同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

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Cancer Research

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Summary

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS 解析に続いて単一細胞懸濁液を準備する解離。

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An, X., Ouyang, X., Zhang, H., Li, T., Huang, Y. y., Li, Z., Zhou, D., Li, Q. X. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (140), e57460, doi:10.3791/57460 (2018).

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Abstract

同種 (同系) の腫瘍は、今日の免疫・腫瘍学 (I/O) 臨床研究の主力製品です。腫瘍微小環境 (TME)、特に免疫-コンポーネントは予後との特にそれらの免疫療法の治療結果の予測に不可欠です。TME 免疫-コンポーネントは、マルチカラーの FACS による腫瘍浸潤の評価の免疫細胞のさまざまなサブセットの構成されます。膵管腺癌 (PDAC) は、良い治療法の選択肢、したがって、緊急と満たされていない医療ニーズを欠けている最悪の malignances の一つです。様々 な治療 (化学療法をターゲット、I/O) の非応答のための 1 つの重要な理由は、これらの治療から腫瘍細胞を守る白血球や線維芽細胞から成る、その豊富な TME をされています。注入 PDAC より正確に考えられているがんは、皮下 (SC) 従来よりも人間の膵臓癌の TME を奪還します。

同種腫瘍 (KPC) は、遺伝子組み換え KPC マウスから発信されたマウス自発 PDAC の移植 (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-再C) (KPC ジェム)。腫瘍組織は小さな断片 (~ 2 mm3) にカットし、皮下移植 (SC) (C57BL/6、7-9 週齢) の同系の受信者に。移植手術していたがんと一緒に SC 注入、17 日まで 300-1,000 mm3の腫瘍体積の新しい c57bl/6 マウスの膵臓に移植しました。400-600 mm3の腫瘍だけは承認された解剖プロシージャごとに収穫され、きれいに隣接する非腫瘍性組織を削除します。単一細胞懸濁液、異なる免疫細胞の様々 なマーカーの蛍光標識抗体の指定されたパネルとの汚損によって続いてに組織発生器を使用してプロトコルごと解離彼ら (リンパ球、骨髄性 NK、DCs)。ステンド グラス サンプルの腫瘍内での相対的な割合と同様、異なる系統の免疫細胞の数を決定するマルチカラー FACS を用いていた。同所性同種腫瘍の免疫プロファイルは SC 腫瘍のものと、比較しました。予備的なデータは、膵臓と SC の腫瘍ではなく、同所性同種に高い B 細胞浸潤腫瘍の浸潤なティルズ/Tam を有意に上昇を示した。

Introduction

膵管腺癌 (PDAC) ほぼ半分百万死亡世界中毎年トップ 5 がんキラーの 1 つが発生します。いくつかの効果的な治療オプションとも承認された免疫療法;したがって、新しい治療法が必死に必要です。癌は、今日知られている遺伝的疾患に加えて PDAC を含む免疫疾患として認識され始めています。病の予後と治療免疫学的および遺伝的要因を決定可能性が高い結果。腫瘍は、ホスト免疫監視を回避して最終的に死を引き起こすに進みます。多くのこれらの免疫プロセス内で発生する腫瘍微小環境 (TME)1,2,3,4異なったタイプの免疫細胞が腫瘍細胞、互いおよび他の腫瘍を対話間質成分は、直接または間接的を介してサイトカイン疾患の結果を最終的に決定します。したがって、TME、または腫瘍診療、サブタイプ、記数法の免疫細胞の異なる系統のローカリゼーションなどの腫瘍免疫成分の特性は、抗腫瘍免疫を理解する重要です。PDAC、場合それを提案されている腫瘍浸潤抑制マクロファージ (TAM) を昇格して、B 細胞は T 細胞の浸潤や活性化の防止や線維症5,6の高いレベルにつながっています。

実験的免疫手ごろを調査する一般的なアプローチは、サロゲート腫瘍臨床モデル動物を用いたが、主に関連するマウス腫瘍モデル7、特にマウス同系 (同種) または遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム)がんのマウスおよび腫瘍および免疫8,9に対するヒトの想定された類似性に。それが現実でわかる 2 種10,11の間の本質的な違いがあること。

