流式细胞术对小鼠原发性胰腺导管腺癌原位同种异体 (自体) 免疫分型的研究

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

免疫分型小鼠原位 PDAC homografts 的实验程序旨在分析肿瘤免疫微环境。肿瘤通过手术原位植入。200–600毫米3的肿瘤被收获和分离, 以制备单细胞悬浮液, 然后使用不同的荧光标记抗体进行多免疫标记物的分析。

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An, X., Ouyang, X., Zhang, H., Li, T., Huang, Y. y., Li, Z., Zhou, D., Li, Q. X. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (140), e57460, doi:10.3791/57460 (2018).

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Abstract

同种异体 (自体) 肿瘤是当今免疫肿瘤学 (i/o) 临床前研究的主力。肿瘤微环境, 特别是其免疫成分, 对于预后和预测治疗结果, 尤其是免疫疗法是至关重要的。免疫成分由多色流化物所应课税的肿瘤浸润免疫细胞的不同亚群组成。胰导管腺癌 (PDAC) 是最致命的恶性肿瘤之一, 缺乏良好的治疗方案, 因此迫切和未满足的医疗需求。其对各种治疗方法 (化疗、靶向、i/o) 不反应的一个重要原因是它的丰富, 由成纤维细胞和白细胞组成, 保护肿瘤细胞免受这些疗法的侵害。原位植入 PDAC 被认为比传统的皮下 (SC) 模型更准确地夺回人胰腺癌的发病率。

同种异体肿瘤 (kpc) 是移植的小鼠自发 PDAC 起源于基因工程的 KPC-小鼠 (KrasG12D/+/P53-/Pdx1-C) (kpc-GEMM)。原发肿瘤组织被切割成小片段 (2 毫米3), 并移植皮下 (SC) 到自体接受者 (C57BL/6, 7–9周岁)。homografts 的手术原位移植到新的 C57BL/6 小鼠的胰腺, 连同 SC 植入, 达到300–1,000 毫米3的肿瘤体积17天。只有400–600毫米3的肿瘤是根据经批准的尸检程序获得的, 并清理清除相邻的非肿瘤组织。它们被分离每协议使用组织 dissociator 入单细胞悬浮, 然后染色与指定的小组荧光标记抗体为不同的免疫细胞标记 (淋巴, 髓体并且 NK, DCs)。用多种颜色的方法对染色样品进行了分析, 以确定不同血统的免疫细胞数量以及肿瘤内的相对比例。然后将原位肿瘤的免疫剖面与 SC 肿瘤进行比较。初步数据显示, 胰腺肿瘤浸润 TILs/TAMs 明显升高, B 细胞浸润至原位而非 SC 型肿瘤。

Introduction

胰腺导管腺癌 (PDAC) 导致近100万死亡率全球每年, 其中一个前5个癌症杀手。没有有效的治疗方案, 也没有批准的免疫疗法;因此, 迫切需要新的治疗方法。除了今天已知的基因疾病外, 癌症越来越被公认为免疫学疾病, 包括 PDAC。免疫学和遗传因素可能决定疾病的预后以及治疗结果。肿瘤逃避宿主免疫监测, 最终导致死亡。其中许多免疫过程发生在肿瘤微环境中 (1,2,3,4 ), 其中不同类型的免疫细胞相互作用与肿瘤细胞, 彼此和其他肿瘤基质成分, 直接或间接通过细胞因子最终决定疾病结局。因此, 肿瘤免疫成分的免疫分型, 或肿瘤, 包括子类型), 计数和定位的不同血统的免疫细胞, 是至关重要的, 以了解抗肿瘤免疫。在 PDAC 的情况下, 提出了高肿瘤浸润抑制巨噬细胞 (TAM) 和 B 细胞已导致预防 T 细胞浸润和/或活化和高水平的纤维化5,6

研究免疫巴掌就的常用方法是使用代孕瘤前动物模型, 主要是相关的小鼠肿瘤模型7, 特别是小鼠自体 (同种异体) 或基因工程鼠模型 (GEMM)癌症的假设相似性的老鼠和人的肿瘤和免疫8,9。事实上, 这两个物种之间存在着内在的差异,10,11

