पूर्वव्यापी MicroRNA अनुक्रमण: पूरक डीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड आरएनए नमूनों

Genetics

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Summary

Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड नमूनों मानव रोगों के आणविक के एक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहाँ हम एक प्रयोगशाला आधारित सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल, शुरू में ताजा जमे हुए आरएनए के साथ बनाया गया है, और ३५ साल तक संग्रहीत ऊतकों से संग्रहीत microRNAs के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं ।

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

-संग्रहीत, चिकित्सकीय वर्गीकृत formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों को कैंसर के विकास के पूर्वव्यापी आण्विक अध्ययन के लिए न्यूक्लिक एसिड प्रदान कर सकते हैं । रोगियों को जो बाद में इनवेसिव रोग का विकास से गैर इनवेसिव या पूर्व घातक घावों का उपयोग करके, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण मदद जल्दी आणविक परिवर्तन है कि कैंसर के जोखिम को कम करने की पहचान कर सकते हैं । यह अच्छी तरह से वर्णित किया गया है कि न्यूक्लिक FFPE ऊतकों से बरामद एसिड गंभीर शारीरिक क्षति और रासायनिक संशोधनों, जो उनके विश्लेषण करना मुश्किल है और आम तौर पर परख अनुकूलित की आवश्यकता है आया है । MicroRNAs (miRNAs), तथापि, जो आरएनए केवल अप करने के लिए फैले अणुओं के एक छोटे से वर्ग का प्रतिनिधित्व करने के लिए ~ 18 – 24 न्यूक्लियोटाइड, लंबी अवधि के भंडारण का सामना करने के लिए दिखाया गया है और सफलतापूर्वक FFPE नमूनों में विश्लेषण किया गया है. यहाँ हम एक 3 बारकोड पूरक डीएनए (सीडीएनए) पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल विशेष रूप से संग्रहीत ऊतकों से निकाले गए छोटे RNAs के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं, जो हाल ही में मजबूत और अत्यधिक reproducible जब संग्रहीत का उपयोग कर प्रदर्शित किया गया था नैदानिक नमूनों के लिए ३५ साल के लिए संग्रहीत । इस पुस्तकालय की तैयारी अच्छी तरह से समझौता/नीचा सामग्री के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, जहां आरएनए नमूने (18 तक) व्यक्तिगत 3 ' बारकोड एडाप्टर के साथ ligated रहे हैं और फिर बाद में एंजाइमी और जैव रासायनिक तैयारी के लिए एक साथ परित विश्लेषण करने से पहले । सभी शुद्धि polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) है, जो आकार विशिष्ट चयन और बारकोड छोटे आरएनए प्रजातियों के संवर्धन की अनुमति देता द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं । इस सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी अच्छी तरह से मिनट आरएनए आदानों के लिए अनुकूलित है, एक पायलट पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए सामग्री की इष्टतम मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक विशिष्ट प्रवर्धन चक्र का निर्धारण की अनुमति देता है. यह दृष्टिकोण ३५ साल तक के लिए संग्रहीत नमूनों से नीचा FFPE आरएनए के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था और अत्यधिक reproducible NGS डेटा प्रदान करता है.

Introduction

miRNAs उल्लेखनीय अच्छी तरह से formalin में संरक्षित कर रहे है-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) नमूनों1,2,3। पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि इन लघु विनियामक गैर कोडिंग एकल असहाय आरएनए अणुओं की अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक FFPE नमूनों से कुल आरएनए का उपयोग कर मूल्यांकन कर सकते है और प्रासंगिक जीन अभिव्यक्ति डेटा प्रदान जब मूल की तुलना में ताजा ऊतकों4,5,6,7,8। जब बड़े आकार के दूत RNAs, जो गंभीर रूप से FFPE ऊतक प्रसंस्करण (formaldehyde, गर्मी, सुखाना, आदि), अंतर्जात RNases, और नमूनों की उंर से प्रभावित होना दिखाया गया है की तुलना में, miRNAs के छोटे आकार (~ 18 – 24 न्यूक्लियोटाइड) के लिए उंहें क्षरण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए लचीला करने के लिए प्रतिरोधी प्रतीत होता है, यह भी miRNA अभिव्यक्ति अध्ययन के माध्यम से प्रदर्शन किया है कि मात उच्च प्रवाह में mRNA अध्ययन के नमूने9। miRNA अभिव्यक्ति संग्रहीत नैदानिक नमूनों, जो ज्यादातर छोटे पैमाने पर विश्लेषण में प्रदर्शन किया गया है का उपयोग कर अध्ययन, प्रदर्शन किया है कि एकल या मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक पीसीआर परख, microarray प्रौद्योगिकियों के विभिंन प्रकार, और सबसे हाल ही में NGS कर सकते है इन परख के अनुकूलन के बाद संरक्षित miRNAs की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा10,11,12,13,14

यह देखते हुए कि miRNA अभिव्यक्ति की dysregulation मानव द्रोह की एक किस्म के विकास के साथ जुड़ा हुआ है और वहां संभवतः नैदानिक व्याख्या संग्रहीत नमूनों की एक विशाल आपूर्ति है, यह स्पष्ट हो गया है कि इन छोटे आरएनए अणु संभावित कैंसर के एक होनहार स्रोत15,16,17,18का प्रतिनिधित्व करते हैं । ऐसे NGS के रूप में एक उच्च प्रवाह जीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी के उपयोग के सभी miRNA टेप के एक वैश्विक मूल्यांकन प्रदान करने का लाभ है जब ऐसी पीसीआर और/या microarrays19के रूप में लक्षित प्रौद्योगिकियों की तुलना में/ इस कारण से, एक अनुकूलित, सस्ती, और NGS के लिए पुराने संग्रहीत नमूनों से छोटे RNAs के सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए आसानी से लागू प्रोटोकॉल के लिए बड़े पैमाने पर पूर्वव्यापी अध्ययन20सक्षम अनुकूलित किया गया था ।

हम पहले से आरएनए और डीएनए की अलग वसूली के लिए एक एक साथ आरएनए/डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल की स्थापना की है जो हम समकालीन वाणिज्यिक किट21मात करने के लिए पाया पुराने संग्रहीत नमूनों, से । इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, FFPE ऊतकों से कुल आरएनए प्राप्त करने के लिए समय की विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत, हम ३५ वर्ष तक के लिए नैदानिक नमूनों में संरक्षित miRNAs के NGS के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी अनुकूलित. इसके अलावा, एक हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में जहां हम सीटू (DCIS) नमूनों में नैदानिक वर्गीकृत डक्टर कार्सिनोमा से सीडीएनए पुस्तकालयों तैयार, हम अंतर व्यक्त की पहचान की है कि मात्रात्मक पीसीआर, जो संकेत दिया द्वारा मान्य किया गया miRNAs कि विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति परिवर्तन रोगियों को जो स्तन कैंसर का विकास नहीं है, जो रोगियों से DCIS घावों की तुलना में DCIS घावों में पहचाने जा सकता है ।

छोटे आरएनए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी के लिए वाणिज्यिक किट की लागत को ध्यान में रखते हुए, उनके विच्छेदन के लिए संभावित, साथ ही कॉपीराइट का उपयोग/पेटेंट-संरक्षित एजेंट है कि अनुकूलित नहीं किया जा सकता है, हम एक पहले से प्रकाशित अनुकूलन का फैसला किया प्रयोगशाला आधारित और किट-नि: शुल्क 3 बारकोड FFPE नमूनों में संग्रहीत छोटे RNAs के NGS के लिए सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल, 18 नमूनों की एक साथ विश्लेषण की अनुमति22. इस प्रोटोकॉल दृश्य और तकनीकी मूल्यांकन चौकियों, जो FFPE आरएनए नमूनों के लिए अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण थे के साथ एक आदर्श और मजबूत कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है, और समझौता या मुश्किल के अन्य स्रोतों के लिए आवेदन के लिए एक मजबूत क्षमता है आरएनए सामग्री का उपयोग करने के लिए. मूल प्रोटोकॉल प्रयोज्य फ्लोरोसेंट के साथ रेडियोधर्मी लेबल आकार मार्करों की जगह द्वारा सुधार किया गया था (उदा., SYBR गोल्ड) detectable आरएनए आकार मार्करों बड़े polyacrylamide जैल पर ligated पुस्तकालयों के चयन के दौरान इस्तेमाल किया । यह अनुकूलित प्रोटोकॉल तो 5 ' अनुकूलक बंधाव, रिवर्स-प्रतिलेखन, और अंतिम सीडीएनए के अनुरूप प्रवर्धन के लिए एक पायलट पीसीआर विश्लेषण से गुजरना के लिए एक साथ परित हैं, जो 18 व्यक्तिगत FFPE आरएनए नमूनों के लिए 3 ' बारकोड एडाप्टर के बंधाव पर निर्भर करता है पुस्तकालय बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन, शुद्धि, और एक उच्च प्रवाह sequencer पर NGS करने से पहले ।