マウスの移植腫瘍自発腫瘍7、親のジェム自発腫瘍開発と対照をなして、すなわち同期腫瘍開発上重要な操作上の利点があります。マウス腫瘍の移植であることのなかった原発操作の in vitro、・ ミラーリング オリジナル マウス腫瘍病理組織/分子病理7、として可能性のある免疫プロファイル。多くの場合、これらのマウスの移植は「患者由来の異種移植片 (PDXs) のマウス バージョン」と見なされます。彼らしたがって可能性が高い従来の同系細胞由来のマウス腫瘍12より良い翻訳可能性があります。特に、多くの移植は、特定疾病のメカニズム、例えば発癌ドライバー変異、設計、これらの移植がその臨床的意義への利点必要したがって、特定のジェムから派生されます。特に、KPC ジェムは年齢、形態学的主にも-に分化腺アーキテクチャと人間の病気を繰り返すし、間質を高濃縮の 15-20 週間以内マウス PDAC を開発します。このモデルは、人間 PDAC、すなわち Kras 変異および P53 の機能喪失、人間 PDAC、それぞれ5,6の 75% と 90% で発生するアクティブ化の最も一般的な遺伝的特徴をまた繰り返します。

移植のサイトはモデル訳しで役割を果たすことも提案されています。対応する同所性同種環境など、特定の周囲組織環境は一般的移植腫瘍の進行状況、制服の皮下 (SC) とは対照的環境に特定の腫瘍のためのニッチかもしれない。特別な関心のであろう場合、および/または、どのような違いは例えば免疫-微小環境とひと癌との関連性の面で、2 つの移植サイト間に存在します。場合 PDAC。

免疫プロファイルや診療の最も重要な側面の一つは、異なる系統、数字、腫瘍の中で相対的な割合と同様、彼らのアクティベーション状態、および場所の腫瘍浸潤の免疫細胞を決定します。これは腫瘍 infiltratrating lymphoctyes が含まれています (ティルズ、両方の T - と B-)、(Tam) 腫瘍浸潤マクロファージ、ナチュラル キラー細胞の腫瘍浸潤 (NKs) と腫瘍居住者樹状細胞3,13,14,15,16,17、および特定の細胞18,19,20の細胞内局在。蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) または流れの cytometry はセルの特定のパラメーターを測定する一般的使用される単一細胞検出技術です。マルチカラー流れの cytometry 措置単一のセル3,4,21日複数のマーカーと数字と免疫細胞のさまざまなサブセットの相対的な割合を決定する最も一般的に使用される方法です。腫瘍を含みます。

このレポートは、免疫細胞の腫瘍浸潤のプロファイリングの手順を説明します: 1) 同所性同種 PDAC マウス腫瘍移植、SC 注入; と共にの注入2) 腫瘍組織の収穫と腫瘍解離を介して単一のセル準備3) 流フローサイトメトリー解析; ベースラインとして腫瘍由来細胞のすべての4) 移植両方のベースライン プロファイルの比較。

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Protocol

すべてのプロトコルとぞやケアとの動物の使用を含む手順の見直しし、試験の実施前にクラウン バイオ施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されました。ケアと動物の使用通常行われる AAALAC (評価・実験動物医療認定協会) 国際ガイドラインに従ってケアと使用の実験動物、研究のためのガイドで報告されました。理事会 (2011 年)。すべての動物実験の手続き (特定病原体フリー) SPF 施設で滅菌条件の下で、別の政府機関 (例えばからケアと実験動物の使用のためのガイドに従い、実施国立衛生研究所)。プロトコルは、施設機関の動物実験の倫理委員会によって承認される必要があります (例:委員会 IACUC 制度)。

