehydrogenase (LDH) Entlassung aus abgestorbenen Zellen, die mit im Handel erhältlichen LDH-Assay Kits und des Herstellers empfohlenen Verfahren.
      2. Alternativ zu quantifizieren Zelle Tötung mikroskopisch mit ImageJ-Software. Dafür, mikroskopische Aufnahmen und Bereichen der Kulturschale mit intakten Zellen aufnehmen, dann quantifizieren Regionen fehlen Zellen (indikativ für Zelltod in einem monomolekularen Film) mit einem benutzerdefinierten ImageJ (National Institutes of Health)-Makro (siehe zusätzliche Codierung Datei ). Falls gewünscht, führen Sie das Makro Schritte manuell wie folgt:
        1. Bilder (RGB oder Tiff-Format) in das Makro eingegeben und Kontrast auf 15 % gesättigt Pixel. Doppelte Bilder Kontrast angepasst und führen Sie den Befehl "Subtrahieren Hintergrund", um ein kontrastreiches Bild der Zelle und Lücke in das Blickfeld zu erhalten.
        2. Dieses Bild aus dem Originalbild abziehen und das resultierende Bild mit dem Originalbild mit dem bildrechner "Und"-Funktion kombinieren. Konvertieren Sie das resultierende Bild in schwarz (Lücken) und weiß (Zellen) Maske mit der Schwelle-Funktion (mindestens 0, maximal 5), und verwenden Sie die Funktion "Binär untergraben" Lärm aus dem Bild entfernen.
        3. Messen Sie das Verhältnis von Schwarz bis weiße Pixel innerhalb des resultierenden Bildes mit "Bereich Bruchteil" Messung. Plotten und gebrochene Bereiche für jeden Zeitpunkt der Behandlung als Prozent der maximalen Spaltbereich äußern.
        4. Berechnen Sie Mittel zu und vergleichen Sie mit One-Way ANOVA mit Tukey post-hoc-Test, mit p -Werte weniger als 0,05 als bedeutende.
    4. Verwenden Sie Immunoblot Analyse auf um das Vorhandensein von Amyloid, Oligomere Tau und Aβ in Kultur Überstände zu etablieren. Durchführen Sie Immunoblot Analyse mit Standardverfahren10,11,12, mit Ausnahme der Konzentration Kultur Überstände mindestens 10-divisibel vor der Elektrophorese.
      1. Überstand zu konzentrieren, legen Sie 1 bis 2 mL des Überstandes in eine Zentrifugation-Filter-Einheit, deren Membran ein Molekulargewicht Cut-off von 10 kDa hat. Dann setzen Sie die Filtereinheit in eine Tischplatte Zentrifuge und Zentrifuge bei 2.000 x g bis die nötige Konzentration ist erreicht (in der Regel 45-60 min).
      2. Bestimmen Sie die Menge des Proteins in der konzentrierten überstand11 und laden Sie gleiche Mengen von Proben in einzelnen Vertiefungen des Gels zu.
      3. Gele laufen dann Sonde Blots mit A11 Anti-Amyloid Antikörper, T22 Anti-Oligomere Tau Antikörper oder MOAB2 Anti-Aβ Antikörper, gefolgt von entsprechenden Sekundärantikörper Proteine auf Nitrozellulose übertragen. Die Flecken mit standard Chemilumineszenz-Verfahren zu entwickeln.
    5. Verwenden Sie ein Thioflavin T Assay Thioflavin T Fluoreszenz (ThT), um amyloide in Überstände zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Messungen Filter sterilisiert Überstände.
      1. Bereiten Sie eine Stammlösung (50 X) von Thioflavin T die Aussetzung von 8 mg Thioflavin T (ThT) in 10 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Nach dem Mischen, Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter, Partikel zu entfernen.
      2. Fügen Sie für Messungen 20 µL der ThT-Lager zu 1 mL PBS in einer 1 mL-Spektralphotometer-Küvette hinzu. Legen Sie die verdünnte Probe in einem Spectrofluorimeter.
      3. Die Baseline-Fluoreszenz-Emission mit 425 nm Anregung und Scannen die Fluoreszenzemission von 450-575 nm in Schritten von 2 nm zu messen.
      4. Führen Sie einen Zeitraffer Scan mit 425 nm Anregung und 482 nm Emission mit Daten erworben jeden 0,2 s für 60 s.
      5. Die ersten 20 s der Zeitraffer Scan misst Fluoreszenz in der leere Küvette. Bei 20 s, den Scan anhalten und die Küvette 10 µL des Überstands Filter sterilisiert hinzufügen. Mischen Sie die Küvette durch Umkehrung und setzen Sie dann wieder in die Spectrofluorimeter.
      6. Wiederaufnahme den zeitbasierten Scan, Erwerb der letzten 40 s Daten.
      7. Durchführen Sie nach Abschluss des Time-Lapse Scans einen endgültigen Fluoreszenz Emissionsspektrum Scan mit identischen Einstellungen, wie in 2.1.5.3..