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Protocol

1. सभी रिएजेंट और प्राइमरों की तैयारी

  1. सभी प्राइमरों और एडेप्टर के रूप में चित्रा 1में वर्णित आदेश ।
  2. जो प्रत्येक व्यक्ति बंधाव में नुकीला हो जाएगा, नपे कॉकटेल शेयर तैयार करें ।
    1. वाहक oligonucleotide (चित्र 1) को RNase-मुक्त पानी के साथ ०.५ µ मीटर तक पुनर्स्थगित करें । ०.५ µ m वाहक oligonucleotide समाधान का उपयोग करते हुए 10 औजार oligonucleotides (चित्रा 1) को १०० µ m से रिसस्पेंड करें ।
    2. एक १०० µ एम कॉकटेल औजार प्राप्त करने के लिए एक सिलिकॉन microcentrifuge में 10 औजारों में से प्रत्येक के 10 µ एल गठबंधन, और एक ०.०२६ एनएम समाधान तैयार करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. ५० µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 20 अद्वितीय, lyophilized, adenylated 3 ' एडेप्टर RNase-मुफ्त पानी के साथ पतला (चित्रा 1).
    नोट: यह व्यक्तिगत सिलिकॉन ट्यूबों में प्रत्येक अनुकूलक से २.५ µ एल aliquots तैयार करने की सिफारिश की है और उन पर स्टोर-८० ° c अप करने के लिए 2 साल के लिए ।
  4. (चित्रा 1) एनजी 19 nt-3 अनुकूलक और 24 nt-3 ' अनुकूलक आकार मार्कर oligonucleotides २५० के लिए $ reसस्पेंड ।
  5. reसस्पेंड HPLC शुद्ध 5 ' अनुकूलक RNAse के साथ १०० µ मीटर मुक्त पानी के साथ । 5 ' और 3 ' पीसीआर प्राइमरों reसस्पेंड १०० µ एम के लिए RNase-मुफ्त पानी (चित्रा 1) का उपयोग कर ।
    नोट:-८० ° c पर 1 – 2 प्रयोगों और स्टोर के लिए आवश्यक मात्रा में सभी oligonucleotides Aliquot.
  6. ९८.८% formamide, 1% (v/v) ०.५ M ना2H2 EDTA, pH ८.०, और ०.२% bromophenol ब्लू के संयोजन से polyacrylamide denaturing (पा) जेल लोडिंग डाई तैयार करें, और सेट 1 मिलीलीटर aliquots-८० ° c ।
    1. ०.५ मीटर ना2एच2 EDTA सॉल्यूशन को जोड़ कर2एच2 EDTA पाउडर को ५० मिलीलीटर के nuclease से नि: शुल्क पानी में घोल कर तैयार करें । NaOH छर्रों जोड़ें पीएच ८.० तक पहुंचने के लिए । १०० मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम समायोजित करने के लिए एक ०.५ एम ना2एच2 EDTA, पीएच ८.० शेयर समाधान प्राप्त करते हैं ।
    2. एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब में bromophenol नीले रंग के 15 मिलीग्राम वजन । nuclease-मुक्त जल के ६०० µ l को जोड़ें । १४.२५ एमएल के डी-formamide जोड़ें । जोड़ें १५० µ एल के ०.५ एम ना2एच2 EDTA, पीएच ८.० समाधान ।
    3. Aliquot-८० ° c में 1 मिलीलीटर aliquots में 15 मिलीलीटर की पा अंतिम समाधान है ।
  7. 5x agarose जेल ०.२% bromophenol नीला, ०.२% xylene cyanol एफएफ, ५० mM Na2H2 EDTA, पीएच ८.०, और 20% Ficoll प्रकार-४०० के संयोजन से डाई लोड हो रहा है तैयार करें ।
    1. nuclease के ५० मिलीलीटर में Na2H2-EDTA के १.८६ g reसस्पेंड-कमरे के तापमान पर एक चुंबकीय सरगर्मी पर एक ४०० मिलीलीटर चोंच में नि: शुल्क पानी (आरटी) । एक पीएच ८.० तक पहुंचने के लिए NaOH छर्रों जोड़ें । जोड़ें nuclease-मुफ्त पानी १०० मिलीलीटर तक पहुंचने के लिए एक ५० mM Na2H2 EDTA समाधान प्राप्त करने के लिए ।
    2. वजन 20 bromophenol नीले पाउडर के मिलीग्राम, 20 xylene cyanol एफएफ पाउडर के मिलीग्राम, और Ficoll प्रकार के 2 जी-४०० पाउडर, और ५० mM ना2H2 EDTA के 5 मिलीलीटर में reसस्पैंड ।
    3. भंवर ट्यूब तीनों रंगों से युक्त है और ५० mM ना2H2 EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें । 5x agarose जेल लोडिंग डाई मिक्स, 1 मिलीलीटर aliquots तैयार है, और दुकान पर-८० ° c ।

2.18 व्यक्तिगत आरएनए नमूने के साथ 3 ' बारकोड एडाप्टर Ligations सेट अप

  1. 18 व्यक्ति आरएनए नमूनों की पहचान (पूर्व-aliquoted में १०० एनजी के ९.५ µ एल में nuclease-मुफ्त पानी की १.५ मिलीलीटर सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूबों), और बर्फ पर ट्यूबों सेट करने के लिए 10 मिनट के लिए ठंढ ।
  2. ताजा 10x आरएनए Ligase बफर (एटीपी बिना) तैयार करते हैं ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर में सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब, RNase के ३४३ µ l का मिश्रण-नि: शुल्क जल, ५०० µ l के Tris 1 m pH ७.५, १०० µ l की 1 m MgCl2, ५० µ l की 20 mg/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, और 7 µ l की 14 m 2-mercaptoethanol. ट्यूब झटका द्वारा मिक्स, 2 के लिए केंद्रापसारक पर २,००० x जी और आर टी, और बर्फ पर सेट ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी कदम है कि संकेत मिलता है "2 एस के लिए केंद्रापसारक" RT पर एक benchtop microcentrifuge में प्रदर्शन किया और २,००० x जी की एक शीर्ष गति के लिए ट्यूबों के नीचे समाधान इकट्ठा कर रहे हैं ।
  3. एक 2 मिलीलीटर सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब में DMSO के 1 मिलीलीटर के लिए RNase-मुफ्त पानी की 1 मिलीलीटर जोड़कर ५०% जलीय DMSO शेयर तैयार, एल्यूमीनियम पंनी में ट्यूब लपेटो, और आरटी पर स्टोर ।
  4. 10 मिनट के लिए बर्फ पर ०.०२६ एनएम नपे कॉकटेल को दूर करें । एक १.५ मिलीलीटर में निंनलिखित क्रम में संयोजन द्वारा बंधाव मास्टर मिश्रण तैयार microcentrifuge ट्यूब: ४० µ 10x आरएनए Ligase बफर और १२० µ एल के एल ५०% जलीय DMSO का उपयोग कर एक २०० मिलीलीटर पिपेट , और एक 10 µ एल पिपेट का उपयोग कर ०.०२६ एनएम औजार कॉकटेल के 10 µ एल जोड़ें । झटका १.५ एमएल ट्यूब मिश्रण करने के लिए, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और यह बर्फ पर सेट ।
  5. बंधाव मास्टर मिश्रण के ८.५ µ एल जोड़ें 18 व्यक्तिगत aliquoted FFPE आरएनए नमूनों में से प्रत्येक के लिए, धीरे ट्यूब झटका, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और बर्फ पर दुकान.
  6. २.५ µ एल aliquots 18, 3 ' बारकोड एडाप्टर के प्रत्येक से और उंहें बर्फ पर जगह के लिए 20 मिनट के लिए ठंढ ।
    1. एक 3-µ l पिपेट का उपयोग करने के लिए प्रत्येक एडेप्टर के 1 µ l को हस्तांतरित करने के लिए इसी FFPE आरएनए नमूने युक्त आरएनए और बंधाव मास्टर मिश्रण (अर्थात, ९.५ µ l + ८.५ µ l).
    2. ऊपर और नीचे पिपेट मत करो, बस तरल में बांटना और टिप बाहर खींचो । FFPE आरएनए नमूनों के बीच सुझावों को बदलने के लिए सुनिश्चित करें । एक ट्यूब बंद, मिश्रण करने के लिए झटका, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और बर्फ पर सेट ।
  7. 1 मिनट के लिए ९० ° c पर एक गर्मी ब्लॉक पर 18 ट्यूबों रखकर प्रतिक्रिया स्वभाव और फिर बर्फ पर तुरंत जगह है ।
  8. एक ताजा १.५ मिलीलीटर में Ligase ट्यूब µ-मुक्त पानी की 10 RNase एल के साथ काट K227Q टी-4 आरएनए microcentrifuge 2 के कमजोर 10 µ एल द्वारा बंधाव एंजाइम समाधान तैयार करें ।
  9. एक 3 µ एल पिपेट का उपयोग करने के लिए 18 आरएनए नमूनों में से प्रत्येक में पतला बंधाव एंजाइम के 1 µ एल हस्तांतरण (ऊपर और नीचे नहीं पिपेट, और प्रत्येक ट्यूब के बीच सुझावों को बदलने). 18 एच की एक रात की गर्मी के लिए बर्फ और जगह पर एक 4 ° c ठंडे कमरे में ligations सेट करें ।