1. 腫瘍の移植のための準備

  1. 動物飼育
    1. 商業繁殖ベンダーから汎用の c57bl/6 マウスを取得します。
    2. 次の条件で個別換気ケージで家のマウス (5): 温度: 20 ~ 26 ° C湿度 30 ~ 70%;照明サイクル: 光 12 h、12 h 暗い。
    3. 毎週変更使用トウモロコシ穂軸寝具です。
    4. 食事療法のためには、全体の研究期間中に照射滅菌乾燥顆粒食品を提供します。
    5. 水、動物に無菌の飲料水への無料アクセスを提供します。
  2. ドナー腫瘍フラグメント作製
    1. キャリパー測定、腫瘍移植モデルによるバランスと腫瘍体積 (テレビ) を使用して重量を量るを介して体重 (BW) を監視することによって開始します。
    2. テレビでは、500-1,200 mm3に達すると、プロトコルに従ってバイオハザード フードに動物を安楽死させます。
    3. Iodophor 綿棒を使って腫瘍の周りの皮膚を消毒します。
    4. 腫瘍を外科的に削除 (セクション 3 で説明の詳細: 剖検および腫瘍の収穫) し、20 mL の PBS を含むペトリ皿に腫瘍を配置 (メディアまたは動物を安楽死させる前に 4 ° C にバッファーの冷える前)。
    5. 汚染血液がある場合別のシャーレに腫瘍を転送し、PBS で腫瘍を洗います。
    6. 半分、余分な皮膚、血管、石灰化や壊死の取り外しに腫瘍をカットします。
    7. 腫瘍のだけそのまま作品を選択し、滅菌 50 mL の遠心管にそれらを置くと 20 mL の PBS を追加し、薬理学研究の別の動物部屋にチューブを輸送します。

2. 同所性同種と皮下 (SC) の生着

  1. SC 接種
    1. メス、1 チャンクを入れて各トロカールは、SC 注入、後の同所性同種移植 (下記参照) を使用して直径個 2 mm に腫瘍をカットします。
    2. 1% で鼻の円錐形によって維持されている 5% イソフルランと受信者の動物を麻酔します。動物は彼らの立ち直り反射を失うこと、リラックスを開始し、最終的に不動になります。麻酔のこの深さで彼らすることができます簡単にから起こされる痛みの刺激;痛みにこのような反応が欠席になるまでを深めるために麻酔を許可します。
    3. 麻酔、一度右側臥位で実験基板のマウスを修正します。腫瘍周辺特に iodophor 綿棒を使ってマウスを滅菌します。
    4. メス、左のわき腹、腰にちょうど頭蓋の 0.5 から 1.0 cm の皮膚切開を行います。
    5. 鈍い鉗子が付いて前肢、2 〜 3 センチの方の皮膚の下をトンネルします。
    6. 無菌培地から腫瘍の 1 つのキューブを転送し、皮下トンネルの奥深くに配置します。
    7. 視覚的に腫瘍がトンネルの深さ (と皮膚切開ではない) ことを確認します。
    8. 傷クリップで傷口を閉じます。
    9. 胸骨の recumbence を維持するために十分な意識を取り戻すまで、動物接種を監視します。麻酔から完全回復後にのみ、ケージに動物を戻ります。麻酔ログを完了し、動物健康グラフを開始します。3 日間毎日受信者動物の重量を量る
    10. 標準的な手順は、腫瘍の成長を監視するためグループあたり 5-10 マウスを接種します。
  2. 同所性膵移植
    1. 麻酔・鎮痛
      1. 2 mL ケタミン注射 0.42 mL キシラジン注射 (20 mg/mL) 5.91 滅菌注射用水または 0.06 – 0.1 の投与量で生理食塩水に混合して mL/20-25 g の体重。
        注: 動物の福祉, に鎮痛が必要な両方の前によると、術後。0.05-0.1 mg ブプレノルフィン/kg、理学博士最初の線量は事前操作であり、継続的に 3 回各 4 時間のポスト操作を投与します。
    2. 同所性同種移植の手術
      1. 2.2.1 ステップあたりの筋肉内注射 (IM) 経由でマウスを麻酔します。
      2. 動物は麻酔が完全に後、は、右側臥位で実験基板のマウスを修正します。
      3. マウスを右側臥位にしてください。ヨウ素デ iodinate と 75% のエチルアルコールを脾臓の周りの皮膚を消毒します。
      4. 脾臓の中のポイントを見つけるし、脾臓を公開する腹部で 1 cm の縦切開を行います。
      5. フラット チップ ピンセットで軽く下脾臓膵臓組織の一部を引くし、9-0 外科縫合によって受信者のマウスの膵臓の種子マウスからマウス同種腫瘍部分を縫合します。
      6. 二重継ぎ目で 6-0 シルク縫合糸で腹部を閉じます。圧縮によって恒常性を実現します。
      7. 仕上げの腫瘍移植後も出血も腫瘍組織の漏洩が発生した場合は、暖かいケージで、動物を飼います。
      8. それは胸骨の横臥; を維持するために十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。麻酔から完全に回復した後、動物の部屋に動物を返します。監視、担癌マウス脾臓付近の腹部の触診で、同所性同種腫瘍を有するマウスを選択します。
  3. 担癌マウスの健康監視
    1. 水や食料の消費を毎日確認してください。
    2. ソフトスノー髪コート、しこり、薄さ、異常呼吸や腹水のマウスの外観を確認します。
    3. 肝臓や脾臓に腫瘍があるか確認する腹部を触診します。
    4. 毎週バランスを用いたマウスの重量を量る。
    5. マウスがサンプル採取および剖検のため犠牲に次の臨床症状のいずれかが認められた場合: BW の損失 > 20%;障害者のモビリティ (飲んだり食べたりしてないことが);通常重要な腹水と拡大された腹部のため移動できません。呼吸の努力。