移植小鼠肿瘤具有显著的手术优势优于自发性肿瘤7, 即同步肿瘤的发展, 与父母 GEMM 自发性肿瘤的发展形成对照。Homografts 的自发性小鼠肿瘤被认为是原发肿瘤从未纵的体外, 并镜像原鼠肿瘤历史 - / 分子病理7, 以及可能的免疫剖面。这些小鼠 homografts 通常被认为是 "一个老鼠版本的病人衍生的移植 (PDXs)"。因此, 它们有可能比传统的自体细胞线衍生的小鼠肿瘤有更好的可译性12。特别是, 许多 homografts 来自特定的 GEMM, 其中具体的人类疾病机制,致癌驱动因素突变, 被设计, 这些 homografts 应该有优势, 其临床相关性。特别是, KPC GEMM 在15–20周的年龄内开发小鼠 PDAC, 这在形态学上概括人类疾病, 主要是适度分化的腺结构和高度丰富的基质。该模型还概括人类 PDAC 最常见的遗传特征, 即 Kras 激活突变和 P53 功能丧失, 这在人类 PDAC 的90% 和75% 分别发生56

移植部位也被建议在模型可译性中发挥作用。特定的周围组织环境, 如相应的原位环境, 可能是特定肿瘤进展的利基, 而不是一般移植肿瘤的均匀皮下 (SC) 环境。这将是特别感兴趣的, 如果和/或, 有什么区别, 在两个移植地点之间的免疫微环境, 以及与人类癌症的相关性, e.在 PDAC 的情况下。

免疫分析的一个最重要的方面, 或免疫分型, 是确定肿瘤浸润免疫细胞的不同血统, 数量, 相对比例的肿瘤, 以及他们的活化状态, 和地点。这包括肿瘤-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T 和 B), 肿瘤浸润巨噬细胞 (TAMs), 肿瘤浸润自然杀伤干细胞 (NKs) 和肿瘤驻留的树突状细胞3,13,14,15,16,17、以及某些细胞在181920等区域的局部定位。荧光活化细胞分选法或流式细胞仪是一种单细胞检测技术, 通常用于测量细胞的特定参数。多色流式细胞仪测量单个细胞3421的多个标记, 是确定不同免疫细胞子集的数量和相对百分比的最常用方法,包括肿瘤内的那些。

本报告描述了肿瘤浸润免疫细胞的分析程序: 1) 原位 PDAC 小鼠肿瘤 homografts 的植入, 以及 SC 植入;2) 肿瘤组织的收获和单细胞的分离制备;3) 以肿瘤为基线的所有细胞的流式细胞仪分析;4) 两种移植方法基线剖面的比较。

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Protocol

所有有关照顾和使用动物的议定书及修订或程序, 将由官方生物科学机构动物保育及使用委员会 (IACUC) 在进行研究前进行检讨和批准。对动物的照料和使用通常会按照 AAALAC (实验室动物护理的评估和认可协会) 国际准则进行, 如《实验室动物护理和使用指南》所报告的, 国家研究理事会 (2011)。所有动物实验程序将在 SPF (无病原体) 的无菌条件下, 并严格按照《护理和使用来自不同政府机构的实验动物指南》进行 (如:国立卫生研究院)。该议定书将需要由设施机构动物实验伦理学委员会 (例如机构 IACUC 委员会) 批准。

1. 肿瘤移植的准备工作

  1. 动物住房
    1. 从商业饲养商那里获得一般的 C57BL/6 老鼠。
    2. 房子老鼠 (5) 在单独通风的笼子在以下情况: 温度: 20–26°c;湿度 30–70%;照明周期:12 h 光和 12 h 黑暗。
    3. 使用玉米芯床上用品, 这是每周改变。
    4. 为饮食, 提供辐照灭菌干颗粒食品在整个研究期间。
    5. 为水, 提供动物免费获得无菌饮用水。
  2. 供体肿瘤片段制备
    1. 首先通过监测体重 (体重), 通过权衡使用平衡, 和肿瘤体积 (电视), 通过卡尺测量, 肿瘤的捐献者小鼠。
    2. 当电视到达500–1,200 毫米3, 弄死动物在生物防护罩根据协议。
    3. 用碘伏拭子对肿瘤周围的皮肤进行消毒。
    4. 手术切除肿瘤 (3 节描述的细节: 尸检和肿瘤收获), 并将肿瘤放置在含有20毫升 PBS 的培养皿中 (在 euthanizing 动物之前先将介质或缓冲液冷却到4摄氏度)。
    5. 如果有污染的血液, 将肿瘤转移到另一种培养皿中, 用 PBS 冲洗肿瘤。
    6. 将肿瘤切成两半, 除去多余的皮肤、血管、钙化和/或坏死。
    7. 选择只有完整的肿瘤片, 并将其放入一个无菌的50毫升离心管, 并添加20毫升的 PBS, 然后运输管到一个单独的动物室进行药理学研究。