3. Ligated छोटे RNAs का शुद्धिकरण

  1. ९० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक पर 1 मिनट के लिए 18 ट्यूबों रखने के द्वारा बंधाव प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय, और फिर बर्फ पर लौटने के लिए नीचे ठंडा कम 2 मिनट के लिए ।
  2. एक ताजा सिलिकॉन RNase ट्यूब में 5 एम NaCl-नि: शुल्क microcentrifuge के 26 µ एल के लिए ग्लाइकोजन से जुड़े ब्लू डाई covalently के 1 µ एल जोड़कर वर्षा मास्टर मिश्रण तैयार करें ।
    1. स्थानांतरण १.२ 18 ट्यूबों में से प्रत्येक में वर्षा मास्टर मिश्रण के µ एल । 18 ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए १००% इथेनॉल के ६३ µ एल जोड़ें । एक ट्यूब बंद, मिश्रण करने के लिए झटका, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और बर्फ पर ट्यूबों जगह है । एक एकल १.५ मिलीलीटर में सभी 18 ट्यूबों की सामग्री का मिश्रण ट्यूब सिलिकॉन ।
    2. ट्यूब बंद करो, मिश्रण करने के लिए तीन बार पलटना, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और ६० मिनट के लिए बर्फ पर जगह हाला ।
  3. एक बड़ा (16 x 20 cm2) पृष्ठ के लिए 15% polyacrylamide जेल तैयार करें ।
    1. दो सिलिकॉन ग्लास प्लेट्स कास्ट (silane कोटिंग्स के लिए एक सुरक्षित विकल्प के साथ इलाज) ०.१ सेमी स्पेसर्स के साथ ।
    2. प्रणाली मंदक के 9 मिलीलीटर, सिस्टम ध्यान केंद्रित के 18 मिलीलीटर, सिस्टम बफर के 3 मिलीलीटर, ए पी एस के २४० µ एल (9%), और TEMED के 12 µ एल का मिश्रण एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ।
    3. पृष्ठ जेल समाधान ग्लास प्लेटों के बीच में स्थानांतरण एक 30 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर, एक 14-well कंघी डालें (०.१ सेमी मोटी), और 30 मिनट के लिए आर टी पर जेल जमना चलो ।
  4. १.५-एमएल ट्यूब १६,००० x g पर परित ligations और ६० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के साथ केंद्रापसारक ।
  5. कंघी निकालें । RNase के साथ बहुतायत से साफ कुओं को मुक्त पानी अपने अंत में एक २०० µ एल टिप के साथ एक धार बोतल का उपयोग करने के लिए कुओं और सेना के अंदर पहुंच-बहुलक acrylamide बाहर (एक अच्छी तरह से एक समय में) एक सिंक के ऊपर । एक जेल उपकरण पर 15% पृष्ठ सेट, 0.5 x Tris-बोराटे EDTA (TBE) समाधान के साथ जलाशयों को भरने, और पूर्व ४५० वी पर 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
  6. केंद्रापसारक से परित ligations के साथ ट्यूब ठीक है और ध्यान से आरएनए गोली सूखी ।
    1. एक 1-एमएल पिपेट टिप के साथ supernatant निकालें, लेकिन नीचे कुछ तरल छोड़ दें । ट्यूब झुकाव और गोली छूने के बिना शेष supernatant को दूर करने के लिए एक 20 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें । वैक्यूम चूषण अपने अंत पर एक 10-µ एल टिप के साथ एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर ट्यूब, गोली छूने के बिना ।
    2. ट्यूब को झाड़ने से मुक्त पानी RNase के 20 µ एल में आरएनए गोली reसस्पेंड । पा जेल के 20 µ एल जोड़ें समाधान आरएनए reसस्पेंड करने के लिए, मिश्रण करने के लिए फ्लिक, 2 सैट आरटी के लिए केंद्रापसारक, और 1 मिनट के लिए ९० º सी पर ट्यूब सेट और फिर तुरंत बर्फ पर जगह है ।
  7. ताजा 0.5 x TBE के साथ जेल उपकरण के 0.5 x TBE बदलें, और सीढ़ी, आकार मार्कर, और जेल के केंद्र में ligated miRNAs, दोनों पक्षों (चित्रा 2) पर 2 खाली कुओं छोड़ लोड ।
  8. ६० मिनट के लिए ४५० v (३५ mA) पर जेल भागो, 10 मिनट के लिए नीचे ठंडा करने के लिए चलाने के लिए रोकें, और एक और ६० मिनट के लिए ५२० V (25 mA) पर फिर से चला । इस ग्लास प्लेट्स में से एक को हटाकर 15% पेज अनकास्ट करें ।
  9. हल्के 0.5 x TBE के 25 मिलीलीटर में फ्लोरोसेंट डाई समाधान (10 µ एल) के साथ कांच की थाली पर बैठे जेल स्प्रे, और यह अंधेरे में 5 मिनट के लिए फ्लैट बैठते हैं ।
  10. एक नीली बत्ती transilluminator पर जेल के साथ कांच रखना, और एक शासक के साथ दोनों 19 nt और 24 nt आकार मार्करों ligated छोटा RNAs (चित्रा 2) के उत्पाद को निर्देशित करने के लिए संरेखित करें । एक्साइज जेल.
  11. एक ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक्साइज जेल प्लेस, जेल स्लाइस खंडित करने के लिए डिज़ाइन किया गया, सुरक्षित रूप से एक १.५ मिलीलीटर सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब में तैनात । आरटी पर 3 मिनट के लिए १६,००० x g पर केंद्रापसारक । ४०० mM NaCl समाधान के ३०० µ एल के साथ खंडित जेल reसस्पेंड, ट्यूब बंद है, और यह आयल फिल्म के साथ सील ।
  12. एक thermomixer पर आंदोलन पर ट्यूब सेट १,१०० rpm में एक 4 ° c ठंडे कमरे में एक रात भर की मशीन के लिए (16-17 ज) ।

4. बंधाव के 5 ' अनुकूलक

  1. एक १.५ मिलीलीटर में बैठे एक 5 µm फ़िल्टर ट्यूब करने के लिए समाधान और खंडित जेल स्थानांतरण ट्यूब, तेल फिल्म के साथ सील, और २,३०० x जी और आरटी पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  2. फ़िल्टर किए गए समाधान के लिए १००% इथेनॉल के ९५० µ एल जोड़ें, ट्यूब बंद, मिश्रण करने के लिए पलटना, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, आयल फिल्म के साथ ट्यूब सील, और बर्फ पर सेट के लिए 1 ज ।
  3. चरण ३.३ में वर्णित के रूप में एक 12% पृष्ठ जेल तैयार है, लेकिन मंदक के १२.६ मिलीलीटर, १४.४ ध्यान की मिलीलीटर, बफर के 3 मिलीलीटर, २४० µ एल ए पी एस, और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में TEMED के 12 µ एल गठबंधन । पहले ४५० V (~ ३५ mA) में 0.5 x TBE में 30 मिनट के लिए 12% पृष्ठ जेल चलाते हैं ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए १६,००० x g पर शुद्ध लघु आरएनए समाधान केंद्रापसारक ।
  5. ध्यान से समाधान के थोक हटाने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर supernatant बाहर पिपेट और एक २०० मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए शेष समाधान निकालने के लिए, गोली छूने के बिना ।
  6. एक वैक्यूम कुप्पी से जुड़े अपने अंत में एक 10 मिलीलीटर टिप के साथ एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, ध्यान से इसे छूने के बिना गोली सूखी ।
  7. RNase के 9 µ एल में गोली reसस्पेंड-मुक्त पानी ऊपर और नीचे pipetting बिना, लेकिन हल्के से ट्यूब फ़्लिक करके, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और बर्फ पर ट्यूब सेट ।
  8. 10x आरएनए Ligase बफर (एटीपी के साथ) के संयोजन के द्वारा ताजा तैयार करें ५०० µ l के 1 m Tris pH ७.५, १०० µ l के 1 m MgCl2, ५० µ l की 20 mg/मब acetylated BSA, २०० µ l के 10 एमएम एटीपी, 7 µ l के 2-mercaptoethanol 14 मीटर , और RNase-मुक्त जल के १४३ µ l
  9. ट्यूब फ़्लिक करके (एटीपी के साथ) 10x आरएनए Ligase बफर मिश्रण, और ट्यूब के तल पर समाधान इकट्ठा करने के लिए 2 एस के लिए केंद्रापसारक ।
  10. 10x आरएनए Ligase बफर के 2 µ एल जोड़कर 5 ' अनुकूलक बंधाव सेट (एटीपी के साथ), १०० µ एम 5 अनुकूलक के 1 µ एल, और 6 µ एल ५०% जलीय DMSO करने के लिए 9 µ l, 3 ' बारकोड्ड लघु आरएनए समाधान.
  11. ट्यूब हल्के ढंग से झटका मिश्रण करने के लिए, समाधान इकट्ठा करने के लिए 2 एस के लिए, 1 मिनट के लिए ९० ° c पर एक गर्मी ब्लॉक पर ट्यूब जगह है, और बर्फ पर वापस कम 2 मिनट के लिए ।
  12. टी-4 आरएनए के 2 µ एल जोड़ें समाधान में Ligase 1 (ऊपर और नीचे पिपेट नहीं है), ट्यूब झटका, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और ६० मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में फ्लोटिंग रैक में ट्यूब बैठते हैं ।
  13. साथ ही, दो ligations के बीच सेट अप 19 nt-3 ' एडाप्टर और 5 ' एडाप्टर, और दो ligations के बीच 24 nt-3 ' एडाप्टर और 5 ' एडाप्टर ।
    1. 19nt-3 अनुकूलक के 2 µ एल का मिश्रण (२५० एनजी/µ एल) या 24 nt-3 ' अनुकूलक (२५० एनजी/µ एल) के साथ: 2 µ एल के 5 ' अनुकूलक (१०० µ मीटर), 2 µ एल के 10x आरएनए Ligase बफर (एटीपी के साथ), 6 µ एल के ५०% जलीय DMSO, 6 µ एल के RNase-मुक्त पानी , और टी-4 आरएनए के 2 µ एल Ligase एक १.५ मिलीलीटर में 1 microcentrifuge ट्यूब सिलिकॉन ।
    2. झटका ट्यूबों मिश्रण करने के लिए, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेट ।
  14. सभी ligations करने के लिए पा Denaturing बफर के 20 µ एल जोड़ें (शुद्ध छोटे RNAs, ligations के साथ 2 19nt-3 ' अनुकूलक, और ligations-3 ' अनुकूलक के साथ 2 24nt).
    1. ट्यूबों को झाड़ने से मिश्रण, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और 1 मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर एक हीट ब्लॉक पर ट्यूबों गर्मी । बर्फ के लिए सभी ट्यूबों हस्तांतरण, और एक सीढ़ी (20 µ एल के साथ सीढ़ी के 3 मिलीलीटर) तैयार ।
  15. जेल उपकरण के ऊपरी जलाशय को खाली करने के साथ पूर्व-भागो 12% पृष्ठ जेल, और कुओं के स्तर के नीचे ताजा 0.5 x TBE समाधान जोड़ें (कुओं एक लंबी, पतली टिप पिपेट के साथ खाली कर रहे हैं) ।
    1. नमूने को एक पतली पिपेट टिप के साथ लोड करें, जैसा आरेख 3में वर्णित है ।
    2. जेल के शीर्ष पर व्यक्तिगत कुओं को भरने के लिए ताजा 0.5 x TBE का प्रयोग करें ।
    3. कुओं के ऊपर जलाशय के लिए ताजा 0.5 x TBE जोड़ें और ४५० V (~ ३५ mA) पर ६० मिनट के लिए 12% पृष्ठ के ट्रो शुरू करते हैं ।
    4. बंद जेल शांत करने के लिए 10 मिनट के लिए जनरेटर स्विचन द्वारा भागो रोकें । जनरेटर पुनरारंभ करें और ५२० V (~ 25 mA) पर ६० मिनट के लिए जेल चलाने ।
  16. जनरेटर बंद करो, एक सिंक के ऊपर तंत्र औंधा द्वारा जलाशयों खाली है, और ग्लास प्लेटों में से एक को हटाने के द्वारा 12% पृष्ठ कच्चा ।
  17. जेल के फ्लैट के साथ ग्लास बैठो, 25 मिलीलीटर 0.5 x TBE में फ्लोरोसेंट डाई के 10 µ एल के साथ जेल स्प्रे, और 5 मिनट के लिए अंधेरे में गर्मी. एक नीली बत्ती transilluminator पर जेल के साथ गिलास रखना, और दोनों के साथ 19 nt और दोनों 24 nt आकार मार्करों संरेखित करें एक शासक ligated लघु RNAs (चित्रा 3) के उत्पाद का प्रत्यक्ष करने के लिए ।
    1. एक्साइज जेल और एक ०.५ मिलीलीटर जेल ब्रेकर ट्यूब में एक्साइज जेल टुकड़ा स्थानांतरण । जेल ब्रेकर ट्यूब, एक १.५ मिलीलीटर सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब में सेट की टोपी बंद करो, और आयल फिल्म के साथ सुरक्षित । जेल ब्रेकर ट्यूब निकालें, ३०० mM NaCl के ३०० µ एल, और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कुचल जेल टुकड़े करने के लिए १०० µ एम 3 ' पीसीआर प्राइमरी के 1 µ एल जोड़ें ।
    2. एक ठंडे कमरे में १,१०० rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस, रात भर (17-18 घंटे) में एक thermomixer पर आंदोलन पर तेल फिल्म के साथ ट्यूब सील ।