3. 剖検と腫瘍の収穫

  1. 視覚と終了前に腫瘍を触知の有無を触診で調べます。
  2. 終了、最初承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させると腹部を開くし、腫瘍の膵臓を視覚的に調べる。
  3. ポスト人間手術によって腫瘍を切断し、冷 PBS に追加。使用する二酸化炭素の配信ポートで特別なふたをしたきれいな、中性、半透明の安楽死室にすべての動物を配置します。
  4. 動物に最小限の苦痛で急速な無意識状態を生成する流量で室にガスを排出します。CO2の最適流量は約 2-2.5 L/分をする必要があります。
  5. 視覚的にすべての動物が十分なガス濃度を受け安楽死プロシージャの間に意識を回復しない保証するために安楽死処理中に各動物を観察します。
  6. 動物が回復の可能性を最小限に抑えるために明白な臨床死の後、少なくとも 1 分間のガスの流れを維持 (場合無呼吸ですが死んではいない)。
  7. 隣接する非腫瘍性組織を削除します。清掃腫瘍はすぐに撮影できます。
    RPMI 1640 に腫瘍組織を置き、解離の前に、の氷に保存します。
    注: 動物の死体は袋や除去を待つため適切な冷凍保存します。

4. 腫瘍組織解離と単一セル準備

  1. 試薬の準備
    注: 腫瘍解離キットには酵素 D (凍結乾燥粉末)、酵素 R (凍結乾燥粉末)、1 バイアル酵素 A (凍結乾燥粉末) 1 mL のバッファー A. の 1 バイアルの 2 バイアルが含まれています
    1. RPMI 1640 の 3 ml 各バイアル凍結乾燥粉体を再構成することによって酵素 D を準備します。凍結融解の繰り返しを避けるために適切なボリュームの因数を準備します。
    2. RPMI 1640 の 2.7 ml バイアル、凍結乾燥粉末を再構成することによって酵素 R を準備します。凍結融解の繰り返しを避けるために適切なボリュームの因数を準備します。
    3. バッファー A キットに付属の 1 ml バイアル凍結乾燥粉体を再構成することによって酵素 A を準備します。ボルテックスにかけないでください。繰り返し無料解凍サイクルを避けるために適切なボリュームの因数を準備します。
    4. 酵素ミックスを準備するには、各 gentleMACS の C 管に 12.5 μ L 酵素 A の酵素 R の 50 μ L、100 μ L の酵素 D RPMI 1640 2.35 の mL を追加します。
  2. 腫瘍解離
    1. 各腫瘍に対する腫瘍消化ミックスの 1 つの C 管を準備、消化バッファー希釈と準備のためのセクション 4.1 を参照してください。
    2. 腫瘍の断片 3 mL 消化バッファーを使用 < 0.8 g し腫瘍は完全に消化されることを確認します。
    3. 研究コード、腫瘍、マウスの ID、治療グループと腫瘍重量とラベルを付けます。
    4. マウスから腫瘍を収集、冷 PBS で腫瘍を洗うし、腫瘍(血管、脂肪、筋膜等)に付着した組織を一掃します。
    5. 滅菌 6 ウェル プレートのウェル 1 個消化メディアに腫瘍ができます。
    6. 滅菌ピンセット ・鉗子とメスとスライスで腫瘍を保持します。腫瘍を小さく (〜 1 mm3) に分割するのにも十分なスライスします。
    7. C 管に腫瘍部分を置き、プレートを洗浄し、消化まで氷に置かれる C 管に流体を転送するバッファーの残りの消化を使用します。
    8. ヒーターと、分解に切り替えます。
    9. 袖に逆さまの位置に空いている腫瘍解離 C チューブを置き、選択する自由から管位置の状態を調整します。プログラムの一覧が表示されます、必要なフォルダーの選択によって続いて解離プログラム (37_c_m_TDK_1) を選択します。
    10. プログラムが終了した後分解と簡単にスピン (300 × g、4 ° C) サンプルをペレットに C 管を取る。
    11. 再サンプルを中断して 50 mL のチューブ上セル ストレーナーに。10 mL の単一細胞懸濁液を提供するために洗浄バッファーを持つセル ストレーナーを介して細胞を洗浄します。
    12. 300 x gで 5 分でチューブを遠心分離機、上澄みを廃棄し、再の中断 5 ml の洗浄バッファーのセル トリパン ブルーおよび/または細胞カウンターによってを使用して実行可能なセルを数えるおよび 1 x 10 の6セル管ごと、またはサンプルごとに細胞濃度を調整します。染色は特定できるように正しいアイソタイプ コントロール抗体が含まれて