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Representative Results

Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Überstands beobachtet und Zelle Tötung quantifiziert.

Zugabe von p. Aeruginosa , konfluierende Schichten von PMVECs induziert Bildung von Lücken zwischen den Zellen. In Vivo, Spaltbildung zu Lungenödem und verminderte Lungenfunktion führt. In der beschriebenen Test ist Spaltbildung verwendet, da der Zeitpunkt für das Screening zollrechtlich Zytotoxin Zelle Kultur Überstände und ausreichender Dauer der Inkubation mit PA103 durch das Vorhandensein von Lücken, die in der Zelle monomolekularen Film zu bilden beginnen angezeigt wird, wie in gezeigt Abbildung 1. ΔPcrV Bakterien auslösen kein Zelle Lücken unter diesen Inkubationsbedingungen. Sobald Lücken erkannt werden, ist der Überstand gesammelt, Filter sterilisiert und anschließend zu naive PMVECs Beurteilungder zytotoxische Aktivität hinzugefügt. Die PMVECs in ihren jeweiligen Überstände dann platziert in einem Inkubator für 21-24 h, und dann beobachtet und fotografiert. Wie in Abbildung 2dargestellt, enthalten überstand von PMVECs, die mit p. Aeruginosa Belastungen PA103 infiziert hatte ZELLGIFTE, die Tod von kultivierten Zellen durch 21 h nach der Zugabe des Überstands induziert. Im Gegensatz dazu verzeichneten keine Zelltod Kontrollzellen mit entweder HBSS Medium oder mit überstand gesammelt aus dem ΔPcrV-Stamm der Pseudomonas behandelt. Immunoblot Analyse ergab, dass Amyloid-Moleküle, einschließlich Oligomere Tau und Aβ, entstehen während der Infektion mit dem PA103 Stamm, während keine amyloiden durch die ΔPcrV Belastung, nach Impfung des PMVECs (Abbildung 2) erzeugt werden. Immunodepletion von amyloiden aus der Überstand vor der Zugabe zum kultivierten Zellen12die Rolle der amyloide als ZELLGIFTE in diesem Test bestätigt. Obwohl hier nicht gezeigt, verbraucht Immunodepletion zytotoxische überstand mit A11 Anti-Amyloid Antikörper und T22 Anti-Tau-Oligomer Antikörper vollständig zytotoxische Aktivität von Überstände produziert nach PA103 Infektion (Balczon Et Al. 2017 12 und Balczon Et Al., in Vorbereitung).

Eine neuartige, kostengünstige und einfache Methode zur Quantifizierung der Zelle Tötung wurde entwickelt. Für diesen Test wurde ImageJ-Software angepasst, direkte Messung der Bereiche im mikroskopischen Bereich zuzulassen, die Zellen (indikativ für Zelle Tötung) fehlt. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde bestätigt durch direkten Vergleich der etablierte Methode der Messzelle zu töten, die LDH-Freisetzung aus den Zellen ist. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann ImageJ-Software zur Umwandlung eines mikroskopischen Feldes, die weißen Zellen enthalten und Regionen, die Zellen zu schwarz fehlt. Ein einfaches Verhältnis von weißen Flächen schwarz kann dann verwendet werden, um Zelle Tötung zu messen. Beim Starten mit konfluierende Monolage Zellen sind alle Regionen der mikroskopischen Bereich weiß. Jedoch konnte um 18 h nach der Zugabe der Überstände mit Zellgiften, Lücken in der Monolage nachgewiesen werden. Berechnung von Flächengrößen der Kulturschale frei von Zellen, dann erhöht sich linear bis 36 h nach Zugabe von zytotoxischen überstand. Bei der Messung der LDH-Freisetzung wurden mit LDH Freigabe erkannt wird zunächst um 18 Uhr nach der Zugabe von zytotoxischen überstand identische Ergebnisse erzielt. LDH-Freisetzung erhöht dann sich linear, bis maximal Zelle Tötung bei 36 h nach der Zugabe von überstand gemessen wurde. Kleine Zelle Tod wurde in Zellen mit überstand gesammelt aus ΔPcrV beimpft Zellen (Abbildung 3) behandelt oder in Kulturen mit HBSS behandelt wurden 36 h gemessen.