5. रिवर्स प्रतिलेखन 5 ' Ligated और 3 ' बारकोड शुद्ध छोटे RNAs

  1. thermomixer से ट्यूब निकालते हैं और एक 5 µ एम फिल्टर ट्यूब के साथ समाधान शुद्ध फिल्टर.
    1. एक १.५ मिलीलीटर सिलिकॉन RNase-मुक्त संग्रह ट्यूब में डाला एक 5 µ मीटर फिल्टर ट्यूब पर समाधान हस्तांतरण करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग करें । २,३०० x जी और आर टी पर 3 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक
    2. फ़िल्टर ट्यूब त्यागें और १.५ मिलीलीटर microcentrifuge संग्रह ट्यूब फ़िल्टर समाधान युक्त करने के लिए १००% इथेनॉल के ९५० µ एल जोड़ें । मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटा, 2 एस के लिए केंद्रापसारक, और ६० मिनट के लिए बर्फ पर जगह है । १६,००० x g और 4 ° c के लिए 1 ज पर ट्यूब केंद्रापसारक द्वारा आरएनए गोली हाला ।
  2. आरएनए गोली सूखी ।
    1. टोपी खोलो और ध्यान से एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant हटाने के लिए, नीचे कुछ तरल छोड़ ।
    2. गोली को छूने के बिना शेष सभी supernatant को दूर करने के लिए एक 20 µ l पिपेट का प्रयोग करें । किसी भी समाधान गोली के विपरीत पक्ष पर बैठने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूब झुकाव ।
    3. एक 10 मिलीलीटर unफ़िल्टर्ड पिपेट टिप के साथ एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें supernatant महाप्राण और एक वैक्यूम का उपयोग कर गोली सूखी ।
  3. RNase-मुफ्त पानी की ५.६ µ एल में आरएनए गोली पुनः स्थगित ।
    1. 15 मिनट के लिए बर्फ पर रिवर्स प्रतिलेखन रिएजेंटों को ठंढ । 5x बफर के 3 µ एल जोड़कर एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेट करें, 10x deoxynucleotide ट्राइफॉस्फेट (dNTPs) के ४.२ µ एल (प्रत्येक 2 मिमी), और १.५ µ एल के dithiothreitol (डीटीटी) µ के ५.६ RNase एल के लिए मुक्त निलंबित गोली ।
    2. धीरे ट्यूब झटका करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण है, और 2 एस के लिए समाधान इकट्ठा करने के लिए केंद्रापसारक । ९० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक पर प्रतिक्रिया ठीक 30 एस के लिए सेट और फिर सीधे एक thermomixer पर ५० डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण ।
    3. 2 मिनट के लिए thermomixer पर ट्यूब छोड़ दें ताकि तापमान equalizes । रिवर्स प्रतिलेखन एंजाइम के ०.७५ µ एल जोड़ें सीधे समाधान में, झटका धीरे मिश्रण करने के लिए, और वापस thermomixer पर ५० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए तुरंत ट्यूब सेट ।
  4. 30 मिनट के बाद, एक गर्मी ब्लॉक करने के लिए 1 मिनट के लिए ९५ ° c में ट्यूब हस्तांतरण रिवर्स प्रतिलेखन को रोकने के लिए । RNase के ९५ µ एल जोड़ें-सीधे रिवर्स प्रतिलेखन के लिए नि: शुल्क पानी, झटका ट्यूब मिश्रण करने के लिए, और यह 2 मिनट के लिए बर्फ पर सीधे सेट ।
  5. सीडीएनए स्टॉक लाइब्रेरी और लाइब्रेरी आईडी के साथ ट्यूब लेबल ।