5. 免疫パネル デザインとフロー データ集録

  1. パネル デザイン
    1. 表 1を参照してください。
  2. 免疫染色
    1. Fc ブロック サンプル細胞: 染色バッファー 1 μ g/ml Fc ブロック、暗闇の中で 15 分間氷や 4 ° C の冷凍の孵化によって続いて 200 μ L のセルを再中断します。
    2. 染色細胞使用目的抗体/蛍光パネル (例えばT-cell パネル、マクロファージ パネルなど。): 各サンプルについては、暗闇の中で氷の上で少なくとも 30 分間染色する Fc ブロック バッファーで希釈した抗体の混合物を追加。
    3. 各管に 1 mL の氷冷 PBS を追加し、再優しく、300 x gで 5 分間破棄結果上澄みでの遠心分離に続いてセルを中断します。
      1. セルを 2 回洗浄するを繰り返します。
    4. 細胞内マーカーの汚れ、次の手順 6-10 は、それ以外の場合ステップ 10 にジャンプします。
    5. パルス渦による細胞ペレットを再停止し、各サンプルの調製した固定/透過作業溶液 200 μ L を追加します。再び、渦をパルスし, 4 ° C で一晩 (最寄り) 暗闇の中で部屋の温度で、30 分。
    6. セル スピンダウンし、上清を削除します。
    7. X (x 透過バッファー、蒸留 H2O で希釈 10 から作られる) 透過バッファー 1 の 1 mL と遠心分離を追加および上澄みのデカントによって 2 回洗います。
    8. 1 透過バッファー x 細胞マーカー抗体を追加し、暗闇の中で 30 分間室温でインキュベートします。
    9. 1 x 透過バッファーの 1 つの mL で 2 回細胞を洗います。遠心し、上清をデカントします。
    10. Cytometer で分析・染色バッファーの 150 μ L で細胞を再懸濁します。固定・透過のプロシージャ、FSC (前方光散乱) のため/セル人口の SSC (サイドライト散布) 分布細胞は異なるようになります。したがって、電圧とゲートは、変更する必要があります。
  3. FMO のコントロール (1 つのコントロール マイナス蛍光)
    注: マルチカラー フロー解析は、免疫細胞の腫瘍浸潤の解析のため特に重要です。したがって、識別し、データを特定のパネルで複数の蛍光色素による分散のコンテキストでセルをゲートに方法を見つける必要があります。FMO (蛍光マイナス 1) コントロールは、この目的のための重要なアプローチです。
    1. このため、FMO コントロール (少なくとも Rx あたりの 2) の各グループと各組織の個別のプロセスで追加のマウスがあります。解離後組織をプールします。たとえばで研究 4 Rx グループ、8 追加腫瘍必要があります個別に処理になり FMOs のサンプルを 1 つにプールし。
  4. 計測器のセットアップを流れ
    1. マシンはウォーム アップ (最低 20 分) 間補償ビーズを作る。
    2. CS & T のビーズを使用して、パフォーマンスをチェックします。
    3. 電圧と補償の設定: UltraComp ビーズ、渦の Comp は使用する前に徹底的にビーズを使用します。
    4. 各蛍光色素標識された抗体の別の 12 × 75 mm2サンプル チューブにラベルを付けます。
    5. 各管にバッファーを染色の 100 μ L を追加します。各管にビーズの 1 完全なドロップ (約 60 μ L) を追加します。
    6. 抗体を追加し、4 に記載されているプロセスの例とおり染色の手順を実行します。
    7. 完全に再渦を介してビーズ ペレットを中断する、それぞれのバッファーを染色の 0.5 mL を加えます。
    8. 与えられた実験用の標的組織あたりの流れの cytometer PMT 電圧を設定します。
    9. FSC と SSC の測定値当たりの一重項ビーズ人口のゲートによって、データ集録の流れの cytometer を介して実行します。
    10. 周りの設定流量 200-300 のイベント/秒。
    11. 指定されたフルオレセイン [FITC] の適切な補償を設定-共役抗体、使用、FL1FL2 ドット プロット。
    12. 象限儀のゲートに置き、負ビーズ内にある左下腹部、肯定的なビーズ上でまたは低い右の象限。(象限の統計情報ウィンドウに表示される)、各人口の平均蛍光強度 (MFI) がほぼ等しくなるまで補正値を調整する (すなわちFL2 %fl1 の両方のビーズの FL2 MFI ようになります)。
    13. すべてのチューブの 5.4.11 と 5.4.12 の手順を繰り返します。
    14. 染色サンプル取得実際に進みます。補正ウィザードを実行し、「日付実験あなたのイニシャル」形式で設定を保存。