Die Menge an Amyloid aus Zellen mit Bakterien behandelt entlassen kann durch Messung von ThT Fluoreszenz quantifiziert werden. Bindung von amyloiden, ThT bewirkt eine Konformationsänderungen Verschiebung in das Molekül und eine Erhöhung der Fluoreszenz-Intensität. Dieser Assay Thioflavin T wird hinzugefügt, um eine Küvette und Grundlinie Fluoreszenz wird gemessen. Die Fluoreszenz-Aufnahme wird dann gestoppt, während eine kleine aliquoten Probe hinzugefügt wird. Die Küvette wird dann an die Fluorimeter zurückgegeben und die Änderung ist, dass Fluoreszenzemission aufgenommen wurde. Wie in Abbildung 4dargestellt, überstand von Zellen, die mit PA103 Stamm von p. Aeruginosa enthaltenen Amyloid durch die Zunahme der Fluoreszenzemission inkubiert wurden gesammelt. Im Gegensatz dazu fehlte überstand von PMVECs mit ΔPcrV Stamm beimpft amyloide, wie durch das Fehlen einer erhöhten Fluoreszenz angegeben.

Figure 1
Abbildung 1. Beeinflussung der PMVEC Morphologie der p. Aeruginosa Inolculation. Konfluierende Monolage von PMVECs vor (A) und vier Stunden nach der Zugabe (B) PA103 Stamm von p. Aeruginosa. Lücken können in der Zelle Monolayer in den infizierten Zellen deutlich erkennbar. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analysen von zytotoxischen Überstände. Teil [I]. Repräsentative Bilder von Kontrolle und behandelten Zellen. PMVECs wurden 21 h mit überstand gewonnenen Zellen beimpft mit entweder PA103 Bakterien (B) oder Stamm ΔPcrV (C)behandelt. Kontrollzellen wurden auch für 21 h mit HBSS Puffer (A)inkubiert. Maßstabsleiste = 100 µm. Teil [II]. Vertreter Immunoblots der Überstände abgeholt oder PA103 als auch ΔPcrV (A) (B) infiziert PMVECs. Flecken waren mit Antikörpern gegen Amyloid (A11) oder Oligomere Tau (T22) sondiert. MR im kDa. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Quantifizierung der Zelle Tötung. (A) repräsentative Mikroskop Felder aus verschiedenen Zeitpunkten (in h nach überstehende Zugabe) in welchen, die Regionen des Feldes enthalten und ohne Zellen entweder weiß oder schwarz, bzw. umgebaut wurden mit ImageJ-Software. Die gleiche Phase Kontrast Bild bevor Umwandlung auch angezeigt wird. Bar = 100 µm. (B) Vergleich der Quantifizierung der Zelle Tötung mit standard LDH-Release-Assay und ImageJ-Assay. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Vertreter ThT Fluoreszenz Assay Daten. Leere Küvetten mit ThT waren begeistert bei 425 nm und Emission Fluoreszenz wurde gemessen bei 482 nm. Hintergrundfluoreszenz war für 20 s, und dann überstand von entweder PA103 oder ΔPcrV-geimpft PMVECs wurde hinzugefügt, um die Küvetten gesammelt. Fluoreszenzemission wurde dann 40 Sekunden lang aufgezeichnet.

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Discussion

Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und Abbildung 4 sind) und Merkmale einer Prion-12 weisen. Die Generation der zytotoxischen Prion-Moleküle während einer Lungenentzündung bietet eine mögliche Erklärung für die erhöhten Sterberaten bei Lungenentzündung Überlebenden nach ihrer Entlassung Krankenhaus beobachtet. Experimente im Gange sind diese Möglichkeit testen.