6. पायलट पीसीआर और बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन

  1. RNase-मुक्त पानी के ३०४ µ एल जोड़कर ताजा 10x पीसीआर बफर तैयार, १२५ µ l के 2 m KCl, ५० µ l के 1 m Tris pH ८.०, 10 µ l के 1 m MgCl2, 5 µ l के 1% ट्राइटन X-१००, और 6 µ l के 1 m 2-mercaptoethanol में एक सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब , और RT पर रखें ।
  2. RNase के ६७ µ एल के संयोजन से पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया इकट्ठा-मुक्त पानी, 10x पीसीआर बफर के 10 µ एल, 10x dNTPs के 10 µ एल, ०.५ µ एल के १०० µ एम 5 ' पीसीआर प्राइमर, ०.५ µ एल के १०० µ एम 3 ' पीसीआर प्राइमर, µ स्टॉक लाइब्रेरी के 10 सीडीएनए एल, और µ 50x Taq के 2 पोलीमरेज़ एल ।
    1. एक thermocycler पर दो पीसीआर सायकलें निम्नानुसार सेट करें: 1:94 ° c के लिए ४५ s, ५० ° c ८५ s के लिए, और ७२ ° c 10 चक्र के लिए ६० s के लिए, 4 ° c पर रखें; फ़ाइल 2:94 ° c के लिए ४५ s, ५० ° c ८५ s के लिए, और ७२ ° c 2 चक्र के लिए ६० s के लिए, 4 ° c पर होल्ड करें । thermocycler में पायलट पीसीआर रिएक्शन सेट करें और फ़ाइल 1 प्रारंभ करें ।
    2. फ़ाइल 1 के अंत में, पीसीआर ट्यूब खोलें, और एक 20 µ एल पिपेट का उपयोग कर, एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया से 12 µ एल हस्तांतरण 5x जेल लोडिंग डाई के 3 µ एल, मिश्रण pipetting ऊपर और नीचे, ट्यूब बंद , और यह लेबल "10 चक्र" ।
    3. पायलट पीसीआर ट्यूब बंद करें और एक thermocycler पर फ़ाइल 2 शुरू करते हैं । फ़ाइल 2 के अंत में, खुला पीसीआर ट्यूब और एक 20 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में समाधान के 12 µ एल 5x जेल लोड हो रहा है डाई के 3 µ एल के साथ हस्तांतरण, और यह लेबल "12 चक्र" ।
    4. पीसीआर चक्र 14, 16, 18 और 20 में पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया से 12 µ एल पीसीआर उत्पादों को इकट्ठा करने के लिए चरणों 6.2.2 और 6.2.3 में वर्णित चरणों को दोहराएँ । 5x जेल के 3 µ एल जोड़ने प्रत्येक 12 µ l पीसीआर aliquots के लिए डाई लोड हो रहा है, और 20 nt सीढ़ी के 3 µ l युक्त सीढ़ी और µ के 9 RNase एल-मुक्त पानी ।
  3. 0.5 x TBE के साथ एक २.५% agarose जेल तैयार करें ।
    1. एक साफ चोंच में agarose का २.५ ग्राम वजन और 0.5 x TBE की १०० मिलीलीटर जोड़ें । एक माइक्रोवेव में समाधान गर्मी जब तक यह फोड़े । माइक्रोवेव से हल निकालें, agarose मिश्रण करने के लिए बोतल भंवर, ethidium ब्रोमाइड के 4 μL जोड़ें (10 मिलीग्राम/एमएल), और एक 7 x 10 सेमी2 ट्रो ट्रे, टेप के साथ दोनों सिरों पर बंद करने के लिए समाधान हस्तांतरण ।
    2. एक 8 अच्छी तरह से कंघी सेट और agarose जेल आरटी पर जमना चलो एक ट्रो 0.5 x TBE से भरा उपकरण में जम agarose जेल स्थानांतरण ।
  4. agarose जेल पर सीढ़ी और पीसीआर नमूने लोड, और १२० V पर 30 मिनट के लिए इसे चलाने के लिए ।
  5. इष्टतम पीसीआर चक्र (चित्रा 4a) की पहचान करने के लिए एक यूवी बॉक्स पर जेल का मूल्यांकन करें ।
    नोट: प्रत्याशित पीसीआर बैंड का आकार चित्रा 4Bमें दिखाया गया है ।
    1. विभिंन कुओं में से प्रत्येक में दो पीसीआर बैंड का निरीक्षण करें (ऊपरी बैंड: डीएनए लाइब्रेरी, लोअर बैंड: प्राइमरी dimers) ।
    2. जहां सीडीएनए लाइब्रेरी दिखाई दे रही है वहां साइकिल का चयन कर सीडीएनए प्रवर्धन के लिए पर्याप्त पीसीआर साइकिल की पहचान करें, लेकिन प्राइमरी dimers बमुश्किल चौकसी बरत रहे हैं ।
      नोट: सामान्यतः, पर्याप्त पीसीआर चक्र 12 – 16 चक्रों के बीच चुना जाता है । चित्रा 4aपर, इस पुस्तकालय के लिए पर्याप्त पीसीआर चक्र 14 है ।
  6. agarose जेल लाइब्रेरी शुद्धिकरण के लिए बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं (6x १०० µ l) सेट करें ।
    1. ६.१ कदम निंनलिखित 10x पीसीआर बफर की एक ताजा ट्यूब तैयार करते हैं ।
    2. RNase-नि: शुल्क जल के ४३५.५ µ l को संयोजित करके एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में बड़े पैमाने पर पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें, 10x पीसीआर बफर के ६५ µ एल, ६५ µ के एल 10x dNTPs, ३.२५ µ एल के 5 ' पीसीआर प्राइमर, ३.२५ µ एल के 3 ' पीसीआर प्राइमर, और pipetting अप और मिश्रण करने के लिए नीचे ।
    3. ट्रांसफर ८८ पीसीआर मास्टर मिक्स के µ एल छह में ०.५ एमएल पीसीआर ट्यूबों । स्थानांतरण 10 सीडीएनए स्टॉक लाइब्रेरी के µ एल (बर्फ पर संग्रहीत), 6 पीसीआर ट्यूबों में से प्रत्येक में 50x Taq पोलीमरेज़ के 2 µ एल जोड़ने के लिए, और मिश्रण करने के लिए पिपेट ।
    4. RNase-नि: शुल्क पानी के ७७ µ l के संयोजन से एक नकारात्मक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब तैयार करें, 10x पीसीआर बफर के 10 µ एल, 10x dNTPs के 10 µ एल, ०.५ µ एल के 5 ' पीसीआर प्राइमर, ०.५ µ एल के 3 ' पीसीआर प्राइमर, और 2 µ एल के 50x Taq पोलीमरेज़, और मिश्रण करने के लिए पिपेट ।
    5. thermocycler में पीसीआर ट्यूबों प्लेस 6.2.1 चरण में वर्णित पीसीआर चक्र का उपयोग और प्रवर्धन चक्र की इष्टतम संख्या निर्धारित किया है । ६.३ चरण में वर्णित के रूप में 0.5 x TBE का उपयोग कर एक २.५% agarose जेल तैयार करें ।
  7. पीसीआर प्रवर्धन के बाद, 6 १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक पीसीआर ट्यूब से 9 µ एल स्थानांतरण 5x जेल लोडिंग डाई के 3 µ एल युक्त ।
    1. RNase मुक्त पानी की 9 µ एल में सीढ़ी के 3 मिलीलीटर के संयोजन से 20 nt सीढ़ी तैयार है और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 3 µ एल जेल लोड हो रहा डाई जोड़ने ।
    2. agarose जेल पर सीढ़ी, नकारात्मक पीसीआर नियंत्रण, और 6 पीसीआर उत्पादों लोड, और १२० वी में 30 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
    3. एक यूवी बॉक्स (एक छवि ले) पर गलियों के बीच पीसीआर प्रवर्धन की एकरूपता की पुष्टि करें ।
    4. दो १.५ मिलीलीटर सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब (3x ९१ µ एल) में 3 पीसीआर प्रतिक्रियाओं का मिश्रण, 5 एम NaCl के 27 µ एल जोड़ने और १००% इथेनॉल के ९५० µ एल । मिश्रण करने के लिए ट्यूबों पलटना और पीसीआर उत्पादों को तेज करने के लिए रातोंरात-20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेट.

7. सीडीएनए पुस्तकालय शुद्धिकरण एवं मूल्यांकन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए १६,००० x g पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं के साथ दोनों ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  2. एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant निकालें, तो ऊपरी पक्ष और निचले पक्ष पर तरल पर गोली के साथ ट्यूब झुकाव, और एक पाश्चर पिपेट एक टब और महाप्राण पाश्चर के अंत में एक 10 मिलीलीटर टिप के साथ तरल पिपेट के साथ एक वैक्यूम कुप्पी से जुड़ा का उपयोग करें ।
  3. PmeI डाइजेस्ट सेट करें ।
    1. nuclease-नि: शुल्क पानी की १७.५ µ एल के साथ पीसीआर छर्रों में से एक reसस्पेंड, और दूसरी पीसीआर गोली के लिए reसस्पैंड गोली हस्तांतरण । 10x बफर और PmeI एंजाइम के ०.५ µ एल के 2 µ एल जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक पानी के स्नान में डाइजेस्ट सेट ।
    2. 0.5 x TBE (step ६.३) का उपयोग करके २.५% agarose जेल तैयार करें । 5x जेल के 6 µ एल जोड़ें पचाने के लिए डाई लोड हो रहा है । agarose जेल के दो आसंन कुओं में प्रत्येक डाइजेस्ट के 13 µ l हस्तांतरण, अंत कुओं में 20 nt आकार सीढ़ी लोड, और १५० V (चित्रा 4d) पर ९० मिनट के लिए जेल चलाने ।
    3. एक्साइज जेल से ऊपरी पीसीआर बैंड यूवी बॉक्स पर, एक हौसले से तौला १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जेल टुकड़े हस्तांतरण, और एक पैमाने पर जेल टुकड़े वजन ।
  4. निर्माता के निर्देश के बाद एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर एक्साइज पीसीआर प्रवर्धित सीडीएनए पुस्तकालय को शुद्ध करें । सीडीएनए एक डीएनए ठहराव परख और साधन का उपयोग कर पुस्तकालय यों तो, निर्माता के निर्देशों का पालन ।
  5. एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप के साथ सीडीएनए पुस्तकालय के आकार और पवित्रता का मूल्यांकन करें (चित्रा 5) । एक उच्च प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर सीडीएनए पुस्तकालय अनुक्रम । FASTQ डेटा फ़ाइल RNAworld पाइपलाइन एडाप्टर ट्रिमिंग करने के लिए और मानव जीनोम के लिए संरेखण miRNA अनुक्रम की पहचान करने के लिए स्थानांतरण ।

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Representative Results

यहां विधि में वर्णित के रूप में, कुल 18 व्यक्तिगत FFPE आरएनए नमूने (१०० प्रत्येक एनजी) अलग ट्यूबों में स्थापित करने के लिए 3 ' adenylated बारकोड oligonucleotide टी-4 बंधाव रातोंरात से गुजरना कर रहे हैं । अगले दिन, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं गर्मी निष्क्रिय कर रहे हैं, संयुक्त, और एक एकल ट्यूब में उपजी । आरएनए गोली reसस्पैंड कर दिया है और ligated आरएनए अणु एक 15% denaturing polyacrylamide जेल (पृष्ठ) पर अलग कर रहे हैं, जहां आरएनए oligonucleotide आकार मार्कर कि पृष्ठ जेल के आसंन कुओं में चले गए, का चयन करने के लिए उपयोग किया जाता है उचित आकार 3 ' बारकोड छोटा RNAs (चित्र 2) । आबकारी जेल टुकड़ा एक NaCl समाधान में रात भर की मशीन है ligated आरएनए अणु elute । अगले दिन, eluted आरएनए उपजी है, और एक 5 अनुकूलक बंधाव किया जाता है । फिर, 5 अनुकूलक ligated छोटे आरएनए अणु चले गए और एक 12% acrylamide जेल, पर अलग कर रहे हैं, जहां फिर से चले गए आरएनए आकार मार्कर oligonucleotides छोटे RNAs के दोनों 3 ' बारकोड oligonucleotides और 5 ' एडाप्टर युक्त के आकार के उत्पाद की अनुमति ( चित्रा 3) । एक NaCl समाधान में रात भर के लिए आबकारी जेल की मशीन है । अगले दिन, ligated छोटे आरएनए अणु उपजी हैं, और गोली RNase मुक्त पानी में reसस्पैंड कर दिया है, उल्टे-प्रतिलेखन के बाद; सीडीएनए अणुओं की एक aliquot एक पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया (चित्रा 4a) से गुजरती है । बड़े पैमाने पर पीसीआर सीडीएनए पुस्तकालयों के एक ही इनपुट का उपयोग कर प्रतिक्रियाओं की स्थापना की और एक २.५% agarose जेल पर मूल्यांकन के लिए सत्यापित करें कि सभी प्रतिक्रियाओं पर्याप्त रूप से (चित्रा 4B) पीसीआर, पूलिंग और रातोंरात इथेनॉल वर्षण से पहले परिवर्धित थे । अगले दिन, परिवर्धित सीडीएनए 18 अद्वितीय FFPE आरएनए के नमूनों के लिए सभी 18 व्यक्तिगत पुस्तकालयों युक्त पुस्तकालय, एक २.५% agarose जेल पर चले गए, और शीर्ष पीसीआर बैंड, १०० nt पर चल रहा है और उत्पाद है शुद्ध (चित्र 4c) । सीडीएनए पुस्तकालय शुद्धि तो एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप पर मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 5) यह निर्धारित करने के लिए कि शुद्ध पीसीआर उत्पाद एक प्राइमरी dimers या पीसीआर प्रतिक्रिया के अन्य प्रतिफल के अतिरिक्त शामिल नहीं है । पीसीआर उत्पाद तो एक उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रणाली पर विश्लेषण किया है । अनुकूलक ट्रिमिंग और 18 नमूनों में से प्रत्येक के लिए 18 व्यक्तिगत फ़ाइलों की पीढ़ी RNAworld पाइपलाइन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे है (प्रवेश हमें डॉ थॉमस Tuschl द्वारा प्रदान किया गया था) । इसके बाद FFPE आरएनए नमूनों की miRNA सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण किया जाता है ।