2. 原位和皮下 (SC) 植入

  1. SC 接种
    1. 用手术刀将肿瘤切割成2毫米直径的碎片, 将1块插入套管, 用于 SC 植入或以后的原位植入术 (见下文)。
    2. 麻醉接受者动物与5% 异氟醚, 由鼻子锥体维护在1%。动物将开始放松, 失去他们的矫正反射, 最终变得静止不动。在这种麻醉的深度, 他们可以很容易地激起痛苦的刺激;允许麻醉加深, 直到这种对疼痛的反应缺席。
    3. 一旦被麻醉, 将老鼠固定在实验板的右侧侧位。用碘伏拭子消毒老鼠, 尤其是肿瘤周围的区域。
    4. 用手术刀, 在左侧面做一个0.5 到1.0 厘米的皮肤切口, 只是头骨到臀部。
    5. 隧道下的皮肤向前肢, 两到三厘米, 用钝钳。
    6. 灌装转移一立方体肿瘤从媒介和地方深深地在皮下隧道。
    7. 在视觉上证实肿瘤在隧道深处 (而不是在皮肤切口)。
    8. 用伤口夹紧伤口。
    9. 监测动物后接种, 直到他们恢复足够的意识, 以维持胸骨 recumbence。只有在完全恢复麻醉后, 才能把动物送回笼子里。完成麻醉日志, 启动动物健康图。每日称受赠动物三天
    10. 对于标准程序, 每组5-10 只小鼠接种肿瘤生长监测。
  2. 胰腺原位植入术
    1. 麻醉和镇痛
      1. 使用2毫升氯胺酮注射液和0.42 毫升甲苯噻嗪注射液 (20 毫克/毫升) 混合5.91 无菌注射水或生理盐水的剂量体积的 0.06–0.1 mL/20-25 g 体重。
        注意: 根据动物福利, 镇痛是必要的前和术后操作。0.05–0.1 毫克丁丙诺啡/千克, SC。第一个剂量是预手术, 然后每4小时3次用药后连续手术。
    2. 原位植入术的外科手术
      1. 麻醉小鼠通过肌肉注射 (IM) 每步2.2.1。
      2. 在动物完全麻醉后, 将老鼠固定在实验板的右侧侧位。
      3. 保持小鼠在正确的侧向位置。用碘对脾脏周围的皮肤进行消毒, 然后用75% 乙醇碘酸。
      4. 找到脾脏的中间点, 在腹部做一个1厘米的垂直切口以暴露脾脏。
      5. 用平尖镊子轻轻地抽出脾脏下的部分胰腺组织, 用9-0 可吸收的手术缝合, 将小鼠同种异体肿瘤片从小鼠移植到受体小鼠的胰腺上。
      6. 用6-0 丝缝线缝合腹部。通过压缩实现稳态。
      7. 肿瘤植入术后, 如果不发生出血或肿瘤组织渗漏, 请将动物放在温暖的笼子里。
      8. 监测动物, 直到它恢复足够的意识, 以维持胸骨卧床;从麻醉中完全恢复后, 将动物送回动物室。通过 palpating 腹部附近的腹腔对肿瘤小鼠进行监测, 筛选出含原位肿瘤的小鼠。
  3. 荷瘤小鼠健康监测
    1. 每天检查水和食物消耗量。
    2. 检查鼠标外观的 ungroomed 头发大衣, 肿块, 薄, 异常呼吸或腹水。
    3. 触及腹部检查肝脏或脾脏是否有自发性肿瘤。
    4. 用平衡来衡量老鼠每周的体重。
    5. 如果观察到以下任何临床症状, 则为标本收集和尸检牺牲小鼠: 体重损失 > 20%;流动性受损 (无法进食或饮酒);由于大量腹水和腹部肿大, 无法正常运动;呼吸的努力。