6. 流量データ解析とプレゼンテーション

  1. Flowjo および/または Kaluza によってデータを分析します。

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Representative Results

PDAC の同所性同種移植は、SC の注入のような急速な腫瘍の成長で起因しました。受信者のマウスに移植されたドナー腫瘍フラグメント後両方皮下プロトコルに従ってがんは、2.1 と 2.2 の手順の説明、図 1 a のように埋め込まれた KPC 同種腫瘍が同様の急速な成長を実証.KPC 同種腫瘍異なる時点で収穫は図 1 bに示すように、図 1のとおり代表 H & E の画像。我々 のデータを示したサウスカロライナの同様の成長と同所性同種インプラントします。

同所性同種または SC 注入から免疫細胞の腫瘍浸潤を含む TME における腫瘍細胞と細胞を効率的にリカバリできます。腫瘍は、収穫され、以降 FACS 解析のステップ 4 で説明されているプロトコルに従って商業発生器 (図 2 a) を使用して単一細胞懸濁液を準備する消化します。我々 は通常注入 (~ 80% 生存に基づいてトリパン ブルー); の両方のタイプの腫瘍のサンプルから生菌を合理的に高い利回りを得られる代表の FACS プロットは、死んだ細胞/細胞の残骸 (図 2 b) から分離、腫瘍から細胞を示しています。

自分のプロファイルの違いがある中、異なるサブセットの免疫細胞の腫瘍浸潤を同所性同種と SC の移植腫瘍の両方で識別されています。16 色パネルに示す表 1として重要な免疫細胞の異なる系統をカバーするマーカーの染色後 FACS 解析手順 4.2 で説明したメソッドを使用して腫瘍組織から作製した単一細胞懸濁液を受けた同様の腫瘍細胞。代表的な流れのプロットと共にゲート戦略または免疫系統階層は、図 3 aに表示されます。CD45、すべての成熟した免疫細胞のマーカーは特徴的な腫瘍細胞と免疫細胞の腫瘍浸潤に使われました。すべての免疫系統は CD45 から分析した後+集団パネル (表 1) によって表示されます。

セル サイズも T、B リンパ球、マクロファージ、MDSCs を含む、セルのサブセットを定量化する (図 3B ) 異なる集団を区別するために使用されるマーカーの横にあるなど。腫瘍浸潤した膵癌の同所性同種移植SC の免疫プロファイル比較。免疫細胞を浸潤腫瘍のいくつかのキーのサブセットの列挙の主要な細胞集団には、図 3が表示されます。データは明らかに、腫瘍が健康なマウスの膵臓と比較して免疫細胞浸潤を大幅に増加していることを示しています。さらに、免疫細胞の腫瘍浸潤のサブセット別の割合は、同所性同種で発見されました。SC 移植、例えばSC の同所性同種よりもはるか B 細胞