Das wichtigste Ereignis für alle beschriebenen Studien ist die Generation der zytotoxischen überstand und zwei wichtige Variablen berücksichtigt werden müssen. Erstens in der beschriebenen Experimente Ratte PMVECs für beide die Infektion Schritt und die Zytotoxizität Assay dienten. Ob andere Zelltypen zur Herstellung von Zellgiften verwendet werden könnte ist nicht im Detail untersucht, und es ist möglich, dass andere Zellen zytotoxischen Überstände nach der Behandlung mit verschiedenen Stämme von p. Aeruginosagenerieren können. Wie gezeigt, die ZELLGIFTE sind Amyloid in der Natur und beinhalten Oligomere Tau und Aβ. Es wäre zu erwarten, dass andere Zelltypen, die Tau und/oder Beta-Amyloid-Protein Ausdrücken, zytotoxine nach bakteriellen Impfung zu generieren, obwohl diese Möglichkeit noch um zu prüfenden induziert werden können. Die beschriebenen Verfahren könnte für die Prüfung verwendet werden, ob andere Zelltypen induziert werden können, um zytotoxische amyloide nach verschiedenen Beleidigungen zu produzieren.

Die zweite wichtige Variable bei der Erzeugung von zytotoxischen Überstände ist die Dauer der Behandlung mit Bakterien. Es ist wichtig, dass man die Inkubation von die PMVECs Fortschritte bis Lücken in der Monolage gesehen werden können. Die Identifizierung von Lücken in der Zelle Monolage ist eine Angabe Exoenzymes durch Pseudomonas-Bakterien in den Host Zelle Zytoplasma injiziert haben und die Exoenzymes aktiv, wodurch Retraktion der Zellrahmen (Abbildung 1) sind. Unsere Erfahrung ist, dass der Zeitpunkt der Rücknahme der Zellrahmen ein zuverlässiger Indikator für Zytotoxin Freisetzung der Überstand. Es ist verlockend zu spekulieren, dass die beiden Ereignisse verbunden sind, wie die zytotoxischen amyloiden freigebend Oligomere Tau gehört und Störung der Tau-Aktivität führt zu Mikrotubuli Depolymerisation die Zelle Formänderungen beiträgt. In Experimenten wo Behandlungen weniger als der Betrag der Zeitaufwand für die Spaltbildung induzieren gewesen, hat kleine reife zytotoxischen Amyloid nachgewiesen.

Die Zytotoxizität Assay beschrieben in diesem Manuskript ist einfach und zuverlässig. Zelltod kann leicht durch mikroskopische Untersuchung beobachtet und quantifiziert direkt von mikroskopischen Aufnahmen. Die hier beschriebenen Methoden wurden ausschließlich für die Bewertung Zytotoxin Produktion nach der Ratte pulmonalen endothelial Zellen mit p. AeruginosaInfektion verwendet. Es scheint wahrscheinlich, dass die Verfahren zu beurteilen, ob zytotoxischen amyloide nach Infektion mit anderen Lungenentzündung verursachen Agenten, einschließlich der beiden nosokomiale-assoziierten produziert werden leicht angepasst werden könnten Bakterien und Bakterien und Viren verantwortlich für ambulant erworbenen Arten von Lungenentzündung. Darüber hinaus wurden die gemeldeten Verfahren nur zur zytotoxischen Amyloid Generation während der Infektion von kultivierten Zellen zu untersuchen. Zellkultur ist ein künstliches System, und die Anweisungen hier am ehesten an die Generation der ZELLGIFTE während der pulmonale Infektion von Tiermodellen und menschlichen Patienten beurteilen angepasst werden konnte. Sammlung von biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. alvéolaire Lavage von infizierten Tieren oder Patienten könnte verwendet werden, in die gleichen Arten von Assays berichtet hier zu beurteilen, ob zytotoxische amyloiden während Infektionsprozessen in-vivo generiert werden. Natürlich, die Dauer der Inkubation mit Bakterien können ganz anders sein, wenn in Tiere impfen, und alvéolaire Lavage müssten mehrere Zeitpunkt ultimative Behandlungsdauer bestimmen gesammelt werden.