3. 尸检和肿瘤收获

  1. 在终止前检查视力和触诊是否存在明显的肿瘤。
  2. 为终止, 首先弄死老鼠根据批准的协议, 并且打开腹部并且视觉地检查胰腺为肿瘤。
  3. 切除肿瘤后, 致命的手术, 并添加到冷 PBS。把所有的动物放在一个干净的, 带电的, 半透明的安乐死室里, 用一个带有一个港口的特殊盖子, 用来运送二氧化碳。
  4. 将气体排入腔内, 以产生快速无意识的流速, 使动物的痛苦最小。CO2的最佳流速应在 2–2.5/分钟左右。
  5. 在安乐死过程中观察每一个动物, 以确保所有动物获得足够的气体浓度, 并在弄死过程中不恢复知觉。
  6. 在明显的临床死亡后保持至少1分钟的气流, 以尽量减少动物可能恢复的可能性 (如果窒息, 但不死)。
  7. 移除相邻的非肿瘤组织。清理过的肿瘤可以快速拍照。
    将肿瘤组织放入 RPMI-1640, 在分离前保持冰层。
    注意: 动物尸体被袋装并储存在适当的冷藏库中等待清除。

4. 肿瘤组织离解与单细胞制备

  1. 试剂制剂
    注: 肿瘤离解试剂盒含有2瓶酶 D (冻干粉), 1 瓶酶 R (冻干粉), 1 瓶酶 a (冻干粉) 和1毫升的缓冲 A。
    1. 用3毫升的 RPMI-1640 在每瓶中重组冻干粉制备酶 D。准备适当体积的整除数, 以避免重复的冻融循环。
    2. 用2.7 毫升的 RPMI 1640, 在瓶中重组冻干粉, 制备酶 R。准备适当体积的整除数, 以避免重复的冻融循环。
    3. 用该套件提供的1毫升缓冲液, 在瓶子中重组冻干粉, 制备酶 a。不要旋涡。准备适当体积的整除数, 以避免重复的自由解冻循环。
    4. 通过添加2.35 毫升的 RPMI-1640, 100 µL 酶 D, 50 µL 酶 R 和12.5 µL 酶 A 到每个 gentleMACS C 管中制备酶的混合物。
  2. 肿瘤离解
    1. 为每个肿瘤准备一个 C 管与肿瘤消化混合, 请参阅第4.1 节为消化缓冲稀释和准备。
    2. 使用3毫升消化缓冲肿瘤片段 < 0.8 克, 并确保肿瘤完全消化。
    3. 标签与研究代码, 肿瘤, 鼠证, 治疗组, 肿瘤重量。
    4. 从老鼠体内采集肿瘤, 在寒冷的 PBS 中冲洗肿瘤, 清除附着在肿瘤上的组织 (如血管、脂肪、筋膜等).
    5. 将肿瘤放在消化介质中, 在一个不育的6井板中的一个井中。
    6. 用无菌镊子/镊子和手术刀切开肿瘤。切片肿瘤足够好分成小块 (~ 1 毫米3)。
    7. 将肿瘤片放回 c 管中, 用剩余的消化缓冲液冲洗盘子, 然后将液体转移到放在冰上的 c 管, 直到消化。
    8. 用加热器打开 dissociator。
    9. 将肿瘤离解 C 管倒置成袖子的空缺位置, 并调整管位置的状态从自由选择。选择一个离解程序 (37_c_m_TDK_1), 然后选择所需的文件夹, 其中显示程序列表。
    10. 在程序终止后, 采取 C 管关闭 dissociator 和简要旋转 (300 x g, 4 °c), 以颗粒的样品。
    11. 重新悬浮样品, 放入一个50毫升管上方的细胞过滤器。用10毫升的洗涤缓冲器通过细胞过滤器清洗细胞, 提供单细胞悬浮液。
    12. 离心管在 300 x5 分钟, 丢弃上清, 并重新悬浮细胞与5毫升的洗涤缓冲, 计数可行的细胞使用台盼蓝和/或由细胞计数器, 并调整细胞 concentraton 到 1 x 106细胞每管或每样。包括正确的同种控制抗体, 以确保染色是特定的