マーカー 免疫細胞の人口
CD45 総白血球
CD3 総 T 細胞
CD4 Cd 4 + ヘルパー T 細胞
CD8 Cd 8 + 細胞傷害性 T 細胞
CD44/CD62L * 素朴なメモリ、エフェクター T 細胞
CD69/CD44/OX40/CD25* 活性化マーカー
Cd 4 + cd 25 + FoxP3 + 制御性 T 細胞
CD11b + Ly6c/Ly6g G MDSC と M MDSC
CD11b + F4/80 マクロファージ
IA/IE/CD206 M1 と M2 マクロファージ
CD3-CD335 + NK 細胞
CD3 + CD335 + NKT 細胞
CD19 B 細胞
TNF-a/IFN-r/IL-7/IL-3* サイトカイン
PD-1/PD-L1/CTLA-4/ティム ・ 3* チェックポイント阻害剤
Granzym B* 一般的に要求されるマーカー
キ67/Brd U/PNCA 増殖
ライブ/デッド (修正) ライブ/デッド
* 注: 必要に応じてにさらにマーカーが追加できます。

表 1: マウスの免疫細胞の腫瘍浸潤の解析用に設計された 16 色流パネル。

Figure 1
図 1: 両方注入 PDAC 同種腫瘍 C57BL/6 を示したマウス同様の成長ゲムシタビン治療の有無で同所性同種と SC (subQ).(A) 成長曲線: SC-左と同所性同種右。青: 自動車;ゴールド: ゲムシタビン (SC 腫瘍体積の平均に達すると 200 mm3日 10 ポスト接種開始)。(B) 異なる時点での腫瘍組織。(C) 代表 H & E 染色移植 (40 × 10) の両方のタイプ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 実行可能な単一細胞懸濁液を準備する腫瘍組織解離します。(A) 関連付けの解除; の使用(B)、実行可能なセルは、フロー解析によって示すように、死んだ細胞から分離。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 同所性同種の SC PDAC 移植免疫細胞の腫瘍浸潤のマルチカラー フロー解析します。各腫瘍サンプルからの生データに続いて Flowjo FACS 解析ソフトウェアを用いた解析フロー フローサイトメトリー装置から買収されました。一例として (A) 分析のための標準的なゲート戦略が表示されます(B) 代表的なフロー ゲートや分析データの戦略をゲート規格を使用して(C) 代表的な腫瘍浸潤免疫細胞 B 細胞、Treg マクロファージなどに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

SC 腫瘍を用いた研究を行いやすくが移植がん腫瘍モデルすることができます潜在的臨床薬理試験 (特に I/O 調査) の関連性の高い強化翻訳対象範囲を提供します。このレポートは、直接彼らのそれぞれの研究で使用できる技術的な手順を視覚化できるように興味がある読者/視聴者の支援を目指しています。私達のプロトコルを示すその同所性同種 PDAC の注入が効率的な腫瘍の成長、SC 注入のように 。私達の観察はまた異なるした絵から手ごろのさまざまな免疫プロファイルの存在を示唆しているようです。SC した絵と比較して同所性同種を適応する主要な課題は、複雑なスキルが必要なプロセスは時間がかかる、注入の手術の手順は、労働集約的とも同所性同種腫瘍の監視の難しさ人生の成長。

同所性同種膵腫瘍実験が正常に実行されることを確保するための 4 つの重要なステップがある: 1); 移植の手術腫瘍の開発の 2) の慎重かつタイムリーな監視3) 予備実験を行うことの重要性が最初に手順をよく理解して、率および腫瘍の成長率を評価するテストします。4) 代替生着法として解離腫瘍の単一細胞懸濁液を使用します。このレポート手順は、読者に役立つ膵臓同所性同種の他のモデルと同様に、この特定の疾患を使用して調査を実施しても他の同所性モデルを含む腹部開口手術。