इस अनुकूलित प्रक्रिया को मांय करने के लिए, मिलान ताजा जमे हुए और FFPE स्तन ट्यूमर नमूनों का विश्लेषण (चित्रा 6) के लिए इस्तेमाल किया गया । दो समान इनवेसिव डक्टर स्तन कार्सिनोमा (IDC) ट्यूमर प्रक्रिया की संवेदनशीलता का मूल्यांकन और miRNA अभिव्यक्ति मतभेद दो ताजा जमे हुए ऊतकों के बीच की पहचान का निर्धारण करने के लिए चयनित किया गया था भी मिलान संग्रहीत में पाया जा सकता है FFPE आरएनए नमूनों । इस प्रयोग के लिए 2 ताजे जमे हुए और मिलाए गए दो FFPE आरएनए नमूनों से प्राप्त कुल आरएनए की गुणवत्ता का मूल्यांकन (चित्रा 6A) किया गया. के रूप में प्रत्याशित, आरएनए आकार और FFPE नमूनों की गुणवत्ता बुरी तरह से जब मिलान ताजा जमे हुए RNAs की तुलना में कमी आई थी (लेन 1 और 3, और लेन 2 और 4 की तुलना) । FFPE आरएनए के एक 4 साल के लिए आर टी पर संग्रहीत किया गया था (इनवेसिव स्तन कैंसर 1, (IBC1)) और अन्य 8 साल के लिए आर टी पर संग्रहीत किया गया था (IBC2), जबकि ताजा जमे हुए समकक्षों पर संग्रहीत किया गया था-८० ° c. चार व्यक्तिगत आरएनए नमूनों एक एकल पुस्तकालय में विश्लेषण किया गया, 4 व्यक्तिगत बारकोड का उपयोग कर, और miRNA पढ़ें वितरण भूखंडों चित्रा घमण्डमें प्रदर्शित कर रहे हैं । दो शीर्ष पैनलों दो ताजा जमे हुए ट्यूमर RNAs और उनके विशिष्ट FFPE आरएनए नमूना समकक्षों के बीच miRNA अभिव्यक्ति सहसंबंध प्रदर्शित करते हैं । मिलान ताजा जमे हुए और FFPE miRNAs के बीच भूखंडों संकेत मिलता है कि सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी एक उच्च सहसंबंध के रूप में एक अच्छा reproducibility प्रदान करता है अलग संसाधित नमूनों में पाया miRNAs (जमे हुए बनाम FFPE) के बीच मनाया जा सकता है । दो कम पैनलों दो अलग जमे हुए ट्यूमर से miRNA अभिव्यक्ति डेटा के बीच सहसंबंध और दो अलग FFPE ट्यूमर के बीच प्रदर्शित करते हैं । के रूप में चित्रा 6Cमें संकेत दिया, दो ताजा जमे हुए ट्यूमर के बीच की पहचान miRNA अभिव्यक्ति मतभेद दो मिलान FFPE ट्यूमर नमूनों के बीच का पता चला मतभेद के साथ संबंधित थे । माहात्म्य miRNA अभिव्यक्ति अंतर ताजा जमे हुए और FFPE ट्यूमर दोनों में detectable थे ।

आगे इस दृष्टिकोण की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, 12 संग्रहीत FFPE नमूनों से miRNA अभिव्यक्ति डेटा और 4 ताजा जमे हुए आरएनए नमूनों का इस्तेमाल किया गया (चित्रा 6D). 16 विभिन्न शाही सेना के नमूनों व्यक्तिगत रूप से 3 ' बारकोड और सभी एक एकल सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया. इस पुस्तकालय में प्रयुक्त आरएनए नमूनों में दो स्तन कोशिका रेखाएं शामिल हैं, MCF10A (सामान्य-जैसे सेल लाइन) और MCF7 (स्तन कैंसर सेल लाइन) से आरएनए के साथ ताजा कोशिकाओं और उनके आर्काइव FFPE समकक्षों से23, मिलान ताजा जमे हुए और FFPE आरएनए के नमूने दो स्तन कैंसर के नमूनों से स्वतंत्र रूप से विश्लेषण (IBC1 और IBC2 चित्रा 6A और घमण्डमें), और सामान्य ग्रीवा के नमूनों (Cx) से ताजा जमे हुए और FFPE आरएनए के नमूनों का मिलान किया. इसके अतिरिक्त, सामांय से संग्रहीत FFPE नमूनों (सामांय Br1, सामांय Br2, और सामांय Br3), और कैंसर स्तन ऊतक (IBC 5, IBC 6, और IBC 7), उनके ताजा जमे हुए समकक्षों के बिना विश्लेषण किया गया । के रूप में हीटमैप पर मनाया, ताजा जमे हुए या FFPE आरएनए मूल की परवाह किए बिना, एक ही कोशिकाओं के miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल (MCF10 या MCF7), या एक ही ऊतकों (IBC1, IBC2, या Cx) संकुल एक साथ. इसके अतिरिक्त, के रूप में पर्यवेक्षण क्लस्टर पर उल्लेख किया, बाएं से दाएं, सामांय स्तन कोशिकाओं और ऊतकों को एक साथ संकुल जबकि स्तन ट्यूमर और ट्यूमर कोशिकाओं को सही पर संकुल । ग्रीवा ऊतक, जो एक अलग miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल प्रदर्शित, हीटमैप के अधिकार पर संकुल ।

यह देखते हुए कि नैदानिक संग्रहीत FFPE नमूनों की सबसे ताजा जमे हुए समकक्षों नहीं है, लेकिन है कि वे अलग भंडारण अवधि के बाद प्राप्त किया जा सकता है, यह निर्धारित करने के लिए यदि अनुकूलित सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल लागू किया गया था की मांग की थी और तेजी से पुराने FFPE नमूनों के साथ reproducible । के रूप में चित्रा 7में प्रदर्शित, FFPE ऊतकों से miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल 18, 20, 22, 27, 30, और ३५ साल के लिए संग्रहीत प्राप्त किया गया । आरएनए अनुकूलित एक साथ आरएनए का उपयोग कर निकाला गया था/डीएनए प्रक्रिया21, और प्रत्येक व्यक्ति FFPE नमूना से quadruplet आरएनए aliquots एक ही दिन में तैयार किया गया था और पुस्तकालय की तैयारी से पहले-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । एक कुल 9 विभिन्न FFPE नमूनों की नकल में विश्लेषण किया गया, जहां प्रत्येक व्यक्ति आरएनए aliquot एक ही पुस्तकालय के भीतर विभिन्न बारकोड्ड oligonucleotides (18 बारकोड्स कुल) के साथ ligated था. यह प्रयोग लगातार दो सप्ताह (सप्ताह 1 और सप्ताह 2) के दौरान दोहराया गया । इस सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी का मूल्यांकन reproducibility एक ही शाही सेना के नमूनों के साथ एक एकल पुस्तकालय में दो अलग बारकोड का उपयोग कर, और एक सप्ताह के अंतराल के साथ दो अलग पुस्तकालयों के बीच की अनुमति दी । जैसा कि चित्र 7पर देखा गया है, सहसंबंध गुणांक ०.९६ के ऊपर बना हुआ है चाहे नमूना या लाइब्रेरी तैयारी सप्ताह की आयु का हो; इसलिए, अनुकूलित सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल अपने अभिलेखीय समय की परवाह किए बिना FFPE नमूनों के reproducible विश्लेषण के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है, उदाहरण के लिए, ३५ वर्षीय संग्रहीत FFPE आरएनए (स्तन #9 देखें) प्रदर्शित उच्च reproducible उपाय 20 वर्षीय FFPE आरएनए नमूनों के साथ नोट करने वालों के समकक्ष (स्तन #3 देखें).