5. 免疫面板设计和流量数据采集

  1. 面板设计
    1. 请参阅表 1
  2. 染色
    1. fc 块样本单元: 在200µL 的染色缓冲器中重新悬浮细胞, 1 µg/毫升 Fc 块, 其次是在冰上孵化或4摄氏度制冷, 在黑暗中15分钟。
    2. 使用所需的抗体/荧光板染色细胞 (e.T 细胞面板, 巨噬细胞面板): 添加在 Fc 阻塞缓冲器稀释的抗体混合物, 每样, 在黑暗中的冰上着色至少30分钟。
    3. 每管加1毫升冰寒 PBS, 轻轻地将细胞重新悬浮, 然后离心 300 x以5分钟。
      1. 重复清洗细胞两次。
    4. 染色的细胞内标记如果需要, 在步骤6-10 后, 否则跳转到步骤10。
    5. 用脉冲涡流重新悬浮细胞颗粒, 并为每个样品添加200µL 的固定/通透工作溶液。再次脉涡, 然后在黑暗中在室温下孵化4摄氏度 (首选) 或30分钟。
    6. 向下旋转细胞, 取出上清液。
    7. 通过添加1毫升1x 通透缓冲器 (由10x 通透缓冲, 稀释与蒸馏 H2O), 然后离心和醒酒上清洗两次。
    8. 在1x 通透缓冲中加入细胞内标记抗体, 在室温下孵育30分钟。
    9. 用1毫升的1x 通透缓冲器洗涤细胞两次。离心机和醒酒上清液。
    10. 并用重悬细胞在150µL 的染色缓冲液中进行分析。由于固定和通透的程序, FSC (前光散射)/SSC (侧记散) 分布的细胞群将不同的活细胞。因此, 门和电压将需要修改。
  3. FMO 控制 (荧光减去一个控制)
    注: 多色流动分析对肿瘤浸润性免疫细胞的分析尤为重要。因此, 有必要找到一种方法来识别和栅格在数据传播的背景下, 由于在一个给定的面板中的多个荧光。FMO (荧光减一) 控制是这一目的的重要途径。
    1. 为此, 在每个组中包括额外的小鼠 FMO 控制 (每 Rx 至少 2) 和每个组织单独处理。分离后, 池组织。例如, 在一项与 4 Rx 组的研究中, 另外8个肿瘤应单独处理, 然后汇集成一个样本进行 FMOs。
  4. 流量仪表设置
    1. 在机器预热时, 制作补偿珠 (至少20分钟)。
    2. 使用 CS & T 珠来检查性能。
    3. 电压和补偿设置: 使用 UltraComp 珠, 在使用前彻底涡流的复合珠子。
    4. 为每个 fluorochrome 共轭抗体分别贴上 12 x 75 毫米2样品管。
    5. 每管加100µL 染色缓冲器。添加1全滴 (大约60µL) 的珠子每管。
    6. 添加抗体和执行染色程序完全一样的样本过程中所述的4节。
    7. 添加0.5 毫升的染色缓冲器, 以完全重新悬浮珠粒通过涡。
    8. 设置流式细胞仪 PMT 电压每靶组织为给定的实验。
    9. 通过流式细胞仪进行数据采集, 通过在每一个 FSC 和 SSC 读数上对单线珠种群进行浇口。
    10. 设置围绕200–300xg 事件/秒的流速率。
    11. 为给定的荧光素 [FITC] 共轭抗体设置适当的补偿, 使用 FL1FL2 点图。
    12. 放置一个象限门, 使负珠在左下象限内, 正珠子在上下右象限。调整补偿值直到每个种群的中值荧光强度 (如象限统计窗口中所示) 近似相等 (例如, 对于 FL2-%FL1,两个珠子的 FL2 的多边化都应该相似)。
    13. 对所有管子重复步骤5.4.11 和5.4.12。
    14. 继续获取实际的染色样品。运行补偿向导并使用 "日期实验缩写" 格式保存设置。

6. 流量数据分析和演示

  1. 通过 Flowjo 和/或卡鲁扎分析数据。

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Representative Results

原位植入 PDAC 导致肿瘤快速生长类似于 SC 植入。根据步骤2.1 和2.2 中描述的协议, 将捐献者的肿瘤碎片植入受体小鼠, 无论是皮下还是原位, 移植的同种异体肿瘤显示出类似的快速增长, 如图1A 所示. .图 1B显示了在不同时间点收获的同种异体肿瘤, 其代表性的 H & E 图像显示图 1C。我们的数据显示了 SC 和原位植入物的相似生长。

可行的肿瘤细胞和细胞, 包括肿瘤浸润免疫细胞, 起源于原位或 SC 植入, 可以有效地恢复。根据步骤4中描述的协议, 利用商业 dissociator (图 2A) 对肿瘤进行了采集和消化, 以准备单细胞悬浮物。我们通常从两种类型的肿瘤标本中获得合理的高存活细胞产量 (80% 基于台盼蓝的生存能力);代表的外地资产管制计划显示从肿瘤中存活的细胞, 与死细胞/细胞碎片分离 (图 2B)。