フローサイトメトリーまたは FACS 現在 immunoprofiling を実行する最も重要なツールです。FACS による腫瘍の診療は、末梢血、脾臓、リンパ節、次の方法で骨髄など、さまざまな器官から細胞で大きく異なってください。一般的には、免疫細胞の腫瘍 (小さなサンプル サイズ) で現在の非常に小さいパーセントがあります。腫瘍と免疫細胞の存在の少数の極端な不均一性を作る回復の実行可能な希少な免疫細胞技術的に挑戦的な独自に開発した腫瘍組織解離を含むマシンを必要とします。両方の以前のポイントは、本質的なマルチカラー フローサイトメトリーを使用して同時の複数パラメーター測定を行います。マルチカラー フローでは、複雑なマーカー パネル デザイン、補正、および蛍光スペクトル重複のための戦略をゲートを必要とします。このレポートでは、興味がある読者/視聴者に腫瘍免疫を介して定義された腫瘍組織解離とマルチカラー フロー フローサイトメトリー解析プロファイリングのプロセスを示すしようと。

解析まで生産性をもたらすため特に重要 3 つの重要なステップである: 最初に、実行可能なセルから回復の高収率解離カスタマイズされた腫瘍解離プロシージャの使用腫瘍第二に、に基づいて染色パネルを利用可能な試薬を用いる大規模なマルチカラーの最適設計第三に、分析に最適化されたゲーティング戦略。著者は訓練を強調したい、ティルの成功フロー フローサイトメトリー分析用データ集録および解析のオペレーターの経験が欠かせない。

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Disclosures

すべての著者は、サイエンス株式会社クラウンの現在正社員

Acknowledgments

著者博士ジョディ Barbeau - 重要な読書と原稿の編集、ありがとうと芸術作品を設計するためラルフ ・ マヌエルを感謝思います。著者もクラウン生命科学腫瘍免疫腫瘍マーカー チームとがんのIn Vivoチームの素晴らしい技術的な努力に感謝を思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia machine \ SAS3119 \
Trocar 20 \ \ 2 mm
Petri dish \ \ 20 mm
100x antibiotic and antimycotic \ \ \
Iodophor swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Alcohol swabs \ \ Daily pharmacy purchase
Liquid nitrogen Air chemical \ \
Biosafety hood AIRTECH BSC-1300IIA2 \
FACS machine LSRFortessa X-20 BD LSR Fortessa \
antibodies BD \ \
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration BD 354248 \
FACS buffers BD 554656 Mincing buffer
Brilliant Staining Buffer BD 563794 \
Mouse BD Fc Block BD 553142 \
cell filters BD-Falcon 352350 70 µm
routine blood tube BD-Vacutainer 365974 2 mL
Kaluza Beckman vs 1.5
6-well plates Corning 3516 \
Foxp3 Fix/Perm kit ebioscience 00-5523-00 \
UltraComp eBeads ebioscience 01-2222-42 \
Centrifuge eppendorf 5810R,5920R \
FlowJo software FlowJo LLC \ vs 10.0
PBS Hyclone SH30256.01 50 mL
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 \
Disposable, sterile scalpels Jin zhong J12100 11#
knife handle Jin zhong J11010 \
eye scissors and tweezers Jin zhong Y00030 Eye scissors 10 cm
eye scissors and tweezers Jin zhong JD1060 Eye tweezers 10 cm with teeth
Portable liquid nitrogen tank Jinfeng YDS-175-216 \
Electronic balance Metter Toledo AL204 0-100 g
Miltenyi C-tubes Miltenyi 130-096-334 \
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks Miltenyi 120-018-306 \
Tumor Dissociation Kit Miltenyi 130-096-730 \
Cell counter Nexcelom Cellometer Cellometer Auto T4
cryopreservation tube Nunc 375418 1.8 mL
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME PathClear 3442-005-01 \
syringes Shanghai MIWA medical industry \ 1-5 mL
Studylog software Studylog \ software
Studylog-Balance and supporting USB OHAUS SE601F Balance and supporting USB
Studylog-Data line of vernier calipers Sylvac 926.6721 Data line of vernier calipers
Caliper Sylvac 910.1502.10 Sylvac S-Cal pro
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339653 50 mL
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339651 15 mL
Ice bucket Thermo KLCS-288 4 °C
Ice bucket Thermo PLF-276 -20 °C
Ice bucket Thermo DW-862626 -80 °C
RNAlater Thermo am7021 \

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References

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