Figure 1
चित्र 1: Oligonucleotides. सभी oligonucleotide अनुक्रम, उनके इसी रासायनिक संशोधनों, और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सांद्रता वर्णित हैं । रासायनिक संशोधनों के प्रकार संशोधन बॉक्स और oligonucleotide अनुक्रम में प्रदर्शित संक्षिप्त संशोधनों में वर्णित हैं । औजार के लिए 10 व्यक्ति आरएनए oligonucleotide औजारों की सूची प्रदर्शित करता है, जो वाहक oligonucleotide (०.५ µ m) युक्त समाधान में reसस्पैंड किए गए थे । अठारह 3 ' बारकोड oligonucleotide एडेप्टर बारकोड के अनुक्रम पर ग्रे छायांकन के साथ विस्तृत रहे हैं । 5 ' एडाप्टर के आरएनए अनुक्रम, और 3 ' पीसीआर और 5 ' पीसीआर प्राइमरों के डीएनए दृश्यों विस्तृत कर रहे हैं । दो आकार मार्कर oligonucleotides के आरएनए अनुक्रम, अर्थात् के रूप में प्रोटोकॉल में संदर्भित 19 nt-3 ' एडाप्टर और 24 nt-3 ' एडाप्टर आकार मार्कर, प्रदान की जाती हैं. सभी डीएनए और आरएनए oligonucleotides व्यावसायिक रूप से खरीदे गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:3 ' बारकोड आरएनए नमूने के पृष्ठ शुद्धि । 18 बारकोड आरएनए के नमूनों को पूलिंग और तेज़ करने के बाद, reसस्पैंड किया गया आरएनए गोली एक 15% acrylamide जेल (अच्छी तरह देखें 8) पर ट्रो द्वारा माइग्रेट और अलग की जाती है । लाल वर्ग 3 ' बारकोड microRNAs है, जो एक स्केलपेल ब्लेड के साथ उत्पाद और एक nuclease मुक्त सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था युक्त क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया । चार कुओं की कुल, दो युक्त के साथ 19 nt-3 ' अनुकूलक और दो युक्त 24 nt-3 ' अनुकूलक एक अच्छी तरह से दूर स्थापित किया गया था, पुस्तकालय के प्रत्येक पक्ष पर (कुओं 5, 6 देखते हैं, और 10, 11, क्रमशः). टी-4 आरएनए ligase 1 के लिए एक परीक्षण के रूप में और अगले दिन पूरा किया जा करने के लिए ligated आकार मार्करों की शुद्धि के लिए, 5 एडेप्टर के साथ 19 nt-3 ' अनुकूलक आकार मार्कर और ' 5 अनुकूलक के साथ 24 nt-3 अनुकूलक आकार मार्कर युक्त बंधाव प्रतिक्रियाओं 2 कुओं में चला रहे थे एक डी 3, क्रमशः । पीले चौकों 5 ' अनुकूलक के साथ ligated आकार मार्कर आरएनए oligonucleotides का प्रतिनिधित्व करने वाले एक्साइज बैंड प्रदर्शित करते हैं । इन बैंड शुद्ध, उपजी है, और 12% पृष्ठ शुद्धि पर के दौरान चलाने के लिए (नीचे चित्रा 3 देखें) । वेल्स 1 और 13 20 nt आकार सीढ़ी है, जो ligated उत्पादों के प्रत्याशित आकार की पुष्टि में मदद शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:5 ' अनुकूलक के बंधाव के बाद शुद्ध पुस्तकालय के पृष्ठ शुद्धि । शुद्ध आरएनए पुस्तकालय 5 ' अनुकूलक के साथ ligated था और अपेक्षित उत्पाद आकार 12% ligated आकार मार्करों (लाल स्क्वायर देखें) का उपयोग कर पृष्ठ से आबकारी था. टी-4 आरएनए के उत्पादों के बीच ligations 19 nt-3 ' अनुकूलक और 5 ' अनुकूलक (वेल्स ४ और ९) और के बीच 24 nt-3 ' अनुकूलक और 5 ' एडाप्टर (वेल्स 5 और 10) समानांतर में चलाए गए थे, अच्छी तरह से आरएनए पुस्तकालय युक्त के प्रत्येक पक्ष पर । उच्चतम बैंड (सफेद तारों देखें) 5 ' अनुकूलक बंधाव के उत्पादों रहे हैं और जेल बैंड उत्पाद के लिए गाइड के रूप में इस्तेमाल 5 ' अनुकूलक ligated आरएनए पुस्तकालय युक्त. बंधाव आकार मार्कर बंधाव पिछले पृष्ठ पर शुद्ध उत्पादों अच्छी तरह से 3 में चला रहे हैं । 1 और 12 कुओं में मनाया के रूप में, 20 nt आकार सीढ़ी भी आरएनए पुस्तकालय के प्रत्याशित आकार को मान्य करने के लिए चलाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पायलट पीसीआर और सीडीएनए पुस्तकालय के बड़े पैमाने पर प्रवर्धन । ethidium ब्रोमाइड की उपस्थिति में २.५% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों के आकार और अनुपात का मूल्यांकन किया गया । () बारकोड्ड आरएनए पुस्तकालय के रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, सीडीएनए पुस्तकालय के एक aliquot एक एकल पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया में 5 ' और 3 ' पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर परिलक्षित किया गया । पायलट पीसीआर प्रतिक्रियाओं के Aliquots 10, 12, 14, 16, 18, और 20 चक्र में प्राप्त किया और एक २.५% agarose जेल पर चले गए थे । के रूप में 1 और 7 कुओं के बीच मनाया, सीडीएनए पुस्तकालय और अनुकूलक dimers की उपस्थिति तेजी से देख रहा था (हरी आयतों देखें) । इस पुस्तकालय के लिए, सीडीएनए पुस्तकालय के प्रवर्धन के लिए चयनित पीसीआर साइकिल 15 थी । (B) यह योजनाबद्ध विभिंन oligonucleotides और परिणामी आरएनए और डीएनए उत्पादों की स्थिति और लंबाई को प्रदर्शित करता है, जो पृष्ठ और agarose जैल पर पहचाने जाने योग्य हैं । () 6 बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं के Aliquots ( एकमें पहचान) २.५% agarose जेल पर अलग से विश्लेषण किया गया (वेल्स 3 से 8 देखें) । पीसीआर उत्पादों के दो प्रकार, अर्थात् पुस्तकालय (ऊपरी बैंड) और प्राइमरों dimers (लोअर बैंड) इस जेल पर दिखाई दे रहे हैं (हरी आयतों देखें) । सीडीएनए बिना रिक्त पीसीआर प्रतिक्रिया कोई पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शित करता है (अच्छी तरह से 2 देखें) । 20 nt आकार की सीढ़ी उत्पाद के आकार के सत्यापन की अनुमति देता है (अच्छी तरह से 1 देखें) । (D) जेल छवि २.५% agarose जेल की एक नीली बत्ती transilluminator पर पूल की पीसीआर प्रतिक्रियाओं से युक्त दो आसंन कुओं में भाग गया । के रूप में देखा, दोनों कुओं में सबसे अधिक बैंड की उंमीद पुस्तकालय के आकार के भीतर है और अनुकूलक डिमर बैंड के नीचे स्थित है । ऊपरी पीसीआर बैंड उत्पाद और एक जेल निष्कर्षण किट के साथ शुद्ध थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: शुद्ध पीसीआर परिवर्धित डीएनए पुस्तकालय का मूल्यांकन । पीसीआर प्रवर्धित सीडीएनए लाइब्रेरी का एक छोटा aliquot (1 µ एल) एक microfluidics आधारित मंच पर एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है । (A) इस पैनल उपकरण के अंशांकन के लिए आकार मार्करों के प्रवास को प्रदर्शित करता है । () यह पैनल शुद्ध पीसीआर परिवर्धित सीडीएनए पुस्तकालय के प्रवास को प्रदर्शित करता है । उच्चतम शिखर १०० बीपी (तारे देखें) के आकार पर मापा जाता है और सीडीएनए पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व करता है । साधन द्वारा ७२ बीपी पर मूल्यांकन छोटे शिखर प्राइमर एडेप्टर dimers का प्रतिनिधित्व करता है । १०० बीपी पीक microfluidics आधारित मंच द्वारा पता लगाया सीडीएनए पुस्तकालय है, जो एक उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रणाली पर बाद में NGS के लिए 18 व्यक्तिगत बारकोड आरएनए नमूनों में शामिल है के लिए अनुमानित आकार का पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मिलान ताजा जमे हुए और formalin-फिक्स्ड आयल एंबेडेड नमूनों का उपयोग कर । () कुल आरएनए से निकाले गए मिलान ताजा जमे हुए और FFPE इनवेसिव डक्टिंग कार्सिनोमा (IDC) ट्यूमर एक microfluidics आधारित मंच पर कुल आरएनए चिप पर विश्लेषण किया गया था. () मिलान ताजा जमे हुए और FFPE नमूनों (IBC 1 और IBC2) से कुल आरएनए सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल और miRNA अनुक्रमण डेटा साजिश रची गई थी । (C) IBC1/IBC2 नमूनों और जमे हुए और FFPE युग्मित नमूनों के बीच सहसंबंध के बीच DifferentialmiRNA व्यंजक । miRNA अभिव्यक्ति प्रति दस लाख (सीपीएम), उच्च से कम पढ़ता (नीले रंग के लिए लाल) में लॉग गणना में प्रदर्शित होता है । दो ऊतक जोड़े, प्रति miRNA के बीच अभिव्यक्ति अंतर का महत्व, भूरे रंग हलकों द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, उच्च और कम अभिव्यक्ति miRNAs ताजा और FFPE नमूनों में पहचान के साथ । (D) कुल आरएनए से निकाली गई स्तन कोशिका रेखाओं (MCF10A and MCF7) के कृतित्व ताजे और FFPE आरएनए नमूनों से, मानव इनवेसिव स्तन कैंसर (IBC 1 और IBC2), गर्भाशय ग्रीवा के ऊतकों (Cx), संग्रहीत सामांय स्तन ऊतक (सामांय Br1, सामांय Br2, और सामांय Br 3), और आर्काइव इनवेसिव स्तन कैंसर (IBC 5, IBC 6, और IBC7) एक ही रन के भीतर सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी से गुजरा । पुस्तकालयों में पाया miRNAs का NGS डेटा एक हीट मैप विन्यास में प्रदर्शित कर रहे हैं. यह आंकड़ा Loudig एट अल से संशोधित किया गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: सीडीएनए लायब्रेरी तैयारी और पुराने संग्रहीत FFPE नमूनों का उपयोग कर प्रतिकृति के बीच miRNA अभिव्यक्ति सहसंबंध । 18, 20, 22, 27, 30, और ३५ से कुल आरएनए-वर्षीय संग्रहीत FFPE स्तन ऊतक नमूनों हमारे अनुकूलित सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल से गुजरा । 9 अलग FFPE नमूनों से आरएनए नमूने दोहराने अलग 3 ' बारकोड oligonucleotides के साथ ligated और 1 सप्ताह (w1) पर एक ही पुस्तकालय के भीतर विश्लेषण किया गया । एक सप्ताह के अंतराल (सप्ताह 2 या w2) के भीतर एक ही प्रयोग दोहराया गया था । एक ही संग्रहीत आरएनए नमूनों के बीच डुप्लिकेट miRNA अभिव्यक्ति डेटा के Reproducibility उपाय heatmaps में और सहसंबंध गुणांक ०.९३ और ०.९९ के बीच मूल्यांकित के साथ प्रदर्शित किए जाते हैं । यह आंकड़ा Loudig एट अल से संशोधित किया गया है । 20 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