肿瘤浸润性免疫细胞的不同亚群已被发现在原位和 SC 植入肿瘤, 而他们的外形有差异。通过使用步骤4.2 中描述的方法在肿瘤组织中制备的单细胞悬浮液, 在染色后采用了16色标记,表 1中显示了不同的重要免疫细胞血统, 并进行了生物分析。以及肿瘤细胞。如图 3A所示, 浇口策略或免疫谱系等级和代表性流地块。CD45 是所有成熟免疫细胞的标志物, 用于鉴别肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞。所有免疫血统随后从 CD45+人口分析小组显示 (表 1)。

在标记旁边, 细胞大小也被用来区分不同的亚群 (图 3B ), 以量化细胞子集, 包括 T, B 淋巴细胞, 巨噬细胞和 MDSCs 等。胰腺癌肿瘤浸润性免疫剖面与原位 homografts 的比较。肿瘤浸润免疫细胞的几个关键亚群的主要枚举细胞群显示为图 3C。这些数据清楚地表明, 与健康小鼠的胰腺相比, 肿瘤的免疫细胞浸润明显增加。此外, 在原位肿瘤浸润性免疫细胞的子集中发现不同的百分比。sc homografts,在原位比 sc 显着更多的 B 细胞。

标记 免疫细胞数量
CD45 白细胞总数
CD3 T 细胞总数
CD4 CD4+ T 帮助器单元格
CD8 CD8+ 毒性 T 细胞
CD44/CD62L * 天真, 记忆和效应 T 细胞
CD69/CD44/OX40/CD25* 激活标记
CD4+CD25+FoxP3+ 调节 T 细胞
CD11b+Ly6c/Ly6g G-MDSC 和 MDSC
CD11b+ F4/80 巨 噬 细胞
IA/IE/CD206 M1 和 M2 巨噬细胞
CD3-CD335+ NK 细胞
CD3+CD335+ NKT 细胞
CD19 B 细胞
TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3* 细胞 因子
PD-1/PD-L1/CTLA-4/TIM-3* 检查点抑制剂
Granzym B* 常用标记
KI67/Brd U/PNCA 增殖
活/死 (已修复) 活/死
* 注: 可根据需要添加进一步的标记

表 1:16 色流板, 用于分析肿瘤浸润小鼠免疫细胞。

Figure 1
图 1: 原位和 SC (subQ) 植入 PDAC 同种异体肿瘤的 C57BL/6 小鼠表现出类似的生长与或没有吉西他滨治疗.(A) 生长曲线: 左、右。蓝色: 车辆;金: 吉西他滨 (10 天后接种, 平均 SC 肿瘤体积达到200毫米3)。(B) 不同时间点的肿瘤组织。(C) 两种 homografts 的代表性 H & E 染色 (40 x 10)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 肿瘤组织离解制备可行的单细胞悬浮液.使用disassociator;(B) 与死细胞分离的可行细胞, 如流动分析所示。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 原位和 SC PDAC homografts 肿瘤浸润性免疫细胞的多色流动分析.从流式细胞仪中采集各肿瘤样本的原始数据, 然后使用 Flowjo 的分析软件进行了研究。(A) 分析的标准浇口策略, 以实例显示;(B) 采用标准浇口策略的代表性流量浇口和分析数据;(C) 具有代表性的肿瘤浸润免疫 cellsare 显示为包括 B 细胞、Treg 和巨噬细胞。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

虽然使用 SC 肿瘤的研究更容易进行, 原位植入肿瘤模型可能会更相关的临床前药理学研究 (特别是 i/o 调查), 以提供增强的可译性。本报告旨在帮助感兴趣的读者/读者能够直接可视化的技术程序, 可用于其各自的研究。我们的协议表明, 原位植入 PDAC 可以导致有效的肿瘤生长, 类似于 SC 植入。我们的观察似乎也表明, 不同植入的巴掌就存在不同的免疫剖面。与 SC 植入相比, 适应原位的主要挑战是需要复杂的技能, 这一过程耗时, 植入手术的过程是劳动密集型的, 同时也是监测原位肿瘤的难点。生命的增长。