Immunoblot-Analysen haben gezeigt, dass amyloide in die Überstände, einschließlich Oligomere Tau und Aβ (Abbildung 3) vorhanden sind. Obwohl die Immunoblot-Verfahren standard sind, gibt es ein wichtiger Schritt, der vor Einleitung Immunoblot Analysen durchgeführt werden müssen. Insbesondere ist es wichtig, dass die Überstände konzentrierten mindestens um das Zehnfache vor Immunoblotting sein als der Betrag von Amyloid in der UN-konzentriert überstand unterhalb der Nachweisgrenze von Immunoblot Analyse. Wie hier berichtet, Zentrifugation mit Röhren mit einem Filter ausgestattet ist die Methode, die routinemäßig verwendet für diese Konzentration Schritt, aber es scheint vernünftig, dass andere Methoden, z.B. TCA Niederschlag, ebenso nützlich für diesen Schritt wäre.

Die Quantifizierung der Zelle Tötung mit Bildern stellt einen wichtigen Fortschritt dar. Derzeit Vertrauen verfügbare Verfahren zur Quantifizierung der Zelltod auf den Kauf von ziemlich teuer-Kits, die Messung der LDH-Freisetzung aus abgestorbenen Zellen zu ermöglichen. Der hier beschriebene Test beinhaltet keine Kosten ImageJ Programme kostenlos von der NIH-Website heruntergeladen werden. Die einfache Anpassung von ImageJ-Programme kann ziemlich genaue Messung der Zelle Tötung. Allerdings lohnt es sich, darauf hinzuweisen, dass ein paar kleinere Artefakte sind bei Durchführung des genannten Protokolls anzutreffen. Das Hauptproblem ist, dass zellfragmente wie fokale Kontaktflächen der Kulturschale als Zellen sterben verbunden bleiben können. Diese verbleibende zellfragmente können von der Kamera erkannt werden und geben einen künstlichen Hinweis, den Zellen in der Schale bleiben. Als solches ist es selten, dass ein Wert von 100 % Zelle Tötung mit diesem Verfahren gewonnen wird.

Eine Schwäche des gemeldeten Assay Systems ist, dass der Zytotoxin amyloiden bei der Vorbereitung nie vollständig definiert wurden. Als solche ist die Quantifizierung schwierig. ELISA-Assays lässt sich total anders amyloiden bieten ohne detaillierte Angaben über die einzelnen Arten in jeder Vorbereitung. Bis genauere Tests wie Masse-Spec oder in Vitro synthetisiert Amyloid Oligomere, entwickelt werden können, das beste, das was man, im Moment tun kann ist, starten Sie jedes Experiment mit der gleichen Anzahl von Zellen, die gleiche Dauer inkubieren und stellen Sie sicher, dass Zytotoxizität tritt zum gleichen Preis wie die bisherigen Vorbereitungen, die verwendet wurden. Variation von irgendwelchen der etablierten Normen führt zusätzliche Unsicherheit.

Zusammenfassend lässt sich sagen werden einfache in-vitro- Methoden für den Nachweis der Produktion der giftigen Amyloid Moleküle durch pulmonale Endothelzellen nach Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Agent beschrieben. Die Assays sind zuverlässig und wahrscheinlich angepasst für andere Organismen und für den Einsatz mit biologischen Flüssigkeiten von infizierten Tieren und menschlichen Patienten erhalten werden können. Diese Methoden werden für Studien untersuchen die langfristigen Folgen einer Lungenentzündung und die Etablierung der Mechanismen, die Ende-Organversagen bei Patienten nach Krankenhaus entlassen.

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Disclosures

Nichts zu berichten.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rabbit anti beta amyloid Thermo 71-5800
A11 amyloid oligomer antibody StressMarq SPC-506D
T22 anti-tau oligomer antibody EMD Millipore ABN454
Thioflavin T Sigma Aldrich T3516
HBSS Gibco 14025-092
PBS Gibco 10010-023
0.22 micron syringe filters Millipore SLGP033RS
DMEM Gibco 11965-092
HRP Goat antirabbit IgG Abcam ab6721-1
Strains PA103 and ΔPcrV These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectin Sigma Aldrich L9381
TRITC Helix pomatia lectin Sigma Aldrich L1261
Agar Fisher BP1423-500
0.22 micron nitrocellulose BioRad 162-0112
Type 2 collagenase Worthington LS004176
Fetal bovine serum Hyclone SH30898.03IH
PenStrep Gibco 15070063
Carbenicillin Disodium salt Sigma  C1389
Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off Millipore UFC801008
Potassium phosphate dibasic Sigma  795496-500G
Magnesium phosphate heptahydrate MP Biomedicals MP021914221
Citric Acid G Biosciences 50-103-5801
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9506-500G
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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