FFPE आरएनए नमूनों में संग्रहीत छोटे RNAs के NGS के लिए एक अत्यंत reproducible और मजबूत सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया गया है, जो हैफनर एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया का एक संशोधित और अनुकूलित संस्करण है । 22

इस प्रोटोकॉल के सभी कदम पुराने संग्रहीत और समझौता कुल आरएनए FFPE नमूनों से बरामद के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है । इस प्रोटोकॉल के प्रमुख कदम, FFPE आरएनए की छोटी मात्रा में प्रसंस्करण के लिए, 18 अद्वितीय 3 ' बारकोड एडाप्टर के साथ व्यक्तिगत ligations के बाद सभी शाही सेना के नमूनों (यानी, 18 व्यक्ति १०० एनजी FFPE आरएनए नमूने) के पूलिंग में रहता है. इस महत्वपूर्ण कदम 18 FFPE आरएनए नमूनों के लिए समान रूप से सभी बाद में जैव रासायनिक और एंजाइमी छोटे आरएनए सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए आवश्यक कदम से गुजरना करने के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, इस चरण में छोटी आरएनए के अणुओं के वाहक प्रभाव को बढ़ाने के द्वारा और गोली प्रेक्षण और जेल चयन को सुविधाजनक बनाने के द्वारा शाही सेना की वर्षा और जेल शुद्धि की राशि को अधिकतम । इस प्रोटोकॉल, जो आगे अपनी बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला गया जब FFPE आरएनए की छोटी मात्रा के साथ काम करने का एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि एक पायलट पीसीआर प्रतिक्रिया सीडीएनए पुस्तकालय के इष्टतम प्रवर्धन चक्र की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह कदम भी पुस्तकालय प्रवर्धन बनाम प्राइमर डिमर प्रवर्धन की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो महत्वपूर्ण है जब बड़े पैमाने पर पीसीआर की प्रतिक्रिया तैयार करने और agarose जेल पर लघु आरएनए पुस्तकालय शुद्ध । डेटा इस प्रोटोकॉल में जोड़ा जमे हुए और FFPE नमूनों मिलान के बीच इस दृष्टिकोण के reproducibility प्रदर्शन, और भी ३५ साल तक के लिए संग्रहीत नमूनों से पुराने FFPE आरएनए नमूने के लिए अपनी प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला.

इस प्रोटोकॉल अपने मूल संस्करण से संशोधित किया गया था, तो यह छोटी आरएनए कम गुणवत्ता और रासायनिक संशोधित और समझौता FFPE आरएनए की मात्रा से बना पुस्तकालयों की तैयारी के लिए अनुकूलित है. इस प्रक्रिया का एक पहलू है कि सफलतापूर्वक ligate और FFPE नमूनों से छोटे RNAs बढ़ाना संशोधित किया गया था के लिए प्रारंभिक 3 ' बारकोड एडेप्टर बंधाव, जिसके लिए इनपुट ०.०२६ एनएम के लिए कम किया गया था रोकने के लिए जांच की मात्रा से संबंधित है । FFPE आरएनए नमूनों में मौजूद कम abundancy छोटे RNAs के बंधाव के साथ प्रतियोगिता । मूल प्रक्रिया के लिए एक और महत्वपूर्ण संशोधन ligated छोटे RNAs के पृष्ठ जैल पर चयन के दौरान इस्तेमाल सभी रेडियोधर्मी लेबल आकार मार्करों को हटाने का था । इन radiolabeled आकार-मार्करों का उपयोग न केवल रेडियो-आइसोटोप के उपयोग के लिए प्रमाणित प्रयोगशालाओं के लिए इस दृष्टिकोण की प्रयोज्यता को प्रतिबंधित लेकिन यह भी जैल पर आरएनए उत्पादों का अवलोकन रोका. इसके बजाय, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में, आकार मार्करों पुस्तकालय के बगल में कुओं में चला रहे हैं, पृष्ठ जेल पर, और ligated छोटे RNAs के प्रत्यक्ष उत्पाद के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ सीधे कल्पना । महत्वपूर्ण बात, फ्लोरोसेंट डाई हल्के से आरएनए उत्पादों के प्रसार को रोकने के लिए जेल पर छिड़काव किया जाता है और फिर एक नीली बत्ती बॉक्स पर visualized । बाद में, एहतियात के एक उपाय के रूप में और ligated छोटे आबकारी पृष्ठ जेल टुकड़े में निहित RNAs के प्रसार में सुधार करने के लिए, जेल ब्रेकर ट्यूबों को समान रूप से एक NaCl समाधान में रात में गर्मी से पहले जेल को कुचलने के लिए इस्तेमाल कर रहे है 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के तहत । इन सभी चरणों को ध्यान से सामग्री की छोटी मात्रा के साथ काम करने के लिए मूल्यांकन किया गया ।

इस प्रोटोकॉल विभिंन स्रोतों (अंगों और संस्थाओं) है कि समय के विभिंन मात्रा के लिए संग्रहित किया गया था से FFPE आरएनए नमूने के लिए लागू किया गया था । विश्लेषण इस अनुकूलित प्रक्रिया का उपयोग करते समय, ताजा और जमे हुए नमूनों से अनुक्रमण छोटे RNAs के उच्च reproducibility से पता चला. अतिरिक्त विश्लेषण पुराने संग्रहीत FFPE नमूनों का उपयोग कर, ३५ साल तक के लिए संग्रहित है, और नैदानिक नमूनों को प्रोटोकॉल के विशाल प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया । FFPE नमूनों के लिए ंयूनतम FFPE आरएनए इनपुट आवश्यकता को १०० एनजी दर्शाया गया था । इस कम आवश्यकता विभिंन आकारों और उपलब्धता के घावों की एक किस्म के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता की अनुमति देता है, लेकिन यह एकल कोशिका FFPE आरएनए के विश्लेषण की अनुमति नहीं होगी । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, तथापि, कि इस अनुकूलित प्रोटोकॉल भी कुल आरएनए से कम 1 एनजी के आदानों के साथ exosomes परिसंचारी से निकाले गए और उच्च reproducible लघु आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल (दिखाया गया डेटा) प्रदान करने के लिए दिखाया गया है के साथ इस्तेमाल किया गया है । यह कम इनपुट पता चलता है कि FFPE नमूनों में छोटे RNAs, हालांकि मूल ताजा ऊतक के प्रतिनिधि, बहुत कम अनुपात में परिसंचारी exosomes से कुल आरएनए की तुलना में मौजूद हैं ।

हाल के काम में, जहां इस अनुकूलित प्रोटोकॉल नैदानिक वर्गीकृत DCIS FFPE नमूनों के लिए लागू किया गया था, यह पाया गया कि miRNA अभिव्यक्ति सीडीएनए पुस्तकालय के NGS द्वारा की पहचान अंतर मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मांय किया जा सकता है । यह काम बड़े पैमाने पर पूर्वव्यापी अध्ययन [20] के लिए विभिन्न संस्थानों से संग्रहीत ऊतकों से DCIS घावों का उपयोग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया । इस अध्ययन भी इस सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी की मजबूती पर प्रकाश डाला जब विभिंन समय पर प्रदर्शन (कई हफ्तों के अंतराल पर), reproducibility और परख की संवेदनशीलता समझौता किए बिना ।

नैदानिक वर्गीकृत संग्रहीत FFPE नमूनों की विशाल राशि को ध्यान में रखते हुए, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर पूर्वव्यापी विश्लेषण में सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी के लिए और miRNA के संभावित पहचान के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है कैंसर के विकास से जुड़े21.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करना चाहते हैं कि एक प्रकाशन इस पांडुलिपि में प्रस्तुत आंकड़ों के कुछ युक्त Loudig एट अल द्वारा आणविक विज्ञान के अंतरराष्ट्रीय जर्नल में प्रकाशित किया गया था. 21.

Acknowledgments

हम डॉ थॉमस Tuschl, आरएनए आणविक जीवविज्ञान के लिए प्रयोगशाला के प्रमुख, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके समर्थन के लिए और अपनी प्रयोगशाला में विकसित प्रौद्योगिकी साझा करने और RNAworld पाइप लाइन के लिए उपयोग प्रदान करने के लिए अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए धन्यवाद. हम भी अपने प्रोटोकॉल साझा करने और सभी जैव रासायनिक और एंजाइमी अपने प्रारंभिक प्रक्रिया में इस्तेमाल किया कदम पर विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए Dr. Markus हैफनर धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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