有四个关键步骤, 以确保原位胰腺肿瘤实验成功地执行: 1) 的手术过程中植入;2) 认真及时地监测肿瘤的发展;3) 首先进行前期实验测试, 熟悉程序, 评估服用率和肿瘤生长速率;4) 用单细胞悬浮液分离肿瘤作为替代植入方法。本报告程序有助于读者进行研究使用这一特定的同种异体, 以及其他胰腺原位模型, 甚至其他的原位模型, 包括腹部开放手术。

流式细胞术或 immunoprofiling 是目前最重要的工具。肿瘤的免疫分型与不同器官的细胞, 如外周血、脾、淋巴结、骨髓等有显著差异。一般来说, 肿瘤中存在的免疫细胞比例很小 (样本量小)。肿瘤的极端异质性和小数目的免疫细胞, 使恢复可行的稀有免疫细胞技术上具有挑战性, 需要定制开发的肿瘤组织离解涉及机器。上述两点均采用多色流式细胞仪进行多参数同时测量。由于荧光光谱重叠, 多色流需要复杂的标记面板设计、补偿和浇口策略。本报告还试图向感兴趣的读者/受众展示肿瘤免疫分析的过程, 通过定义的肿瘤组织离解和多色流式细胞术分析。

三关键步骤对产量的提高非常重要, 直到分析: 首先, 使用自定义的肿瘤离解程序, 从游离肿瘤中恢复的活细胞高产;二是基于现有试剂的大型多色染色板的优化设计;第三, 优化了浇注策略的分析。作者想强调的是, 数据采集和分析操作者的训练和经验对于成功的流式细胞术分析是必不可少的。

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Disclosures

所有作者都是官方生物科学公司的现任全职雇员。

Acknowledgments

作者要感谢朱迪 Barbeau 博士对手稿的批判性阅读和编辑, 感谢拉尔夫?曼努埃尔设计艺术品。作者还要感谢皇冠生物科学肿瘤免疫肿瘤生物标志组和肿瘤学在体内的团队, 为他们的伟大的技术努力。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine \ SAS3119 \
Trocar 20 \ \ 2 mm
Petri dish \ \ 20 mm
100x antibiotic and antimycotic \ \ \
Iodophor swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Alcohol swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Liquid nitrogen Air chemical \ \
Biosafety hood AIRTECH BSC-1300IIA2 \
FACS machine LSRFortessa X-20 BD LSR Fortessa \
antibodies BD \ \
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration BD 354248 \
FACS buffers BD 554656 Mincing buffer
Brilliant Staining Buffer BD 563794 \
Mouse BD Fc Block BD 553142 \
cell filters BD-Falcon 352350 70 µm
routine blood tube BD-Vacutainer 365974 2 mL
Kaluza Beckman vs 1.5
6-well plates Corning 3516 \
Foxp3 Fix/Perm kit ebioscience 00-5523-00 \
UltraComp eBeads ebioscience 01-2222-42 \
Centrifuge eppendorf 5810R,5920R \
FlowJo software FlowJo LLC \ vs 10.0
PBS Hyclone SH30256.01 50 mL
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 \
Disposable, sterile scalpels Jin zhong J12100 11#
knife handle Jin zhong J11010 \
eye scissors and tweezers Jin zhong Y00030 Eye scissors 10 cm
eye scissors and tweezers Jin zhong JD1060 Eye tweezers 10 cm with teeth
Portable liquid nitrogen tank Jinfeng YDS-175-216 \
Electronic balance Metter Toledo AL204 0-100 g
Miltenyi C-tubes Miltenyi 130-096-334 \
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks Miltenyi 120-018-306 \
Tumor Dissociation Kit Miltenyi 130-096-730 \
Cell counter Nexcelom Cellometer Cellometer Auto T4
cryopreservation tube Nunc 375418 1.8 mL
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME PathClear 3442-005-01 \
syringes Shanghai MIWA medical industry \ 1-5 mL
Studylog software Studylog \ software
Studylog-Balance and supporting USB OHAUS SE601F Balance and supporting USB
Studylog-Data line of vernier calipers Sylvac 926.6721 Data line of vernier calipers
Caliper Sylvac 910.1502.10 Sylvac S-Cal pro
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339653 50 mL
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339651 15 mL
Ice bucket Thermo KLCS-288 4 °C
Ice bucket Thermo PLF-276 -20 °C
Ice bucket Thermo DW-862626 -80 °C
RNAlater Thermo am7021 \

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References

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